專利名稱：制備液體纖維素酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及在發(fā)酵過程碳源的優(yōu)化應用，特別是涉及一種制備液 體纖維素酶的方法。
背景技術：
纖維素是自然界中含量最豐富的碳水化合物，是一類可再生的資
源和能源。但是纖維素很難被分解利用，如何將纖維素轉化為能直接
利用的資源和能源是擺在人們面前的一個難題。纖維素的降解有兩條
途徑，即化學法和生物法，但化學法特異性差、純度低、污染環(huán)境，
而用生物酶法可克服這些缺點，因此，纖維素酶一經發(fā)現就受到了世 界各國科學界的重視。
纖維素酶(cdlulase)是指能降解纖維素P-l， 4葡萄糖苷鍵，使纖維 素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，是起協(xié)同作用的多組分酶 系，其主要組分是內切|3-1， 4一葡聚糖酶(EC3.2.1 .4,也稱Cr酶)， 外切葡聚糖酶(EC3 .2.1 .9 1也稱C1酶，微晶纖維素酶)和P—葡萄 糖苷酶(EC3 .2 .1 .2 1也稱CB酶或纖維二糖酶)。前兩種酶主要溶解 纖維素，后一種酶可將纖維二糖轉化為葡萄糖，當這三種主要成分活 性比例適當時，就能完成纖維素的降解。纖維素酶在我國每年有幾十 億元的巿場銷售額，在紡織、酒精、飼料等工業(yè)具有廣泛的應用，但 目前國內90%以上的巿場份額被國外產品所占領，因此開展纖維素酶 發(fā)酵技術的研究，提高液體發(fā)酵酶活力、降低生產成本具有很重要的 現實意義。
纖維素酶的生產和其它酶制劑一樣，主要有固體發(fā)酵和液體深層 發(fā)酵兩種，國內外在這方面做了許多有價值的工作。固體發(fā)酵法是以 玉米等農作物秸稈為主要原料，其投資少，工藝簡單，產品價格低廉，目前國內絕大部分纖維素酶生產廠家均釆用該技術生產纖維素酶。但 是固體發(fā)酵法存在著一定的缺陷，以秸稈為原料的固體發(fā)酵法生產的 纖維素酶自動化程度低，勞動強度大，產品質量不穩(wěn)定。因此，隨著 液體發(fā)酵酶工藝的發(fā)展及菌種性能的提高，釆用液體發(fā)酵法生產纖維 酶素是必然趨勢。
現階段已成功開發(fā)出纖維素酶高產菌和高活力的發(fā)酵方法，具有 很好的應用開發(fā)價值。但纖維素酶降解纖維素時，纖維素酶用量大， 成本高，同樣限制了其應用，因此必須考慮降低纖維素酶的生產成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供 一種制備液體纖維素酶的方法。
本發(fā)明所述的制備液體纖維素酶的方法，是利用酸解秸桿作為里
氏木霉發(fā)酵用碳源制備纖維素酶。
所述酸解秸稈是將秸稈經過酸解后得到的，所述酸解是本領域技
術人員常用的技術手段，是為了使秸稈中的纖維素更容易利用。
優(yōu)選的，所述酸解是將秸稈在酸濃度為1-10%,溫度為50-10(TC 酸解l-5小時。
所述的酸解秸稈是將秸稈酸解、水洗和干燥后獲得。 為提高酸解效果，所述的酸解秸稈在酸解前，還包括堿煮，然后 中和。
所述酸解秸稈在堿煮以前，還包括將秸稈進行粗粉碎； 所述酸解秸稈在上述干燥后還包括細粉碎，制備酸解秸稈粉，以 便于配制培養(yǎng)基。
優(yōu)選的，所述酸解秸稈的制備過程如下所示
1) 粗粉碎將秸稈粗粉碎后過篩；
2) 堿煮，然后水洗并中和;
3) 酸解在50-100。C進行，然后水洗并中和；
4) 脫水，干燥，最后細粉碎，得到酸解秸稈粉。
4酸解使用的酸為硫酸或鹽酸，優(yōu)選l-10wt。/。的鹽酸。
由于秸稈不僅是里氏木霉發(fā)酵的碳源，也是里氏木霉發(fā)酵產生纖維素酶的誘導劑，本發(fā)明人經過實驗研究后，發(fā)現經過酸解處理后的酸解秸稈的誘導效果更為突出。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中，酸解秸稈的用量為5-20%;優(yōu)選7-9%;更優(yōu)選8%;實驗證明，在使用里氏木霉(購自中科院微生物菌種庫)制備纖維素酶時，酸解秸稈用量為8%時，纖維素酶的發(fā)酵水平達到最大值24.8FPAIU/ml。
所述秸桿為農作物秸稈，包括麥秸稈、稻秸稈或其他農作物秸稈。
本發(fā)明中，纖維素酶的活力濾紙酶活國際單位，表示方法為一個濾紙酶活力國際單位(FPAIU/ml)定義為酶解反應中每分鐘生成l.Oumol葡萄糖(以還原糖計)的酶量。
實驗證明，與使用未酸解秸稈作為碳源相比，同一種菌株發(fā)酵纖維素酶的水平由1 OFPAIU/ml提高到20FPAIU/ml以上。
本發(fā)明的有益效果利用本發(fā)明能夠明顯提高纖維素酶發(fā)酵水平。使用廉價的農作物秸稈經過簡單酸解處理后作為發(fā)酵用碳源，本方法利用廉價的農作物秸稈經過簡單酸解處理后作為發(fā)酵用碳源，經過搖瓶發(fā)酵試驗發(fā)現，纖維素酶發(fā)酵水平有了顯著提高。纖維素酶發(fā)酵水平由10FPAIU/ml提高到20FPAIU/ml以上。本發(fā)明簡單易行，可應用于大生產，是實現提高液態(tài)纖維素酶發(fā)酵水平，降低成本的有效手段，具有非?？捎^的經濟價值。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例l
1)斜面培養(yǎng)里氏木霉(購自中科院微生物菌種庫)無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，28'C條件下培養(yǎng)7天；
2)種子培養(yǎng)將步驟l)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種 液體培養(yǎng)基，28°C， 200r/min搖床培養(yǎng)48小時；
3)發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5%的接種量，將種子接種到發(fā)酵瓶中，28。C條件下，轉速為220r/min，培養(yǎng)8天。
其中步驟l)使用的培養(yǎng)基配方為
斜面配方(g/L): 土豆100;葡萄糖10克；瓊脂20。
其中步驟2 )使用的培養(yǎng)基配方為
種子配方(g/L):酵母粉10;硫酸鎂2;轔酸二氫鉀15;葡萄糖20;玉米漿IO。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵3;硫酸銅1.3;硼酸0.6;硫酸錳3.1;
硫酸鋅9。
其中步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為
發(fā)酵配方(g/L):酵母粉5;硫酸鎂0.6;磷酸二氫鉀5;葡萄糖10;玉米漿18;硫酸銨3;秸稈粉80;吐溫l。其中秸稈粉以下述方法制備
1) 粗粉碎將秸稈粗粉碎后過50目篩，得到秸稈粗粉；
2) 用5mol/L的氫氧化鈉濃溶液浸煮秸稈粗粉10小時，然后水洗并中和至pt^7.0，然后漂洗；
3) 酸解用10。/。的鹽酸在80'C酸解1小時，然后水洗并中和；
4) 脫水，干燥，最后細粉碎，得到酸解秸稈粉。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵5;硫酸銅2;硼酸l;硫酸錳5;硫酸鋅IO。
發(fā)酵培養(yǎng)過程包括28。C條件下，轉速為220r/min，培養(yǎng)8天，發(fā)酵水平10.3FPAIU/ml。實施例2
1) 斜面培養(yǎng)里氏木霉(購自中科院微生物菌種庫)無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，28。C條件下培養(yǎng)7天；
2) 種子培養(yǎng)將步驟l)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，28°C, 200r/min搖床培養(yǎng)48小時；
3)發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5%的接種量，將種子接種到發(fā)酵瓶中，28'C條件下，轉速為220r/min,培養(yǎng)8天。
其中步驟l)使用的培養(yǎng)基配方為
斜面配方(g/L): 土豆100;葡萄糖10克；瓊脂20。
其中步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為
種子配方(g/L):酵母粉10;硫酸鎂2;磷酸二氫鉀15;葡萄糖20;玉米漿IO。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵3;硫酸銅1.3;硼酸0.6;硫酸錳3.1;
硫酸鋅9。
其中步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為. 發(fā)酵配方(g/L): 酵母粉5;硫酸鎂0.6;磷酸二氫鉀5;葡萄糖10;
玉米漿18;硫酸銨3;酸解秸稈粉70;吐溫l。其中酸解秸稈粉的制備
過程如實施例l所示，只是將酸解酸釆用50%的硫酸，酸解時間控制
為3h。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵5;硫酸銅2;硼酸l;硫酸錳5;硫酸鋅IO。
發(fā)酵培養(yǎng)過程包括28"C條件下，轉速為220r/min,培養(yǎng)8天，發(fā)酵水平21.5FPAIU/ml。實施例3
1)斜面培養(yǎng)里氏木霉(購自中科院微生物菌種庫)無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，28。C條件下培養(yǎng)7天；
2 )種子培養(yǎng)將步驟l )培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，28°C, 200r/min搖床培養(yǎng)48小時；
3)發(fā)酵培養(yǎng):按液體培養(yǎng)基的體積比為5%的接種量，將種子接種到發(fā)酵瓶中，28。C條件下，轉速為220r/min，培養(yǎng)8天。
其中步驟l)使用的培養(yǎng)基配方為
7斜面配方(g/L): 土豆100;葡萄糖10克；瓊脂20。其中步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為
種子配方(g/L):酵母粉10;硫酸鎂2;磷酸二氫鉀15;葡萄糖20;玉米漿IO。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵3;硫酸銅1.3;硼酸0.6;硫酸錳3.1;
硫酸鋅9。
其中步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為
發(fā)酵配方(g/L):酵母粉5;硫酸鎂0.6;磷酸二氫鉀5;葡萄糖10;玉米漿18;硫酸銨3;酸解秸稈粉80;吐溫l。所述酸解秸稈粉釆用按實施例2的方法制備。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵5;硫酸銅2;硼酸l;硫酸錳5;硫酸鋅IO。
發(fā)酵培養(yǎng)過程包括28'c條件下，轉速為220r/min，培養(yǎng)8天，發(fā)酵水平24.8FPAIU/ml。實施例4
1) 斜面培養(yǎng)里氏木霉(購自中科院微生物菌種庫)無菌條件下分別接種于固體培養(yǎng)基上，28。C條件下培養(yǎng)7天；
2) 種子培養(yǎng)將步驟l)培養(yǎng)的菌種無菌條件下分別接種于液體培養(yǎng)基，28°C， 200r/min搖床培養(yǎng)48小時；
3) 發(fā)酵培養(yǎng)按液體培養(yǎng)基的體積比為5%的接種量，將種子接種到發(fā)酵瓶中，28。C條件下，轉速為220r/min,培養(yǎng)8天。
其中步驟l)使用的培養(yǎng)基配方為
斜面配方(g/L): 土豆100;葡萄糖10克；瓊脂20。
其中步驟2)使用的培養(yǎng)基配方為
種子配方(g/L):酵母粉10;硫酸鎂2;磷酸二氫鉀15;葡萄糖20;玉米漿IO。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵3;硫酸銅1.3;硼酸0.6;硫酸錳3.1;硫酸鋅9。
其中步驟3)使用的培養(yǎng)基配方為
發(fā)酵配方(g/L):酵母粉5;硫酸鎂0.6;磷酸二氫鉀5;葡萄糖10;玉米漿18;硫酸銨3;酸解秸稈90;吐溫l。所述酸解秸稈的制備方法如下所述
1) 粗粉碎將秸稈粗粉碎后過20目篩；
2) 用2mol/L的氫氧化鈉溶液煮3.5小時，然后水洗并中和；
3) 酸解用5。/。的HCl在50'C酸解5h,然后水洗并中和；
4) 脫水，干燥，得到酸解秸稈。
微量元素(ppm):硫酸亞鐵5;硫酸銅2;硼酸l;硫酸錳5;硫酸鋅IO。
發(fā)酵培養(yǎng)過程包括28'C條件下，轉速為220r/min,培養(yǎng)8天，發(fā)酵水平23.1 FPAIU/ml 。
權利要求
1、一種制備液體纖維素酶的方法，其特征在于，利用酸解秸稈作為里氏木霉的發(fā)酵用碳源制備纖維素酶。
2、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述酸解秸稈是將秸稈經過酸解得到，所述酸解是將秸桿在酸濃度為1-10%,溫度為50-100'C酸解l-5小時。
3、 如權利要求2所述的方法，所述的酸解秸桿是將秸稈酸解、水洗和干燥后獲得。
4、 如權利要求2或3所述的方法，所述的酸解桔稈在酸解前，還包括堿煮，然后中和。
5、 如權利要求4所述的方法，所述酸解秸稈在堿煮以前，還包括將秸稈進行粗粉碎；在干燥后還包括細粉碎。
6、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，酸解使用的酸為硫酸或鹽酸。
7、 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述秸稈為包括麥秸稈、稻秸稈的農作物秸稈。
8、 如權利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基中酸解秸稈的用量為5-20%。
9、 如權利要求8所述的方法，其特征在于，酸解秸稈的用量為7-9%。
10、 如權利要求9所述的方法，其特征在于，酸解秸稈的用量8%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備液體纖維素酶的方法。本發(fā)明利用酸解秸稈作為發(fā)酵用碳源制備纖維素酶，所述酸解秸稈是將秸稈經過粉碎、酸解、水洗、干燥和粉碎制得。實驗發(fā)現，采用酸解秸稈作為碳源發(fā)酵液體纖維素酶，其發(fā)酵水平有了顯著提高，纖維素酶發(fā)酵水平可由10FPAIU/ml提高到20FPAIU/ml以上。本發(fā)明簡單易行，可應用于大生產，是實現提高液態(tài)纖維素酶發(fā)酵水平，降低成本的有效手段，具有非?？捎^的經濟價值。
文檔編號C12N9/42GK101654670SQ200910091969
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月2日 優(yōu)先權日2009年9月2日
發(fā)明者尚海濤, 剛 崔, 李榮杰 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司