專利名稱：高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的兩步法制備技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的兩步法制備技術(shù)，是 以酪蛋白為原料，枯草桿菌堿性蛋白酶為催化劑，通過酪蛋白的酶促水解，制備出酪蛋白 ACE抑制肽，酪蛋白ACE抑制肽再次利用枯草桿菌堿性蛋白酶為催化劑進行處理，從而制備 出高活性酪蛋白ACE抑制肽。本發(fā)明方法制備的高活性酪蛋白ACE抑制肽，可以作為配料 應(yīng)用于保健食品的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
高血壓不僅發(fā)病率高，而且可以誘發(fā)心肌梗塞、腦萃中等，嚴重時會危及生命。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)是一種二肽羧肽酶，在人的生理過程中，它通過將血管緊張素I轉(zhuǎn)化 為有強收縮血管功能的血管緊張素II，或?qū)⒂醒苁鎻堊饔玫氖婢徏る霓D(zhuǎn)變?yōu)闊o活力的緩 釋肽，從而使血壓升高。ACE抑制肽可以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的活性，減少血管緊張素II 的生成和舒緩激肽的破壞，從而可以達到抑制血壓升高、降血壓的目的。食品蛋白源ACE抑 制肽安全性高、易吸收，在保健食品的開發(fā)和應(yīng)用方面具有廣闊的前景和潛力。利用食品蛋白質(zhì)直接制備ACE抑制肽的方法有很多。利用蛋白酶酶促水解食品蛋 白質(zhì)生產(chǎn)ACE抑制肽，具有安全性高、能在溫和的條件下進行定位水解產(chǎn)生特定的肽分子、 水解過程易控制、便于工業(yè)化生產(chǎn)等諸多優(yōu)勢，成為ACE抑制肽制備的主流技術(shù)，但是也存 在著抑制肽的活性不高、需要提取和純化等不足。本發(fā)明是以酪蛋白為原料，以枯草桿菌堿 性蛋白酶為催化劑，通過水解酪蛋白制備出酪蛋白ACE抑制肽，酪蛋白ACE抑制肽經(jīng)過枯草 桿菌堿性蛋白酶的再次處理后，制備出高活性酪蛋白ACE抑制肽。此高活性酪蛋白ACE抑 制肽可以作為配料應(yīng)用于保健食品的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用酪蛋白為原料，第一步通過枯草桿菌堿性蛋白酶催化酪蛋 白的水解制備出酪蛋白ACE抑制肽，第二步再次利用枯草桿菌堿性蛋白酶對酪蛋白ACE抑 制肽進行處理，從而兩步法制備出高活性酪蛋白ACE抑制肽。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)第一步，酪蛋白ACE抑制肽的制備方法(1)在80°C 90°C條件下用蒸餾水溶解酪蛋白，每分鐘120轉(zhuǎn)攪拌促使酪蛋白完 全溶解，配制質(zhì)量體積百分比(W/ν)為9% 10%的酪蛋白溶液，然后冷卻至50°C 60°C;(2)用2mol · L^1NaOH溶液把上述的酪蛋白溶液的pH值調(diào)至8. 0 9. 0 ；(3)向上述溶液中加入枯草桿菌堿性蛋白酶，蛋白酶的添加量為每克酪蛋白 9000U 10000U酶活力單位；(4)上述溶液于50°C 60°C下攪拌進行水解，攪拌速度為每分鐘120轉(zhuǎn)；(5)上述溶液進行2小時 12小時水解后，升溫至85°C 95°C并保持15分鐘 25分鐘，然后冷卻至室溫。
(6)每分鐘8000轉(zhuǎn)下離心處理上述溶液20分鐘，分離出上清液；將上清液冷凍干 燥或噴霧干燥，得到酪蛋白ACE抑制肽。冷凍干燥時擱板加熱溫度為20°C，干燥箱壓力降至 6帕 8帕時，取出干燥產(chǎn)品得酪蛋白ACE抑制肽；噴霧干燥時，流量為每小時150千克，進 口溫度為140°C 160°C，出口溫度為70°C 90°C，取出干燥產(chǎn)品得酪蛋白ACE抑制肽。在第一步中，酪蛋白的最佳質(zhì)量體積百分比濃度為10%，枯草桿菌堿性蛋白酶最 佳添加量為每克酪蛋白10000U酶活力單位，PH值最佳為8.5，水解溫度最佳為551，水解 時間最佳為6小時。第二步，高活性酪蛋白ACE抑制肽的制備方法(1)用蒸餾水配制質(zhì)量百分數(shù)(W/W)為30% 40%的酪蛋白ACE抑制肽溶液，同 時加入枯草桿菌堿性蛋白酶，蛋白酶添加量為每克酪蛋白ACE抑制肽5000U 10000U酶活 力單位；(2)上述溶液在10°C 50°C的條件下攪拌處理0. 5小時 9. 5小時，攪拌器轉(zhuǎn)速 為每分鐘120轉(zhuǎn)；(3)上述溶液升溫至85°C 95°C保持20分鐘，然后冷卻至室溫；(4)上述溶液經(jīng)過冷凍干燥或噴霧干燥，得到高活性酪蛋白ACE抑制肽。冷凍干 燥時擱板加熱溫度為20°C，干燥箱壓力降至6帕 8帕時，取出干燥產(chǎn)品得高活性酪蛋白 ACE抑制肽；噴霧干燥時，流量為每小時150千克，進口溫度為140°C 160°C，出口溫度為 70°C 90°C，取出干燥產(chǎn)品得高活性酪蛋白ACE抑制肽。在第二步中，酪蛋白ACE抑制肽的質(zhì)量百分數(shù)濃度最佳為35%，枯草桿菌堿性蛋 白酶最佳添加量為每克酪蛋白ACE抑制肽8000U酶活力單位，酶處理溫度最佳為43°C，酶處 理時間最佳為6小時。本發(fā)明以酪蛋白、草桿菌堿性蛋白酶為基本原料，兩步法制備的高活性酪蛋白ACE 抑制肽最終產(chǎn)品，和利用第一步方法制備出的酪蛋白ACE抑制肽相比，其對血管緊張素轉(zhuǎn) 化酶的抑制活性更高。
具體實施例方式為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例做進一步地詳細說明，但是本發(fā)明要求保護 的范圍并不局限于實施例表示的范圍。實施例1(1)在90°C條件下用蒸餾水溶解酪蛋白，每分鐘120轉(zhuǎn)攪拌促使酪蛋白完全溶解， 配制質(zhì)量體積百分比(W/ν)為10%的酪蛋白溶液，然后冷卻至55°C ；(2)用2mol · L^1NaOH溶液把上述的酪蛋白溶液的pH值調(diào)至8. 5 ；(3)向上述溶液中加入枯草桿菌堿性蛋白酶，蛋白酶的添加量為每克酪蛋白 10000U酶活力單位；(4)上述溶液于55°C下攪拌進行水解，攪拌速度為每分鐘120轉(zhuǎn)；(5)上述溶液進行6小時水解后，升溫至90°C并保持20分鐘，然后冷卻至室溫。(6)每分鐘8000轉(zhuǎn)下離心處理上述溶液20分鐘，分離出上清液；將上清液冷凍干燥或噴霧干燥，得到酪蛋白ACE抑制肽。冷凍干燥時擱板加熱溫度為20°C，干燥箱壓力降至 6帕時，取出干燥產(chǎn)品得酪蛋白ACE抑制肽；噴霧干燥時，流量為每小時150千克，進口溫度為140°C 160°C，出口溫度為70°C 90°C，取出干燥產(chǎn)品得酪蛋白ACE抑制肽。(7)用蒸餾水配制質(zhì)量百分數(shù)(W/W)為35%的酪蛋白ACE抑制肽溶液，同時加入 枯草桿菌堿性蛋白酶，蛋白酶添加量為每克酪蛋白ACE抑制肽8000U酶活力單位；(8)上述溶液在43°C的條件下攪拌處理6小時，攪拌器轉(zhuǎn)速為每分鐘120轉(zhuǎn)；(9)上述溶液升溫至90°C并保持20分鐘，然后冷卻至室溫；(10)上述溶液經(jīng)過冷凍干燥或噴霧干燥，得到高活性酪蛋白ACE抑制肽。冷凍干 燥時擱板加熱溫度為20°C，干燥箱壓力降至6帕 8帕時，取出干燥產(chǎn)品得高活性酪蛋白 ACE抑制肽；噴霧干燥時，流量為每小時150千克，進口溫度為140°C 160°C，出口溫度為 70°C 90°C，取出干燥產(chǎn)品得高活性酪蛋白ACE抑制肽。用Murray等公開發(fā)表的ACE抑制活性測定方法(見Murray ΒΑ, Walsh DJ, FitzGerald RJ. Modification of the furanacryIoy1-L-phenylalany1-glycylglycine assay for determination ofangiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity. Journal of Biochemical and BiophysicalMethods, 2004, 59 (2) : 127-137)，測定本發(fā)明制 備出的高活性酪蛋白ACE抑制肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。高活性酪蛋白ACE抑制肽 在濃度為10μ g · ml；1時對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制率為95. 6%，而第一步方法制備出的 酪蛋白ACE抑制肽在濃度為10 μ g · mL—1時對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制率為20. 6% ；高活 性酪蛋白ACE抑制肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的半抑制濃度為0. 5 μ g · mL—1，而第一步方法制 備出的酪蛋白ACE抑制肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的半抑制濃度為47μ g · mL—1。高活性酪蛋 白ACE抑制肽的活性提高93倍。
權(quán)利要求
高活性酪蛋白ACE抑制肽的兩步法制備技術(shù)，其特征在于利用酪蛋白和枯草桿菌堿性蛋白酶兩步法制備出高活性酪蛋白ACE抑制肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性酪蛋白ACE抑制肽的第一步制備方法，其特征在于(1)在80°C 90°C條件下用蒸餾水溶解酪蛋白，每分鐘120轉(zhuǎn)攪拌促使酪蛋白完全溶 解，配制質(zhì)量體積百分比(W/V)為9% 10%的酪蛋白溶液，然后冷卻至50°C 60°C ；(2)用2mol· L-1NaOH溶液把上述的酪蛋白溶液的pH值調(diào)至8. 0 9. 0 ；(3)向上述溶液中加入枯草桿菌堿性蛋白酶，蛋白酶的添加量為每克酪蛋白9000U 10000U酶活力單位；(4)上述溶液于50°C 60°C下攪拌進行水解，攪拌速度為每分鐘120轉(zhuǎn)；(5)上述溶液進行2小時 12小時水解后，升溫至85°C 95°C并保持15分鐘 25分 鐘，然后冷卻至室溫。(6)每分鐘8000轉(zhuǎn)下離心處理上述溶液20分鐘，分離出上清液；將上清液冷凍干燥或 噴霧干燥，得到酪蛋白ACE抑制肽。冷凍干燥時擱板加熱溫度為20°C，干燥箱壓力降至6 帕 8帕時，取出干燥產(chǎn)品得酪蛋白ACE抑制肽；噴霧干燥時，流量為每小時150千克，進口 溫度為140°C 160°C，出口溫度為70°C 90°C，取出干燥產(chǎn)品得酪蛋白ACE抑制肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高活性酪蛋白ACE抑制肽的第一步制備方法，其特征在于 所述酪蛋白的最佳質(zhì)量體積百分比濃度為10%，枯草桿菌堿性蛋白酶最佳添加量為每克酪 蛋白10000U酶活力單位。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高活性酪蛋白ACE抑制肽的第一步制備方法，其特征在于 所述水解時間最佳為6小時，水解溫度最佳為55°C，pH值最佳為8. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性酪蛋白ACE抑制肽的第二步制備方法，其特征在于(1)用蒸餾水配制質(zhì)量百分數(shù)(W/W)為30% 40%的酪蛋白ACE抑制肽溶液，同時加 入枯草桿菌堿性蛋白酶，蛋白酶添加量為每克酪蛋白ACE抑制肽5000U 10000U酶活力單 位；(2)上述溶液在10°C 50°C的條件下攪拌處理0.5小時 9. 5小時，攪拌器轉(zhuǎn)速為每 分鐘120轉(zhuǎn)；(3)上述溶液升溫至85°C 95°C并保持20分鐘，然后冷卻至室溫；(4)上述溶液經(jīng)過冷凍干燥或噴霧干燥，得到高活性酪蛋白ACE抑制肽。冷凍干燥時 擱板加熱溫度為20°C，干燥箱壓力降至6帕 8帕時，取出干燥產(chǎn)品得高活性酪蛋白ACE抑 制肽；噴霧干燥時，流量為每小時150千克，進口溫度為140°C 160°C，出口溫度為70°C 90°C，取出干燥產(chǎn)品得高活性酪蛋白ACE抑制肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高活性酪蛋白ACE抑制肽的第二步制備方法，其特征在于 所述酪蛋白ACE抑制肽的質(zhì)量百分數(shù)濃度最佳為35%，枯草桿菌堿性蛋白酶最佳添加量為 每克酪蛋白ACE抑制肽8000U酶活力單位。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高活性酪蛋白ACE抑制肽的第二步制備方法，其特征在于 所述酶處理時間最佳為6小時，酶處理溫度最佳為43°C。
全文摘要
本發(fā)明公開的是高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽的兩步法制備技術(shù)。第一步，配制質(zhì)量體積比(W/V)為9％～10％的酪蛋白溶液，調(diào)pH值至8.0～9.0，加入堿性蛋白酶后在50℃～60℃處理2小時～12小時，加熱至85℃～95℃并保持20分鐘，冷卻至室溫后離心，上清液冷凍干燥或噴霧干燥得酪蛋白ACE抑制肽。第二步，配制質(zhì)量百分比(W/W)為30％～40％的酪蛋白ACE抑制肽溶液，加入堿性蛋白酶后在10℃～50℃處理0.5小時～9.5小時，加熱至85℃～95℃并保持20分鐘；溶液冷凍干燥或噴霧干燥得高活性酪蛋白ACE抑制肽。本發(fā)明方法制備的高活性酪蛋白ACE抑制肽可用于保健食品的生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/06GK101824454SQ20091007149
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者李亞云, 趙新淮 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學