專利名稱：一種多順反子表達載體構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及表達載體的構建方法，特別涉及一種多順反子表達載體的構建 方法。
背景技術：
通常蛋白質的表達方法是將待克隆的目的基因與載體連接，將該重組子轉 化到受體菌中，篩選鑒定正確的克隆進行擴增，再將其轉入宿主細胞中表達。 這是目前蛋白質表達研宄中運用最多的方法，但表達量低一直是蛋白質表達研 究的一個瓶頸問題。為提高表達量，科學家采取了不同的改進措施，如串聯(lián)表
達(Dai， etal.MarBiotechnol,DOI 10.1007/sl0126-008-9125-6)和多順反子表 達(楊利軍，等.中國生物工程雜志，2006,26 11 :45 47)等。在上述構建表 達載體的方法中，需要合成的引物多，要求PCR擴增的次數多，涉及的限制性 內切酶多，涉及的實驗步驟多，繁瑣費時。另外，采用串聯(lián)表達，表達產物多 以多聚體形式存在。如果表達產物為藥用蛋白質，可能會妨礙蛋白質在體內的 運輸，或多聚體形式影響蛋白質功能的發(fā)揮。因此，從目的蛋白功能發(fā)揮方面 考慮，不如多順反子表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在克服現有技術存在的上述缺陷。提供一種生產成本低， 操作簡便快捷的多順反子表達載體構建方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現的本發(fā)明的多順反子表達載體構 建方法，是利用T-載體作為中間載體，設計兩對引物，在引物中引入iW^1和
酶切位點及核糖體結合位點(RBS)，以含目的基因的DNA為模板，進行 PCR擴增，擴增產物重組到T-載體上，將得到的重組T-載體用iV^I+Mel、i^d+S/^I雙酶切，所得DNA片段用DNA連接酶連接，就能使單個異源基因 以2n-l (n為上一步重組T-載體含目的基因個數)的方式在T-載體上遞增；最 后將含多個異源基因的DNA片段，通過對應于其兩端酶切位點的限制性內切酶 切下，亞克隆到表達載體啟動子下游，即可得到多順反子表達載體。 其構建方法的具體步驟如下
1)設計引物(在設計引物時，引入MeI和Spd兩種限制性內切酶位點。 利用兩種限制性內切酶是同尾酶的特點，經A^el和酶切的DNA片段可以 用DNA連接酶連接，連接后的DNA片段，兩種限制性內切酶的酶切位點消失， 以利于后續(xù)Mel和5^1酶切操作。)
a、 根據待擴增的目的基因序列，設計兩對引物，在第一對引物的下游引物 P!下5'端引入i^el酶切位點，在第二對引物的上游引物P2上5'端引入M^1 酶切位點，在第二對引物的下游引物Pa 5'端引入S/7d酶切位點；
b、 根據T-載體和表達載體多克隆位點結構特點，在引物中引入亞克隆用酶 切位點；
為便于亞克隆到表達載體中，可以在第一對引物的上游引物P^5'端引入
合適的酶切位點，在第二對引物的下游引物P2T的S/7dt酶切位點5'端引入另
一個合適的酶切位點，如果選用T-載體多克隆位點處的限制性內切酶位點進行 亞克隆操作，就不必在引物中另外引入限制性內切酶位點；
c、 根據表達載體的特點，在引物中引入起始密碼子、終止密碼子的反義密 碼子和核糖體結合位點(RBS)或RBS的互補序列；
如果表達載體是分泌表達載體，由于載體啟動子下游存在信號肽序列，設 計的上游引物中不用引入起始密碼子，下游引物中酶切位點3'端與目的基因 的互補序列5'端之間需引入終止密碼子的反義密碼子，同時第二對引物的上 游引物A^el酶切位點3'端與目的基因序列5'端之間需引入核糖體結合位點 和信號肽序列；
如果表達載體不是分泌型表達載體，且亞克隆時，酶切位點處可產生起始 密碼子，如AWeI酶切位點，則第一對引物的上游引物不用引入起始密碼子，第
一對引物的下游引物需在Md酶切位點3'端和目的基因互補序列5'端之間依次引入1 6個任意額外堿基，核糖體結合位點的互補序列和終止密碼子的反 義密碼子序列；在第二對引物的上游引物iV/^I酶切位點3'端與目的基因序列 5'端之間引入起始密碼子，第二對引物的下游引物S/^I酶切位點3'端與目的 基因的互補序列5'端之間引入終止密碼子的反義密碼子。
如果表達載體不是分泌表達載體，且亞克隆時，酶切位點處不能產生起始 密碼子，則在兩對引物的上游引物酶切位點3'端與目的基因序列5'端之間需 引入起始密碼子，下游引物緊鄰目的基因的互補序列5'端引入終止密碼子的 反義密碼子，同時在第一對引物的下游引物中，需在Md酶切位點3'端和終 止密碼子的反義密碼子序列5'端之間依次引入1 6個任意額外堿基和核糖體 結合位點的互補序列；
2) 分別以含目的基因的DNA為模板，用上述兩對引物和DNA聚合酶進 行PCR擴增，得到擴增產物；
3) T-載體是一個廣泛使用的便于亞克隆操作的商品化載體，是一個具有T 粘性末端的線性載體，可與具有A末端的PCR產物連接，通過對應于目的基因 兩側酶切位點的限制性內切酶切割，可直接亞克隆到其他載體上。
將擴增產物與商品化的T-載體混合，按照T-載體使用說明書上介紹的方法 進行操作，通過轉化子菌落顏色，篩選出菌落呈白色的陽性克隆，提取質粒， 測序或酶切鑒定陽性重組子，得到含1個目的基因的重組T-載體；
4) 在T-載體185bp處(不在T-載體的多克隆位點)有一個7N^fel酶切位點。 將步驟3)得到的兩種含1個目的基因的重組T-載體，用Md和AWd酶切， 分別回收重組載體片段和目的基因片段,用DNA連接酶連接，轉化克隆宿主菌， 提取轉化子質粒，測序或酶切鑒定陽性重組子，得到含有2個目的基因的重組 T-載體；
5) 將步驟4)得到的含2個目的基因的重組T-載體，分別用Mfel+Spel和 iV^HW/^I進行酶切，分別回收重組載體片段和目的基因片段，用DNA連接酶 連接，轉化克隆宿主菌，提取轉化子質粒，測序或酶切鑒定陽性重組子，得到 含有3個目的基因的重組T-載體；
6) 將步驟5)得到的含3個目的基因的重組T-載體，分別用A^M+S; d和MfePHW/el進行酶切，分別回收重組載體片段和目的基因片段，用DNA連接酶 連接，轉化克隆宿主菌，提取轉化子質粒，測序或酶切鑒定陽性重組子，得到 含有5個目的基因的重組T-載體；
7) 按上述步驟6)進行操作，可得到含2n-l個目的基因的重組T-載體，其 中n為前一步目的基因的個數；
8) 將得到的含2n-l個目的基因的重組T-載體，用對應于其兩側酶切位點 的限制性內切酶切割，回收含2n-l個目的基因的DNA片段，與用相應限制性 內切酶切割的表達載體相連，得到多順反子表達載體，轉化表達宿主菌，進行 表達。
在本發(fā)明中，A7^I和^el為同尾酶。
引物中引入核糖體結合位點，及核糖體結合位點(RBS)與起始密碼子之 間7-12個堿基，以使第2至第2n-l個目的基因上游7-12個堿基處有RBS。(即 引入核糖體結合位點(RBS)， RBS與6個堿基的A^I酶切位點之間引入1 6 個額外堿基，或RBS與信號肽序列，以保證第2至第2n-l個目的基因上游7-12 個堿基處有RBS)
步驟3)用T-載體作為中間介導載體；
步驟4)、 5)、 6)和7)利用了T-載體上多克隆位點外的一個限制性內切酶 位點AWel酶切位點。
步驟5)、 6)和7)利用了同尾酶的特點，使T-重組載體經和Spel酶 切后產生的粘性末端可以互補，連接后酶切位點消失。
步驟8)利用T-載體多克隆位點或引入的酶切位點，可以將多拷貝的目的 基因亞克隆到表達載體上。
本發(fā)明所加入的DNA連接酶為T4 DNA連接酶。
本發(fā)明提供的構建多順反子表達載體的方法具有以下特點
1) 適用基因范圍廣。既適用于原核基因，也適用于真核基因cDNA序列。
2) 用的限制性內切酶種類少。利用現有技術構建一個多順反子表達載體， 需要2n種限制性內切酶(n為順反子個數)；而利用本方法，不管順反子個數 是多少，構建一個多順反子表達載體，僅用5種限制性內切酶。3) 設計引物少。利用現有技術構建一個多順反子表達載體，需要n對引物 (n為順反子個數)；而利用本方法，不管順反子個數是多少，構建一個多順反
子表達載體，僅需要兩對引物。
4) 操作步驟少。如構建1個9順反子表達載體，利用現有技術，需要9次 PCR反應，9次酶切連接；而利用本方法，僅需要2次PCR反應，5次酶切連 接。順反子個數越多，該發(fā)明可簡化操作步驟的優(yōu)點越能得到體現。
5) 多順反子個數不受限制。利用現有技術構建多順反子表達載體，多順反 子個數受表達載體MCS處限制性內切酶位點的個數限制；而利用本方法，多順 反子個數不受限制。


圖1為多順反子表達載體構建示意圖。
圖2為實施例1 PCR擴增示意圖
圖3為實施例1構建重組T-載體示意圖
圖4為實施例1構建多順反子表達載體示意圖
圖5為實施例2 PCR擴增示意圖
圖6為實施例2構建重組T-載體示意圖
圖7為實施例2構建多順反子表達載體示意圖
具體實施例方式
本發(fā)明以下結合(附圖)實施例作進一步描述，但并不限制本發(fā)明。 具體實施例1
利用三順反子表達載體在枯草芽孢桿菌中分泌表達嗜鉻粒蛋白A (CGA) 抗真菌衍生肽CGA-N46。
以下所述步驟中所使用的限制性內切酶均購自NEB公司，引物由上海生工 生物工程有限公司合成，T-載體pMD18-T為TAKARA公司產品，DNA測序由 上海英駿生物技術有限公司完成。 (1)兩對引物的合成由于實施實例使用的T-載體pMD18-T有多克隆位點(MCS)，表達載體 pSBPTQ (李瑞芳，等.微生物學報，2006， 46 (5): 714-719.)是發(fā)明人構建的 枯草芽孢桿菌分泌表達載體，載體上有枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因GacB) 啟動子和信號肽序列，啟動子下游的MCS處的限制性內切酶位點與pMD18-T 上MCS處的限制性內切酶位點順序相反。為便于亞克隆，第一對引物根據 cga-iW6基因序列(Genbank編號GQ169789)設計，第二對引物的上游引物 P2上根據枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因啟動子序列(王紅革，等.微生物學報， 1997， 37 (2): 101-106)中核糖體結合位點(RBS)序列設計，下游引物P2下 根據c^-A^基因序列設計，并引入i^wl酶切位點。
Pi上5' ccc a(g c" gfc agc aag 3'
P i下5 'gpj^gp.幽難啤妙c" etc 3'
P2上5 'gp紹gp. ccg cto aca cag to afa 3'
P2下5 'g趙鄉(xiāng)aetagt幽難難啤妙c" "c 3'
下劃線".__—一"表示引入的酶切位點，下劃線".........."表示引入的i^"I
酶切位點，下劃線"—"表示引入的S羅I酶切位點，下劃線"—"表示引入的 終止密碼子UAA的反義密碼子，斜體字母表示目的基因序列；
考慮到將要用到的表達載體是分泌型枯草芽孢桿菌表達載體，載體上具有 s^B;w，因此，Pi上中不用引入起始密碼子，P^引入終止密碼子，P2上根據sac 5基因RBS序列設計，P2下引入終止密碼子UAA的反義密碼子。
(2) PCR擴增參照圖2，以含s"c5戸和cga-A^6基因的pSC31-76質 粒(李瑞芳，等.中山大學學報，2006， 45 (2): 64-67)為模板，第一對引物合 成出148bp的cga-A^基因片段；第二對引物合成出大約300bp的sac5 s-c^-AW基因片段。
(3) 含l個cr^r-JW6基因重組T-載體的構建參照圖3，將PCR產物回收 后，分別與pMD18-T連接，按使用說明書進行操作，轉化大腸桿菌DH5a后， 涂布含X-gal的LB平板，通過轉化子呈現的藍白顏色篩選，白斑為陽性轉化子。 提取質粒，測序正確。得到含c^^W6基因片段的重組T-載體和含sac5 ^g"W"基因片段的重組T-載體，分別命名為pT-N46和pT-SN46(4) 含2個cga-iW6基因重組T-載體的構建參照圖3，用M^I+iV。fel雙 酶切pT-N46得到2602bpDNA片段，用iV/zel+AWel雙酶切pT-SN46得到 545bpDNA片段，兩個DNA片段以1: 3的摩爾比于16'C連接過夜，轉化大腸 桿菌DH5a。轉化子質粒經酶切鑒定，得到含2個cga-^^基因重組T-載體， 命名為pT-N46-SN46。
(5) 含3個cga-iW6基因重組T-載體的構建參照圖3，用i^el+S/^I雙 酶切pT-N46-SN46得到3147bpDNA片段，用JV^I+Mzel雙酶切pT-N46-SN46 得到545bpDNA片段，兩個DNA片段以1: 3的摩爾比于16'C連接過夜，轉化 大腸桿菌DH5cu轉化子質粒經酶切鑒定，得到含3個cga-i^6基因重組T-載 體，命名為pT-N46-2SN46。
(6) c^z-i^6基因多順反子枯草芽孢桿菌分泌型表達載體的構建參照圖 4，將構建好的pT-N46、 pT-N46-SN46和pT-N46-2SN46用AT/wI和力dt雙酶切 后，與經同樣雙酶切的質粒pSBPTQ連接，轉化大腸桿菌DH5a。轉化子質粒 經酶切鑒定，分別得到c^"-iW6基因單順反子、二順反子和三順反子枯草芽孢 桿菌分泌型表達載體pSBPTQ-N46、 pSBPTQ-2N46和pSBPTQ-3N46。
(7) cg"-iW6基因多順反子枯草芽孢桿菌工程菌的構建將構建好的 pSBPTQ-N46、 pSBPTQ-2N46和pSBPTQ-3N46轉化枯草芽孢桿菌DB1342，成 功構建了三株cga-iV￥6異源表達工程菌。
(8) 由于cga-i^6基因在載體中處在sacB基因啟動子下，因此采用使宿 主菌生長至一定數量，再使用蔗糖誘導表達的策略。將三株抗菌肽異源表達菌 株37。C搖床培養(yǎng)3小時，至OD6o。約為0.4 0.6時，加入終濃度為2%的蔗糖 誘導，繼續(xù)培養(yǎng)24h, SDS-PAGE檢測及Western印跡分析，在5kD左右檢測到 目的條帶。對三株抗菌肽異源表達菌株表達量進行比較，發(fā)現目的蛋白 CGA-N46的表達量分別為5mg/L， 9 mg/L和13 mg/L，說明多順反子表達可以 有效提高異源蛋白表達量。
具體實施例2
利用三順反子表達載體在大腸桿菌中表達鈣網蛋白(CRT)衍生的抗癌多肽CRT-N58
以下所述步驟中所使用的限制性內切酶均購自NEB公司，引物由上海生工 生物工程有限公司合成，T-載體pMD18-T為TAKARA公司產品，DNA測序由 上海英駿生物技術有限公司完成。
(1) 兩對引物的合成
實施實例使用的T-載體pMD18-T有多克隆位點(MCS)，表達載體為商品 化pET-3c， pET-3c為大腸桿菌表達載體，載體上僅有T7/"cr啟動子，不能分泌 表達外源蛋白。第一對引物根據CRTcDNA設計，其上游引物5'端引入起始 密碼子atg，下游引物M^I位點3'端和目的基因互補序列5'端之間依次引入 1個額外堿基a、大腸桿菌核糖體結合位點aggagg的互補序列cctcct和終止密碼 子UAA的反義密碼子序列TTA;第二對引物的上游引物Pu和下游引物Ph根 據CRTcDNA序列設計，其上游引物5'端引入位點和起始密碼子atg， 下游引物P2t5'端引入引入5amHI酶切位點、S/7dt酶切位點、終止密碼子UAA 的反義密碼子序列TTA。
P！上5'幽cgc gac fca toc 3'
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P2下5 'gg幽p actagt幽g gfc敏鄉(xiāng)aaf cag 3'
下劃線"—"表示引入的起始密碼子和終止密碼子UAA的反義密碼子，下 劃線"_____"表示引入的^^1酶切位點，下劃線"_"表示引入的附加堿基，下
劃線"_"表示引入的RBS位點，下劃線".........."表示引入的&mHI酶切位點，
下劃線"—"表示引入的酶切位點，斜體字母表示目的基因序列；
(2) PCR擴增參照圖5，以CRTcDNA為模板，第一對引物合成出194bp 的DNA片段；第二對引物合成出大約198bp的DNA片段。
(3) 含l個crf-iV5S基因重組T-載體的構建參照圖6，將PCR產物回收 后，分別與pMD18-T連接，按使用說明書進行操作，轉化大腸桿菌DH5a后， 涂布含X-gal的LB平板，通過轉化子呈現的藍白顏色篩選，白斑為陽性轉化子。 提取質粒，測序正確。得到含crt-iV5S基因片段與RBS序列的重組T-載體和含cW-WS基因片段的重組T-載體，分別命名為pT-N58R和pT-N58
(4) 含2個cW-iV5S基因重組T-載體的構建參照圖6，用Mzel+A^I雙 酶切pT-N58R得到2648bpDNA片段，用iWzel+iVafel雙酶切pT-N58得到 436bpDNA片段，兩個DNA片段以1: 3的摩爾比于16。C連接過夜，轉化大腸 桿菌DH5cu轉化子質粒經酶切鑒定，得到含2個crf-iV5S基因重組T-載體，命 名為pT-2N58。
(5) 含3個cW-WS基因重組T-載體的構建參照圖6，用i^M+S; el雙 酶切pT-2N58得到2834bpDNA片段，用A^fel+Mzel雙酶切pT-2N58得到 436bpDNA片段，兩個DNA片段以1: 3的摩爾比于16'C連接過夜，轉化大腸 桿菌DH5a。轉化子質粒經酶切鑒定，得到含3個c^-A^S基因重組T-載體，命 名為pT-3N58。
(6) c^-iV5S基因多順反子大腸桿菌表達載體的構建參照圖7，將構建好 的pT-N58、 pT-2N58和pT-3N58用力al和BamH I雙酶切后，與經同樣雙酶切 的質粒pET-3c連接，轉化大腸桿菌DH5a。轉化子質粒經酶切鑒定，分別得到 cW-iV5S基因單順反子、二順反子和三順反子大腸桿菌表達載體pET-N58、 pET-2N58和pET-3N58。
(7) crW-iV5S基因多順反子大腸桿菌工程菌的構建將構建好的pET-N58、 pET-2N58和pET-3N58轉化大腸桿菌BL21(DE3)，成功構建了三株cW-W5S異 源表達工程菌。
(8) 由于crf-iV5S基因在載體中處在/"c啟動子下，因此采用使宿主菌生 長至一定數量，再使用IPTG誘導表達的策略。將三株抗癌多肽異源表達菌株 37°C搖床培養(yǎng)至OD6。o約為0.4 0.6時，加入終濃度為0.4mmol/LIPTG誘導， 繼續(xù)培養(yǎng)6h, SDS-PAGE檢測及Western印跡分析，在6.2kD左右檢測到目的 條帶。對三株抗癌多肽異源表達菌株表達量進行比較，發(fā)現CRT-N58在總蛋白 中的百分含量分別為20.6%， 35.4%和53.1%,說明多順反子表達可以有效提高 異源蛋白表達量。
權利要求
1、一種多順反子表達載體構建方法，其特征在于利用T-載體作為中間載體，設計兩對引物，在引物中引入NheI和SpeI酶切位點及核糖體結合位點(RBS)，以含目的基因的DNA為模板，進行PCR擴增，擴增產物重組到T-載體上，將得到的重組T-載體用NdeI+NheI、NdeI+SpeI雙酶切，所得DNA片段用DNA連接酶連接，就能使單個異源基因以2n-1(n為上一步重組T-載體含目的基因個數)的方式在T-載體上遞增；最后將含多個異源基因的DNA片段，通過對應于其兩端酶切位點的限制性內切酶切下，亞克隆到表達載體啟動子下游，即可得到多順反子表達載體。
2、 按權利要求1所述的多順反子表達載體構建方法，其特征在于該構 建方法的具體步驟如下1) 設計引物a、 根據待擴增的目的基因序列，設計兩對引物，在第一對引物的下游引物 P,下5'端引入滿61酶切位點，在第二對引物的上游引物P2上5'端引入Md酶切位點，在第二對引物的下游引物P2T 5'端引入S/7d酶切位點；b、 根據T-載體和表達載體多克隆位點結構特點，在引物中引入亞克隆用酶 切位點；c、 根據表達載體的特點，在引物中引入起始密碼子、終止密碼子的反義密 碼子和核糖體結合位點；2) 分別以含目的基因的DNA為模板，用上述兩對引物和DNA聚合酶進 行PCR擴增，得到擴增產物；3) 將擴增產物與商品化的T-載體混合，按照T-載體使用說明書上介紹的方 法進行操作，通過轉化子菌落顏色，篩選出菌落呈白色的陽性克隆，提取質粒， 測序或酶切鑒定陽性重組子，得到含1個目的基因的重組T-載體；4) 將步驟3)得到的兩種含l個目的基因的重組T-載體，用Mel和iV^el 酶切，分別回收重組載體片段和目的基因片段，用DNA連接酶連接，轉化克隆 宿主菌，提取轉化子質粒，測序或酶切鑒定陽性重組子，得到含有2個目的基因的重組T-載體；5) 將步驟4)得到的含2個目的基因的重組T-載體，分別用iV^I+S/^I和 W&I+M^進行酶切，分別回收重組載體片段和目的基因片段，用DNA連接酶 連接，轉化克隆宿主菌，提取轉化子質粒，測序或酶切鑒定陽性重組子，得到 含有3個目的基因的重組T-載體；6) 將步驟5)得到的含3個目的基因的重組T-載體，分別用A^I+S/7d和 A^fel+Mid進行酶切，分別回收重組載體片段和目的基因片段，用DNA連接酶 連接，轉化克隆宿主菌，提取轉化子質粒，測序或酶切鑒定陽性重組子，得到 含有5個目的基因的重組T-載體；7) 按上述步驟6)進行操作，可得到含2n-l個目的基因的重組T-載體，其 中n為前一步目的基因的個數；8) 將得到的含2n-l個目的基因的重組T-載體，用對應于其兩側酶切位點 的限制性內切酶切割，回收含2n-l個目的基因的DNA片段，與用相應限制性 內切酶切割的表達載體相連，得到多順反子表達載體，轉化表達宿主菌，進行 表達。
3、 按權利要求2所述的多順反子表達載體構建方法，其特征為？WzeI和 5^el為同尾酶。
4、 按權利要求2所述的多順反子表達載體構建方法，其特征為引物中引 入核糖體結合位點，及核糖體結合位點(RBS)與其下游起始密碼子之間7-12 個堿基以使第2至第2n-l個目的基因上游7-12個堿基處有RBS。
5、 按權利要求2所述的多順反子表達載體構建方法，其特征為步驟3) 用T-載體作為中間介導載體；
6、 按權利要求2所述的多順反子表達載體構建方法，其特征為步驟4)、5) 、 6)和7)利用了T-載體上多克隆位點外的一個限制性內切酶位點MfeI酶 切位點。
7、 按權利要求2所述的多順反子表達載體構建方法，其特征為步驟5)、6) 和7)利用了同尾酶的特點，使T-重組載體經A7^I和S;^I酶切后產生的粘 性末端可以互補，連接后酶切位點消失。
8、 按權利要求2所述的多順反子表達載體的構建方法，其特征為步驟8) 利用T-載體多克隆位點或引入的酶切位點，可以將多拷貝的目的基因亞克隆到 表達載體上。
9、 按權利要求2所述的多順反子表達載體的構建方法，其特征為步驟4)、 5)、 6)中所加入的DNA連接酶為T4DNA連接酶。
全文摘要
一種多順反子表達載體構建方法，利用商品化T-載體作為中間載體，設計兩對引物，在引物中引入NheI和SpeI酶切位點及核糖體結合位點(RBS)，將擴增產物與T-載體相連，所得重組T-載體用NdeI+NheI、NdeI+SpeI雙酶切，得到的DNA片段用DNA連接酶連接，就能使單個異源基因以2n-1(n為上一步重組T-載體含目的基因個數)的方式在T-載體上遞增。最后將含多個異源基因的DNA片段，通過對應于其兩端酶切位點的限制性內切酶切下，亞克隆到表達載體啟動子下游，即可得到多順反子表達載體。本發(fā)明操作簡單，適用范圍廣，適用于所有蛋白，特別是小肽的表達。構建的表達載體可直接轉化原核宿主細胞，可為解決蛋白質原核基因工程表達中表達量低的瓶頸問題提供技術平臺。
文檔編號C12R1/125GK101608187SQ20091006546
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月20日 優(yōu)先權日2009年7月20日
發(fā)明者李瑞芳, 薛雯雯 申請人:河南工業(yè)大學