專利名稱：：利用水稻基因OsNHAD提高植物的耐鹽性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水稻基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠提高鹽脅迫耐受能力的水稻feAM4Z基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應(yīng)用。所述的基因0sAK4Z與植物對非生物逆境的抗性相關(guān)。將該基因的完整翻譯區(qū)(Codingsequence)與花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV35S)結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的耐受性顯著提高。
背景技術(shù)：
：植物的生長除了有其固有的遺傳基礎(chǔ)外，往往還會受到諸多環(huán)境因素的影響。干旱、高鹽、低溫是最為常見的非生物逆境，嚴重影響了植物的生長，限制了植物的分布。非生物逆境會造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，培育抗逆性作物品種一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標之一。為了適應(yīng)或抵御這些逆境條件，植物在經(jīng)過長期的生物馴化之后，形成了一套防御干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫的自我保護機制。干旱、高鹽和低溫脅迫，都破壞了植物細胞的離子平衡，致使細胞脫水，使植物細胞受到離子和水分脅迫，引起植物體在基因表達，新陳代謝以及形態(tài)上的變化，這些變化包括一些基因表達升高或降低，生長的減緩甚至停止，體內(nèi)激素(如ABA)的瞬時上升，體內(nèi)調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)的聚集等(SekiM，UmezawaT，UranoK，ShinozakiK.Regulatorymetabolicnetworksindroughtstressresponses.Cwrr加'/7/Va;3t^'o力2007,10:296-302)。植物在受到逆境脅迫后，經(jīng)過一系列的信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，啟動下游大量抗逆基因的表達。下游抗逆基因的編碼產(chǎn)物主要是一些在植物抗逆反應(yīng)中直接起保護作用的蛋白質(zhì)，包括保護細胞免受水分脅迫傷害的功能蛋白、合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的關(guān)鍵酶類、清除活性氧KOS的酶類等。這類蛋白能提高植物對逆境的耐受性，如伴侶蛋白、LEA蛋白、抗凍蛋白、通道蛋白、抗氧化蛋白等(ValliyodanB,NguyenHT.Understandingregulatorynetworksandengineeringforenhanceddroughttoleranceinplants.CwxQw'/j/Va/^&'o/，2006，9:189-195)。這些功能蛋白在植物對逆境的應(yīng)答過程中起著非常重要的作用。因此分離和鑒定這些抗逆功能基因，并用于作物抗逆的遺傳改良有著重要的意義。根據(jù)對已有的模式植物的研究，人們已在植物抗性改良方面作了嘗試。例如LEA蛋白具有高度的親水性，使植物能夠在缺水條件下，保持膜系統(tǒng)及生物大分子免受破壞。將大麥的LEA蛋白基因^^轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性和耐鹽性均比對照有明顯提高；且抗性強弱明顯與LEA蛋白的含量相關(guān)(XuD，DuanX,WangB，HongB,HoT,VfuR.ExpressionofaLateErabryogenesisAbundantProteinGene,HVA1,fromBarleyConfersTolerancetoWaterDeficitandSaltStressinTransgenicRice.戶Ja/7f1996，110:249-257)。擬南芥的鈉氫離子交換蛋白基因^艦W不僅在擬南芥中表達能提高植株的抗鹽性(ShiH,ZhuJK.RegulationofexpressionofthevacuolarNa+/H+抑tiportergeneAtNMlbysaltstressandabscisicacid./V朋tifo/fo'W，2002,50:543-550),將其轉(zhuǎn)化番茄，轉(zhuǎn)基因植株抗鹽性也明顯提高(ZhangHX，BlunwaldE.Transgenicsalt-toleranttomatoplantsaccumulatesaltinfoliagebutnotinfruit,〃at^-otec力加7，2001，19:765-768)。水稻(arza是最重要的糧食作物之一，培育抗逆水稻新品種具有重要的意義。在我們的前期研究中分離到一條受多種逆境誘導(dǎo)的cDNA，序列分析表明它與細菌的NHAD蛋白有一定的相似性。細菌的NHAD蛋白可以通過對鈉氫離子的運輸，提高轉(zhuǎn)基因細菌對高鹽等逆境的抗性(HabibianR，DziobaJ，BarrettJ,GalperinMY,LoewenPC,DibrovP.FunctionalanalysisofconservedpolarresiduesinVc-NhaD，Na7H'antiporterofVibriocholerae./歷o7C力棚，2005,280:39637-39643)。但植物中NHAD蛋白超量表達能否提髙植物的抗逆性尚無報道。因此，從水稻中分離出AM4Z)同源基因，并鑒定它在提高水稻抗逆性方面所發(fā)揮的功能，對于培育抗逆水稻新品種將具有非常重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個包含該功能蛋白同源基因完整編碼區(qū)段的DNA片段(在本發(fā)明中所述"DNA片段"與"核苷酸序列"同義，下同)，利用這個基因提高水稻對鹽脅迫耐受能力，應(yīng)用該基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應(yīng)用。對這個基因編碼的蛋白序列進行分析表明它與細菌的冊八0(%+/11+antiporterDtype)蛋白有一定的相似性，因此被命名為OsNHAD基因。本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含flsAK^基因的DNA片段，該片段賦予植物在逆境條件下抗性增強的能力。其中，所述的0sNHAD基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO:1中第60-1649位所示的DNA序列；或2)編碼與l)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列?？梢圆捎靡呀?jīng)克隆的OsAffi^基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基閔。同樣，也可以采用PCR(polymerasechainreaction)技術(shù)，從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的GsyW朋基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含0/ffi^基因的序列，將這一序列與任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達的載體連接后轉(zhuǎn)化植物，可獲得抗逆性增強的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，可以在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。攜帶有本發(fā)明&^\^必基因的表達載體可通過使用11質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細胞(Weissbach,1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463;GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition)。可使用包括本發(fā)明的tts鵬4"基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗旱，抗鹽或抗寒的植物品種。本發(fā)明基因是受逆境誘導(dǎo)表達的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的逆境誘導(dǎo)啟動子結(jié)合后連入合適的表達載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在逆境條件下可誘導(dǎo)表達基因，提高植物對非生物逆境的抗性。4下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。序列表SEQIDNO:1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有foAK仏基因編碼區(qū)的核昔酸序列。圖1:采用ClustalW軟件(公開使用軟件)將fl5腳5基因預(yù)測的蛋白序列與NHAD同源蛋白序列進行比對的結(jié)果。圖中0s:gi115477946,Sequencesource:0ryzasativa水稻；Zm:gi195611882,Sequencesource:Zeamays玉米Atl:gi18402254,Sequencesource:Arabidopsisthaliana擬南芥At2:gi15222822,Sequencesource:Arabidopsisthaliana擬南芥；Mc:gi150247011，Sequencesource:Mesembryanthe咖mcrystallin咖冰葉日中花；Bj.'gi27378850，Sequencesource:Bradyrhizobiumjaponic咖大豆根瘤菌.圖2:本發(fā)明的超量表達載體pCB2004H-0s朋AD的構(gòu)建示意圖。將fls/W必全長基因經(jīng)重組反應(yīng)插入CaMV35S啟動子后。圖3:用Real-timePCR檢測fl7W7朋基因在水稻不同組織中的表達水平。10個組織或器官依次是1.愈傷組織；2.種子；3.發(fā)芽3天的幼苗；4.三葉期的葉片和根；5.劍葉；6.莖；7.短于5Cm的幼穗；8.抽出的穗；9.穎殼；10.胚乳。各組織/器官的fl7W力"基因相對表達量以愈傷組織為參照(即設(shè)定為1)。圖4(包含圖4a，圖4b，圖4c和圖4d):用Real-timePCR檢測fcAKW在多種逆境(干旱、高鹽、低溫、脫落酸即ABA等)脅迫后的表達量變化。flaWJ"基因相對表達量以處理前為參照(即設(shè)定為l)。圖5:正常生長和200mmol/L高鹽脅迫下，5個ttM^)超量表達轉(zhuǎn)基因水稻家系(TO和對照生長狀況的比較。具體實施例方式以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆包含有fls，遮因完整編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗證ttsTWMZS因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實施例1:分離克隆fls鵬W基因通過水稻品種"中旱5號"(由中國上海農(nóng)科院提供的一個公開使用的一個水稻品種)和"珍汕97"(—個中國普遍推廣應(yīng)用的一個雜交水稻親本)的干旱誘導(dǎo)基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個受干旱誘導(dǎo)上升表達的EST(表達序列簽)，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因fc旭4Z編碼產(chǎn)物與細菌(大豆根瘤菌)蛋白NHAD有7W的同源性(圖1)，通過查找日本水稻全長數(shù)據(jù)庫(http:〃cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所對應(yīng)的cDNA克隆J013023H14，并將其定位于第9染色體BAC克隆AP005787的110206bp-122237bp上。釆用TRIZ0L試劑(購自Invitrogen公司)從干旱脅迫處理的水稻品種"日本晴"(公開報道的一個品種)中提取葉片總RNA(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSII(購自Irwitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)條件為65°C5min，42'C120min，70°C10min。用引物GPF(5，-GGCACTCTCACTCACACGG-3，)和GPR(5'-GGATGGTCCCAATGTMCCC-3，)擴增出flsvW^9基因的全長cDNA(3252bp)。PCK反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3niin;94°C30see,53°C30sec,72'C4min,35個循環(huán)；72'C延伸10rain。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的基因全長cDNA。將該克隆命名為pGEM-OsNHAD。實施例2:fo旭4Z基因超量表達載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好的分析&AK4Z基因的功能，申請人將其在水稻中超量表達。從轉(zhuǎn)基因植株的表型研究該基因的功能。超量表達載體構(gòu)建方法如下首先將實施例1中得到的陽性克隆pGEM-0sNHAD質(zhì)粒(實施例1中得到)用引物ALLF(5'-GGGGACAAGTTTGTACMAAAAGCAGGCTTMTACGACTCACTATAGGG-3')和ALLR(5，-GGGGACCACTTTGTACMGMAGCTCGGTATTTAGGTGACACTATAG-3')，擴增出包含flsV^必全長的DNA片斷，反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性3niin;94'C30sec,50°C30sec,72°C4min，35個循環(huán)；72'C延伸10min。將該片段經(jīng)BP重組反應(yīng)構(gòu)建到pD0NR207載體上(載體購自Invitrogen公司)，操作按Invitrogen公司提供的重組克隆試劑盒說明書進行。然后將pDONR207OsNHAD與pCB2004H載體(公開發(fā)表的超量表達載體,Leieta/-(2007)High-throughputbinaryvectorsforplantgenefunctionanalysis./W朋t扮oJ49:556-567)做LR重組，按Invitrogen公司提供的重組克隆試劑盒說明書(貨號Cat.No.11791-020)進行。最終將ftryW必構(gòu)建到可用于做遺傳轉(zhuǎn)化的超量表達載體pCB2004H上(見圖2)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系將其導(dǎo)入到水稻品種中花11(中國水稻研究所提供的一個公開使用的一個水稻品種)中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系在Hiei等人報道的方法(Hiei等，Efficienttransformationofrice,Qr/^aL，mediatedby々i-ofe"erj'咖andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA,f/朋t/，6:271-282,1994)基礎(chǔ)上改良進行。轉(zhuǎn)化載體共獲得了40株獨立的轉(zhuǎn)基因水稻植株。具體步驟(l)愈傷誘導(dǎo)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0.15《氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(成分見后)；將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25土rC。(2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rC。(3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25土rC。(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(來源于CAMBIA，商用菌株)兩天，培養(yǎng)溫度28'C;將所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基(成分見后)里，28"C搖床上培養(yǎng)2-3小時。(5)農(nóng)桿菌侵染將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0De。。0.8-1.0;將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20'C。(6〉愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400卯m羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸千；轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基(成分見后)上選擇2-3次，每次2周(第一次篩選羧芐青霉素濃度為400ppm,第二次以后為250卯m,潮霉素濃度250ppm)。(7)分化將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(成分見后)上黑暗處培養(yǎng)5-7周；轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26'C。(8)生根剪掉分化時產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26t;。(9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。試劑配方(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-節(jié)基腺嘌呤);CN(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素);KT(Kinetin,激動素);NM(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IM(Indole-3-aceticacid,d引哚乙酸)；2，4_D(2，4-Dichlorophe加xyaceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate,7jC解酪蛋白)'HN(HygromycinB，潮霉素)；DMS0(DimethylSulfoxide,二甲基亞砜)；N6咖x(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(10X)]的配制硝酸鉀(KM)3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2P04)4.0g硫酸銨((NH4)2S04)4.63g硫酸鎂(MgS047ft0)1.85g氯化鈣(CaCl22H20)1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3B03)0.16g硫酸錳(MnS044H20)0.44g硫酸鋅(ZnS047H20)0.15g室溫下溶解并定容至IOOOml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準備800ml雙蒸水并加熱至70。C，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA2H20)3.73克'充分溶解后在70'C水浴中保持2小時，定容至1000ml,4'C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素Bl(ThiamineHC1)0.1g7200910061607.X說明書第6/17頁維生素B6(PyridoxineHC1)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ral，4'C保存?zhèn)溆谩?)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制硝酸銨(NH4N03)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g室溫下溶解并定容至1000ml。6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(IOOX)的配制碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳0.86g鉬酸鈉(Na2Mo042H20)0.025g硫酸銅(CuS045H20)0.0025g室溫下溶解并定容至IOOOml。7)2,4-D貯存液，6-BA貯存液，萘乙酸(NAA)貯存液，吲哚乙酸(IM)貯存液l均為mg/ml。8)葡萄糖貯存液0.5g/ml。9)AS貯存液的配制秤取AS0.392g,DMSO10ml。(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6醒母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA)C存液(100X)10ml維生素貯存液(ioox)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml,分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAJt存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液脯氨酸CH蔗糖Phytsgel100ml10ml10ml10ml2.0ml0.5g0.6g30g3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9,煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6薩母液(IOX)N6mix母液(100X)Fe"EDTA貯存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH蔗糖瓊脂粉(Agarose)12.5ml1.25ml2.5nil2.5ml0.75ml0.15g5g1.75g加蒸餾水至250ral，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe"EDTApt存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH蔗糖瓊脂粉12.5ml1.25ral2.5ml2.5ml0.75ml0.2g5g1.75g加蒸餾水至250inl，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250WAS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe"EDTAIC存液(100X)維生素貯存液(100X)2,4-D貯存液CH蔗糖加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4,萄糖貯存液和IOOWASjt存液。6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAfc存液(100D維生素貯存液(100X)2，4-DIC存液CH蔗糖瓊脂粉加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)N6raix母液(100X)Fe2+EDTAjC存液(100X)維生素貯存液(100X)6-BA!t存液KT貯存液NM!t存液IM貯存液CH5ml0.5ml0.5ml1ml0.2ml0.08g2g分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入lml葡25ml2.5ml2.5ml2.5ml0.625ml0.15g7.5g1.75g封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250WHN和400ppniCN，25ml2.5ral2.5ml2.5ml0.5ml0.5ml50W50Pi0.15g7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml,1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250WHN和200ppmCN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基100ml10ml10ml10ml2ml2ml0.2ml0.2ml1g30g3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并定容至IOOOml,分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。N6咖x母液(10X)N6mix母液(薩)Fe2+EDTA於存液(100X)維生素lt存液(100X)6-BA貯存液KTft存液NAA貯存液IM貯存液CH蔗糖Phytsgel9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)MSmix母液(腿)Fe"EDTAfc存液(100X)維生素貯存液(100X)蔗糖Phytagel50ml5ml5ml5ml30g3g加蒸餾水至900ffll，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pf!值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。實施例3:檢測水稻內(nèi)源te艦4Z基因的表達水平以水稻品種"珍汕97"(&7za紹"raL.ssp.Indica，中國公開推廣的水稻品種)為材料，提取以下IO個不同生長時期的不同組織的RM用Rea-timePCR檢測fls/lS^基因的表達水平。選取的10個組織分別是1.愈傷組織；2.種子；3.發(fā)芽3天的幼苗；4.三葉期的葉片和根；5.劍葉；6.莖；7.短于5cm的幼穗；8.抽出的穗；9.穎殼；10.胚乳?？俁NA采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)提取(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSII(購自Invitrogen公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(方11法根據(jù)Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書)，反應(yīng)條件為65°C5min，42°C120min，70°C10min。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物(5'-GCACMMTCTCCCTCTATCCCT-3'和5，-CACCCTTTCATGACCCCG-3')對ttaW必基因進行特異的PCR擴增(擴增產(chǎn)物長73bp)。同時用引物(AF:5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3'和AR:5'-TGCACMTGGATGGGTCAGA-3')對水稻Actinl基因做特異擴增(擴增產(chǎn)物長76bp)，以作為內(nèi)對照進行定量分析。反應(yīng)條件為95。C5min;95°C10sec,60°C5sec,72°C34sec,40個循環(huán)。反應(yīng)過程中進行熒光檢測實時定量分析。結(jié)果表明OsNHAD基因在所選取的組織中均有一定量的表達，但在葉片和胚乳中的表達量相對較高(見圖3)。我們選用秈稻品種"珍汕97"做為表達譜分析的材料。種子催芽后，在正常生長條件下培養(yǎng)18-20天，至四葉期時進行各種逆境和激素的處理。干旱處理是將幼苗直接從水培液(參考文獻？？)中取出暴露于空氣中，分別在脅迫前、脅迫后1小時、3小時、6小時、12小時、24小時取樣；高鹽脅迫是將幼苗由水培液移入含有200咖ol/LNaCl的水培液中，分別在脅迫前，脅迫至水稻葉片微巻、半巻、全巻，以及復(fù)水后取樣；低溫脅迫是把水稻幼苗放入4'C人工氣候室，分別于脅迫前、脅迫后1小時、6小時、12小時、24小時取樣。激素處理是用100iiM脫落酸(ABA)均勻的噴灑水稻植株表面后，分別在脅迫前、脅迫后30分鐘、3小時、6小時、12小時、24小時取樣。所有的處理和取樣過程都是在持續(xù)光照的條件下進行的。提取葉片的總RNA(Trizol試劑，購自Invitrogen公司)后，按J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黃培堂，王嘉璽等譯，分子克隆實驗指南(第三版)，科學(xué)出版社，2002版有關(guān)實驗操作方法進行RNA轉(zhuǎn)膜，并以O(shè)sNHAD為探針做Northern雜交。結(jié)果表明，Os細Z基因在高鹽、低溫和旭A處理中有非常強的誘導(dǎo)上升表達，在干旱脅迫中也有輕微地上升表達(見圖4)。實施例4:OsNHAD基因超量表達轉(zhuǎn)基因Tl代家系在逆境條件下的生長狀況本實施例選取了5個OsNHAD基因超量表達Tl家系進行了高鹽脅迫實驗。具體步驟如下將超量表達轉(zhuǎn)基因家系水稻種子去殼消毒(75%酒精處理3min，0.15%氯化汞處理30min，無菌水清洗數(shù)次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS基本培養(yǎng)基上發(fā)芽，將野生型水稻對照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS基本培養(yǎng)基上，2-3天后挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子轉(zhuǎn)移到含有0咖ol/L和150mmol/L的NaCl的1/2MS基本培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)室(模仿自然生長條件，光照14個小時，黑暗10個小時)生長10夭后觀察表型和測量植株的株高。每個家系的每種處理株數(shù)不少于30棵植株，實驗設(shè)置3次重復(fù)。結(jié)果表明本發(fā)明克隆的^yVK必基因超量表達的轉(zhuǎn)基因植株的生長在正常條件下與對照沒有明顯的差別，但在逆境脅迫處理后其生長要顯著(t測驗尸<0.01)優(yōu)于對照，說明ttyiK4Z基因的表達可以緩解逆境條件造成的植株生長受阻，增強轉(zhuǎn)基因水稻植物對非生物逆境的抗性(圖5)。盡管OsAK^基因也受低溫和干旱逆境的誘導(dǎo)表達，但在本實施例中的Os鵬4Z基因5個超量表達的轉(zhuǎn)基因T,代家系對低溫和千旱逆境的耐受性沒有顯著地提高，這可能因為fta^K4Z編碼的是一個Na7H+反向運輸?shù)鞍讖亩禺愋詤⑴c對高鹽脅迫的耐受性。<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉利用水稻基因OsNHAD提高植物的耐鹽性<130><141>2009-04-13<勝2<170>Patentlnversion3.1〈210>1<211>3252<212>■<213〉7jC稻(Oryzasativa)<220><221>gene〈222>(1).(3252)<223〉〈220〉<221〉CDS〈222〉(60)..(1649)<223><400>1ggcactctcactcacacggagagagagagagagagagactagactagtagtaccaatta59atggcggcgetctcctcctgcttaetcgccgccgtccgacctcatcct107MetAlaAlaLeuSerSerCysLeuLeuAlaAlaValArgProHisPro151015ccacctccacctcgaccgetctccccttccttcateccctctgccetc155ProProProProArgProLeuSerProSerPhelieProSerAlaLeu202530cgccaccgccaccgcetcagecaagcgccgcccetcgccacctctetc203ArgHisArgHisArgLeuSerGinAlaProProLeuAlaThrSerLeu35404513<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>actcgaaatcca卿actcttetctgggtgatagggtttgtaactttc779ThrArgAsnProArgThrLeuLeuTrpVallieGlyPheValThrPhe225230235240ttcttgagttctatecttgacaatttgacttecactattgtgatggtt827PheLeuSerSerlieLeuAspAsnLeuThrSerThrlieValMetVal245250255teattgctteggaaaetagtacctccateagagtacagaaaattgtta875SerLeuLeuArgLysLeuValProProSerGluTyrArgLysLeuLeu260265270ggcgetgUgttgtgatatctgcaaatgetgggggtgcatggacacca923GlyAlaValValVallieSerAlaAsnAlaGlyGlyAlaTrpThrPro275280285attggtgatgtgacgaccactatgttgtggattcatggtcagattaca971lieGlyA印ValThrThrThrMetLeuTrplieHis'GlyGinlieThr290295300acgttgaacacaatgcagggcttgtttcttcccteagttgttteattg1019ThrLeuAsnThrMetGinGlyLeuPheLeuProSerValValSerLeu305310315320gcagttccactggetctgatgtecetcacgagtgaagcaaatggatct1067AlaValProLeuAlaLeuMetSerLeuThrSerGluAlaAsnGlySer325330335tctcagaaatcttecagettgctgteateagagcagatggetcctcga1115SerGinLysSerSerSerLeuLeuSerSerGluGinMetAlaProArg340345350ggacaacttgtatttgetgttggccttggagccttagtgtttgttcca1163GlyGinLeuValPheAlaValGlyLeuGlyAlaLeuValPheValPro355360365gtgtttaaagetetcactgggctgccacctttcatgggcatgatgctt1211ValPheLysAlaLeuThrGlyLeuProProPheMetGlyMetMetLeu370375380ggtcttgcaactctttggatectgacagatgcgatacattatggggac1259GlyLeuAlaThrLeuTrplieLeuThrAspAlalieHisTyrGlyAsp385390395400tctgga鄉(xiāng)cag卿ttg幼agttccacaagcgctgteaeggattgat1307SerGlyArgGinArgLeuLysValProGinAlaLeuSerArglieAsp405410415acacaaggagttetaUtttcttaggaattcttatgteagttggcage1355ThrGinGlyValLeuPhePheLeuGlylieLeuMetSerValGlySer420425430ttggaatctgetggcattttgaggcagttggcgaactatetcgatgcc1403LeuGluSerAlaGlylieLeuArgGinLeuAlaAsnTyrLeuAspAla435440445肌tattccgaatgccgaccttattgcaagegetateggtAsnlieProAsnAlaAspLeulieAlaSerAlalieGly450455460gcaattatagacaatgttccacttgttgetgcaacaatgAlalielieAspAsnValProLeuValAlaAlaThrMet465470475ggctttcatgggaatggaaaaggtggatttcttttggtaGlyPheHisGlyAsnGlyLysGlyGlyPheLeuLeuVal485490ggtaaattgaacttttactctaataataagtggagetgtGlyLysLeuAsnPheTyrSerAsnAsnLysTrpSerCys500505tacacaatacag組cgtatgttacagaacaagaaacttTyrThrlieGinAsnArgMetLeuGinAsnLysLysLeu515520525ggttgatatttccctgtcgaactgttaaatccaatccatatatgetGlyttcagtaattctgat卿ggctggg犯cagggaB犯aaattgattttggactgcagcttg1759gtttagcttctctstaggasaac犯ttgtgatatcatgeattgatggtacgtacgt卿g1819gcaagattgtgcttttctgt卿ggatg犯ataccatgetttcattaattagttatagtt1879ttatgttttaaaccaagctcgcttatttgtttacggcat3actttgtttatagatttgea1939c肌gtgtcttctcaatgatttggatgt犯agtsgsttgeecacctttcttcaactatttg199916gtagcatea1451ValAlaSergggatgtgt1499GlyMetCys480tttccgcaa1547PheProGin495ggaacaact1595GlyThrThr510atteggtgt1643lieArgCyscatcatatct1699tgcttttcggagaattgcaacactaatttataagtccatcgtgctgttegtgtcatctca2059tccttaacgattggtagtaagttgtgtgtaCttgt8Cgg3attagcMct2119鄉(xiāng)cccgtagaatatatgtatgatctstgtcttttgagtc2179cacattgtatttataccgcttggttttgcaggtgsgtggttttgcccttgcaggttatgc2239agctggtatcELtCElCttELtCtagctgcacaaaatctccctctatcccttcccacttcact2299agccg兆atcccatttatctCggggtC3Ltg犯agggtgsccagattcaggtatgga犯tg2359gacatattttattgtctggccagcttatgt犯gcataatc3ggatgtgU2419agatgtcccatgattacatgggatggELELtaaaatatatgccctgatctcc2479aacctccaagtttcccaacattgaccggaaggctttggggtgctggtg犯ctatggtatg2539ct犯g卿ggagcgattttgcttagaggctagagctgcacgcttgt犯tt2599cacg犯ttctattccatctt肌卿ggELgCtgcaccttgtgtaaaatttg2659冊g3tCCtg3aatcatatcatC3Ctgggtttatttttgccctgttgtttgcctacacttg2719ttgggtacttgtgttttctgtactccgttcccattgctatcacactatgc2779cattg組catttccttctaccttttgtgatggttccsitttgagtc犯ag2839tcaagtca^atgtaatggactaggaacatcatgtggggacagatgctttcccagaagcag2899a^ttgctsc3ccactactccctccgtcccaa犯ccctggttttcgtgccc2959犯tgtttgaccgtctgtcttaaaataaaaagacaagttac3019ttaattatgttttatcatctaacaacaata30793tttcstatatC3肌gttggcc鄉(xiāng)gtttgcctttttttt3139鄉(xiāng)acggagggagtagtgctgtgtctaccgggtctgcctgaaga犯tgacaaacatggcc3199tagggcattcctaatgcctattttggctgscaagggttacattgggaccatec3252<210〉2<211〉529<212〉PRT<213>水稻(0ryzasativa)〈400>2MetAlaAlaLeuSerSerCysLeuLeuAlaAlaValArgProHisPro151015ProProProProArgProLeuSerProSerPhelieProSerAlaLeu202530ArgHisArgHisArgLeuSerGinAlaProProLeuAlaThrSerLeu35404517ProArgPro50ProProPro65AsnCysAspArgProAspAspProLeu85GluAlaAsnTyrLys100AlaLeulieAlaThr115AlaGluHisGinAsplieAla130135AlaGlylieliePheGluGluSer145150GlyLeuLeuMetAlaValCysLeu165ProSerThrAspValAlaValGin180lieValPhePheProTrpCysArgPheSerAlaSerSerProPro5560ProAspAspTyrGluLeuLeuAspThrThrGly707580CysSerValAspGluValSerSerGinTyrPhe9095ProLysAsnAspLeuLeuLys'AlaLeuThrlie105110AlaAlalieAsnHisSerTrpVal125AlaGlyAla120MetValLeuValPhe140AsnSerLeuAlaPhe155TrpVallieArgSerlie170LeuSerHisThrAlaLeuGlyTyrLysValSerGlu195AspAlaHisGinGlu185LeuGlyAlaMetGlyVal160GlyAla175AlaGlulieVal210ThrArgAsnProArgPheLeuSerLeu200PheLysLeuValGly215LeuLeuTrpThr厶OULeuAspAsnLeuSerlie245SerLeuLeuArgLysLeuValPro260ValVallieSerGlyAlaVal275lieGlyAspValThrThr290Thr295Ala280MetPro265AsnLeuThr220VallieGlyPheVal乙J3ThrSerThrlieVal250SerGluThr190ThrlieValGlu205AspAsnlieSerAlaGlyTrplieTyrGlyHis300ArgThrPhe240MetVal255LeuLeuLys270TrpThrProAla285GlyGinlieThrThrLeuAsnThrMetGinGlyLeuPheLeuProSerValValSer305AlaValProLeuGin310LeuMetSerLeuAla325SerGinLysSerSerSerLeuLeu340ValPheAlaValPro315SerGluAlaAsnGlyGinLeu355LysAlaLeuThrThr330SerSerGluGinMet345LeuGlyAlaLeuGly335ProLeu320SerArgValPhe370GlyLeuAlaThrLeu385SerGlyGly360GlyLeuProProPheMet375380lieLeuThrAspAlalieAla350PheValProVal365GlyMetMetLeuArgThrGinGlyGinTrp390LeuLysValProAlalieHisTyrGly395GinAlaLeuSerArglie410415lieLeuMetSerValGlyArg405ValLeuPhePheLeu420AlaGlylieLeuLeuGluSer435ProAsnAlaAspGly425GinLeuAlaAsnAsp400AspSerAsnlie450AlalielieAspAsn465GlyPheHisGlyArg440lieAlaSerAlaLeu455ProLeuValAlaVal430TyrLeuAspAla445GlyValAlaSerGlyLysTyrThrLeulie515Asn500GinAsnPheVal470GlyLysGlyGlylie柳ThrMetGlyMetAla475LeuLeuValPheTyrSerAsnAsnArgMetLeu520Phe490LysTrpSerCysAsn505GinAsnLysLysPro495ThrCys480GinThrLeu525Gly510lieArgCysGly權(quán)利要求1、一種能夠提高鹽脅迫耐受能力的OsNHAD基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應(yīng)用，其特征在于，該基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO1中第60-1649位所示的DNA序列；或2)編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的DNA序列。全文摘要本發(fā)明涉及水稻基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。分離、克隆和通過功能驗證得到一種能夠提高鹽脅迫耐受能力的水稻OsNHAD基因在水稻耐鹽性遺傳改良中的應(yīng)用，所述的基因是下列核苷酸序列之一序列表SEQNO1中第60-1649位所示的核苷酸序列；或編碼與1)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。將含OsNHAD基因的核苷酸序列與外源啟動子連接后轉(zhuǎn)入水稻，轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽性得到顯著提高。文檔編號C12N15/82GK101538573SQ20091006160公開日2009年9月23日申請日期2009年4月16日優(yōu)先權(quán)日2009年4月16日發(fā)明者昕侯,戚珠云,熊立仲申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)