專利名稱：基于siet的植物耐鹽性快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物無損檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于SIET的植物耐鹽性快速 檢測方法。
背景技術(shù)：
鹽害是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及鹽堿地區(qū)生態(tài)恢復(fù)的不利因素之一，全世界約20%耕地鹽 漬化。我國有2. OX 107hm2鹽荒地和6. 67X 106hm2鹽漬化土壤，約可占耕地面積的25%。 對(duì)現(xiàn)有植物種質(zhì)資源進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)，篩選耐鹽植物對(duì)充分利用有農(nóng)用潛力的大面積鹽堿 土，恢復(fù)鹽堿地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。一般情況下，植物的耐鹽性與其對(duì)不同離子的吸收、運(yùn)輸、分配的調(diào)控能力有直接 關(guān)系，且認(rèn)為植物的發(fā)芽期和苗期對(duì)鹽分最為敏感。在鹽脅迫條件下維持體內(nèi)較低的Na+/K+ 對(duì)維持正常生長具有重要意義，因此植物對(duì)K+離子的保有能力成為耐鹽植物的重要特征。非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)(Scanning Ion-selective ElectrodeTechnique, SIET)是利用離子和分子選擇性微電極結(jié)合計(jì)算機(jī)控制的自動(dòng)定位 測量系統(tǒng)構(gòu)成的掃描離子技術(shù)，可以以非損傷的方式測量到進(jìn)出生物材料的離子以及分子 的運(yùn)動(dòng)速率、方向及濃度等信息。這種技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用到基礎(chǔ)生物學(xué)、生理學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng) 林學(xué)以及藥物機(jī)理等領(lǐng)域。澳大利亞塔桑馬尼亞大學(xué)的Shabala小組利用與之相近的非 損傷性離子流檢狽Ij技術(shù)(Non-invasive Microelectrode Ion FluxMeasuring Technique， MIFE)在大麥的抗鹽研究上做了許多工作，證明鹽脅迫下大麥幼苗根系的K+離子流速與其 耐鹽性指標(biāo)產(chǎn)量相關(guān)性可達(dá)到0. 85 (請(qǐng)參見Crop Science，2008，48 1382-1388.)。Cuin 在小麥上的研究表明，SOmMNaCl脅迫1小時(shí)后的K+離子流速與各項(xiàng)生理指標(biāo)之間也存在極 大的相關(guān)性(請(qǐng)參見 Journal of ExperimentalBotany, 2008, 59 (10) :2697_2706)。目前對(duì)植物種質(zhì)的耐鹽性評(píng)價(jià)已有一些報(bào)道，所用材料有水稻，番茄，甘薯等。 評(píng)價(jià)所用的方法主要包括鹽/堿脅迫下發(fā)芽指標(biāo)法、形態(tài)傷害評(píng)價(jià)法和生長量比較法 等，或者利用具有鹽濃度的組織培養(yǎng)來篩選耐鹽的植株和突變體。尹偉倫在申請(qǐng)?zhí)枮?200310113317.8的中國專利申請(qǐng)中根據(jù)植物細(xì)胞膜損傷程度，提出了對(duì)植物耐鹽能力定 量評(píng)價(jià)的方法。朱為民在申請(qǐng)?zhí)枮?00610118700.6的中國專利申請(qǐng)中通過對(duì)一定鹽濃 度下幼苗鹽害調(diào)查和鹽脅迫指數(shù)的計(jì)算，進(jìn)行番茄品種耐鹽篩選。劉慶昌等在申請(qǐng)?zhí)枮?200710062936. 7的中國專利申請(qǐng)中也利用鹽脅迫下的組培方法篩選甘薯耐鹽突變體。孫振 元在申請(qǐng)?zhí)枮?00910300988. 2的中國專利申請(qǐng)中則根據(jù)克隆植物的特性，提出了基于生 理整合能力的克隆植物耐鹽性評(píng)價(jià)方法。然而以上方法中，生理指標(biāo)的評(píng)價(jià)需進(jìn)行破壞性取樣試驗(yàn)，從而進(jìn)行判斷其鹽害 程度，例如植物細(xì)胞膜損傷程度。針對(duì)目前耐鹽品種及材料稀少(例如轉(zhuǎn)耐鹽基因的材 料)，或經(jīng)破壞性取樣后無法跟蹤檢測同一樣本的問題，做到無損檢測對(duì)于節(jié)省種質(zhì)資源， 提高檢測精確度非常必要。而利用組培條件下鹽脅迫篩選的方法則存在消耗周期較長、過 程復(fù)雜的問題。

發(fā)明內(nèi)容
(一)要解決的技術(shù)問題本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法破壞性取樣和檢測周期 長的缺陷。( 二 )技術(shù)方案針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法， 包括以下步驟Si，選取萌發(fā)期或苗期的植物根系的樣品作為檢測對(duì)象，將樣品置于培養(yǎng)液中利 用非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)SIET對(duì)該樣品進(jìn)行檢測，得到樣品的K+離子的流向和 流速；S2，一定時(shí)間之后，在培養(yǎng)液中加入鹽溶液，待培養(yǎng)液中NaCl達(dá)到一定終濃度后， 繼續(xù)檢測得到所述K+離子的流向和流速，根據(jù)所檢測到的流向和流速判斷植物在鹽脅迫條 件下對(duì)所述K+離子的保有能力，進(jìn)而作為評(píng)價(jià)植物的耐鹽性的依據(jù)。其中，在步驟Sl或S2中，檢測得到所述K+離子的流向和流速的方法具體為利用 SIET檢測樣品上兩點(diǎn)之間的電壓差，將該電壓差換算成該兩點(diǎn)之間的離子濃度差，然后將 該離子濃度差換算成該兩點(diǎn)之間的流向和流速。其中，所述培養(yǎng)液的成分包括0. 5mM KCl和0. ImM CaCl2。其中，在所述SIET中所用的微電極為K+離子選擇性玻璃微電極。其中，所檢測的指標(biāo)為瞬時(shí)NaCl誘導(dǎo)下的根系K+離子流，NaCl所達(dá)到的一定終濃 度為 50-150mM。其中，所述的一定時(shí)間為10分鐘。其中，利用所述K+選擇性微電極校正后得到的斜率將該電壓差換算成該兩點(diǎn)之間 的離子濃度差。其中，利用Fick第一擴(kuò)散定律公式Jtl = -D dc/dx將該離子濃度差換算成該兩點(diǎn) 之間的流向和流速。其中，所述SIET為非損傷微測系統(tǒng)中的SIET。其中，所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物；所述單子葉植物包括小麥、玉米和 水稻，所述雙子葉植物包括番茄和大豆。(三)有益效果本發(fā)明的技術(shù)方案基于非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)進(jìn)行萌發(fā)期或苗期植物 根系的K+離子的流向和流速數(shù)據(jù)檢測，以鹽脅迫下植物根系對(duì)K+的保有能力作為耐鹽性評(píng) 價(jià)的依據(jù)，并選擇瞬時(shí)鹽脅迫范圍為50-150mMNaCl，實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物耐鹽性的快速(從種子 萌發(fā)到檢測，只需要3-6天)無損檢測，在節(jié)省品種和材料的同時(shí)，還可以實(shí)現(xiàn)檢測之后的 植物重復(fù)利用，消除了因個(gè)體差異造成的誤差，提高了檢測的準(zhǔn)確性。


圖1本發(fā)明實(shí)施例的方法流程圖；圖2示出了利用本發(fā)明實(shí)施例的方法所做的試驗(yàn)中，在SOmMNaCl誘導(dǎo)下洲元9369和長武134根系K+離子的流速變化；圖3示出了利用本發(fā)明實(shí)施例的方法所做的試驗(yàn)中，SOmMNaCl脅迫對(duì)洲元9369和 長武134根系K+離子平均流速的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的實(shí)施例中，利用非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)檢測不同小麥品種的耐 鹽性。其流程圖如圖1所示。1.實(shí)驗(yàn)方法材料為小麥，品種為普通高產(chǎn)冬小麥(Triticum aestivum L.)洲元9369 (由萊州 市金海種業(yè)提供，簡稱9369)；以及耐旱品種冬小麥(Triticum aestivum L.)長武134 (由 中科院水利部水土保持研究所提供，簡稱134)。將冬小麥長武134和洲元9369用3%次氯酸鈉消毒15分鐘，分別浸種催芽24小 時(shí)后，挑選萌發(fā)一致的種子，置于鋪有單層濾紙的發(fā)芽盒中生長，濾紙及培養(yǎng)液每天更換， 培養(yǎng)液為(0. 5mM KCl,0. ImM CaCl2)。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后，用于根系K+離子流檢測。K+離子流檢測利用非損傷微測系統(tǒng)(BI0-001B，Younger USA Sci. & Tech. Corp.， USA)中的非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)進(jìn)行。以掃描離子選擇性微電極技術(shù)動(dòng)態(tài)的檢 測，獲取進(jìn)出樣品的K+離子濃度(毫摩爾mM級(jí))、流速及流向(三維運(yùn)動(dòng)方向)的信息。K+ 離子選擇性微電極前端灌充180 μ m K+離子的液態(tài)交換劑(LIX)液柱，后端灌充有15_20mm 左右的電解液柱(IOOmM KC1)，將電極固定器上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解 液接觸。參比電極為固體電極。幼苗在測量前轉(zhuǎn)移到測試盒中平衡lh，測試液成分為0. 5mMKCl,0. ImM CaCl2，測 量位點(diǎn)為距離根尖IOmm左右的根系成熟區(qū)。在距離根表面10 μ m處垂直測量兩點(diǎn)之間的 電壓差，電極兩點(diǎn)移動(dòng)距離30 μ m。穩(wěn)定測量IOmin后，加入等體積由測試液配制的160mM 濃度的NaCl溶液，使其終濃度達(dá)到80mM后，繼續(xù)檢測60min內(nèi)K+離子的運(yùn)動(dòng)狀況。溶液中 K+離子擴(kuò)散平衡時(shí)間約為l-2min，所以這段時(shí)間內(nèi)的數(shù)據(jù)丟棄。每個(gè)處理檢測三株苗。利 用K+離子選擇性微電極校正后得到的斜率(Nernst slope)將兩點(diǎn)之間的電壓差換算成兩 點(diǎn)之間的離子濃度差。在凈離子流的計(jì)算過程中，基本上認(rèn)為根系K+離子流符合圓柱擴(kuò)散 幾何模型。離子濃度差到流速和流向的換算使用Fick第一擴(kuò)散定律公式Jtl =-D dc/dx 完成。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2可知，在正常生長條件下，小麥洲元9369根系成熟區(qū)K+流速為負(fù)值，表明根 系附近K+內(nèi)流，震蕩幅度較大，平均流速為-802pmol. cm-2· s-1 (圖3)。長武134根系K+流 速震蕩幅度較小(圖2)，表明進(jìn)出根系的K+離子流速較小，平均流速僅為-117pmol. cm—2.
圖3)。測試液中加入80mM NaCl后，兩個(gè)品種小麥的根部K+流速為正值，表明根系表面 K+離子流向轉(zhuǎn)為外排。洲元9369根部K+離子外排流速較大，且穩(wěn)定維持在3000-4000pmol. cm"2, s—1，平均流速為3533pmol. cm—2, s—1。在NaCl瞬時(shí)誘導(dǎo)下，長武134根系K+流向也表現(xiàn) 為外排，同時(shí)流速增加，最高流速可達(dá)1890pmol. cm_2. s、但隨后的3_4分鐘內(nèi)，其流速迅速下降到 600-900pmol. cnT2. (圖 2)，平均流速為 776pmol. cnT2. s、僅為洲元 9369 的 1/5。 這表明在NaCl脅迫下，長武134根系的K+外排流速較洲元9369小，其根系對(duì)K+保有能力 更強(qiáng)，其耐鹽性更強(qiáng)。其中，圖3中的“CK”是指無NaCl對(duì)照測試液，該無陰影的方框表示 利用含OmM的NaCl濃度的測試液所得到的試驗(yàn)結(jié)果。由以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的技術(shù)方案基于非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù) 進(jìn)行萌發(fā)期或苗期植物根系的K+離子的流向和流速數(shù)據(jù)檢測，以鹽脅迫下植物根系對(duì)K+的 保有能力作為耐鹽性評(píng)價(jià)的依據(jù)，并選擇瞬時(shí)鹽脅迫范圍為50-150mMNaCl，實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物 耐鹽性的快速(從種子萌發(fā)到檢測，只需要3-6天)無損檢測，在節(jié)省品種和材料的同時(shí)， 還可以實(shí)現(xiàn)檢測之后的植物重復(fù)利用，消除了因個(gè)體差異造成的誤差，提高了檢測的準(zhǔn)確 性。以上實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而并非對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以做出各種變化和變型，因此所有 等同的技術(shù)方案也屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護(hù)范圍應(yīng)由權(quán)利要求限定。
權(quán)利要求
一種基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟S1，選取萌發(fā)期或苗期的植物根系的樣品作為檢測對(duì)象，將樣品置于培養(yǎng)液中利用非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)SIET對(duì)該樣品進(jìn)行檢測，得到樣品的K+離子的流向和流速；S2，一定時(shí)間之后，在培養(yǎng)液中加入鹽溶液，待培養(yǎng)液中NaCl達(dá)到一定終濃度后，繼續(xù)檢測得到所述K+離子的流向和流速，根據(jù)所檢測到的流向和流速判斷植物在鹽脅迫條件下對(duì)所述K+離子的保有能力，進(jìn)而作為評(píng)價(jià)植物的耐鹽性的依據(jù)。
2.如權(quán)利要求1所述的基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在于，所檢測的 指標(biāo)為瞬時(shí)NaCl誘導(dǎo)下的根系K+離子流，NaCl所達(dá)到的一定終濃度為50_150mM。
3.如權(quán)利要求1所述的基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在于，在步驟Sl 或S2中，檢測得到所述K+離子的流向和流速的方法具體為利用SIET檢測樣品上兩點(diǎn)之 間的電壓差，將該電壓差換算成該兩點(diǎn)之間的離子濃度差，然后將該離子濃度差換算成該 兩點(diǎn)之間的流向和流速。
4.如權(quán)利要求1所述的基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在于，所述培養(yǎng) 液的成分包括0. 5mM KCl和0. ImM CaCl2。
5.如權(quán)利要求4所述的基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在于，在所述 SIET中所用的微電極為K+離子選擇性玻璃微電極。
6.如權(quán)利要求1所述的基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在于，所述的一 定時(shí)間為10分鐘。
7.如權(quán)利要求1所述的基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在于，所述SIET 為非損傷微測系統(tǒng)中的SIET。
8.如權(quán)利要求1 7之任一項(xiàng)所述的基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，其特征在 于，所述植物包括單子葉植物和雙子葉植物；所述單子葉植物包括小麥、玉米和水稻，所述 雙子葉植物包括番茄和大豆。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于SIET的植物耐鹽性快速檢測方法，包括步驟選取萌發(fā)期或苗期的植物根系的樣品作為檢測對(duì)象，將樣品置于培養(yǎng)液中利用非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)SIET對(duì)該樣品進(jìn)行檢測，得到樣品的K+離子的流向和流速；一定時(shí)間之后，在培養(yǎng)液中加入鹽溶液，待鹽溶液中氯化鈉的達(dá)到一定終濃度后，繼續(xù)檢測所述K+離子的流向和流速，根據(jù)所檢測到的流向和流速判斷植物在鹽脅迫條件下對(duì)所述K+離子的保有能力，進(jìn)而作為評(píng)價(jià)植物的耐鹽性的依據(jù)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)植物耐鹽性的快速無損檢測，在節(jié)省品種和材料的同時(shí)，還可以實(shí)現(xiàn)檢測之后的植物重復(fù)利用，且消除了因個(gè)體差異造成的誤差，提高了檢測的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N27/26GK101881747SQ20101020647
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者侯瑞鋒, 王成, 王曉冬, 王紀(jì)華, 馬智宏 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心