專利名稱：一種鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中的鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽漬對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有極其嚴(yán)重的影響。鹽脅迫是抑制植物生長，降低農(nóng)作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素之一。中國15億畝耕地中鹽堿地大約有一億畝，中低產(chǎn)田約10億畝，大部分是由于干旱鹽堿所致，另外還有3億畝鹽堿荒地。而且，在灌溉地區(qū)次生鹽漬化田地還在繼續(xù)增加。
Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器(Na+/H+antiporter)在細(xì)胞膜和液泡膜上都有分布。Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器與鹽生植物的抗鹽性有很大關(guān)系，它保證了Na+在液泡中的區(qū)域化，大大降低了液泡的滲透勢，又減輕了Na+對細(xì)胞質(zhì)的傷害。Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器還可以將進(jìn)入根中的Na+泵出，維持體內(nèi)低濃度的離子環(huán)境，這種機(jī)制在許多農(nóng)作物中普遍存在。高等植物中Na+流出的主要機(jī)制是質(zhì)膜上的H+/ATPase把H+泵出細(xì)胞，產(chǎn)生的電化學(xué)勢可激活質(zhì)膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器，H+進(jìn)入細(xì)胞，Na+逆電化學(xué)勢流出。從生理生化角度，在許多高等植物及藻類上都證明了Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器的活動。
許多植物的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器載體的活性很低，因此他們在高鹽環(huán)境中會失水最終死亡。在高鹽環(huán)境中，Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器的合成及其活動都會受到抑制，但是通過提高細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的含量，可以消除這種阻礙因素的影響或通過轉(zhuǎn)基因的方法增加Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)器在植株中的含量來達(dá)到抗鹽的目的。
1999年Apse用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將AtNHX1轉(zhuǎn)入擬南芥中，得到抗鹽植株。這一結(jié)果給培育抗鹽品種帶來了美好的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器來源于玉米，名稱為zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由539個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
以玉米EST設(shè)計(jì)引物，通過5’、3’RACE方法克隆到zmNHX1基因的全長cDNA。鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一
1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由2035個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1到第1617位堿基。
本發(fā)明所提供的鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器及其編碼基因，可以來自所有單子葉和雙子葉植物，如煙草，擬南芥，草坪草，楊樹，大豆，小麥，水稻，棉花和番茄等。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對高鹽脅迫耐受力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，Ubiqutin啟動子，增強(qiáng)子既可以是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，也可以是翻譯增強(qiáng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。攜帶有本發(fā)明鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1基因的表達(dá)載體可以是Ti(Tumor-induced-癌誘導(dǎo))質(zhì)粒、Ri(Root-induced-根誘導(dǎo))質(zhì)粒、植物病毒載體等，轉(zhuǎn)化可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等常規(guī)生物技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)，被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻，小麥，玉米，大豆，棉花，蔬菜，樹木和草坪草等。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤果}植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。


圖1為Northern雜交分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1的克隆營養(yǎng)生長階段的玉米(生長2周，4到5葉期)用150mmNaCl處理3小時(shí)。用TRIZLO(PROMAGA)提取根總RNA。根據(jù)玉米EST序列設(shè)計(jì)并合成基因特異引物GSP15’agcgtgcacacagaatccgttgcagGSP25’tgctgaatatcgctattgcgccgagGSP35’ctcggcgcaatagcgatattcagcaGSP45’ctgcaacggattctgtgtgcacgct具體操作按SMART RACE(CLONTECH)試劑盒進(jìn)行。首先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反映體系為1ul鹽處理玉米根總RNA，1ul 5’-CDS或3’-CDS，1ul SMATII OLIGO引物(10um/L)，2ul滅菌水?；靹蚝?，于70℃加熱2min。置冰上冷卻2min，離心使液體沉底。加入2ul 5X第一鏈緩沖液，1ul DTT(20mm/L)，1ul dNTP(10mm/L)和1ul MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(20U/ul)，42℃逆轉(zhuǎn)錄1.5小時(shí)，加入100ul滅菌水，于72℃加熱2min終止反應(yīng)。
隨后，以通用引物混合物(UPM)和GSP1，UPM和GSP3分別進(jìn)行5’，3’“TOUCHDOWN”PCR擴(kuò)增。在PERKIN-ELMOR(PE)DNA THERMAL CYCLER 9700啟動PCR反應(yīng)。條件為5X(94℃30 S，72℃ 3min)，5X(94℃30S，70℃10S，72℃2min)，20X(94℃30S，63℃30S，72℃30S)72℃min。以該次反應(yīng)為模板，分別使用通用引物(NUP)和GSP2，GSP4進(jìn)行巢式PCR。5’RACE獲得400bp大小的條帶，3’RACE獲得1.6Kb大小的條帶。分別回收純化后，5’RACE片段連在PGEM-T EASY載體上，3’RACE直接測序。測序結(jié)果和已知EST序列進(jìn)行拼接，并結(jié)合測序峰圖進(jìn)行校正。獲得拼接好的序列zmNHX1基因，如序列表中的序列1所示，全長共2035bp，其中3’非編碼區(qū)為418bp，編碼區(qū)為1617bp。編碼產(chǎn)物為539個(gè)氨基酸，如序列表中的序列2所示。
實(shí)施例2、zmNHX1基因在逆境脅迫條件下的表達(dá)特征玉米種于含蛭石的花盆中，待長到3葉一心時(shí)期進(jìn)行不同濃度的鹽脅迫處理50mM，150mM NaCl進(jìn)行澆灌至土壤飽和。3小時(shí)后收取，提取根、葉總RNA，進(jìn)行Northern blot分析。結(jié)果如圖3所示，圖中R對照根；L對照葉；50mmR50mMNaCl處理根；50mmL50mM NaCl處理葉；150 mmR150mM NaCl處理根；150mmL150mM NaCl處理葉。從圖中可以看出，zmNHX1基因在根中表達(dá)，在葉中不表達(dá)。50mMNaCl處理后，zmNHX1表達(dá)量大幅度升高。在100mM NaCl處理時(shí)，zmNHX1轉(zhuǎn)錄水平高于50mM NaCl處理時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平。表明zmNHX1在根中表達(dá)并受鹽脅迫誘導(dǎo)。
序列表<160>2<210>1<211>2035<212>DNA<213>玉米屬玉米(Zea mays.L)<400>1atggggctgg gtgcgggggc ggagctggtg cggctgggcg tgctgagctc gacctctgac60cacgcgtcgg tggtgtccat caacctgttc gtcgcgctgc tctgcgcctg catcgtcctg120ggccacctcc tggaggagaa ccgctgggtt aacgagtcca tcaccgcgct catcatcggg180ctgtgcaccg gcgtcgtgat cctgctgacc accaagggga agagctcgca catcctcgtc240ttcagcgagg acctcttctt catctacctc ctacctccca tcatcttcaa tgccgagttc300caggtgaaga agaaacggtt cttccggaat ttcatgacaa tcacactgtt gcagtgctgt360tggcacaatg atatccttct tcacatctct ctcggcgcaa tagcgatatt cagcagaatg420aacattggga cgctagatgt cggggatttt ctcgctattg gagctatctt ttctgcaacg480gattctgtgt gcacgctgca ggttctccat caggatgaga cgcccttttt gtacagtctc540gtgttcggtg agggagtcgt gaacgatgcc acgtctgttg tgctcttcaa cgcactccag600aacttcgatc ttaaccacat cgatgtagcc gttgtgctga atttcttggg aaacttctgt660tacttattcg tgtcaagcac cttacttgga gtgtttactg gattgctcag tgcctacata720attaagaagc tatatatagg aaggcattcc actgaccgtg aggttgcgct tatgatgctc780atggcttacc tctcctacat gctggccgag ctgctagatc tgagtggcat tcttaccgta840ttcttctgcg gcatcgtgat gtcgcattac acctggcaca atgtgacaga gagctcaaga900gtcacaacca agcatgcctt tgctactttg tccttcatcg ccgagacttt tctcttcctg960tatgttggga tggatgccct cgacatcgag aagtgggagt ttgccagtga cagcccgggc1020aaatccattg gcattagctc gattttgcta ggattggttc tgctggggag agctgcattt1080gttttcccat tgtcgttttt gtccaacctg acaaagaagt ctccattgga gaaaataaca1140tttagacagc aaattgtaat atggtgggcc ggactgatga gaggtgccgt gtccattgct1200ctcgcttaca acaagttcac gagatctgga cacactgagc tgcacggcaa cgcgataatg1260atcaccagca cgatcactgt ggtcctgttt agcactatgg tgtttgggat gatgacgaag1320ccattgatcc ggctgctgct ccctgcctgc agcaacacgg ccacctccga gccgtcctca1380cccaagtccc tgcactcgcc tctcctgacg agcatgcagg gctcggacat cgagacgggg1440tcggcacaga ttgtgaggcc gtccagcctc cggatgctcc taagcaagcc aacccacacg1500gtgcactact actggcgcaa gttcgacgac gcgctcatgc ggcccatgtt tggcggccgc1560gggttcgtgc ccttctcccc tggatcgccc actgagcaga gcgtccacga cggacggtga1620acaaagccgc gtctgacacc aagagacgag caggacatgc ttttggctgc taatggtcag1680atgatgatgt ttttgtttgt tgacagcttc tgatggtgcg ttagcaatgg caaggaggtg1740tcagtttgtt tggattagca ggatgaagaa gagcaaccct ggtaactggg gctgggggat1800tgagtttgtg catgacaagg ctgcaaactt ttgtatgtag ataaaaagaa cacccatttg1860gccatttgta ttgtatgtta ttgtatgtaa gctagcaggc ctgtacaact gcttttaggt1920cttcgtttgg atgggcgaaa ttctggcaaa cagcagcaca tccactctgt gttctgatct 1980aagcatcttg gtttgatttt tgaaatggac tcggtgtgta ggataagctt ttgga 2035<210>2<211>539<212>PRT<213>玉米屬玉米(Zea mays.L)<400>2Met Gly Leu Gly Ala Gly Ala Glu Leu Val Arg Leu Gly Val Leu1 5 10 15Ser Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Ile Asn Leu Phe20 25 30Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu35 40 45Glu Asn Arg Trp Val Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly50 55 60Leu Cys Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Thr Thr Lys Gly Lys Ser65 70 75Ser His Ile Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu80 85 90Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Glu Phe Gln Val Lys Lys Lys95 100 105Arg Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr Ile Thr Leu Leu Gln Cys Cys110 115 120Trp His Asn Asp Ile Leu Leu His Ile Ser Leu Gly Ala Ile Ala125 130 135Ile Phe Ser Arg Met Asn Ile Gly Thr Leu Asp Val Gly Asp Phe140 145 150Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ser Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr155 160 165Leu Gln Val Leu His Gln Asp Glu Thr Pro Phe Leu Tyr Ser Leu170 175 180Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu185 190 195Phe Asn Ala Leu Gln Asn Phe Asp Leu Asn His Ile Asp Val Ala200 205 210Val Val Leu Asn Phe Leu Gly Asn Phe Cys Tyr Leu Phe Val Ser215 220 225Ser Thr Leu Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile230 235 240Ile Lys Lys Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val
245 250 255Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu260 265 270Leu Leu Asp Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile275 280 285Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg290 295 300Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Ile Ala Glu305 310 315Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu320 325 330Lys Trp Glu Phe Ala Ser Asp Ser Pro Gly Lys Ser Ile Gly Ile335 340 345Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Val Leu Leu Gly Arg Ala Ala Phe350 355 360Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr Lys Lys Ser Pro365 370 375Leu Glu Lys Ile Thr Phe Arg Gln Gln Ile Val Ile Trp Trp Ala380 385 390Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Ile Ala Leu Ala Tyr Asn Lys395 400 405Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Glu Leu His Gly Asn Ala Ile Met410 415 420Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val Phe425 430 435Gly Met Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro Ala Cys440 445 450Ser Asn Thr Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His455 460 465Ser Pro Leu Leu Thr Ser Met Gln Gly Ser Asp Ile Glu Thr Gly470 475 480Ser Ala Gln Ile Val Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Ser485 490 495Lys Pro Thr His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asp500 505 510Ala Leu Met Arg Pro Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe515 520 525Ser Pro Gly Ser Pro Thr Glu Gln Ser Val His Asp Gly Arg530 535 539
權(quán)利要求
1.鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1到第1617位堿基。
6.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
8.權(quán)利要求4所述基因在培育抗鹽植物品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器來源于玉米，名稱為zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。鈉/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運(yùn)器zmNHX1的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤果}植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號C12N15/29GK1490331SQ02146310
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者王學(xué)臣, 陳敏, 陳珈, 陳受宜 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所