專利名稱：甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbEST及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbEST及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
世界上存在大面積的鹽潰化的土地。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界共有3.8X108hm2鹽堿地，在灌溉地區(qū)還有占耕地面積33%的次生鹽潰化土地，土壤的鹽潰化嚴(yán)重影響現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展。就我國而言，在全國18億畝耕地中有近十分之一的次生鹽潰化土地，另外還有2XlOW鹽堿荒地。大面積的鹽潰化土地的存在嚴(yán)重影響了糧食生產(chǎn)，成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素。通過對植物耐鹽機(jī)理的深入研究，培育耐鹽作物新品種是利用鹽堿地資源最經(jīng)濟(jì)、有效的措施之一。植物的耐鹽機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，它涉及到生長發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征以及代謝調(diào)節(jié)等諸多方面。植物在鹽脅迫條件下，會(huì)采用一定的策略去阻止或減輕鹽的危害，在長期的進(jìn)化過程中，植物發(fā)展出了一系列的耐鹽機(jī)制。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，植物耐鹽生理生化機(jī)制日益明確，使得克隆與植物耐鹽相關(guān)基因成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbEST及其編碼基因。本發(fā)明所提供 的與甘薯耐鹽相關(guān)的蛋白，名稱為IbEST，來源于甘薯(Ipomoeabatatas),是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。上述序列2由410個(gè)氨基酸殘基組成.
上述蛋白中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述DNA分子是如下(1)-(3)中任一種的DNA分子:(1)編碼區(qū)為序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。上述序列I由1233個(gè)堿基組成，其開放閱讀框(ORF)為自5'末端第I位一第1233位喊基，編碼氣基酸序列是序列表中序列2所的蛋白。
上述嚴(yán)格條件為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述重組載體為將編碼上述蛋白的DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體為pCB⑶S，上述重組載體為將序列表中序列I所示的DNA分子插入pCB⑶S中，替換掉表達(dá)載體pCB⑶S中的gusA報(bào)告基因，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體；上述重組載體具體可為將序列表中序列I所示的DNA分子取代pCB⑶S的BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)間的小片段(gusA報(bào)告基因)得到的重組載體。所述載體pC B⑶S是通過包括如下步驟的方法得到的:(I)將pCAMBIA1301載體經(jīng)過HindIII和EcoRI雙酶切，回收11786bp載體大片段；(2)將pBI121載體經(jīng)過HindIII和EcoRI雙酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；(3)將步驟(I)中回收的11786bp載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段連接，得到重組載體pCB⑶S。所述pCAMBIA1301載體購自CAMBIA公司；所述pBI121載體購自Clontech公司。擴(kuò)增上述DNA分子全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對為如下I)或2)所示:I)由序列表中序列3所示的DNA片段和序列表中序列4所示的DNA片段組成的引物對；2)由序列表中序列5所示的DNA片段和序列表中序列6所示的DNA片段組成的引物對。上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用中，上述耐逆性為耐鹽性；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。上述調(diào)控植物耐逆性為提高植物耐逆性。上述雙子葉植物為煙草(Nicotianatabacum)或甘薯(Ipomoea batatas)。上述耐鹽性具體由增加株高、增加脯氨酸含量和/或降低丙二醛含量體現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼上述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。編碼上述蛋白的DNA分子是通過所述重組載體導(dǎo)入目的植物中。在上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；上述雙子葉植物為煙草(Nicotiana tabacum)或甘薯(Ipomoea batatas)。上述耐鹽性具體由增加株高、增加脯氨酸含量和/或降低丙二醛含量體現(xiàn)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了一種IbEST蛋白及其編碼基因，將該基因?qū)胍吧蜔煵葜?，得到轉(zhuǎn)IbEST煙草，將轉(zhuǎn)IbEST煙草進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)其與野生型煙草相比，耐鹽，具體體現(xiàn)在株高增力卩、脯氨酸含量增加和/或丙二醛減低。因此，可以看出，IbEST基因及其所編碼的蛋白在植物對抗非生物脅迫的過程中起著重要的作用。本發(fā)明所提供的IbEST蛋白及其編碼基因在提高植物耐鹽研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。


圖1為轉(zhuǎn)IbEST煙草植株的PCR檢測結(jié)果圖
圖2為轉(zhuǎn)IbEST煙草耐鹽表型結(jié)果3為脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、與甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbEST及其編碼基因的獲得—、與耐鹽相關(guān)蛋白IbEST及其編碼基因的獲得實(shí)驗(yàn)材料:甘薯耐鹽突變體LM79(公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是:何紹貞.甘薯耐鹽突變體的離體篩選及耐鹽候選基因的克隆.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2008 ；)無菌苗展開葉葉片取下，液氮速凍，-80° C保存。1、葉片總RNA提取和純化取LM79無菌苗展開葉 葉片約2g，在液氮中研磨成粉狀，加入IOmL離心管，用Applygen 植物 RNA 提取試劑盒(Applygen Technologies Inc, Bei jing)提取甘薯葉片總RNA，試劑盒中包括:Plant RNA Reagent，植物組織裂解、分離RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent,有機(jī)抽提去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖和多酹；Plant RNA Aid,去除植物多糖多酚和次生代謝產(chǎn)物。利用 QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit (QIAGEN,GmbH,Germany)從總RNA中純化mRNA。最后，取I μ L于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，另取2 μ L稀釋至500 μ L，用紫外分光光度計(jì)檢測其質(zhì)量(0D260)和純度(0D260/0D280)，提取的LM79無菌苗葉片總RNA，經(jīng)非變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，且二者亮度比值為1.5 2: 1，表明總RNA沒有降解，純化所得mRNA符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于甘薯EST蛋白cDNA全長的克隆。2、IbEST蛋白cDNA的全長克隆以本實(shí)驗(yàn)室獲得的IbEST EST片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行IbEST蛋白cDNA的全長克隆。(1)3' -RACE以LM79的葉片cDNA為模板，用IbEST EST正向引物I和正向引物2及反向引物
3、反向引物4(反向引物3、反向引物4序列參照Invitrogen GeneRacer.RACE Ready cDNAKit Manual, Version A)進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中正向引物2在引物I的下游。引物序列如下:引物序列如下:引物1:5' -TCTTGAAGACGGGAGGTGAT-3'引物2:5' -GTTGAGGCACGGCCAGACTT-3'
引物3:5' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'引物4:5' -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'PCR得到的Y RACE片段，回收后連接pMD19_T載體(購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 D102A)進(jìn)行 TA 克隆，以 BcaBESTTM Sequencing Primers/M13 Primers通用引物進(jìn)行測序。(2)5' -RACE以LM79cDNA為模板，用IbEST EST正向引物5和正向引物6及反向引物7、反向引物8 (反向引物7、反向引物8序列參照Invitrogen5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends, Version2.0)進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中正向引物6在引物5的下游。引物序列如下:引物5:5' -AAAATCACCTCCCGTCTTCA-3'引物6:5' -TCCCGTCTTCAAGATTGCTT-3'引物7:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3'引物8:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'`PCR得到的5’ RACE片段，回收后連接pMD19_T載體(購自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 D102A)進(jìn)行 TA 克隆，以 BcaBEST Sequencing Primers/M13Primers 通用引物進(jìn)行測序。(3) PCR擴(kuò)增IbEST蛋白cDNA的編碼區(qū)利用DNAMAN7.0軟件拼接候選的甘薯IbEST蛋白cDNA序列。進(jìn)一步設(shè)計(jì)正向引物9和反向引物10進(jìn)行PCR擴(kuò)增IbEST蛋白cDNA的編碼區(qū)。引物序列如下:引物9:5，-ATGAAAGGCGTCTTCTCGG-3’(序列 3)引物10:5’-CTATACTAAGITTCTAAATTCCAAGCAA-3’(序列 4)以LM79cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為 95°C lmin，隨后 95°C 20s, 53°C 20s和72°C lmin，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得1233bp長度的擴(kuò)增片段。經(jīng)過測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I所示的核苷酸，該序列所示的基因命名為IbEST，該基因的編碼區(qū)為序列表中序列I自5'端第1-1233位核苷酸；序列表中序列I由1233個(gè)堿基組成；該基因編碼的蛋白命名為IbEST，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2 ;序列表中序列2由410個(gè)氨基酸殘基組成。實(shí)施例2、IbEST蛋白在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用一、轉(zhuǎn)IbEST煙草的獲得1、重組載體pCBIbEST的構(gòu)建根據(jù)甘薯IbEST蛋白cDNA的編碼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼序列的引物序列，正反向引物分別引入BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)，引物序列如下:引物11:5，GGATCC ATGAAAGGCGTCTTCTCGG’(序列 5)(下劃線部分為 BamH I 酶切位點(diǎn))，引物12:5’ GAGCTC CTATACTAAGTTTCTAAATTCCAAGCAA3’(序列 6)(下劃線部分為Sac I酶切位點(diǎn))。以人工合成的序列表中序列I所示的DNA分子為模板(或以LM79cDNA為模板)，用引物11和引物12進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1245bp的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接到pGEM_TEasy載體(購自北京澤平科技有限責(zé)任公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為A1360)上，命名為pGIbEST載體，進(jìn)行T7/sp6的測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列I自5’末端第1-1233位核苷酸；保證甘薯IbEST蛋白cDNA的閱讀框及酶切位點(diǎn)的正確。用Sac I和BamH I酶切載體pCB⑶S，回收12926bp載體大片段；同時(shí)，用Sac I和BamH I酶切載體pGIbEST，回收約1.2kb中間片段；將回收12926bp載體大片段與約1.2kb中間片段連接，得到重組載體pCBIbEST。將重組載體pCBIbEST轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為⑶201-01)，37°C培養(yǎng)20h，進(jìn)行重組載體的PCR分析和酶切鑒定，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果表明，重組載體pCBIbEST為將序列表中序列I自5'端第I位-第1233位所示核苷酸插入載體PCB⑶S的BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)(替換掉gusA報(bào)告基因)間得到的載體，即為植物表達(dá)載體。上述pCB⑶S載體是通過包括如下步驟的方法得到的:(I)將pCAMBIA1301載體(購自CAMBIA公司)經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收11786bp的載體大片段；(2)將pBI121載體(購自Clontech公司；含35S啟動(dòng)子，gusA報(bào)告基因，nos終止子片段)也經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；(3)將步驟(I)中回收的11786bp載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段經(jīng)T4DNA酶連接，得到重組載體pCB⑶S。2、重組載體pCBIb EST轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(I)從_80°C低溫冰箱中取出200 μ L ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞(購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，置冰上融化，加入I μ g上述步驟I得到的重組載體pCBIbEST，混勻；(2)液氮冷凍 lmin,37°C溫育 5min ；(3)加入800 μ L LB液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)6h ；(4)取100 μ L菌液至LB固體培養(yǎng)基上(含100 μ g/mL利福平(Rif) >25 μ g/mL卡那霉素(Kan))，涂布均勻，將培養(yǎng)皿封口。倒置培養(yǎng)皿28°C培養(yǎng)2d ；(5)PCR鑒定呈陽性(引物為引物11和引物12，得到1245bp的為陽性)的單菌落命名為 EHA105/pCBIbEST ;將 EHA105/pCBIbEST 接種到含有 100 μ g/mL Rif、25 μ g/mL Kan 的LB液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)30h至對數(shù)生長期，取適量農(nóng)桿菌用液體MS培養(yǎng)基稀釋30倍備用，即得到EHA105/pCBIbEST農(nóng)桿菌菌液。3、轉(zhuǎn)IbEST煙草的獲得I)轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將IbEST cDNA的編碼序列導(dǎo)入到煙草品種cv.Wisconsin38(以下也稱為野生型煙草；Wang LJ, He SZ, Zhai H, Liu DG, Wang YN, Liu QC:Molecularcloning and functional characterization of a salt tolerance-associated geneIbNFUlfrom sweetpotat0.Journal of Integrative Agriculture, 2012,12 (1):101-108;公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得)中，具體方法如下:(I)取經(jīng)過繼代培養(yǎng)6周的野生型煙草無菌苗葉片，在超凈臺(tái)中，切下5 X 5mm的煙草葉盤(去掉主葉脈)，懸浮于上述步驟2制備好的EHA105/pCBIbEST農(nóng)桿菌菌液中，IOmin后將菌液吸出，將侵染過的煙草葉盤接種培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基(1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA的MS)上。28°C、黑暗，共培養(yǎng)3d。(2)將共培養(yǎng) 3d后的煙草葉盤用含有 500mg/l CarbU.0mg/16_BA、0.lmg/lNAA 的MS液體培養(yǎng)基洗滌2次后，將煙草葉盤轉(zhuǎn)至含有1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的固體MS培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為27±1°C、每日13h、30001x的光照。培養(yǎng)4周后，將不定芽轉(zhuǎn)移至含有1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行不定根誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件為27土1°C、每日13h、30001x的光照。4_8周后，形成完整的再生植株，得到Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草。采用同樣的方法將空載體pCBGUS轉(zhuǎn)入野生型煙草中，得到轉(zhuǎn)空載體煙草。2)分子鑒定用CTAB法提取Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草、轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草的基因組DNA作為模板，用常規(guī)方法進(jìn)行PCR檢測，所使用的IbEST基因引物為:primerl:5 ' -GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3 '(序列表中序列 7)和 primer2:5' -CCACTTTAGGGCCAAAATCA-3'(序列表中序列 8)。在 0.2ml Eppendorf 離心管中加入IOXPCR buffer2y l、4dNTP(10mol/L) I μ 1、引物(10ymol/l)均為 I μ 1、模板 DNA (50ng/ul) 2 μ 1、Taq DNA聚合酶0.25ul，加H2O至總體積20 μ I。反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30S，55°C復(fù)性30S，72°C延伸2min，共35個(gè)循環(huán)。電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果見圖1 (泳道M為Maker:泳道P為陽性對照(重組質(zhì)粒pCBIbEST);泳道W野生型煙草植株；泳道Tl-泳道T8為T0代轉(zhuǎn)IbEST煙草)，可以看出，得到622bp的為陽性Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草，泳道Tl-泳道T8所示的Ttl代轉(zhuǎn)IbSnRKl煙草均為陽性，表明IbEST基因已經(jīng)整合到煙草的基因組中，并證明這些再生植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。
轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草結(jié)果無顯著差異。將經(jīng)鑒定為陽性的編號(hào)為Tl、T3、T5的Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草擴(kuò)繁，進(jìn)行耐鹽性鑒定及相關(guān)生理指標(biāo)的測定。二、轉(zhuǎn)IbEST煙草植株的耐鹽鑒定1、表型鑒定將編號(hào)為Tl、T3、T5的Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草植株、轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草植株(CK)分別用含有200mmol/L NaCl的水溶液澆灌，每7d澆灌I次，連續(xù)澆灌4周后，觀察植株生長情況。每個(gè)株系3株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖2所示，可以看出，編號(hào)為T1、T3、T5的Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草植株比野生型對照植株生長明顯旺盛，株高顯著增高，表明其耐鹽性明顯增強(qiáng)。同時(shí)統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型煙草植株的株高，結(jié)果如下:編號(hào)為Tl的Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草的株高為17.5厘米；編號(hào)為Τ3的Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草的株高為17.2厘米；編號(hào)為Τ5的Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草的株高為16.9厘米；野生型煙草的株高為7.6厘米。轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草結(jié)果無顯著差異。2、脯氨酸和丙二醛含量的測定 植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽等脅迫時(shí)，游離的氨基酸便會(huì)大量積累，并且積累指數(shù)和植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可以作為植物抗逆性的一項(xiàng)生化指標(biāo)。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。MDA從膜上產(chǎn)生的位置上釋放出后，可以與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，改變這些大分子的構(gòu)型，或者使之產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，從而喪失功能，或抑制蛋白質(zhì)的合成。因此，MDA的積累可能對膜和細(xì)胞造成一定的傷害。對上述用含有200mmol/L NaCl的水溶液澆灌4周的編號(hào)為Tl、T3、T5的Ttl代轉(zhuǎn)IbEST煙草植株、轉(zhuǎn)空載體煙草和野生型煙草植株(CK)進(jìn)行脯氨酸和丙二醛含量的測定，測定方法參照鄒琦(植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000)，具體如下:I)脯氨酸含量的測定(I)脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作①取7支試管按照下表I加入各試劑?；靹蚝笊w上蓋子，在沸水中加熱40min。表I為7支試管加入試劑組分
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(1)-(3)中任一種的DNA分子: (1)編碼區(qū)為序列表中序列I所示的DNA分子； (2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。
7.權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
9.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述耐逆性為耐鹽性；所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘薯耐鹽相關(guān)蛋白IbEST及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與甘薯耐鹽相關(guān)的蛋白，名稱為IbEST，來源于甘薯(Ipomoea batatas)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供IbEST基因及其所編碼的蛋白在植物對抗非生物脅迫的過程中起著重要的作用。本發(fā)明所提供的IbEST蛋白及其編碼基因在提高植物耐鹽研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場前景。
文檔編號(hào)C07K14/415GK103204915SQ20131012514
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者劉慶昌, 翟紅, 何紹貞, 王連軍, 劉德高 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)