專利名稱：一種匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，專用于匍匐型地被菊分子育種工作， 屬于菊花分子育種領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
地被菊是一類同時具備綠化、美化、彩化和香化綜合功能的獨特地被植物，株型低矮 或匍匐，但匍匐型品種目前還奇缺，其推廣應(yīng)用前景極為廣闊，倍受園林部門關(guān)注。因 而篩選、培育具有優(yōu)良性狀的匍匐型地被菊新品種有著巨大的實用價值和經(jīng)濟意義。
近年來，隨著植物基因工程的發(fā)展，分子育種克服了常規(guī)育種的種種限制，為利用新 的基因資源改良菊花品種提供了新的手段和途徑。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其易操作、低費用、 高效率、插入DNA片段大、穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)低等優(yōu)點，成為轉(zhuǎn)基因策略中的首 選方法。自Lemieux利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法誕生第l株轉(zhuǎn)基因菊花以來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳 轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)在菊花遺傳轉(zhuǎn)化方面獲得了成功。但菊花轉(zhuǎn)基因還存在對基因型依賴性強、 轉(zhuǎn)化頻率低、轉(zhuǎn)化后外植體再生困難、重復(fù)性差、轉(zhuǎn)化細胞不易成苗等問題，因此，針 對不同類型菊花品種建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，已成為大范圍菊花分子育種首要解決的問題。
匍匐型地被菊的遺傳轉(zhuǎn)化研究至今未見報道，因此，系統(tǒng)深入研究其遺傳轉(zhuǎn)化條件， 建立專門針對匍匐型地被菊的遺傳轉(zhuǎn)化體系，可為地被菊分子育種工作提供理論基礎(chǔ)和 實驗依據(jù)，有效推進匍匐型地被菊分子育種進程。
三、
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是針對根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菊花轉(zhuǎn)基因存在的基因型依賴性強、轉(zhuǎn)化頻率 低、轉(zhuǎn)化后外植體再生困難、重復(fù)性差、轉(zhuǎn)化細胞不易成苗等問題，專門對匍匍型地被 菊的遺傳轉(zhuǎn)化條件進行了系統(tǒng)深入研究，建立了一套適用于匍匐型地被菊的遺傳轉(zhuǎn)化體 系，為匍匐型地被菊分子育種奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)方案
一種匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括 1)無菌苗的獲得
于秋末取匍匐型地被菊腳芽，洗滌劑清洗15min，流水沖洗2h，濾紙吸干水分，無 菌條件下依次用體積比為70。/。的乙醇浸泡30s，質(zhì)量百分比為0."/。的升汞溶液消毒6min， 無菌水沖洗4次，切取0.5cm帶腋芽的莖段，接種于MS+細胞分裂素6-BA1.0mg丄"+生長素NAA 0.1 mg丄—1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，不定芽長至2cm左右時切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng) 基1/2MS+生長素NAA0.1 mg丄—1獲得無菌苗；
2) 農(nóng)桿菌懸浮液制備
菊花'鐘山紅楓'Di^Bfl基因的克隆、植物表達載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
① Z)i 五Sa基因克隆與連接
以菊花品種'鐘山紅楓'RNA為模板進行RT-PCR (Reverse transcription PCR，以RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA的PCR)擴增合成"i 五^"基因的cDNA開放閱讀框ORF (Open Reading Frame),擴增引物如下(下劃線部分為酶切位點，^附///和/;>7/分別 為酶切正向引物和反向引物的內(nèi)切酶)
正向引物5，-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3, I
反向引物5，-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3 ， 用瓊脂糖凝膠電泳回收純化以上RT-PCR目的產(chǎn)物片段872bp，與T-載體(T-easy Vector) 連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，進行LB+50mg七"氨芐青霉素平板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件 為37°〇和16h，挑取白色克隆接種于LB培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37匸和16h， 提取含有基因片段的T-載體質(zhì)粒，測序驗證；
② pCAMBIA1301-￡>i ￡5a植物表達載體構(gòu)建與DH5a轉(zhuǎn)化
用5aw//1和I雙酶切連接到T-載體的D7 五5a基因，電泳回收目的片段，與用 Bam/H和I雙酶切過的植物表達載體pCAMBIA 1301連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感 受態(tài)，挑取陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37'C和16h，提取質(zhì) 粒，5awHI和K戶I雙酶切鑒定pCAMBIA1301-Di 五^重組質(zhì)粒；
③ pCAMBIA1301-Di^萬fl植物表達載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與鑒定 pCAMBIA1301-Di 五Ba重組質(zhì)粒采用液氮冷凍法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)菌株，
于YEP+50 mg丄"卡那霉素+50 mg丄-1利福平固體培養(yǎng)基劃板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28。C和 48h，挑取單克隆于YEP+50 mg丄"卡那霉素+50 mg七"利福平液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，培 養(yǎng)條件為28i:和12h，震蕩速度200rmiiT1，采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒并進行雙酶切檢 測，經(jīng)酶切驗證含有pCAMBIA1301-Di 五B"重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液則可用于下一步的葉 盤侵染。添加終濃度20% (體積比)的甘油至農(nóng)桿菌菌液，-8(TC長期保存；
將-8(TC保存的農(nóng)桿菌菌液常溫化凍后于YEP+50 mg丄"卡那霉素+50 mg七"利福平固 體培養(yǎng)基劃板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28'C和48h，挑取單克隆接種于30mlYEP+50mg'L"卡那 霉素+50mg丄"利福平液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28。C，震蕩速度200rmirT1，至 農(nóng)桿菌長至對數(shù)生長期即OD6oo為0.5時，將菌液倒入無菌離心管中，4000rpm離心10min， 收集菌體沉淀，用等量30mlMS液體培養(yǎng)基重懸，備用；
3) 遺傳轉(zhuǎn)化體系建立
在超凈工作臺上，25天苗齡的無菌苗頂端2-4片幼嫩葉片切成5mi^大小，在黑暗條件下進行下述培養(yǎng)在MS十細胞分裂素6-BA1.0 mg丄"+生長素NAAl.O mg丄—1培養(yǎng)基上 預(yù)培養(yǎng)3d，在上述制備的農(nóng)桿菌懸浮液中侵染10min，用無菌濾紙吸干葉面菌液，放置 于MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg.L"+生長素NAAl.O mg丄"上25。C共培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)入脫菌培 養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg'L"+生長素NAAl.O mg丄"+羧芐青霉素Carb350 mg-L—1 上脫菌培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg七"+生長素NAAl.O mg丄"+潮霉素Hyg8 mg丄—羧芐青霉素Carb250 mg丄"上培養(yǎng)至誘導(dǎo)出愈傷組織，之后 轉(zhuǎn)入低選擇壓的篩選培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg丄"+生長素NAALO mg丄"+潮 霉素Hyg6 mg七"+羧,青霉素Carbl50 mg'U1上繼續(xù)培養(yǎng)至萌發(fā)不定芽點，以上黑暗培 養(yǎng)時溫度均為26i2'C，共培養(yǎng)時除外；
切取帶有不定芽點的愈傷塊轉(zhuǎn)入不加抗生素的再生培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg七"+生長素NAAl.O mg丄"上，在溫度為26士2t:，光照時間為16h'cT1的條件下培養(yǎng)， 待不定芽長至2.0cm左右時，切下不定芽轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基1/2MS+生長素NAA 0.1 mg.L"+潮霉素Hyg7mg七—1，獲得具有潮霉素抗性的生根苗，將生根苗轉(zhuǎn)入1/2MS+生長 素NAAO.l mg丄"培養(yǎng)基中正常生根； 4)轉(zhuǎn)基因植株的獲得
待抗性植株長出8-10片葉時，取其嫩葉，采用CTAB法提取基因組DNA。根據(jù)潮 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因/^r兩端序列合成擴增反應(yīng)引物Hyg-F (正向序列)和Hyg-R (反 向序列)
Hyg-F: 5'- CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3' Hyg-R: 5'-TACTTCTACACAGCCATC-3'
分別以抗性植株和未轉(zhuǎn)化的野生植株的DNA為模板，以Hyg-F和Hyg-R為引物， 進行PCR擴增，PCR鑒定結(jié)果顯示抗性植株在近1000bp下方擴增出一條清晰的條帶， 未轉(zhuǎn)化野生植株則沒有擴增出相應(yīng)的條帶，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析表明與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移 酶基因/ffr核苷酸序列一致(950bp)，證實外源基因已轉(zhuǎn)入地被菊基因組DNA中。
有益效果
本發(fā)明提供的匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點
和積極效果
1. 本發(fā)明首次針對地被菊中奇缺的匍匐型品種，對其遺傳轉(zhuǎn)化條件進行了系統(tǒng)深入 的研究，為后續(xù)的匍匐型地被菊分子育種工作提供了最基本的方法。
2. 遺傳轉(zhuǎn)化體系建立中，對影響遺傳轉(zhuǎn)化的條件如預(yù)培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌侵染時間、 共培養(yǎng)時間、脫菌培養(yǎng)時間進行了摸索，獲得了最佳遺傳轉(zhuǎn)化組合。
3. 在篩選方式上，針對匍匐型地被菊對篩選抗生素(潮霉素)敏感的問題，采用了
高選擇壓長時間篩選抗性芽點，無選擇壓恢復(fù)抗性芽分化和生長，再高選擇壓篩選抗性
不定芽并結(jié)合生根篩選的多次篩選方法，取得了較好效果，提高了轉(zhuǎn)化體再生率。4.在脫菌方法上，基于脫菌抗生素(羧芐青霉素)對匍匐型地被菊葉片再生的強烈 抑制作用，在遺傳轉(zhuǎn)化初期使用高濃度脫菌抗生素抑制農(nóng)桿菌過度生長，在篩選的后期 降低脫菌素濃度，在有效抑制農(nóng)桿菌滋生的同時獲得較高的轉(zhuǎn)化體再生率。
四

圖1-2匍匐型地被菊葉盤再生過程.
左—右依次為脫分化期；初分化期；分化期；不定芽長至2-3cm時 圖3不同濃度潮霉素對地被菊葉盤再生的影響
A: Omg.L.1; B: 3mg'L"; C: 5mg,L-1;
D: 8mg七"；E: 10mg.L"; F: 20mg.L—1 圖4不同濃度潮霉素對地被菊不定芽生根的影響
A: Omg-L"; B: 3mg'L"; C: 5mg-L";
D: 8mg-L"; E: 10mg.L"; F: 20mg丄" 圖5抗性植株篩選過程
左—右依次為抗性愈傷篩選；抗性芽篩選；抗性芽恢復(fù)生長；生根篩選；經(jīng)
PCR檢測正常生根的轉(zhuǎn)基因植株 圖6轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測
M:分子量標記；0:質(zhì)粒陽性對照；WT:野生植株；1-7:抗性植株
五具體實施例方式
1) 無菌苗的獲得
于秋末取匍匐型地被菊品種'雨花勛章'(中國菊花研究網(wǎng)，
http:〃www. chrysanthemum, cn)生長健壯的地下腳芽，洗滌劑清洗15min，流水沖洗2h， 濾紙吸干水分，無菌條件下依次用體積比為70。/。的乙醇浸泡30s，質(zhì)量百分比為0.1%的 升汞溶液消毒6min，無菌水沖洗4次，切取0.5cm帶腋芽的莖段，接種于MS+細胞分裂 素6-BA1.0 mg七"+生長素NAAO.l mg七"培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，不定芽長至2cm左右 時切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+生長素NAAO.l mg丄—1獲得無菌苗；
2) 農(nóng)桿菌懸浮液制備
菊花'鐘山紅楓'Di 五5"基因的克隆、植物表達載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 ①Di^^a基因克隆與連接
以菊花品種'鐘山紅楓，(中國菊花研究網(wǎng)，http:Wwww.chrysanthemum.cn) RNA[總 RNA提取方法參照J.薩姆布魯克等著，分子克隆實驗指南(第三版)(上冊)，北京科 學(xué)出版社]為模板進行RT-PCR (Reverse transcription PCR，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成雙 鏈cDNA的PCR)擴增合成Di 五5a基因的cDNA開放閱讀框ORF(Open Reading Frame) [洪波等，AZ)i 五5L4基因在菊花中的異源表達提高了植株對干旱和鹽漬脅迫的耐性，中
7國科學(xué)C輯，2006， 36 (3): 223-231]，擴增引物如下(下劃線部分為酶切位點，B"mi/ /和&w /分別為酶切正向引物和反向引物的內(nèi)切酶)
正向引物5 ，-CGCGGATCCATGGATATCGAATCACACTAC-3 ， 爭I
反向引物5，-CGGGGTACCTCACTAAGAACACCACAACGA-3' 擴增體系(25pL):
10xbuffer2.5pL， 25mM MgCl2 1.5pL， 2.5mM dNTP 2.0pL， 20pM正向引物l.OpL， 20nM反向引物l攀，Taq酶1U， Template cDNA l單，ddH20 16攀。
擴增程序
95°C 5min; 94°C lmin， 60°C lmin， 72°C lmin， 35 cycles; 72°C 10min。 4。C保存。 用瓊脂糖凝膠電泳回收純化以上RT-PCR目的產(chǎn)物片段872bp，與T-載體(T-easy Vector)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，進行LB+50 mg七—1氨芐青霉素平板培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為37'C和16h，挑取白色克隆接種于LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C 和16h，提取含有D及五5a基因片段的T-載體質(zhì)粒，測序驗證；
② pCAMBIA1301-Di 五5a植物表達載體構(gòu)建與DH5a轉(zhuǎn)化
用5aw/f I和^ " I雙酶切連接到T-載體的i)i 五5a基因，電泳回收目的片段，與用 Bawi/I和^pw I雙酶切過的植物表達載體pCAMBIA 1301[高秀麗，微測序基因芯片檢測 質(zhì)粒pCAMBIA1301，中國水稻科學(xué)，2005， 19(2): 181-186]連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a 感受態(tài)，挑取陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37'C和16h，提取 質(zhì)粒，5aw別和雙酶切鑒定pCAMBIA1301-￡)i ￡5a重組質(zhì)粒；
③ pCAMBIA1301-i)i ￡5a植物表達載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與鑒定 pCAMBIA1301-Di^Ba重組質(zhì)粒采用液氮冷凍法[朱錦輝，根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的
制備以及質(zhì)粒ProkII對其轉(zhuǎn)化的研究，西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006， 34 (7): 92-95]轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)菌株，于YEP+50 mg七—1卡那霉素+50 mg-L—1 利福平固體培養(yǎng)基劃板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28'C和48h，挑取單克隆于YEP+50 mg七—i卡 那霉素+50 mg七4利福平液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28'C和12h，震蕩速度200rmin "，采用堿裂解法(楊獻光，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的研究，生物技術(shù)通報，2006， 6: 24-26)提取重組質(zhì)粒并進行雙酶切檢測。經(jīng)酶切驗證含有pCAMBIA1301-D7 五^ 重組質(zhì) 粒的農(nóng)桿菌菌液則可用于下一步的葉盤侵染。添加終濃度20% (體積比)的甘油至農(nóng)桿 菌菌液，-S(TC長期保存；
將-80'C保存的農(nóng)桿菌菌液常溫化凍后于YEP+50 mg'L—1卡那霉素+50 mg'L—1利福平固 體培養(yǎng)基劃板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28t:和48h，挑取單克隆接種于30ml YEP+50mg'Ui卡 那霉素+50 mg，i;1利福平液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C ，震蕩速度200rmin —1 ， 至農(nóng)桿菌長至對數(shù)生長期即OD,為0.5時，將菌液倒入無菌離心管中，4000rpm離心 10min，收集菌體沉淀，用等量30mlMS液體培養(yǎng)基重懸，備用；
83) 遺傳轉(zhuǎn)化體系建立
在超凈工作臺上，25天苗齡的無菌苗頂端2-4片幼嫩葉片切成5mr^大小，在黑暗條 件下進行下述培養(yǎng)在MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg'L"+生長素NAA1.0 mg'L—1培養(yǎng)基上 預(yù)培養(yǎng)3d，在上述制備的農(nóng)桿菌懸浮液中侵染10min，用無菌濾紙吸干葉面菌液，放置 于MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg七"+生長素NAA1.0 mg七—1上25。C共培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)入脫菌培 養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg.L"+生長素NAA1.0 mg'L"+羧節(jié)青霉素Carb350 mg-L" 上脫菌培養(yǎng)3d,然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg七"+生長素NAA1.0 mg丄"+潮霉素Hyg8 mg.L—1+羧芐青霉素Carb250 mg七—1上培養(yǎng)至誘導(dǎo)出愈傷組織，之后 轉(zhuǎn)入低選擇壓的篩選培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg丄"+生長素NAA1.0 mg丄"+潮 霉素Hyg6 mg.L"+羧芐青霉素Carbl50 mg丄"上繼續(xù)培養(yǎng)至萌發(fā)不定芽點，以上黑暗培 養(yǎng)時溫度均為26i2'C，共培養(yǎng)時除外；
切取帶有不定芽點的愈傷塊轉(zhuǎn)入不加抗生素的再生培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0 mg丄"+生長素NAA1.0mg丄"上，在溫度為26士2X:，光照時間為16h'd"的條件下培養(yǎng)， 待不定芽長至2.0cm左右時，切下不定芽轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基1/2MS+生長素NAA 0.1 mg七"+潮霉素Hyg7mg七—1，獲得具有潮霉素抗性的生根苗，將生根苗轉(zhuǎn)入1/2MS+生長 素NAAO.l mg丄"培養(yǎng)基中正常生根；
4) 遺傳轉(zhuǎn)化植株的獲得
待抗性植株長出8-10片葉時，取其嫩葉，采用CTAB法(鄒喻萍，系統(tǒng)與進化學(xué)中 的分子標記[M]，科學(xué)出版社，2001: 3-9)提取基因組DNA。根據(jù)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基 因i/戶r兩端序列合成擴增反應(yīng)引物(由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)Hyg-F (正向序 列)和Hyg-R (反向序列)
Hyg-F: 5'-CGTCTGTCGAGAAGTTTC隱3' Hyg-R: 5'-TACTTCTACACAGCCATC-3'
分別以抗性植株和未轉(zhuǎn)化的野生植株的DNA為模板，以Hyg-F和Hyg-R為引物，進 行PCR擴增，PCR鑒定結(jié)果顯示抗性植株在近1000bp下方擴增出一條清晰的條帶，未 轉(zhuǎn)化植株則沒有擴增出相應(yīng)的條帶，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序分析表明與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 i/尸r核苷酸序列一致(950bp)，證實外源基因已轉(zhuǎn)入地被菊基因組DNA中(圖6)，初 步獲得了 PCR檢測單株60個，對單株進行擴繁獲得60個轉(zhuǎn)基因株系。
擴增體系為lulDNA模板，2uldNTPMixture (各2.5mM)， 2 5ul 10xPCRBuffer, 1.5ul MgCl2 (2.5mM)， lUTaq酶，Hyg-F禾口 Hyg-R (20uM)各lul，去離子水補足25uL。
擴增條件為94。C預(yù)變性5min; 94。C變性lmin， 60。C退火lmin， 72。C延伸lmin， 35 個循環(huán)；72'C延伸10min。序列表
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種匍匍型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法
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<221> DREBa基因擴增引物反向序列<formula>formula see original document page 11</formula>
權(quán)利要求
1、一種匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括1)無菌苗的獲得于秋末取匍匐型地被菊腳芽，洗滌劑清洗15min，流水沖洗2h，濾紙吸干水分，無菌條件下依次用體積比為70％的乙醇浸泡30s，質(zhì)量百分比為0.1％的升汞溶液消毒6min，無菌水沖洗4次，切取0.5cm帶腋芽的莖段，接種于MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生長素NAA0.1mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，不定芽長至2cm左右時切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+生長素NAA0.1mg·L-1獲得無菌苗；2)農(nóng)桿菌懸浮液制備菊花‘鐘山紅楓’DREBa基因的克隆、植物表達載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化①DREBa基因克隆與連接以菊花品種‘鐘山紅楓’RNA為模板進行RT-PCR擴增合成DREBa基因的cDNA開放閱讀框ORF，擴增引物如下 BamHI正向引物5’-CGC<u>GGATCC</u>ATGGATATCGAATCACACTAC-3’ Kpn I反向引物5’-CGG<u>GGTACC</u>TCACTAAGAACACCACAACGA-3’用瓊脂糖凝膠電泳回收純化以上RT-PCR目的產(chǎn)物片段872bp，與T-載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，進行LB+50mg·L-1氨芐青霉素平板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃和16h，挑取白色克隆接種于LB培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃和16h，提取含有DREBa基因片段的T-載體質(zhì)粒，測序驗證；②pCAMBIA1301-DREBa植物表達載體構(gòu)建與DH5α轉(zhuǎn)化用BamH I和Kpn I雙酶切連接到T-載體的DREBa基因，電泳回收目的片段，與用BamH I和Kpn I雙酶切過的植物表達載體pCAMBIA 1301連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑取陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃和16h，提取質(zhì)粒，BamHI和KpnI雙酶切鑒定pCAMBIA1301-DREBa重組質(zhì)粒；③pCAMBIA1301-DREBa植物表達載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與鑒定pCAMBIA1301-DREBa重組質(zhì)粒采用液氮冷凍法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)菌株，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固體培養(yǎng)基劃板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃和48h，挑取單克隆于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃和12h，震蕩速度200r·min-1，采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒并進行雙酶切檢測，經(jīng)酶切驗證含有pCAMBIA1301-DREBa重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液則可用于下一步的葉盤侵染。添加終濃度體積比20％的甘油至農(nóng)桿菌菌液，-80℃長期保存；將-80℃保存的農(nóng)桿菌菌液常溫化凍后于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固體培養(yǎng)基劃板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃和48h，挑取單克隆接種于30ml YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃，震蕩速度200r·min-1，至農(nóng)桿菌長至對數(shù)生長期即OD600為0.5時，將菌液倒入無菌離心管中，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，用等量30ml MS液體培養(yǎng)基重懸，備用；3)遺傳轉(zhuǎn)化體系建立在超凈工作臺上，25天苗齡的無菌苗頂端2-4片幼嫩葉片切成5mm2大小，在黑暗條件下進行下述培養(yǎng)在MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生長素NAA1.0mg·L-1培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，在上述制備的農(nóng)桿菌懸浮液中侵染10min，用無菌濾紙吸干葉面菌液，放置于MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生長素NAA1.0mg·L-1上25℃共培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)入脫菌培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生長素NAA1.0mg·L-1+羧芐青霉素Carb350mg·L-1上脫菌培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生長素NAA1.0mg·L-1+潮霉素Hyg8mg·L-1+羧芐青霉素Carb250mg·L-1上培養(yǎng)至誘導(dǎo)出愈傷組織，之后轉(zhuǎn)入低選擇壓的篩選培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生長素NAA1.0mg·L-1+潮霉素Hyg6mg·L-1+羧芐青霉素Carb150mg·L-1上繼續(xù)培養(yǎng)至萌發(fā)不定芽點，以上黑暗培養(yǎng)時溫度均為26±2℃，共培養(yǎng)時除外；切取帶有不定芽點的愈傷塊轉(zhuǎn)入不加抗生素的再生培養(yǎng)基MS+細胞分裂素6-BA1.0mg·L-1+生長素NAA1.0mg·L-1上，在溫度為26±2℃，光照時間為16h·d-1的條件下培養(yǎng)，待不定芽長至2.0cm左右時，切下不定芽轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基1/2MS+生長素NAA 0.1mg·L-1+潮霉素Hyg7mg·L-1，獲得具有潮霉素抗性的生根苗，將生根苗轉(zhuǎn)入1/2MS+生長素NAA0.1mg·L-1培養(yǎng)基中正常生根；4)轉(zhuǎn)基因植株的獲得待抗性植株長出8-10片葉時，取其嫩葉，采用CTAB法提取基因組DNA，根據(jù)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HPT兩端序列合成擴增反應(yīng)引物Hyg-F正向序列和Hyg-R反向序列Hyg-F5′-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3′Hyg-R5′-TACTTCTACACAGCCATC-3′以抗性植株的DNA為模板，以Hyg-F和Hyg-R為引物，進行PCR擴增，PCR鑒定結(jié)果顯示抗性植株擴增出一條清晰的條帶950bp，與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HPT核苷酸序列一致，證實外源基因已轉(zhuǎn)入地被菊基因組DNA中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種匍匐型地被菊遺傳轉(zhuǎn)化的方法，屬于菊花分子育種領(lǐng)域。以菊花品種“鐘山紅楓”RNA為模板擴增合成DREBa基因，克隆到T-載體，雙酶切獲取的DREBa基因目的片段與pCAMBIA 1301連接，而后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得含有重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-DREBa的農(nóng)桿菌菌液；無菌苗葉圓片用農(nóng)桿菌液侵染10min，共培養(yǎng)3d、脫菌培養(yǎng)3d、篩選培養(yǎng)獲得具潮霉素抗性的生根苗。經(jīng)PCR檢測證實外源基因已轉(zhuǎn)入地被菊基因組DNA中。本發(fā)明首次針對匍匐型地被菊建立了其遺傳轉(zhuǎn)化體系，為地被菊分子育種工作提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，將有效推動其分子育種進程。
文檔編號C12N15/29GK101451140SQ200910028638
公開日2009年6月10日 申請日期2009年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日
發(fā)明者劉兆磊, 姜貝貝, 崔新利, 房偉民, 滕年軍, 管志勇, 繆恒彬, 陳發(fā)棣, 陳素梅 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (1),