專利名稱：一種含有甘露聚糖的配體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有甘露聚糖的配體及其制備方法和在納米載體表面修飾中的應(yīng)用，屬 于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
納米載體是一種近年來十分熱門的非病毒載體。由于其和病毒載體相比安全低毒、無免 疫原性以及其極小的粒徑可以達(dá)到人們需要的治療目的，納米載體在基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床醫(yī) 學(xué)研究領(lǐng)域都越來越受到人們的重視。然而，由于缺乏對(duì)于目標(biāo)器官、組織和細(xì)胞的特異性 識(shí)別性能，可能導(dǎo)致意想不到的毒副作用，從而限制了納米載體的應(yīng)用。
對(duì)納米載體進(jìn)行表面修飾，使其成為表面帶有特殊配體的修飾納米載體，從而賦予其特 異性識(shí)別靶位，主動(dòng)靶向目標(biāo)細(xì)胞和組織的能力，是醫(yī)藥和化學(xué)工作者追求的目標(biāo)。利用各 種糖類對(duì)納米載體進(jìn)行表面修飾，可以靶向細(xì)胞表面的糖類受體一凝集素，從而達(dá)到細(xì)胞識(shí) 別和定位耙向的目的。
使用糖類對(duì)于納米載體進(jìn)行表面修飾有很多類型，例如可以直接將糖類連接到納米載體 材料的表面；可以使用多糖對(duì)納米載體進(jìn)行包覆；可以合成含有糖類的糖脂或者其他衍生物 作為配體，從而賦予其更多的靶向特性等。其中最后一種使用最為廣泛，這類配體的種類也 相當(dāng)繁多。
將糖類修飾的納米載體荷載基因，用于基因治療，是一個(gè)新的發(fā)展方向，科研人員也在 糖修飾載荷基因納米載體方面取得了一定的進(jìn)展。如何選擇和設(shè)計(jì)合適的含有糖類的配體， 顯得至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合 物；本發(fā)明的另一目的在于提供該接枝聚合物的制備方法；本發(fā)明的再一目的在于應(yīng)用該接 枝聚合物作為配體用于荷基因納米載體的構(gòu)建。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下-
本發(fā)明合成了一種作為配體的甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物，具有如下結(jié)構(gòu)通
背景技術(shù)：
式(ni)
本發(fā)明甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體的合成路線如下:<formula>formula see original document page 5</formula>
式(m)
本發(fā)明甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體的制備方法包括如下步驟
(A) 將100—500mg的甘露聚糖溶解于1 —5mL，濃度為l一5mol/L的氫氧化鈉溶液中， 攪拌10—30分鐘使其堿化后，加入1.2—6mL, 16%的一氯乙酸，并在55—65° C油浴條件下 攪拌7 — 18小時(shí)得到式(I)產(chǎn)物；此時(shí)加入1—3mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值2 —3，得到式(II)所示
羧甲基化的甘露聚糖。
(B) 步驟(A)得到的羧甲基化的甘露聚糖用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，攪拌下加入同 樣用二甲基亞砜(DMSO)溶解的磷脂酰乙醇胺(PE) 5 —30mg，冰浴條件下逐滴加入二甲基 亞砜(DMSO)溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC'HCl)12—60mg，其 中加入等摩爾量的三乙胺，冰浴攪拌一小時(shí)，然后室溫?cái)嚢?8 — 72小時(shí)；旋蒸除去二甲基 亞砜(DMSO)，沉淀物用Milli-Q純水溶解后透析60—72小時(shí)，旋蒸干得產(chǎn)物。
本發(fā)明甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體的制備方法優(yōu)選如下步驟
(A) 將100mg的甘露聚糖溶解于lmL，濃度為3mol/L的氫氧化鈉溶液中，攪拌10分鐘 使其堿化后，加入1.2mL， 16%的一氯乙酸，并在55° C油浴條件下攪拌7小時(shí)得到式(I)產(chǎn) 物；此時(shí)加入lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值2—3，得到式(II)所示羧甲基化的甘露聚糖。
(B) 步驟(A)得到的羧甲基化的甘露聚糖用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，攪拌下加入同 樣用二甲基亞砜(DMSO)溶解的磷脂酰乙醇胺(PE) 5mg，冰浴條件下逐滴加入二甲基亞砜
(DMSO)溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)12mg，其中加入等摩爾量的三乙胺，冰浴攪拌一小時(shí)，然后室溫?cái)嚢?8小時(shí)；旋蒸除去二甲基亞砜(DMS0)， 沉淀物用Milli-Q純水溶解后透析72小時(shí)，旋蒸干得產(chǎn)物。 以上試劑濃度均為質(zhì)量體積比。
本發(fā)明中所述的接枝聚合物用做配體制備修飾荷基因納米載體，使用該配體、固體脂質(zhì) 或多聚物、乳化劑、表面活性劑和基因，構(gòu)建多種荷基因納米載體，包括荷載基因的脂質(zhì)體、 固體脂質(zhì)納米粒、聚乳酸納米粒、聚乳酸乙醇酸共聚物納米粒、聚乳酸一聚乙二醇納米粒、 聚乙烯亞胺一聚乙二醇納米粒、多聚賴氨酸納米粒、聚乙二醇一聚己內(nèi)酯嵌段共聚物納米粒等等。
接枝聚合物用做配體制備的修飾荷基因納米載體的各成分用量如下甘露聚糖和磷脂酰 乙醇胺的接枝聚合物配體5—25mg，固體脂質(zhì)或者多聚物10—35mg，乳化劑5—30mg，陽離 子表面活性劑10—30mg，基因1-6mg。
上述的固體脂質(zhì)選自硬脂酸、棕櫚酸、膽固醇、單硬脂酸甘油酯、雙硬脂酸甘油酯、三 硬脂酸甘油酯、山榆酸甘油酯、三月桂酸甘油酯等材料之一或者它們的組合。
上述的多聚物選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚乙二醇、聚乳酸/ 乙醇酸共聚物等材料之一或者它們的組合或嵌段共聚物。
上述的乳化劑選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、羊腦卵磷脂、腦磷脂、磷脂酰乙醇胺以及 合成磷脂二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二豆蔻酰磷脂酰膽堿，泊洛沙姆、泰洛沙姆等材料之一或者 它們的組合。
上述的陽離子表面活性劑選自十二烷基三甲基氯化銨，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)， 雙十二垸基二甲基溴化銨(DDAB)，十八酰氨乙基二乙基節(jié)基氯化銨或十八酰氨乙基三甲基 甲硫酸銨中的一種或幾種。
本發(fā)明中所述的修飾荷基因納米載體的制備方法如下
方法一溶劑擴(kuò)散法。將固體脂質(zhì)或多聚物和乳化劑溶解于有機(jī)溶劑構(gòu)成有機(jī)相，將陽 離子表面活性劑溶于雙蒸水中構(gòu)成水相，將有機(jī)相勻速滴加到水相，攪拌下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑后 得陽離子納米載體混懸液。將納米混懸液和基因復(fù)合孵育，成為陽離子荷基因納米載體。將 配體溶解于雙蒸水中，勻速滴加到荷基因納米載體混懸液中，攪拌下使其充分結(jié)合，得修飾 納米載體。
方法二溶劑乳化一揮發(fā)法。將固體脂質(zhì)或多聚物和乳化劑溶解于與水不相混溶的有機(jī)
溶劑構(gòu)成有機(jī)相，加入溶解有單鏈陽離子類脂的水相中，攪拌下?lián)]發(fā)有機(jī)溶劑后得納米載體 混懸液。將納米混懸液和基因復(fù)合孵育，成為陽離子荷基因納米載體。將配體溶解于雙蒸水 中，勻速滴加到荷基因納米載體混懸液中，攪拌下使其充分結(jié)合，得修飾納米載體。
方法三薄膜分散法。將固體脂質(zhì)或多聚物和乳化劑溶解于有機(jī)溶劑中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 除去有機(jī)溶劑，形成一層脂質(zhì)薄膜，加入含有單鏈陽離子類脂的水溶液，后進(jìn)行超聲分散后得 納米載體混懸液。將納米混懸液和基因復(fù)合孵育，成為陽離子荷基因納米載體。將配體溶解 于雙蒸水中，勻速滴加到荷基因納米載體混懸液中，攪拌下使其充分結(jié)合，得修飾納米載體。
方法四微乳法。將固體脂質(zhì)或多聚物、乳化劑和單鏈陽離子類脂混合溶于水形成透明
的微乳體系，在將其迅速分散到冷水(2—3'C)中得納米載體混懸液。將納米混懸液和基因
復(fù)合孵育，成為陽離子荷基因納米載體。將配體溶解于雙蒸水中，勻速滴加到荷基因納米載體混懸液中，攪拌下使其充分結(jié)合，得修飾納米載體。
上述方法中的有機(jī)溶劑，選自丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或乙醚中 的一種或者它們的組合。
上述修飾荷基因納米載體的制劑制備將所得的修飾納米載體混懸液梯度通過微孔濾膜 過濾后，加入凍干保護(hù)劑(如甘露醇)后，冷凍干燥，得凍干制劑。
本發(fā)明甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物可作為配體應(yīng)用于各種陽離子荷基因納 米載體的表面修飾。接枝聚合物用做配體制備的修飾荷基因納米載體在主動(dòng)靶向基因傳遞中 的應(yīng)用。
本發(fā)明制得的甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物其作為配體制備的修飾荷基因納 米復(fù)合物的優(yōu)點(diǎn)如下
(1) 該接枝聚合物制備簡(jiǎn)單，溶解性較好，其中含有甘露聚糖部分，可以靶向巨噬細(xì) 胞表面的甘露糖受體一刀豆球蛋白A (伴刀豆凝集素A)，為制備具有主動(dòng)靶向性能的修飾納 米載體提供了前提條件。
(2) 該接枝聚合物中含有的磷脂酰乙醇胺，即通常所稱的腦磷脂，具有天然的親脂性， 并且和甘露聚糖連接后，暴露出的一端羧基具有負(fù)電荷，由于可以和陽離子納米載體靜電吸 引和傾向于摻入含有脂質(zhì)的材料表面的性質(zhì)，使制備修飾納米載體成為可能。
(3) 采用各種方法制備的陽離子納米載體，可以通過靜電吸附荷載基因，使用該接枝 聚合物作為配體對(duì)荷基因納米載體進(jìn)行表面修飾，制得的修飾納米載體表面形態(tài)圓整光滑， 粒徑較小，粒度分布集中，可以較為理想的控制基因的緩慢釋放。
(4) 制得的修飾荷基因納米載體作用于巨噬細(xì)胞，表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性，并且成功
實(shí)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞的耙向轉(zhuǎn)染。
(5) 制得的修飾荷基因納米載體混懸液還可以通過冷凍干燥方法進(jìn)行制劑，提高了其
儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)姆€(wěn)定性，延長了保質(zhì)期。


圖1是本發(fā)明制備的修飾荷基因納米載體的透射電鏡照片，放大10萬倍。 圖2是修飾荷基因納米載體的體外釋放曲線圖。
圖3是修飾荷基因納米載體的體外鼠類巨噬細(xì)胞(RAW)轉(zhuǎn)染的熒光倒置顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但不限于此。 實(shí)施例l.甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物(Mannan—PE)的合成 甘露聚糖(100mg)溶解于氫氧化鈉溶液(3mol/L， lmL)中，攪拌10分鐘使其堿化。再 加入一氯乙酸(16%, 1.2mL)并在55。C油浴條件下攪拌7小時(shí)，此時(shí)加入鹽酸(lmol/L)調(diào) 節(jié)pH值2—3，得到羧甲基化的甘露聚糖。羧甲基化的甘露聚糖用二甲基亞砜(DMSO)溶解 后，攪拌下加入同樣用二甲基亞砜溶解的磷脂酰乙醇胺(5mg)，冰浴條件下逐滴加入二甲基 亞砜溶解的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl) (12mg)(其中加入等摩 爾量的三乙胺)，冰浴攪拌一小時(shí)，然后室溫?cái)嚢?8小時(shí)。旋蒸除去二甲基亞砜，沉淀物用雙蒸水溶解后透析72小時(shí)，旋蒸干得產(chǎn)物。
對(duì)目標(biāo)化合物Mannan—PE以紅外分光光度法和核磁共振波譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證IR: 3441.7 cm" v(—OH， —NH—)； 2927.6 cm_1v (—CH2—， —CH—) ； 1642.1 cm—、(—HN—CO —,一HN—) ；1416.0 cm" v(—CH2CO_); 1090.3 cnT1 v (—C一0—C—，甘露聚糖上的 仲醇結(jié)構(gòu))結(jié)合甘露聚糖紅外光譜及磷脂酰乙醇胺紅外光譜相比可分析，其主要吸收峰一致, 因此，可以初步確定產(chǎn)物是Mannan—PE。
化合物的氫核磁共振譜分別用氘代二甲基亞砜和氘代水(D20)為溶劑測(cè)定。1HNMRS (3.0 6.0)與甘露聚糖圖譜比較，峰型基本一致，可以認(rèn)為目標(biāo)化合物含有甘露聚糖成分；S (0 3.0)與磷脂酰乙醇胺圖譜比較，峰型相似，可以確定目標(biāo)化合物也含有磷脂酰乙醇胺部分。 從僅有氘代二甲基亞砜為溶劑的氫核磁共振譜中S值在5. 2左右的曲線下面積明顯大于氘代 水(D20)為溶劑時(shí)，我們可以認(rèn)為有酰胺鍵的存在。因而可確定本實(shí)驗(yàn)所得的目標(biāo)化合物 是甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物(Maman—PE)。且根據(jù)甘露聚糖部分與磷脂酰乙 醇胺部分氫原子比例計(jì)算出約每150個(gè)甘露糖單糖單位接有1個(gè)磷脂酰乙醇胺。
實(shí)施例2.固體脂質(zhì)納米粒混懸液的制備
稱取硬脂酸25mg,卵磷脂15mg，混合后加入3mL丙酮超聲溶解，作為有機(jī)相。稱取20mg十 六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶解于20mL雙蒸水中，作為水相。將有機(jī)相以18mL/h的速度勻 速注入600r/min攪拌的水相中。繼續(xù)以400r/min攪拌8小時(shí)將有機(jī)溶劑揮發(fā)完全，調(diào)節(jié)pH值 為7.2—7.4，得到陽離子固體脂質(zhì)納米?；鞈乙骸?br> 實(shí)施例3:固體脂質(zhì)納米?；鞈乙豪砘再|(zhì)的研究
取實(shí)施例2中的固體脂質(zhì)納米?；鞈乙旱沃龄佊刑寄さ你~網(wǎng)上，靜置2min，用濾紙吸干 混懸液，再滴加質(zhì)量濃度為2W磷鎢酸負(fù)染2min，于透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)并拍照。另 取納米粒的混懸液適量，經(jīng)適當(dāng)稀釋后用Zetasizer 3000 HS納米粒度分析儀測(cè)定平均粒徑 和多分散度。再取納米粒混懸液適量，適當(dāng)稀釋后用納米粒度分析儀測(cè)定zeta電位。
透射電鏡下觀察的納米粒形態(tài)為球形或類球形實(shí)體顆粒，分布均勻，無聚集粘聯(lián)現(xiàn)象。 粒徑51.6士9. 1 nm，粒度分布O. 21 ±0.14， Zeta電位43. 54± 1. 33 mV。
實(shí)施例4:用固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐苽浜苫蚬腆w脂質(zhì)納米粒
取適量增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(pEGFP)和實(shí)施例2中的固體脂質(zhì)納米?；鞈乙簻u旋混 合均勻，室溫放置孵育20min，得荷基因固體脂質(zhì)納米粒(SLN—DNA)混懸液。
實(shí)施例5:采用實(shí)施例4中的荷基因固體脂質(zhì)納米粒混懸液進(jìn)行理化性質(zhì)的研究
方法同實(shí)施例3。納米粒形態(tài)為球形或類球形顆粒，分布均勻，無聚集粘聯(lián)現(xiàn)象。粒徑 94.5土8.8nm，粒度分布O. 18±0. 09， Zeta電位21. 37± 1. 20mV。
實(shí)施例6:修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒的制備
釆用實(shí)施例1中的甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物作為配體對(duì)實(shí)施例4中的荷基 因固體脂質(zhì)納米?；鞈乙哼M(jìn)行表面修飾首先將2mL荷基因固體脂質(zhì)納米粒溶于磷酸鹽緩沖 液(PBS， pH 7.4)置于磁力攪拌器上攪拌(400 rpm)，將甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝 聚合物溶于lmL磷酸鹽緩沖液(PBS， pH 7.4)，使用微量注射泵恒速(18 mL/h)注入荷基因 固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐?，攪拌孵育12小時(shí)使其完全修飾。離心(2000轉(zhuǎn)/分鐘)20分鐘除 去未修飾的接枝聚合物配體，雙蒸水溶解沉淀物并且水洗三遍。得到甘露聚糖修飾的荷基因 固體脂質(zhì)納米粒(Man-SLN-DNA)。實(shí)施例7:修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒的處方優(yōu)化
由于甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物(Mannan—PE)具有天然的親脂性，并且 磷脂酰乙醇胺帶正電荷的氨基端和甘露聚糖結(jié)合，暴露出帶負(fù)電的磷酸基端，因此整個(gè)配體 帶有負(fù)電荷。其在修飾過程中不斷的結(jié)合到荷基因固體脂質(zhì)納米粒的表面，逐漸的掩蓋了其 正電荷，于是在孵育的過程中Zeta電位會(huì)有一個(gè)降低的趨勢(shì)。于是，在制備過程中的兩個(gè)變 量Maman—PE配體和荷基因固體脂質(zhì)納米粒的質(zhì)量比例，以及復(fù)合孵育的時(shí)間，可以通 過考察甘露聚糖修飾的荷基因固體脂質(zhì)納米復(fù)合物的Zeta電位的變化來進(jìn)行優(yōu)化處方。最優(yōu) 的質(zhì)量比例和孵育時(shí)間，都是在Zeta電位降低到不再有明顯變化的時(shí)候達(dá)到的。從而采用不 同質(zhì)量比的Mannan—PE配體和荷基因固體脂質(zhì)納米粒，孵育12小時(shí)，篩選最優(yōu)質(zhì)量比；再 使用這個(gè)質(zhì)量比孵育不同的時(shí)間，篩選最優(yōu)孵育時(shí)間。
使用不同的配體和荷基因納米粒的質(zhì)量比例(Mannan—PE/SLN—DNA，w/w)，對(duì)處方 進(jìn)行優(yōu)化Mannan—PE/SLN—DNA (w/w)從1/10到10/10變化，甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺 的接枝聚合物(Mannan—PE)配體的量逐漸增加，觀察到Zeta電位逐漸下降，到4/10之后 不再顯著下降(P〉0.05)。證明配體和荷基因納米粒的質(zhì)量比為2/5時(shí)為最佳修飾比例。按照 上述最優(yōu)質(zhì)量比進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)，選擇從0 12小時(shí)內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)量Zeta電位，觀察到 隨著孵育時(shí)間的增加Zeta電位逐漸下降，至lj4小時(shí)之后不再顯著下降(P>0.05)。證明4小時(shí)為 最佳孵育時(shí)間。
采用篩選優(yōu)化的處方制備修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒將2mL (2mg/mL)荷基因固體脂 質(zhì)納米粒溶于磷酸鹽緩沖液(PBS， pH 7.4)置于磁力攪拌器上攪拌(400 rpm)，將甘露聚 糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物10mg溶于lmL磷酸鹽緩沖液(PBS， pH7.4)，使用微量注射 泵恒速(18 mL/h)注入荷基因固體脂質(zhì)納米?；鞈乙褐?，攪拌孵育4小時(shí)使其完全修飾。離 心(2000轉(zhuǎn)/分鐘)20分鐘除去未修飾的接枝聚合物配體，雙蒸水溶解沉淀物并且水洗三遍。 得到甘露聚糖修飾的荷基因固體脂質(zhì)納米粒(Man-SLN-DNA)。
實(shí)施例8:釆用實(shí)施例7中制備的修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行理化性質(zhì)研究 方法同實(shí)施例3。納米粒形態(tài)為球形或類球形顆粒，更為圓整光滑，分布均勻，無聚集 粘聯(lián)現(xiàn)象，見圖l。粒徑113. 7±10. 5nm，粒度分布O. 12±0. 07， Zeta電位5. 68±1. 12mV。 實(shí)施例9:采用實(shí)施例7中的修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行基因結(jié)合率研究 用PicoGreen熒光法測(cè)定未修飾的荷基因納米粒和修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒的基因結(jié) 合率。分別精密量取荷基因納米粒(SLN-DNA)和修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒(Man-SLN-DNA) 混懸液各200 Pl，高速離心(15000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)后，吸取上清IOO ixl， PicoGreen 熒光法測(cè)定上清液中游離DNA的濃度，按公式"DNA結(jié)合率- (總的DNA量-游離DNA量)/總的 DNA量X100《"計(jì)算DNA結(jié)合率。
定量測(cè)定荷基因納米粒(SLN-DNA)和修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒(Man-SLN-DNA)荷基 因率分別為92,15±1.02%和91.48±1.56%,由此可知修飾荷基因固體脂質(zhì)納米?？梢暂^好 的結(jié)合綠色熒光蛋白基因(pEGFP)，對(duì)荷基因固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行修飾對(duì)于其載基因的能力并 未產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05)。
實(shí)施例10:采用實(shí)施例7中的修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行體外釋放研究 采用恒溫振蕩搖床法進(jìn)行荷基因固體脂質(zhì)納米?；鞈乙旱捏w外釋放實(shí)驗(yàn)，用O. lmol/L的 磷酸鹽緩沖液(PBS， pH7.4)和150mmol/L的氯化鈉組成的混合溶液為釋放介質(zhì)。精密量取荷基因固體脂質(zhì)納米粒和修飾荷基因固體脂質(zhì)納米?；鞈乙焊?00u 1，加入等體積的釋放介 質(zhì)，37。C水浴恒溫振蕩(100轉(zhuǎn)/分鐘)。在預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)取樣，15000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取 上清100ul，測(cè)定綠色熒光蛋白基因(pEGFP)含量，并計(jì)算釋放百分含量，繪制釋放曲線。見 圖2.
結(jié)果表明在修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒中pEGEP的釋放在前12小時(shí)為一個(gè)相對(duì)速釋的過 程，之后持續(xù)緩釋到48小時(shí)，其釋放曲線符合Higuchi模型，方程為Q%= 0. 1268 t1/2_ 0. 0463， R2 = 0.9933。其中t為時(shí)間，Q^為釋放百分率。
實(shí)施例11:采用實(shí)施例7中的修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒的細(xì)胞活性。將鼠類巨噬細(xì) 胞系RAW細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，密度約為1XW個(gè)/ L，過夜，分別加入200 nl含10 %肽牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋而成的不同濃度的Man-SLN-DNA混懸液，以轉(zhuǎn)染劑量的陽離 子脂質(zhì)體Lipofectamine作為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照孔，每組重復(fù)3次，孵 育24 h，加入噻唑藍(lán)(MTT)終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)，振蕩 使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定其吸光度，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率
細(xì)胞存活率(％) = (A樣品-A空白)/ (A對(duì)照-A空白)X 100%
其中A附。為加入納米?；騆ip后細(xì)胞的吸光度；A對(duì)照為陰性對(duì)照孔細(xì)胞的吸光度；A空白 為空白對(duì)照孔細(xì)胞的吸光度。
結(jié)果表明，與Lipofectamine 2000相比，在所考査濃度范圍內(nèi)，納米粒組的細(xì)胞平均 存活率均在80 120%之間，納米?；緹o毒，細(xì)胞存活率較高，顯著高于商品化的陽離子脂 質(zhì)體Lipofectamine 2000 (p<0. 05)。
實(shí)施例12:采用實(shí)施7中的修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
RAW細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，在24 孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為lxl05/ L，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞約達(dá)到80%融合。用PBS沖洗細(xì)胞2次， 分別加入0.5 ml由不含血清的培養(yǎng)基和含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋的修飾荷基因固體 脂質(zhì)納米粒(含有質(zhì)粒l嗎)。兩者于37。C， 5%(302孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)，移去介質(zhì)，加入 含有l(wèi) ml 10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基因得以表達(dá)，并分別 于24小時(shí)和48小時(shí)利用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)采用裸DNA 作為陰性對(duì)照(1 UgDNA/ L)，以陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine作為陽性對(duì)照(lugDNA/ 孔)，未修飾的荷基因固體脂質(zhì)納米粒作為對(duì)照(liigDNA/孔)操作按試劑盒說明書進(jìn)行。 每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)定三個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)平行操作三次。見圖3.
實(shí)施例13:采用實(shí)施例7中的修飾荷基因固體脂質(zhì)納米粒進(jìn)行凍干制劑研究
取修飾荷基因固體脂質(zhì)納米?；鞈乙河?000卬m離心20min，棄上清液，所得沉淀加入 等體積雙蒸水渦旋分散，將得到的荷基因固體脂質(zhì)納米?；鞈乙禾荻韧ㄟ^0.8， 0. 45和0.22 微孔濾膜過濾后，加入5%甘露醇作為凍干保護(hù)劑在在-8CTC超低溫冰箱預(yù)凍12h，再在-60 。C下冷凍干燥48h即可。
權(quán)利要求
1.一種甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體，其為具有如下結(jié)構(gòu)式III的化合物式III。
2. 如權(quán)利要求1所述的甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體的制備方法，其特 征在于包括以下的步驟(A) 將100 — 500mg的甘露聚糖溶解于l一5mL，濃度為l一5mol/L的氫氧化鈉溶液中， 攪拌10—30分鐘使其堿化后，加入1.2—6mL, 16%的一氯乙酸，并在55—65。 C油浴條件下 攪拌7—18小時(shí)得到式(I)產(chǎn)物；此時(shí)加入l一3mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值2—3，得到式(II)所示 羧甲基化的甘露聚糖；(B) 步驟(A)得到的羧甲基化的甘露聚糖用二甲基亞砜(DMS0)溶解后，攪拌下加入同 樣用二甲基亞砜(DMS0)溶解的磷脂酰乙醇胺(PE) 5 — 30mg,冰浴條件下逐滴加入二甲基 亞砜(DMS0)溶解的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)12-60mg，其 中加入等摩爾量的三乙胺，冰浴攪拌一小時(shí)，然后室溫?cái)嚢?8 — 72小時(shí)；旋蒸除去二甲基 亞砜(DMS0)，沉淀物用Milli-Q純水溶解后透析60—72小時(shí)，旋蒸干得產(chǎn)物。
3. 如權(quán)利要求1中所述的甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體在荷基因納米載 體表面修飾中的應(yīng)用。
4. 一種經(jīng)過表面修飾的荷基因納米載體，其特征在于該納米載體使用固體脂質(zhì)或多聚 物，乳化劑以及陽離子表面活性劑制備并荷載基因，使用權(quán)利要求1中所述的配體對(duì)其進(jìn)行 表面修飾。
5. 如權(quán)利要求4所述的修飾荷基因納米載體，其特征在于其中的固體脂質(zhì)選自硬脂酸、 棕櫚酸、膽固醇、單硬脂酸甘油酯、雙硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山榆酸甘油酯或三 月桂酸甘油酯中的一種或幾種；其中的多聚物選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、多聚賴氨酸、聚乙烯 亞胺、聚乙二醇或聚乳酸乙醇酸共聚物中的一種或他們的組合或者嵌段共聚物；其中的乳化 劑選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、羊腦卵磷脂、腦磷脂以及合成磷脂二棕櫚酰磷脂酰膽堿、 二豆蔻酰磷脂酰膽堿，泊洛沙姆或泰洛沙姆；其中的陽離子表面活性劑選自十二烷基三甲基 氯化銨，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，雙十二垸基二甲基溴化銨(DDAB)，十八酰氨乙基 二乙基芐基氯化銨或十八酰氨乙基三甲基甲硫酸銨中的一種或幾種。
6. 如權(quán)利要求4所述的修飾荷基因納米載體，其特征在于其為修飾的荷基因脂質(zhì)體， 修飾的荷基因固體脂質(zhì)納米粒，修飾的荷基因聚乳酸納米粒、聚乳酸/乙醇酸共聚物納米粒、聚乳酸一聚乙二醇納米粒、聚乙烯亞胺一聚乙二醇納米粒、多聚賴氨酸納米?；蛘呔垡叶?一聚己內(nèi)酯嵌段共聚物納米粒。
7. 如權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的修飾荷基因納米載體，其特征在于其中各成分用量如 下權(quán)利要求l的甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體5—25mg，陽離子表面活性劑 10—30mg，固體脂質(zhì)或者多聚物10 — 35mg，乳化劑5 —30mg，基因l一6mg。
8. 如權(quán)利要求4一6任一項(xiàng)所述的修飾荷基因納米載體的制備方法，其特征在于包括如 下步驟將固體脂質(zhì)或多聚物和乳化劑溶解于有機(jī)溶劑構(gòu)成有機(jī)相，將陽離子表面活性劑溶 于雙蒸水中構(gòu)成水相，采用薄膜分散法、乳化-溶劑揮發(fā)法或者溶劑擴(kuò)散法混合有機(jī)相和水 相，揮發(fā)有機(jī)溶劑后得陽離子納米載體混懸液；將納米混懸液和基因復(fù)合，成為陽離子荷基 因納米載體；將權(quán)利要求l的甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物配體溶解于雙蒸水中， 注入荷基因納米載體混懸液中對(duì)其進(jìn)行表面修飾。
9. 如權(quán)利要求8所述的修飾荷基因納米載體的制備方法，其特征在于其中構(gòu)成有機(jī)相 的溶劑選自丙酮、二氯甲垸、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或乙醚中的一種或幾種。
10. 如權(quán)利要求4一6任一項(xiàng)所述的修飾荷基因納米載體在主動(dòng)靶向基因傳遞中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了一種甘露聚糖(mannan)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)的接枝聚合物，并將其作為配體應(yīng)用于納米載體的表面修飾。屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。特點(diǎn)是用化學(xué)合成的方法制備了糖基親水部分，脂基疏水部分和帶負(fù)電荷的甘露聚糖配體，合成方法簡(jiǎn)便，且產(chǎn)物收率較高，并將其應(yīng)用于各種載體材料的陽離子荷基因納米載體的表面修飾，修飾后的納米載體由于甘露聚糖靶向巨噬細(xì)胞表面甘露糖受體的能力，作用于鼠類巨噬細(xì)胞，表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性并成功實(shí)現(xiàn)了納米載體的巨噬細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)染。該靶向性接枝聚合物可作為配體應(yīng)用于各種陽離子荷基因納米載體的表面修飾。
文檔編號(hào)C12N15/87GK101597338SQ20091001626
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者余汪洋, 瑜 劉, 娜 張, 徐文方 申請(qǐng)人:山東大學(xué)