專利名稱：一種利用淀粉類原料生產2,3-丁二醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工技術領域，尤其涉及一種利用淀粉類原料生產2，3-丁二醇的方法。
技術背景2,3-丁二醇(2,3-butanediol)是一種高附加值的平臺化合物，具有廣泛的應用領域。 2,3-丁二醇是一種無色無味的手性化合物，有3種構型。沸點為180-184°C，凝固點較低， D-2，3-丁二醇(-60'C)可以作為抗凍劑。2,3-丁二醇具有較高的辛垸值，可以用于生產高 級航空煤油，是極具價值的液體燃料。脫水可以轉化為工業(yè)溶劑甲乙酮，甲乙酮可以作為 燃料添加劑，并可以作為溶劑用于樹脂和制漆業(yè)。甲乙酮進一步脫水可以得到1,3-丁二烯， 可以作為底物用于合成橡膠工業(yè)(Syu MJ. Appl Microbiol Biotechnol， 2001, 55: 10-18) 。 2，3-丁二醇脫氫可以得到乙偶姻和丁二酮，可以作為香料作為食品添加劑。在我國，2，3-丁二 醇還被添加到白酒中以改善白酒風味。2,3-丁二醇在油墨、化妝品、香薰劑、軟化劑、增 塑劑、炸藥和藥物載體等領域也具有潛在用途(Xiu ZL, Zeng AP. Appl Microbiol Biotechnol， 2008， 78: 917-926)。近年來由于石油價格的不穩(wěn)定以及石化產品價格的不斷上漲，2,3-丁 二醇的價格和生產在國際上也引起越來越廣泛的關注。開發(fā)廉價可再生生物質資源發(fā)酵生 產2,3-丁二醇有利于降低發(fā)酵生產成本，實現生物質資源的高價值開發(fā)利用，并且利用可 再生生物質資源開發(fā)石化產品替代品有利于社會的可持續(xù)性發(fā)展。目前文獻報道的用于2,3-丁二醇發(fā)酵生產的底物主要有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、甘油等 (Syu MJ. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55: 10-18; Qin et al. Chin J Chem Eng， 2006, 14:132-136; Afschar et al. Appl Microbiol Biotechnol, 1991, 34:582-585; Pe加v K and Petrova P, Appl Microbiol Biotechnol, DOI 10.1007/s00253-009-2004-x)，專利報道的2,3-丁二醇的 生產有中國專利申請?zhí)?00610113390.9公開了一種利用植物秸桿發(fā)酵生產2,3-丁二醇 的方法，液體發(fā)酵得到0.14 0.24 g/L的2,3-丁二醇，固態(tài)發(fā)酵2,3-丁二醇的產量在0.026 0.067 g/g干料。中國專利申請?zhí)?00810057041.9公開了一種由木質纖維原料生產乙醇和 2，3-丁二醇的方法，72小時可得到42.5 g/L 2,3-丁二醇。中國專利申請?zhí)?00810011692.4 公開了一種以菊芋為原料發(fā)酵生產2,3-丁二醇的方法，得到了終濃度為49 105§/1^的2,3-丁二醇。中國專利申請?zhí)?00510011959.6公開了一種由粗淀粉原料生產1,3-丙二醇和2，3-丁二醇的方法，該方法是先由粗淀粉原料經過酵母細胞發(fā)酵得到甘油發(fā)酵液，甘油發(fā)酵液 過濾處理后，再由處理的甘油發(fā)酵液經細菌先厭氧后有氧流加補料生產1,3-丙二醇和2,3-丁二醇，但由于工藝條件限制，1,3-丙二醇是主要產物，2,3-丁二醇濃度能達到30.4g/L。淀粉類生物質原料在我國有廣泛的來源，近年我國每年生產各種淀粉超過1000萬噸， 已發(fā)展成為世界淀粉最大生產國。淀粉包括玉米淀粉、薯類淀粉、變性淀粉等。目前淀粉 類原料已經成功用于乙醇、乳酸、檸檬酸等產品的發(fā)酵生產。利用淀粉類原料直接發(fā)酵生 產2,3-丁二醇鮮見報道。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種淀粉類原料發(fā)酵生產2,3-丁二醇的方法，以實現淀粉類原料 的充分開發(fā)利用，生產高值平臺化合物2，3-丁二醇。本發(fā)明所述利用淀粉類原料生產2,3-丁二醇的方法，其特征在于包括如下步驟5(1) 淀粉類原料處理及分步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的制備 以水與淀粉類原料質量比為1 6:1的比例將淀粉類原料加入自來水中混勻成淀粉漿；調節(jié)淀粉漿pH值在5.5 8.0，向淀粉漿中加入a-淀粉酶，a-淀粉酶加酶量為1 10U/g 淀粉干重，在90 110'C條件下，液化0.5 4小時，得到淀粉液化液；將淀粉液化液pH 值調節(jié)在3.5 6.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉干重，在50 70 t:條件下糖化0.5 6小時，得到淀粉糖化液，其葡萄糖濃度范圍為60 510g/L;將糖化 液115t:滅菌20min，冷卻后作為碳源，用于制備進行分步糖化發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；適于進行分歩糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉糖化液，其用量以其 含葡萄糖量計為100 120 g/L， (NH4)2S04 16 g/L, K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaC12g/L， CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04.7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4g/L，檸 檬酸三鈉4 g/L; pH值調至6.0 7.0;適于進行分步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量計為40 60 g/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P044g/L， NaC12g/L， CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4g/L，梓 檬酸三鈉4 g/L; pH值調至6.0 7.0;上述淀粉類原料為玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、紅薯 干粉中的一種或幾種任意重量比例混合物；(2) 5升發(fā)酵罐分步糖化發(fā)酵生產2,3-丁二醇以體積比5 10%的接種量，將制備的肺炎克雷伯氏菌CS7efo/e〃a/wew附ww'ae) SDM CCTCCM 208097或者肺炎克雷伯氏菌(A7efc/e〃a;wewm^ae) CICC 10011或者肺炎克雷 伯氏菌(〖Mw'e〃a ，ewwow'ae) ATCC 8724種子液接種到裝有2 4升分步糖化發(fā)酵培養(yǎng) 基的5升發(fā)酵罐中，以發(fā)酵溫度為30 40°C，攪拌轉速為200 500rpm，通氣量0.5 1.5 vvm實施發(fā)酵；發(fā)酵過程中，通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M 的H3P04來調節(jié)pH值，使之控制在pH 5.5 6.5;并每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的 葡萄糖含量和2,3-丁二醇濃度；若進行分步糖化分批發(fā)酵，當2,3-丁二醇濃度不再上升時， 結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2,3-丁二醇；若進行分步糖化補料分批發(fā)酵，當檢測葡萄 糖濃度降到15 20g/L時，補加上述滅菌的淀粉糖化液，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 60g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2g/(L七)時，停止補加淀粉糖化液，待2,3-丁二醇濃 度不再上升時，結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇；或者(1)淀粉類原料處理及同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的制備以水與淀粉類原料質量比為1 6:1的比例將淀粉類原料加入自來水中混勻成淀粉 漿；調節(jié)淀粉漿pH值在5.5 8.0，向淀粉漿中加入a-淀粉酶，a-淀粉酶加酶量為1 10U/g 淀粉干重，在卯 110'C條件下，液化0.5 4小時，得到淀粉液化液；將淀粉液化液115 'C滅菌20min，冷卻后作為碳源，用于制備進行同步糖化發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；適于進行同步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉液化液，其用量為 250 600 mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04-3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaCl 2 g/L， CaCl2 0.4g/L， MgSO4'7H2O0.4g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4 g/L，檸檬酸三鈉4 g/L; pH 值調至6.0 7.0;適于進行同步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉液化液，其用量為100 300mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04,3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaC12g/L，CaCl2 0.4 g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4 g/L，檸檬酸三鈉4 g/L;pH值調至6.0 7.0;
上述淀粉類原料為玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、紅薯干粉中的一種或幾種任意重量比例混合物；
(2) 5升發(fā)酵罐同步糖化發(fā)酵生產2,3-丁二醇
以體積比5 10%的接種量，將制備的肺炎克雷伯氏菌(i:/efc/e〃fl p加wmow'ae) SDMCCTCCM 208097或者肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃a/weww w'ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(《/efe/e〃a p股wwo"/"e) ATCC 8724種子液接種到裝有2 4升同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中，同時補加過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100 1000U/g淀粉干重；以發(fā)酵溫度為30 40°C，攪拌轉速為200 500 rpm，通氣量0.5 1.5 vvm實施發(fā)酵；發(fā)酵過程中，通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節(jié)pH值，使之控制在pH5.5 6.5;并每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇濃度；若進行同步糖化分批發(fā)酵，當檢測葡萄糖濃度降到15 20g/L時，加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100 500 U/g淀粉干重，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 40g/L，當加入糖化酶后葡萄糖濃度不再增加時，停止補加糖化酶；待葡萄糖耗完，2,3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2,3-丁二醇；若進行同步糖化補料分批發(fā)酵，當檢測葡萄糖濃度降到15 20 g/L時，補加200 800 mL滅菌的淀粉液化液并加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100 500 U/g淀粉干重，以保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 60 g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L七)時，停止補加淀粉液化液和糖化酶，待2,3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2,3-丁二醇。
上述淀粉類原料優(yōu)選玉米粉、玉米淀粉、木薯粉或木薯淀粉。上述加水量與淀粉類原料質量比優(yōu)選1 4:1。上述a-淀粉酶的加酶量優(yōu)選2 6 U/g淀粉干重。
上述分步糖化發(fā)酵過程中，糖化酶的添加量優(yōu)選400 800U/g淀粉干重。上述同步糖化發(fā)酵過程中，糖化酶的添加量優(yōu)選200 400 U/g淀粉干重。上述發(fā)酵溫度優(yōu)選35 37°C，攪拌轉速優(yōu)選300 400 rpm，通氣量優(yōu)選0.8 1.2 vvm。上述肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃ap^wmow'ae) SDM CCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(A7eZw7'e〃c /7"ew附o"/ae) CICC 10011或者月市炎克雷伯氏菌(A7e6i7.e〃a /wewmow'ae)ATCC 8724種子液的制備方法是將活化的肺炎克雷伯氏菌(/^fc/e〃a/w^mow'ae) SDMCCTCCM208097或者肺炎克雷伯氏菌(幻efczW/a;wewww/ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(K/efc/e〃ap"ewwo"/ae) ATCC 8724菌種接到滅菌的種子培養(yǎng)基中，在30 37°C ,100 150rpm培養(yǎng)10 14小時得到種子液。
其中所述種子培養(yǎng)基配方是葡萄糖40 g/L，NH4Cl 5 g/L，K2HP04'3H20 3 g/L，KH2P043g/L， Na2S042g/L， MgS04.7H20 0.3 g/L， ZnS04.7H20 0.2 g/L。
本發(fā)明的顯著特點是
1.充分利用自然資源中的淀粉類生物質原料來直接發(fā)酵生產高價值平臺化合物2,3-
丁二醇，可以提高生物質資源的利用效率，產生更高的社會效益。并且利用可再生資源代替石化資源生產高價值化學品，有利于經濟社會的可持續(xù)性發(fā)展。所用的淀粉類生物質原料來源廣泛，價格低廉，再生循環(huán)迅速，環(huán)境友好，可以顯著降低發(fā)酵生產成本。
2. 本發(fā)明通過對加水比、(X-淀粉酶加量、糖化酶加量、酶處理溫度和處理時間、發(fā)酵時間、發(fā)酵條件優(yōu)化等方面的研究，得到了優(yōu)化的發(fā)酵工藝。
3. 通過比較，采用同步糖化發(fā)酵更有優(yōu)勢同步糖化發(fā)酵省略了糖化階段，節(jié)約能耗；糖化和發(fā)酵在同一個反應器中進行，節(jié)省設備投資；另外糖化和發(fā)酵同時進行，糖化產生的葡萄糖很快被菌體利用，保持較低的水平，可以避免底物抑制，同時消除了菌體對高濃度底物的延遲期，縮短了發(fā)酵周期，提高了生產效率。
4. 本發(fā)明實現了淀粉類生物質原料的有效利用，與中國專利申請?zhí)枮?00510011959.6公開的方法相比，本發(fā)明方法回避了使用2種菌進行發(fā)酵，無需經過復雜的發(fā)酵過程。中國專利申請?zhí)?00510011959.6公布的方法是使用酵母菌先有氧后厭氧制備甘油發(fā)酵液，甘油發(fā)酵液過濾處理后，再利用細菌由甘油發(fā)酵液先厭氧后有氧流加補料生產1，3-丙二醇和2,3-丁二醇，1，3-丙二醇是主要產物，2,3-丁二醇濃度能達到30.4g/L。本發(fā)明簡化了發(fā)酵操作流程，利用淀粉類原料經細菌發(fā)酵獲得了高產的2,3-丁二醇。通過分步糖化發(fā)酵或者同步糖化發(fā)酵，2,3-丁二醇的最終濃度達到43 112g/L,乙偶姻和2，3-丁二醇的最終濃度達到45 121 g/L，具有極大的推廣和應用前景。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不僅限于此。
一般性說明
本發(fā)明所選用的菌株為肺炎克雷伯氏菌(《/efo/e〃" ；wrawo附'ae) SDM CCTCC M208097或者肺炎克雷伯氏菌(/:/efc/e〃a p"ewwom'ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(A7efo/e〃of/wewmom'ae) ATCC 8724。其中，月市炎克雷伯氏菌(A7efc/e〃a/ "eM附om.ae) SDMCCTCC M 208097由山東大學(本申請發(fā)明人所在實驗室)篩選并保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心；肺炎克雷伯氏菌CICC 10011可由中國工業(yè)微生物菌種管理保藏中心購得；肺炎克雷伯氏菌ATCC 8724可由美國標準生物品收藏中心購得。
本發(fā)明方法中涉及的葡萄糖的測定方法為發(fā)酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀SBA-40C (山東省科學院生物研究所)測定。測定原理為利用固定化葡萄糖氧化酶膜專一性測定葡萄糖含量。
本發(fā)明方法中涉及的2,3-丁二醇的測定方法為VARIAN CP-3380氣相色譜儀檢測。乙酸丁酯為萃取劑，體積比l:l萃取，取上層有機相檢測。具體測定的條件是火焰離子監(jiān)測器(FID)溫度為280°C，進樣器溫度為220'C，而毛細管柱溫是從50。C升溫到180'C，升溫速度20 °C/min，載氣為氮氣。利用2,3-丁二醇標準品(德國Sigma-Aldrich公司，貨號361461)做出標準曲線，再根據標準曲線計算出發(fā)酵液中2,3-丁二醇的含量。
實施例l:利用肺炎克雷伯氏菌(幻efc/e〃a; "ewmom^) ATCC 8724以玉米淀粉為原料在5升發(fā)酵罐中分步糖化補料分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇
(1)玉米淀粉處理及分步糖化補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
將1200 g玉米淀粉加水調制成淀粉漿定容至2.5 L，調節(jié)pH至5.5，按加酶量為10U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在95'C條件下蒸煮2小時，得到玉米淀粉液化液；將玉米淀粉液化液冷卻至55°C ，調節(jié)液化液的pH至4.0，按加酶量為1000 U/g淀粉干重加入糖化酶，在55'C條件下處理2小時，得到玉米淀粉糖化液，測得葡萄糖濃度為452g/L，將糖化液
8115'C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源用于制備進行分步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；適于進行分步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為玉米淀粉糖化液，其
用量以其含葡萄糖量計為45g/L;其余成分是(NH4)2S04 16g/L， K2HP(V3H20 4 g/L，KH2P044g/L， NaCI2g/L， CaCl2 0.4 g/L， MgS04.7H20 0.4 g/L， ZnS04.7H20 0.4 g/L,乙酸鉀4g/L，檸檬酸三鈉4g/L; pH值調至6.5， 115。C滅菌20分鐘；(2) 5升發(fā)酵罐分步糖化補料分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇無菌條件下將培養(yǎng)好的肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃fl，《/wo"/fle) ATCC 8724種子液按體積比為5%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐初始裝液量為2L，以發(fā)酵溫度為35'C，攪拌轉速為350rpm，通氣量為1.2 vvm進行發(fā)酵；發(fā)酵初始pH值為6.5，發(fā)酵過程中，當pH值降低到6.0，通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節(jié)pH值，使之控制在pH6.0;每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇濃度；發(fā)酵過程中，當檢測葡萄糖濃度降到15 20 g/L時，補加200 400 mL滅菌的玉米淀粉糖化液，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 60g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2g/(L-h)時，停止補加玉米淀粉糖化液，待2,3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，最終發(fā)酵時間為66小時；發(fā)酵完畢后，2,3-丁二醇的濃度為107.87 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的總含量為114.69 g/L，生產效率為1.74g/(L-h)。
實施例2:利用肺炎克雷伯氏菌(《fefe,W/a/wwwow'ae) ATCC 8724以玉米淀粉為原料在5升發(fā)酵罐中同步糖化補料分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇
(1) 玉米淀粉處理及同步糖化補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
將1200 g玉米淀粉加水調制成淀粉漿定容至2.5 L，調節(jié)pH至6.5，按加酶量為2 U/g淀粉干重加入(x-淀粉酶，在9(TC條件下蒸煮4小時，得到玉米淀粉液化液，115。C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源，用于制備進行同步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；
適于進行同步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為玉米淀粉液化液，其用量為150mL/L;其余成分是(NH4)2S04 16 g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L，NaC12g/L, CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4 g/L，檸檬酸三鈉4g/L; pH值調至6.0， 115。C滅菌20分鐘；
(2) 5升發(fā)酵罐同步糖化補料分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇無菌條件下將培養(yǎng)好的肺炎克雷伯氏菌(K/efo/e//a p加w附ow'ae) ATCC 8724種子液
按體積比為10%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，同時補加過濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為300U/g淀粉干重；發(fā)酵罐初始裝液量為2L，以發(fā)酵溫度為37'C，攪拌轉速為450 rpm，通氣量為1.2 vvm進行發(fā)酵；發(fā)酵初始pH值為6.0，發(fā)酵過程中通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節(jié)pH值使之維持在pH 6.0;每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇濃度；發(fā)酵過程中，當檢測葡萄糖濃度降到15 20 g/L時，補加200 400 mL滅菌的玉米淀粉液化液并加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100 500 U/g淀粉干重，以保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 60 g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L七)時，停止補加玉米淀粉液化液和糖化酶，待2,3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，發(fā)酵時間為58小時；發(fā)酵完畢后，2,3-丁二醇的濃度為110.63 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的總含量為120.87 g/L，生產效率為2.08 g/(L'h)。與實施例l相比，玉米淀粉同步糖化發(fā)酵縮短了發(fā)酵周期，乙偶姻和2,3-丁二醇的生產效率有很大提高。
實施例3:利用肺炎克雷伯氏菌(iCM^W/a/wewwo"/ae) SDM CCTCC M 208097以木薯粉為原料在5升發(fā)酵罐中同步糖化補料分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇
(1) 木薯粉處理及同步糖化補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
將540 g木薯粉加水調制成淀粉漿定容至1.2 L，調節(jié)pH至6.5，按加酶量為5 U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在90。C條件下蒸煮1小時，得到木薯粉液化液，115。C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源，用于制備進行同步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；
適于進行同步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為木薯粉液化液，其用量為170mL/L;其余成分是(NH4)2S04 16g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaCl2g/L， CaCl20.4g/L， MgS04'7H20 0,4 g/L， ZnS04.7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4 g/L，擰檬酸三鈉4g/L; pH值調至6.0， 115t:滅菌20分鐘；
(2) 5升發(fā)酵罐同步糖化補料分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇無菌條件下將培養(yǎng)好的肺炎克雷伯氏菌(A7efc/e//a SDM CCTCC M
208097種子液按體積比為10%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，同時補加過濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為500 U/g淀粉干重；發(fā)酵罐初始裝液量為1.2L，以發(fā)酵溫度為35'C，攪拌轉速為400 rpm，通氣量為0.6 vvm進行發(fā)酵；發(fā)酵初始pH值為6.0，發(fā)酵過程中通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節(jié)pH值使之維持在pH6.0;每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇濃度；發(fā)酵過程中，當檢測葡萄糖濃度降到15 20 g/L時，補加100 200 mL滅菌的木薯粉液化液并加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100 500U/g淀粉干重，以保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 60g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L七)時，停止補加木薯粉液化液和糖化酶，待2,3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，發(fā)酵時間為60小時；發(fā)酵完畢后，2，3-丁二醇的濃度為62.73 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的總含量為65.10g/L，生產效率為1.09 g/(L.h)。
實施例4:利用肺炎克雷伯氏菌(A7efc/e〃flp"eMmow^) CICC 10011以木薯淀粉為原料在5升發(fā)酵罐中同步糖化分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇
(1) 木薯淀粉處理及同步糖化分批發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
將350 g木薯淀粉加水調制成淀粉漿定容至1 L，調節(jié)pH至6.0，按加酶量為6 U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在95'C條件下蒸煮1小時，得到木薯淀粉液化液，115'C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源，用于制備進行同步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；
適于進行同步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉液化液，其用量為500mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04-3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaCl 2 g/L， CaCl2 0,4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4 g/L，檸檬酸三鈉4g/L; pH值調至6.5， 115"滅菌20分鐘；
(2) 5升發(fā)酵罐同步糖化分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇無菌條件下將培養(yǎng)好的肺炎克雷伯氏菌(^efc/e〃apm wwom'ae) CICC 10011種子液按
體積比為5%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，同時補加過濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為200U/g淀粉干重；發(fā)酵罐總裝液量為2L，以發(fā)酵溫度為37'C，攪拌轉速為350rpm，通氣量為l.O wm進行發(fā)酵；發(fā)酵初始pH值為6.5，發(fā)酵過程中，當pH值降低到6.0，發(fā)酵過程中通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節(jié)pH值，使之控制在pH 6.0;每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇濃度；當檢測葡萄糖濃度降到15 20 g/L時，加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100 500 U/g淀粉干重，以保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 40g/L,當加入糖化酶后葡萄糖濃度不再增加時，停止補加糖化酶，待葡萄糖耗完，2,3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，發(fā)酵時間為40小時；發(fā)酵完畢后，2,3-丁二醇的濃度為69.48 g/L，乙偶姻和2，3-丁二醇的總含量為72.32g/L，生產效率為1.81 g/(L-h)。
實施例5:利用肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃ap7eww)m^) SDM CCTCC M 208097以紅薯干粉為原料在5升發(fā)酵罐中分步糖化補料分批發(fā)酵生產2，3-丁二醇
(1) 紅薯干粉處理及分歩糖化補料分批發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
將1000 g紅薯干粉加水調制成淀粉漿定容至2 L，調節(jié)pH至5.5，按加酶量為5 U/g淀粉干重加入(x-淀粉酶，在94'C條件下蒸煮1小時，得到紅薯干粉液化液；將紅薯干粉液化液冷卻至60'C，調節(jié)液化液的pH至4.3，按加酶量為300 U/g淀粉干重加入糖化酶，在60'C條件下處理6小時，得到紅薯干粉糖化液，測得葡萄糖濃度為312g/L，將糖化液115"C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源用于制備進行分步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；
適于進行分步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為紅薯干粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量計為38g/L;其余成分是(NH4)2S04 16g/L， K2HPCV3H20 4 g/L，KH2P044g/L， NaC12g/L， CaCl20.4g/L， MgS04-7H20 0.4 g/L， ZnS04-7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4g/L，檸檬酸三鈉4g/L; pH值調至6.0， 115。C滅菌20分鐘；
(2) 5升發(fā)酵罐分步糖化補料分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇無菌條件下將培養(yǎng)好的肺炎克雷伯氏菌(Wefe!W/a ，eioww/ae) SDM CCTCC M
208097種子液按體積比為10%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐初始裝液量為2.2L,以發(fā)酵溫度為35'C，攪拌轉速為300卬m，通氣量為1.2 vvm進行發(fā)酵；發(fā)酵初始pH值為6.0，發(fā)酵過程中通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節(jié)pH值使之維持在pH 6.0;每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇濃度；發(fā)酵過程中，當檢測葡萄糖濃度降到15 20 g/L時，補加200 500 mL滅菌的紅薯干粉糖化液，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 60 g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2 g/(L-h)時，停止補加紅薯干粉糖化液，待2,3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，最終發(fā)酵時間為44小時；發(fā)酵完畢后，2,3-丁二醇的濃度為50.28 g/L，乙偶姻和2,3-丁二醇的總含量為56.94 g/L,生產效率為1.29g/(L七)。
實施例6:利用肺炎克雷伯氏菌(/:/eZwW/apwwwo"/ae) CICC 10011以土豆淀粉為原料在5升發(fā)酵罐中同步糖化分批發(fā)酵生產2，3-丁二醇
(1) 土豆淀粉處理及同步糖化分批發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
將400 g 土豆淀粉加水調制成淀粉漿定容至1 L,調節(jié)pH 6.5，按加酶量為8 U/g淀粉干重加入a-淀粉酶，在95。C條件下蒸煮1.5小時，得到土豆淀粉液化液，115'C滅菌20分鐘，冷卻后作為碳源用于制備進行同步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；
適于進行同步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉液化液，其用量為500mL/L， (NH4)2S04 16 g/L， K2HP04'3H20 4 g/L， KH2P04 4 g/L， NaC12g/L， CaCl2 0.4g/L， MgS04'7H20 0.4 g/L， ZnS04'7H20 0.4 g/L，乙酸鉀4 g/L，擰檬酸三鈉4 g/L; pH值調至7.0， 115'C滅菌20分鐘；
(2) 5升發(fā)酵罐同歩糖化分批發(fā)酵生產2,3-丁二醇無菌條件下將培養(yǎng)好的肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃"/weMmo"/w) CICC 10011種子液按體積比為10%的接種量接入滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，同時補加過濾除菌的糖化酶，糖化酶添加量為300U/g淀粉干重；發(fā)酵罐總裝液量為2L，以發(fā)酵溫度為37。C，攪拌轉速為300rpm，通氣量為l.O vvm進行發(fā)酵；發(fā)酵初始pH值為7.0,發(fā)酵過程中，當pH值降低到5.5，發(fā)酵過程中通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調節(jié)pH值，使之控制在pH 5.5;每隔3 4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2,3-丁二醇濃度；當檢測葡萄糖濃度降到15 20 g/L時，加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100 500 U/g淀粉干重，以保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15 40g/L，當加入糖化酶后葡萄糖濃度不再增加時，停止補加糖化酶，待葡萄糖耗完，2，3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，發(fā)酵時間為52小時；發(fā)酵完畢后，2,3-丁二醇的濃度為81.91 g/L，乙偶姻和2，3-丁二醇的總含量為86.18g/L，生產效率為1.66g/(L七)。
1權利要求
1.一種利用淀粉類原料生產2，3-丁二醇的方法，其特征在于包括如下步驟(1)淀粉類原料處理及分步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的制備以水與淀粉類原料質量比為1～6∶1的比例將淀粉類原料加入自來水中混勻成淀粉漿；調節(jié)淀粉漿pH值在5.5～8.0，向淀粉漿中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量為1～10U/g淀粉干重，在90～110℃條件下，液化0.5～4小時，得到淀粉液化液；將淀粉液化液pH值調節(jié)在3.5～6.0后加入糖化酶，糖化酶的添加量為100～1000U/g淀粉干重，在50～70℃條件下糖化0.5～6小時，得到淀粉糖化液，其葡萄糖濃度范圍為60～510g/L；將糖化液115℃滅菌20min，冷卻后作為碳源，用于制備進行分步糖化發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；適于進行分步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量計為100～120g/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸鉀4g/L，檸檬酸三鈉4g/L；pH值調至6.0～7.0；適于進行分步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉糖化液，其用量以其含葡萄糖量計為40～60g/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸鉀4g/L，檸檬酸三鈉4g/L；pH值調至6.0～7.0；上述淀粉類原料為玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、紅薯干粉中的一種或幾種任意重量比例混合物；(2)5升發(fā)酵罐分步糖化發(fā)酵生產2，3-丁二醇以體積比5～10％的接種量，將制備的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDMCCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種到裝有2～4升分步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中，以發(fā)酵溫度為30～40℃，攪拌轉速為200～500rpm，通氣量0.5～1.5vvm實施發(fā)酵；發(fā)酵過程中，通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4來調節(jié)pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；并每隔3～4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇濃度；若進行分步糖化分批發(fā)酵，當2，3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇；若進行分步糖化補料分批發(fā)酵，當檢測葡萄糖濃度降到15～20g/L時，補加上述滅菌的淀粉糖化液，保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15～60g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2g/(L·h)時，停止補加淀粉糖化液，待2，3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇；或者(1)淀粉類原料處理及同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的制備以水與淀粉類原料質量比為1～6∶1的比例將淀粉類原料加入自來水中混勻成淀粉漿；調節(jié)淀粉漿pH值在5.5～8.0，向淀粉漿中加入α-淀粉酶，α-淀粉酶加酶量為1～10U/g淀粉干重，在90～110℃條件下，液化0.5～4小時，得到淀粉液化液；將淀粉液化液115℃滅菌20min，冷卻后作為碳源，用于制備進行同步糖化發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基；適于進行同步糖化分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉液化液，其用量為250～600mL/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl20.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸鉀4g/L，檸檬酸三鈉4g/L；pH值調至6.0～7.0；適于進行同步糖化補料分批發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方是碳源為淀粉液化液，其用量為100～300mL/L，(NH4)2SO4 16g/L，K2HPO4·3H2O 4g/L，KH2PO4 4g/L，NaCl 2g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.4g/L，乙酸鉀4g/L，檸檬酸三鈉4g/L；pH值調至6.0～7.0；上述淀粉類原料為玉米粉、玉米淀粉、木薯粉、木薯淀粉、土豆粉、土豆淀粉、紅薯干粉中的一種或幾種任意重量比例混合物；(2)5升發(fā)酵罐同步糖化發(fā)酵生產2，3-丁二醇以體積比5～10％的接種量，將制備的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)SDMCCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種到裝有2～4升同步糖化發(fā)酵培養(yǎng)基的5升發(fā)酵罐中，同時補加過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100～1000U/g淀粉干重；以發(fā)酵溫度為30～40℃，攪拌轉速為200～500rpm，通氣量0.5～1.5vvm實施發(fā)酵；發(fā)酵過程中，通過發(fā)酵罐關聯控制蠕動泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4來調節(jié)pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；并每隔3～4小時取樣測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量和2，3-丁二醇濃度；若進行同步糖化分批發(fā)酵，當檢測葡萄糖濃度降到15～20g/L時，加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100～500U/g淀粉干重，使發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15～40g/L，當加入糖化酶后葡萄糖濃度不再增加時，停止補加糖化酶；待葡萄糖耗完，2，3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇；若進行同步糖化補料分批發(fā)酵，當檢測葡萄糖濃度降到15～20g/L時，補加200～800mL滅菌的淀粉液化液并加入過濾除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為100～500U/g淀粉干重，以保持發(fā)酵液中葡萄糖濃度在15～60g/L，當測得葡萄糖消耗速率低于2g/(L·h)時，停止補加淀粉液化液和糖化酶，待2，3-丁二醇濃度不再上升時，結束發(fā)酵，取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇。
2. 如權利要求l所述利用淀粉類原料生產2，3-丁二醇的方法，其特征在于所述的淀 粉類原料為玉米粉、玉米淀粉、木薯粉或木薯淀粉。
3. 如權利要求l所述利用淀粉類原料生產2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述加水 量與淀粉類原料質量比為1 4:1。
4. 如權利要求1所述利用淀粉類原料生產2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述a-淀粉酶的加酶量為2 6 U/g淀粉干重。
5. 如權利要求l所述利用淀粉類原料生產2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述分步 糖化發(fā)酵過程中，糖化酶的添加量為400 800U/g淀粉干重；所述同步糖化發(fā)酵過程中， 糖化酶的添加量為200 400 U/g淀粉干重。
6. 如權利要求l所述利用淀粉類原料生產2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述發(fā)酵 溫度為35 37'C，攪拌轉速為300 400rpm，通氣量為0.8 1.2 vvm。
7. 如權利要求l所述利用淀粉類原料生產2,3-丁二醇的方法，其特征在于所述肺炎 克雷伯氏菌CS7efozW/a /wewwow'flie) SDM CCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌 (A7efc/e〃a jW7eMmwH'ae ) CICC 10011或者月市炎克雷伯氏菌(/C/efc/e〃a /wew附ow'ae) ATCC 8724種子液的制備方法是將活化的肺炎克雷伯氏菌(《/efc/e〃ap"ra附om'ae)SDM CCTCC M 208097或者肺炎克雷伯氏菌(/:/￡^&//"/ 恥"附0"/"￡) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(幻dwW/a;7"eMm0"/"e) ATCC 8724菌種接到滅菌的種子培養(yǎng)基中，在30 37。C， 100〃 150 rpm培養(yǎng)10 14小時得到種子液；其中，所述種子培養(yǎng)基配方是葡萄糖40g/L， NH4C15g/L， K2HP04'3H20 3 g/L， KH2P04 3 g/L， Na2S042 g/L， MgS04.7H20 0,3 g/L， ZnS04,7H20 0.2 g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用淀粉類原料生產2，3-丁二醇的方法，是將淀粉類原料經過α-淀粉酶和糖化酶處理，以糖化液或者液化液作為發(fā)酵底物，用肺炎克雷伯氏菌作為發(fā)酵菌株，在無菌條件下通過分步糖化發(fā)酵或者同步糖化發(fā)酵來生產2，3-丁二醇。最終2，3-丁二醇的濃度達到43～112g/L，乙偶姻和2，3-丁二醇的最終濃度達到45～121g/L。本發(fā)明的優(yōu)點是利用淀粉類原料發(fā)酵生產高值平臺化合物2，3-丁二醇，可降低發(fā)酵生產2，3-丁二醇的原料成本；建立了淀粉類原料糖化發(fā)酵生產2，3-丁二醇的最佳發(fā)酵條件；本發(fā)明的同步糖化發(fā)酵生產2，3-丁二醇可以節(jié)約能耗，節(jié)省設備投資，縮短發(fā)酵周期，提高生產效率。
文檔編號C12R1/22GK101565721SQ200910015400
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月4日 優(yōu)先權日2009年6月4日
發(fā)明者唐鴻志, 李理想, 鈺 王, 王愛龍, 平 許, 馬翠卿 申請人:山東大學