專利名稱：通過靶向dnmt3a和dnmt3b恢復(fù)甲基化的方法
通過靶向DNMT3A和DNMT3B恢復(fù)甲基化的方法交叉引用相關(guān)申請本申請要求2007年7月31日提交的美國臨時(shí)申請案60/962，795和2008年xxxxx 提交的PCT/US2008/XXXXX的權(quán)益，其全部公開內(nèi)容明確地通過引用合并入本文。關(guān)于聯(lián)邦政府支助的研究的聲明本發(fā)明是在無任何政府支助的情況下進(jìn)行的，因此政府在本發(fā)明中不具有權(quán)利。背景肺癌是美國癌癥死亡率的首要病因，其發(fā)病率為每年大約213，000例新發(fā)病例并 且具有很高的死亡率15。盡管使用新型藥物和治療方案，但在過去20年中肺癌患者的預(yù)后 一直沒有顯著改變，因此強(qiáng)調(diào)了對新型治療策略的需要。靶向表觀基因組(epigenome)代 表了極具前景的癌癥治療策略16。異常的DNA甲基化已顯示在肺癌中起著重要作用17 1)啟動(dòng)子甲基化是負(fù)責(zé)沉默 TSGS18_2° 例如 CDKN2A、CDH13、FHIT、WWOX、CDH1 和 RASSF1A的機(jī)制之一；2)維持和從頭(de novo) DNA甲基轉(zhuǎn)移酶WMTl和DNMT3B的mRNA表達(dá)據(jù)報(bào)導(dǎo)分 別在102例NSCLC的53%和58%中升高，并且顯示DNMT1 mRNA水平是存活的獨(dú)立預(yù)后因
子13;3)DNMT1、DNMT3A和DNMT3B蛋白表達(dá)相對于正常肺組織在肺腫瘤中升高12 ；4)人DNMT3B啟動(dòng)子中顯著增加啟動(dòng)子活性的特定多態(tài)性與增加的肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)
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5)DNMT1-介導(dǎo)的DNA甲基化的抑制在小鼠中使煙草致癌物誘導(dǎo)的肺癌減少50%
以上22。MicroRNA(miRNA) (19-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過對部分或全部互補(bǔ)位點(diǎn) 的堿基配對而誘導(dǎo)它們的靶mRNA的翻譯抑制或切割，從而調(diào)控基因表達(dá))參與至關(guān)重要的 生物過程，包括發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和增殖u。最近，已確定了特定癌癥的具有診斷和 預(yù)后意義的特定miRNA表達(dá)特征譜(關(guān)于綜述，參考文獻(xiàn)3-5)。值得注意的是，通過使用不 同的 miRNA 靶基因預(yù)測算法(PicTar8，TargetScan3. l9，MiRanda1Q 和 miRGen11)，已用計(jì)算機(jī) (in silico)預(yù)測了之前顯示在NSCLC中被下調(diào)6’7的miR-29家族的成員與DNMT3A和B基 因的;V非翻譯區(qū)(3' UTR)中的位點(diǎn)互補(bǔ)(

圖1)。在報(bào)導(dǎo)的在肺癌中被下調(diào)的miRNA中，miR-29家族(29a，29b和29c)具有吸引人 的對DNMT3A和3B (從頭甲基轉(zhuǎn)移酶)的3'非翻譯區(qū)(UTR)的互補(bǔ)性8_"，所述酶是在肺癌 中經(jīng)常被上調(diào)12并且與不良預(yù)后相關(guān)13的參與DNA甲基化的兩個(gè)至關(guān)重要的酶。雖然現(xiàn)在認(rèn)為miRNA在癌發(fā)生中起作用，但miRNA的表達(dá)在肺癌中(相對于其正 常對應(yīng)物(counterpart))是不同的。此外，對該異常表達(dá)的重要性理解甚少。因此，存在確定miR-29是否可靶向MMT3A和DNTM3B以及確定miR-29的恢復(fù)是 否可使肺癌例如非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的異常甲基化模式恢復(fù)正常的需要。發(fā)明概述
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在一個(gè)廣泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受試者中恢復(fù)期望的DNA 甲基化模式的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的一種 或多種miR-29。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受試者中誘導(dǎo)甲基化沉 默的腫瘤抑制基因(TSG)的再表達(dá)的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B 中的一種或多種的一種或多種miR-29。在某些實(shí)施方案中，TSG包括HUT和WW0X中的一 種或多種。在另一個(gè)廣泛的方面，在本文中描述了用于在有此需要的受試者中體外和體內(nèi)抑 制致瘤性的方法，包括施用有效量的足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的一種或 多種 miR-29。本文所描述的方法可用于患有惡性腫瘤例如肺癌的受試者。在另一個(gè)方面，本文描述了用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的表觀遺傳調(diào)控的方法。在某些實(shí)施方案中，內(nèi)源miR-29b用作起始DNMT3B mRNA的逆轉(zhuǎn)錄的引物。在另一個(gè)方面，在本文中描述了用于降低總DNA甲基化的方法，包括施用有效量 的一種或多種靶向DNMT3A和DNMT3B的miR-29，其中miR-29的表達(dá)促成癌細(xì)胞中DNA的表 觀遺傳修飾。在另一個(gè)方面，在本文中描述了用于通過組合至少一種核苷類似物與一種或多種 足以阻斷從頭和維持DNMT途徑的miR-29來獲得DNA低甲基化的方法。在某些實(shí)施方案中， 核苷類似物包括地西他濱。在另一個(gè)方面，在本文中描述了用于增加腫瘤抑制基因(TSG)的表達(dá)的方法，包 括用一種或多種mi-R29轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，TSG包括H1IT和WW0X蛋白中的一 種或多種。在另一個(gè)方面，本文描述了用于在細(xì)胞中體外抑制細(xì)胞生長和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 (相對于混雜(scrambled)對照)的方法，包括用一種或多種miR-29轉(zhuǎn)染一種或多種細(xì)胞。在另一方面，在本文中描述了用于下調(diào)raiT和/或WW0X酶的表達(dá)水平的方法，包 括通過用一個(gè)或多個(gè)miR-29家族成員轉(zhuǎn)染細(xì)胞來調(diào)控DNMT3A和/或DNMT3B。在某些實(shí)施 方案中，細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本文中描述了用于減少總DNA甲基化的方法，包括在肺癌細(xì)胞中 誘導(dǎo)mi-R29的表達(dá)。在另一個(gè)方面，本文中描述了用于恢復(fù)TSG的表達(dá)的方法，包括在肺癌細(xì)胞中誘 導(dǎo)mi-R29的表達(dá)。在另一個(gè)方面，本文描述了用于體外和體內(nèi)抑制致瘤性的方法，包括在肺癌細(xì)胞 中誘導(dǎo)mi-R29的表達(dá)。在另一個(gè)方面，本文中描述了開發(fā)單獨(dú)地或與其他療法組合使用合成的miR-29 的表觀遺傳療法的方法，以在癌細(xì)胞中重新激活腫瘤抑制基因和使異常的甲基化模式恢復(fù) 正常。在某些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本文中描述了診斷受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病，處于發(fā)生其的 風(fēng)險(xiǎn)中，或?qū)τ谄渚哂袦p少的存活預(yù)后的方法，包括測量受試者的測試樣品中至少一種miR 基因產(chǎn)物的水平；其中測試樣品中miR基因產(chǎn)物的水平相對于對照樣品中相應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平的改變表示受試者患有肺癌相關(guān)疾病，或處于發(fā)生其的風(fēng)險(xiǎn)中；以及其中至少一 種miR基因產(chǎn)物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。在其他方面，在本文中描述了與各種細(xì)胞的誘導(dǎo)肺癌的狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)志物。已發(fā) 現(xiàn)高于任何此類標(biāo)志物或此類標(biāo)志物的組合的正常表達(dá)水平與患者中肺癌相關(guān)疾病的存 在相關(guān)。提供了檢測樣品中肺癌相關(guān)疾病的存在；樣品中所述疾病的不存在；肺癌相關(guān)疾 病的分期；以及與患者中肺癌相關(guān)疾病的評估、預(yù)防、診斷、表征和治療相關(guān)的肺癌相關(guān)疾 病的其他特征的方法。還提供了治療肺癌相關(guān)疾病的方法。在其他方面，在本文中描述了用于治療患有肺癌相關(guān)疾病或處于發(fā)生肺癌相關(guān)疾 病的風(fēng)險(xiǎn)中的患者的方法。此類方法可包括減少標(biāo)志物的表達(dá)和/或干擾標(biāo)志物的生物學(xué) 功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括給患者提供與標(biāo)志物核酸或其區(qū)段互補(bǔ)的反義寡核苷 酸或多核苷酸。例如，可通過遞送表達(dá)標(biāo)志物核酸或其片段的反義多核苷酸的載體來給患 者提供反義多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括給患者提供特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白 或所述蛋白的片段的抗體、抗體衍生物或抗體片段。當(dāng)根據(jù)附圖進(jìn)行閱讀時(shí)，根據(jù)下列優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的 和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯然。附圖概述本專利或申請文件包含至少一個(gè)以彩色制成的圖。具有彩色附圖的本專利或?qū)＠?申請公開案的拷貝將應(yīng)請求且支付必要的費(fèi)用后由Office提供。圖1. DNMT3A和3B的3' UTR區(qū)中對于miR-29的互補(bǔ)位點(diǎn)
Hsa-mi-R29a [SEQ ID NO 1]
Hsa-mi-R29b [SEQ ID NO 2]
Hsa-mi-R29c [SEQ ID NO 3]
845-869 DNMT3A [SEQ ID NO4]
843-869 DNMT3A [SEQ ID NO5]
846-869 DNMT3A [SEQ ID NO6]
1184-1209 DNMT3B [SEQ ID NO 7]
244-267 DNMT3B [SEQ ID NO8]
1374-1398 DNMT3B [SEQ ID NO 9]
1182-1209 DNMT3B [SEQ ID NO: 10]
1185-1209 DNMT3B [SEQ ID NO: 11]
根據(jù)TARGETSCAN 3. 1軟件，大寫和粗體字母標(biāo)識完全堿基配對。PICTAR軟件在
miR-29a與DNMT3B之間鑒別出兩個(gè)額外的配對區(qū)域，用星號*標(biāo)出。圖 2. MiR-29 直接靶向 DNMT3A 和 B。圖2a).在用miR-29轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中DNMT3表達(dá)的螢光素酶測定的結(jié)果。圖2b).上圖，在用miR-29或陰性對照轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，通過qRT_PCR對DNMT3A 和DNMT3B mRNA的表達(dá)的評估；下圖，利用反義分子(AS)沉默miR-29誘導(dǎo)了增加的DNMT3A 和DNMT3B mRNA的表達(dá)。圖2c).從用DNMT3A和B_3 ‘ UTR的GFP抑制載體+miR 29或混雜寡核苷酸共轉(zhuǎn) 染的A549細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)的Western印跡。
圖2d).miR-29b用作逆轉(zhuǎn)錄其預(yù)測的DNMT3B mRNA靶的內(nèi)源引物。黑色字體 DNMT3B cDNA(RefSeq# NM_175848)；藍(lán)色字體實(shí)驗(yàn)獲得的經(jīng)克隆和測序的cDNA (分析了 8 個(gè)克隆)；紅色字體推導(dǎo)的RNA序列和相應(yīng)的miR-29b。3' UTR-DNMT3B 1178-1217 TTTAACACCTTTTACTCTTCTTAC- TGGTGCT ATTTTGTAG[SEQ ID NO 12]cDNA (8) TTTAACACCTTTTACTCTTCTTAA :T GGTGCT A-ADAPTER [SEQID NO : 13]RNA 3' AAAUGAGAAGAAUU :A CCACGA U 5，[SEQ ID NO: 14]Hsa-miR-29b 3' UUGUGACUAAAGUUUA CCACGA U 5，[SEQ ID NO 2]上方下劃線標(biāo)示的黑色和藍(lán)色核苷酸在靶和實(shí)驗(yàn)的cDNA之間不具有同源性。下 方下劃線標(biāo)示的紅色核苷酸代表與miR-29b序列缺少同源性的與cDNA互補(bǔ)的RNA序列。粗 體的核苷酸代表PICTAR預(yù)測的配對位點(diǎn)。圖3. miR-29對癌細(xì)胞表觀基因組的恢復(fù)作用。圖3a).由miR-29對A549細(xì)胞(在轉(zhuǎn)染后48和72小時(shí)收獲)誘導(dǎo)的總DNA甲 基化改變。將結(jié)果與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(模擬)和用混雜寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Scr)相比較。 利用LC/MS-MS確定總DNA甲基化狀態(tài)。圖3b).通過qRT PCR進(jìn)行的用miR_29或陰性對照轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的A549和H1299 細(xì)胞中FHIT和WWOX mRNA水平的測定；miR-29誘導(dǎo)FHIT和WWOX mRNA的再表達(dá)。圖3c).在用miR-29或陰性對照轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，A549和H1299細(xì)胞中的H1IT和 WW0X蛋白的免疫印跡；至72小時(shí)時(shí)，miR-29誘導(dǎo)增加的H1IT和WW0X蛋白的表達(dá)。免疫印 跡圖像上方的數(shù)字表示相對于GAPDH基因的條帶強(qiáng)度(上行FHIT ；下行ffffOX)。圖3d).使用MassARRAY系統(tǒng)的H1IT和WW0X啟動(dòng)子區(qū)域的定量DNA甲基化數(shù)據(jù) 的圖示。各方塊表示被分析的單個(gè)CpG或CpG組，并且各箭頭表示樣品。以從亮綠(較低 甲基化頻率)延伸至亮紅(較高的甲化頻率)的色碼顯示各實(shí)驗(yàn)的甲基化頻率。圖4. miR-29對A549細(xì)胞的致瘤性的作用。圖4a).用miR-29、混雜(Scr)寡核苷酸體外轉(zhuǎn)染的或模擬轉(zhuǎn)染的(模擬)A549細(xì) 胞的生長曲線。曲線表示3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均細(xì)胞數(shù)目。圖4b).測量用混雜(Scr)寡核苷酸或miR-29寡核苷酸(lOOnM終濃度)轉(zhuǎn)染的 A549細(xì)胞中的活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，將其懸浮于具有膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘 化丙啶的結(jié)合緩沖液中，然后通過流式細(xì)胞術(shù)估量細(xì)胞死亡。誤差棒表示SD。圖4c).注射了預(yù)先用miR-29、scr寡核苷酸轉(zhuǎn)染的或模擬轉(zhuǎn)染的(注射前48小 時(shí))A549細(xì)胞的裸小鼠中移植瘤的生長曲線。圖4d).在注射后21天在裸鼠中，模擬_、Scr-和miR-29-轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞的腫 瘤移植物的大小的比較。圖像顯示來自每一個(gè)類別的5只小鼠中的平均大小的腫瘤。圖4e).裸小鼠的腫瘤重量士 SD。圖5. NSCLC中DNMT3A蛋白表達(dá)水平與總存活負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier曲線顯示172 個(gè)在腫瘤中具有不同的DNMT3A表達(dá)水平(相對于鄰近正常肺)的NSCLC患者的存活。具 有更高的DNMT3A表達(dá)的患者具有更短的總存活(P = 0. 029)。DNMT3B蛋白表達(dá)水平與存 活存在朝向相似的相關(guān)性的趨勢，但對于DNMT1不存在這樣的相關(guān)性。圖6.內(nèi)源miR-29水平與DNMT3A/B mRNA水平的相關(guān)性。通過qRT PCR在14個(gè)
11NSCLC中測定的DNMT3A、3B的內(nèi)源mRNA水平與miR-29的內(nèi)源水平之間的負(fù)相關(guān)性。R = 回歸系數(shù)?！?回歸線； =實(shí)際樣品相關(guān)性。實(shí)施方案的描述在整個(gè)本公開內(nèi)容中，通過標(biāo)識引用來引用各種公開物、專利和公開的專利說明 書。這些公開物、專利和公開的專利說明書的公開內(nèi)容通過引用合并入本文以更全面地描 述本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)。除非另外定義，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域(例如，細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)領(lǐng)域)技術(shù)人員通常所理解的意義相 同的意義。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的分子、遺傳學(xué)和生物化學(xué)方 法。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到詳盡的解釋。參見，例如，Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 2 版，由 Sambrook,Fritsch禾口 Maniatis 編著(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) ；DNA Cloning,第 I 和 II 卷(Glover ed.，1985) ；Oligonucleotide Synthesis (Gait ed.，1984) ;Mullis 等，美國專 ^lJ 4, 683, 195 ；Nucleic Acid Hybridization(Hames & Higgins eds. ,1984) ；Transcription And Translation(Hames & Higgins eds. ,1984) ；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) ；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press,1986) ；Perbal, A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N. Y. ) ；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells (Miller 禾口 Calos eds. ,1987, Cold Spring HarborLaboratory) ；Methods In Enzymology，第 154 禾口 155 卷(Wu 等 eds.)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 禾口 Walker, eds., Academic Press,London,1987) ；Handbook OfExperimental Immunology,第 I-IV卷(Weir 禾口 Blackwell, eds. , 1986) ；The Laboratory Rat,主編:Mark A. Suckow ；作者Sharp 禾口 LaRegina. CRC Press，Boston，1988，所述文獻(xiàn)通過引用合并入本文)和化學(xué)方法。如說明書和權(quán)利要求中所使用的，除非上下文清楚地指出，否則單數(shù)形式“a”“an” 和“the”包括復(fù)數(shù)指示物。例如，術(shù)語“a cell”包括多個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。如在本文中可互換使用的，“miR基因產(chǎn)物”、“micr0RNA”、“miR”或“miRNA”是指 來自miR基因的未加工的(例如，前體)或已加工的(例如，成熟)RNA轉(zhuǎn)錄物。由于miR 基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白質(zhì)，因此術(shù)語“miR基因產(chǎn)物”不包括蛋白質(zhì)。未加工的miR基因轉(zhuǎn) 錄物也稱為“miR前體”或“miR prec",其通常包括長度大約70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄 物。可通過用RNA酶(例如，Dicer、Argonaut或RNA酶III (例如大腸桿菌(E. coli) RNA 酶III))將其消化成具有活性的19至25個(gè)核苷酸的RNA分子來加工miR前體。該具有活 性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱為“已加工的” miR基因轉(zhuǎn)錄物或“成熟的” miRNA。“標(biāo)志物”是與其在正?；蚪】到M織或細(xì)胞中的表達(dá)水平相比，其在組織或細(xì)胞中 改變的表達(dá)水平與疾病狀態(tài)相關(guān)的基因或蛋白質(zhì)。標(biāo)志物的“正?！钡谋磉_(dá)水平是標(biāo)志物在未患肺癌相關(guān)疾病的人受試者或患者的 肺細(xì)胞中的表達(dá)水平。標(biāo)志物的“過表達(dá)”或“顯著更高的表達(dá)水平”是指測試樣品中的表達(dá)水平，所述 表達(dá)水平高于用于估量表達(dá)的測定的標(biāo)準(zhǔn)誤，在某些實(shí)施方案中，至少2倍，在其他實(shí)施方 案中，3、4、5或10倍于對照樣品(例如，來自未患有標(biāo)志物相關(guān)疾病的健康受試者的樣品)中的標(biāo)志物的表達(dá)水平和在某些實(shí)施方案中幾個(gè)對照樣品中的標(biāo)志物的平均表達(dá)水平。標(biāo)志物的“顯著更低的表達(dá)水平”是指測試樣品中的表達(dá)水平，所述表達(dá)水平比對 照樣品(例如，來自未患有標(biāo)志物相關(guān)疾病的健康受試者的樣品)中的標(biāo)志物的表達(dá)水平 和在某些實(shí)施方案中幾個(gè)對照樣品中的標(biāo)志物的平均表達(dá)水平低至少2倍，在其他實(shí)施方 案中低3、4、5或10倍?！霸噭┖小笔前辽僖环N試劑，例如用于特異性檢測標(biāo)志物的表達(dá)的探針的任何 產(chǎn)品(例如，包裝或容器)。可以以用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的單位的形式推銷(promote)、 分配或銷售試劑盒。
“蛋白質(zhì)”包括標(biāo)志物蛋白和它們的片段；變異標(biāo)志物蛋白和它們的片段；包含標(biāo) 志物或變異標(biāo)志物蛋白的至少15個(gè)氨基酸的區(qū)段的肽和多肽；以及包含標(biāo)志物或變異標(biāo) 志物蛋白，或標(biāo)志物或變異標(biāo)志物蛋白的至少15個(gè)氨基酸的區(qū)段的融合蛋白。在第一廣泛的方面，本文中提供了其表達(dá)在與不同肺癌相關(guān)的癌細(xì)胞中，相對于 正常對照細(xì)胞，發(fā)生改變的特定microRNA的鑒定?？赏ㄟ^天然加工途徑(例如使用完整的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過合成加工途徑 (例如使用分離的加工酶，例如分離的Dicer、Argonaut或RNA酶III)從miR前體獲得具 有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。應(yīng)理解，還可通過生物或化學(xué)合成(而不用從miR 前體加工)直接產(chǎn)生具有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。當(dāng)在本文中通過名稱提及 microRNA時(shí)，除非另外指出，否則所述名稱相應(yīng)于前體和成熟形式。在一個(gè)方面，在本文中提供了診斷受試者是否患有肺癌或處于發(fā)展肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中 的方法，該方法包括測量來自受試者的受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平和將受試 樣品中的miR基因產(chǎn)物水平與對照樣品中的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相比較。如本文所使用 的，“受試者”可以是患有或懷疑患有肺癌的任何哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是 患有或懷疑患有肺癌的人。在一個(gè)實(shí)施方案中，測試樣品中測量的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR29a、 miR-29b、miR-29c和其組合。在特定實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物是miR_29b。肺癌相關(guān)疾病可以是起于肺組織的任何障礙或癌癥。此類癌癥通常與腫瘤塊的形 成和/或存在相關(guān)，并且可以是例如任何形式的肺癌，例如不同組織學(xué)的肺癌(例如，腺癌、 鱗狀細(xì)胞癌)。此外，肺癌可以與特定的預(yù)后(例如，低存活率、快速進(jìn)展)相關(guān)?？稍趶氖茉囌攉@得的生物樣品(例如，細(xì)胞、組織)中測量至少一種miR基因產(chǎn)物 的水平。例如，可通過常規(guī)的活組織檢查技術(shù)從懷疑患有肺癌相關(guān)疾病的受試者中取出組 織樣品(例如，來自腫瘤)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從受試者中取出血液樣品，并且可通 過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離血細(xì)胞(例如，白細(xì)胞)以用于DNA提取。優(yōu)選在開始放射療法、化學(xué)療法 或其他療法之前從受試者獲得血液或組織樣品?？蓮氖茉囌叩奈词苡绊懙慕M織、從正常人 個(gè)體或正常個(gè)體的群體或從相應(yīng)于受試者的樣品的大部分細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞獲得相應(yīng)的對 照組織或血液樣品。然后將對照組織或血液樣品與來自受試者的樣品一起進(jìn)行處理，以便 可將從受試者的樣品的細(xì)胞中給定的miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來自對照樣品 的細(xì)胞的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平進(jìn)行比較。生物樣品的參照miR表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)也可用作對 照。與對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，從受試者獲得的樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變(例如，增加或減少)表示受試者中存在肺癌相關(guān)疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平高于對照樣品中相應(yīng) 的HliR基因產(chǎn)物的水平(即，HliR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)來自受 試者的細(xì)胞或組織樣品中miR基因產(chǎn)物的量大于對照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)物的 量時(shí)，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“上調(diào)”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物水平低于對照樣品中相 應(yīng)miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)“下調(diào)”)。如本文中所使用的，當(dāng)從來自 受試者的細(xì)胞或組織樣品中的該基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量低于從對照細(xì)胞或組織樣 品中的相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，miR基因的表達(dá)“下調(diào)”?？筛鶕?jù)一個(gè)或多個(gè)RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)確定對照和正常樣品中相對miR基因表達(dá)。所述 標(biāo)準(zhǔn)可包括例如0 miR基因表達(dá)水平、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的miR基因表達(dá)水平、受試者的未受影 響的組織中miR基因的表達(dá)水平或之前獲得的正常人對照的群體的miR基因表達(dá)的平均水平。可使用適合用于檢測生物樣品中RNA表達(dá)水平的任何技術(shù)測量樣品中miR基因產(chǎn) 物的水平。用于測定生物樣品(例如，細(xì)胞、組織)中的RNA表達(dá)水平的合適技術(shù)(例如， Northern印跡分析、RT-PCR、原位雜交)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。在特定的實(shí)施 方案中，使用Northern印跡分析檢測至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可通過在核酸 提取緩沖液存在的情況下進(jìn)行勻漿，接著進(jìn)行離心來從細(xì)胞純化總的細(xì)胞RNA。沉淀核酸， 然后通過用DNA酶處理和沉淀來除去DNA。然后按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在瓊脂糖凝膠上通過凝膠電 泳分離RNA分子，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾器。然后通過加熱將RNA固定在濾器上。使 用適當(dāng)標(biāo)記的與所述RNA互補(bǔ)的DNA或RNA探針進(jìn)行特定RNA的檢測和定量。參見，例如， Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 片反，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，Chapter 7，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。用于給定的miR基因產(chǎn)物的Northern印跡雜交的合適的探針可根據(jù)核酸序列產(chǎn) 生，其包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物具有至少大約70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %， 98%，99%或完全的互補(bǔ)性的探針。用于制備標(biāo)記的DNA和RNA探針的方法以及用于其與靶 核苷酸序列的雜交的條件描述于 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Chapters 10 禾口 11，其 公開內(nèi)容通過引用合并入本文。在一個(gè)非限定性實(shí)例中，可用例如放射性核素例如3H、32P、33P、14C或35S ；重金屬； 能夠用作已標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合對成員的配體(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗 體)；熒光分子；化學(xué)發(fā)光分子；酶等來標(biāo)記核酸探針?？赏ㄟ^Rigby 等人(1977)，J. Mol. Biol. 113 :237_251 的切口 平移法(nick translation method) Fienberg ^A (1983), Anal. Biochem. 132 6-13 白勺 Ρ Ι弓L夕去 (其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文)將探針標(biāo)記至高比放射性(specific activity)。 后者是選擇用于從單鏈DNA或從RNA模板合成高比放射性的32P-標(biāo)記的探針的方法。例如， 按照切口平移法通過用高放射性的核苷酸置換預(yù)先存在的核苷酸，可能制備具有大大超過 IO8Cpm/微克的比放射性的32P-標(biāo)記的核酸探針。然后可通過將雜交濾器暴露于照相膠片 來進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測。暴露于雜交濾器的照相膠片的光密度掃描提供了 miR基因轉(zhuǎn)錄物水平的精確測量。使用另一個(gè)方法，可通過計(jì)算機(jī)化的成像系統(tǒng)例如可從Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 獲.f 導(dǎo)白勺 Molecular Dynamics 40Q-B 2D PhosphorimaRer fe 量miR基因轉(zhuǎn)錄物水平。當(dāng)不能進(jìn)行DNA或RNA探針的放射性核素標(biāo)記時(shí)，可使用隨機(jī)引物法將類似物例 如dTTP類似物5- (N- (N-生物素基-ε -氨基己?；?_3_氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸摻 入探針分子?？赏ㄟ^與偶聯(lián)至熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶的結(jié)合生物素的蛋白質(zhì)例如抗 生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和抗體(例如抗生物素抗體)反應(yīng)來檢測生物素化的探針 寡核苷酸。除了 Northern和其他RNA雜交技術(shù)外，可使用原位雜交技術(shù)來測定RNA轉(zhuǎn)錄物的 水平。該技術(shù)需要比Northern印跡技術(shù)更少的細(xì)胞，其包括將整個(gè)細(xì)胞置于顯微鏡蓋玻片 上和用含有放射性標(biāo)記的或另外標(biāo)記的核酸(例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測細(xì)胞的 核酸含量。該技術(shù)特別適合用于分析來自受試者的組織活檢樣品。原位雜交技術(shù)的實(shí)施在 美國專利5，427，916 (其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文)中進(jìn)行了更詳細(xì)的描述。在一個(gè)非限定性實(shí)例中，用于給定的miR基因產(chǎn)物的原位雜交的合適的探針可從 核酸序列產(chǎn)生。并且包括但不限于與目的miR基因產(chǎn)物具有至少大約70%，75%，80%， 85%,90%,95%,98%,99%或完全的互補(bǔ)性的探針，如上所述的。細(xì)胞中miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對數(shù)目還可通過對miR基因轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物(RT-PCR)來進(jìn)行測定。可通過與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)例 如來自存在于相同樣品中的“持家”基因的mRNA的水平相比較來定量miR基因轉(zhuǎn)錄物的 水平。用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的合適的“持家”基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (G3PDH)。用于進(jìn)行定量和半定量RT-PCR的方法和其變型對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知 的。在一些情況下，可能期望同時(shí)測定樣品中多個(gè)不同miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在 其他情況下，可能期望測定與癌癥關(guān)聯(lián)的所有已知miR基因的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評估數(shù) 百種miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達(dá)水平非常費(fèi)時(shí)并且需要大量的總RNA (例如，對 于每一個(gè)Northern印跡需要至少20 μ g)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。為了克服這些限制，可構(gòu)建以微芯片形式(即，微陣列)存在的寡核苷酸文庫 (oligolibrary)，該文庫包含特異于一組miR基因的一組寡核苷酸(例如，寡脫氧核苷酸) 探針。使用該微陣列，可通過逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸，且將它們與微陣列上 的探針寡核苷酸雜交以產(chǎn)生雜交特征譜或表達(dá)特征譜來測定生物樣品中多個(gè)microRNA的 表達(dá)水平。然后將受試樣品的雜交特征譜與對照樣品的雜交特征譜比較，從而確定在肺癌 細(xì)胞中具有改變的表達(dá)水平的microRNA。如本文中所使用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核苷酸”是指能夠與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸?！鞍泄押塑账帷被颉鞍泄衙撗鹾塑账帷笔侵复龣z測(例如，通過雜交)的 分子?！癿iR-特異性探針寡核苷酸”或“特異于miR的探針寡核苷酸”是指具有選擇用于與 特定miR基因產(chǎn)物或特定miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。特定樣品的“表達(dá)特征譜”或“雜交特征譜”本質(zhì)上是樣品的狀態(tài)指紋；雖然兩種 狀態(tài)可能具有相似表達(dá)的任何特定基因，但同時(shí)評價(jià)大量基因允許產(chǎn)生對于細(xì)胞的狀態(tài)是 獨(dú)特的基因表達(dá)特征譜。即，正常組織可與癌(例如，腫瘤)組織相區(qū)別，并且在癌組織中，可確定不同的預(yù)后狀態(tài)(例如，良好的或不良的長期存活希望)。通過比較不同狀態(tài)中癌組 織的表達(dá)特征譜，獲得關(guān)于哪個(gè)基因在這些狀態(tài)的各狀態(tài)中是很重要(包括基因的上調(diào)和 下調(diào))的信息。在癌組織中差異表達(dá)的序列的鑒定以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果的差異表達(dá)的鑒 定允許以許多方法使用該信息。 在一個(gè)非限定性實(shí)例中，可評估特定的治療方案(例如，以確定化療藥物是否改 善特定患者的長期預(yù)后)。類似地，可通過將患者樣品與已知的表達(dá)特征譜比較來進(jìn)行或確 認(rèn)診斷。此外，這些基因表達(dá)特征譜(或個(gè)體基因)允許篩選抑制肺癌表達(dá)特征譜或?qū)⒉?良預(yù)后特征譜轉(zhuǎn)變成更好的預(yù)后特征譜的藥物候選物。因此，本文中還提供了診斷受試者是否患有肺癌或處于發(fā)展肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方 法，該方法包括逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將靶寡 脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交以提供受試樣品的雜交特征 譜，和將受試樣品雜交特征譜與從對照樣品或參照標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的雜交特征譜比較，其中至少 一種miRNA的信號的改變表示受試者患有肺癌或處于發(fā)展肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，微陣列包含大部分所有已知的人miRNA的miRNA特異性探針 寡核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，微陣列包含一種或多種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和 其組合的miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。可利用基因特異性寡核苷酸探針(所述探針從已知的miRNA序列產(chǎn)生)制備微陣 列。對于各miRNA，陣列可包含兩種不同的寡核苷酸探針，一種探針包含活性成熟序列，而 另一種探針特異于miRNA的前體。陣列還可包含可用作雜交嚴(yán)格性條件的對照的對照，例 如與人直系同源物只相異于少數(shù)幾個(gè)堿基的一個(gè)或多個(gè)小鼠序列。還可將來自兩個(gè)物種的 tRNA或其他RNA(例如，rRNA.mRNA)印制在微芯片上，從而為特異性雜交提供內(nèi)部的、相對 穩(wěn)定的陽性對照。還可將用于非特異性雜交的一個(gè)或多個(gè)合適的對照包含在微芯片上。為 了該目的，基于與任何已知的miRNA不存在任何同源性選擇序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)制備微陣列。例如，在位置C6上對合適長度例如 40個(gè)核苷酸的探針寡核苷酸進(jìn)行5'-胺修飾，并且使用可商購獲得的微陣列系統(tǒng)例如 GeneMachine OmniGrid IOOMicroarrayer 和 Amersham CodeLink 活化的載玻片進(jìn)行印 制。通過用標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA來制備相應(yīng)于靶RNA的標(biāo)記的cDNA寡聚物。在第一 鏈合成后，使RNA/DNA雜交物變性以降解RNA模板。然后將所制備的標(biāo)記的靶cDNA在雜 交條件(例如在25°C下于6X SSPE/30%甲酰胺中進(jìn)行18小時(shí)，然后在37°C下于0. 75X TNT(TrisHCl/NaCl/Tween 20)中清洗40分鐘)下與微陣列芯片雜交。在陣列上的其中固 定的探針DNA識別樣品中的互補(bǔ)靶cDNA的位置上，發(fā)生雜交。標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)記陣列上 的其中發(fā)生結(jié)合的確切位置，從而允許自動(dòng)檢測和定量。輸出信號由一列雜交事件組成，其 標(biāo)示了特定cDNA序列的相對豐度，從而標(biāo)示了患者樣品中相應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對豐度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記的cDNA寡聚物是從生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo) 記的cDNA。然后通過使用例如鏈霉抗生物素蛋白-AleXa647綴合物直接檢測包含生物素的 轉(zhuǎn)錄物來處理微陣列，和使用常規(guī)掃描方法掃描微陣列。陣列上的各點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者 樣品中相應(yīng)的miR的豐度成比例。使用陣列對于miRNA表達(dá)的檢測具有幾個(gè)有利方面。第一，可在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上鑒 定相同樣品中的數(shù)百個(gè)基因的整體表達(dá)。第二，通過寡核苷酸探針的仔細(xì)設(shè)計(jì)，可鑒定成熟分子和前體分子的表達(dá)。第三，與Northern印跡分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用 2. 5yg總RNA可提供可重現(xiàn)的結(jié)果。數(shù)目相對有限的miRNA (每物種數(shù)百個(gè))允許對數(shù)個(gè) 物種構(gòu)建共同的微陣列，其中對每一物種使用不同的寡核苷酸探針。這樣的工具允許分析 各已知的miR在不同條件下的跨物種表達(dá)。除了用于特定miR的定量表達(dá)水平測定外，包含相應(yīng)于miRNome的大部分(優(yōu)選 整個(gè)miRNome)的miRNA-特異性探針寡核苷酸的微芯片可用于進(jìn)行miR基因表達(dá)特征譜分 析，以分析miR的表達(dá)模式。可使不同的miR特征與已建立的疾病標(biāo)志物關(guān)聯(lián)或直接與疾 病狀態(tài)關(guān)聯(lián)。按照本文中描述的表達(dá)特征譜分析法，對來自懷疑患有肺癌相關(guān)疾病的受試者的 樣品的總RNA進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄以提供一組與樣品中的RNA互補(bǔ)的標(biāo)記的靶寡脫氧核苷酸。 然后將靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供樣品 的雜交特征譜。結(jié)果是顯示樣品中miRNA的表達(dá)模式的樣品的雜交特征譜。雜交特征譜包 括來自靶寡脫氧核苷酸(其來自樣品)與微陣列中的miRNA-特異性探針寡核苷酸結(jié)合的 信號。所述特征譜可記錄為結(jié)合的存在或不存在(信號對0信號)。更優(yōu)選地，記錄的特征譜包括來自各雜交的信號的強(qiáng)度。將所述特征譜與從正常 的(即非癌的)對照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較。信號的改變表示受試者中存在癌癥或 發(fā)生癌癥的傾向。用于測量miR基因表達(dá)的其他技術(shù)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，并且包 括用于測量RNA轉(zhuǎn)錄和降解的速率的各種技術(shù)。本文中還提供了測定患有肺癌的受試者的預(yù)后的方法，該方法包括測量受試者的 測試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，所述水平與肺癌相關(guān)疾病的特定預(yù)后(例如，良 好或積極的預(yù)后，不良或不利的預(yù)后)相關(guān)。根據(jù)這些方法，與對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較，測試樣品中與 特定預(yù)后相關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的改變表明受試者患有具有特定預(yù)后的肺癌。在一個(gè) 實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物與不利的(即，不良的)預(yù)后相關(guān)。不利預(yù)后的實(shí)例包括但不限 于低存活率和快速疾病發(fā)展。在某些實(shí)施方案中，這樣測量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平， 即通過逆轉(zhuǎn)錄獲自受試者的受試樣品的RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸，將該靶寡脫氧核 苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供受試樣品的雜交特征譜， 然后將受試樣品的雜交特征譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較來進(jìn)行測量。不希望受任何理論束縛，據(jù)信，細(xì)胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物水平的改變可導(dǎo) 致這些miR的一種或多種預(yù)期的靶失調(diào)，這可導(dǎo)致肺癌形成。因此，改變miR基因產(chǎn)物水平 (例如，通過減少在肺癌細(xì)胞中被上調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平，通過增加在肺癌細(xì)胞中被下 調(diào)的miR基因產(chǎn)物的水平)可成功地治療肺癌。因此，本文中還提供了抑制受試者中的腫瘤發(fā)生的方法，所述受試者患有或懷疑 患有肺癌，其中至少一種miR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中失調(diào)(例如，下調(diào)，上調(diào))。當(dāng)至 少一種分離的miR基因產(chǎn)物(例如，miR-29家族)在癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，方法包括施用有 效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物，或其分離的變體或生物活性片段，以便在受試者中 抑制癌細(xì)胞的增殖。例如，當(dāng)miR基因產(chǎn)物在受試者的癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，對受試者施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物可抑制癌細(xì)胞的增殖。對受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物可與在癌細(xì) 胞中被下調(diào)的內(nèi)源野生型miR基因產(chǎn)物(例如，miR基因產(chǎn)物)相同或其可以是其變體或 生物活性片段。如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的“變體”是指與相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有 低于100%的同一性并且具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性的miRNA。 這樣的生物活性的實(shí)例包括但不限于靶RNA分子的表達(dá)的抑制(例如，抑制靶RNA分子的 翻譯，調(diào)節(jié)靶RNA分子的穩(wěn)定性，抑制靶RNA分子的加工)和與肺癌相關(guān)的細(xì)胞過程(例如， 細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡)的抑制。此類變體包括物種變體和其為miR基因中一個(gè)或 多個(gè)突變(例如，置換、缺失、插入)的結(jié)果的變體。在某些實(shí)施方案中，變體與相應(yīng)的野生 型miR基因產(chǎn)物至少大約70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%或99%的同一。如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的“生物活性片段”是指miR基因產(chǎn)物的RNA片段， 其具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)生物活性。如上所述，此類生物活性的實(shí) 例包括但不限于靶RNA分子的表達(dá)的抑制和與肺癌相關(guān)的細(xì)胞過程的抑制。在某些實(shí)施方 案中，生物活性片段的長度是至少大約5、7、10、12、15或17個(gè)核苷酸。在特定的實(shí)施方案中，可將分離的miR基因產(chǎn)物與一種或多種另外的抗癌療法組 合來對受試者施用。適當(dāng)?shù)目拱┋煼òǖ幌抻诨瘜W(xué)療法、放射療法和其組合(例如，放 化療(chemoradiation))。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被上調(diào)時(shí)，方法包括對受試者施用有 效量的至少一種用于抑制至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物(在本文中稱為miR基 因表達(dá)_抑制化合物)，以便癌細(xì)胞的增殖被抑制。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR表 達(dá)_抑制化合物特異于選自miR29家族的miR基因產(chǎn)物(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c 和其組合)。如本文中所使用的，術(shù)語“治療”、“醫(yī)治”和“療法”是指改善與疾病或病況例如肺 癌相關(guān)的癥狀，包括預(yù)防或延遲疾病癥狀的發(fā)作，和/或減少疾病或病況的癥狀的嚴(yán)重性 或頻率。術(shù)語“受試者”、“患者”和“個(gè)體”在本文中定義為包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，包括但 不限于靈長類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他?？啤⒀蚩?、馬 科、犬科、貓科、嚙齒目或鼠科物種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物是人。如本文中所使用的，分離的miR基因產(chǎn)物的“有效量”是足以在患有肺癌的受試者 中抑制癌細(xì)胞增殖的量。通過考慮因素例如受試者的大小和體重；疾病侵入的程度；受試 者的年齡、健康和性別；施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容 易地確定對給定的受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量。例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量。腫瘤塊 的大致重量可通過計(jì)算腫瘤塊的大致體積來測定，其中1立方厘米的體積大約等于1克?；?于腫瘤塊的重量的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可在大約10至500微克/克腫瘤塊的范 圍之內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，腫瘤塊可以是至少大約10微克/克腫瘤塊，至少大約60微克 /克腫瘤塊或至少大約100微克/克腫瘤塊。分離的miR基因產(chǎn)物的有效量還可基于待治療的受試者的大致或估計(jì)的體重。優(yōu) 選，如本文中所描述的，胃腸外或腸內(nèi)施用這樣的有效量。例如，對受試者施用的分離的miR 基因產(chǎn)物的有效量可在大約5至大約3000微克/kg的體重，大約700至1000微克/kg的體重的范圍內(nèi)，或大于大約1000微克/kg的體重。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于對給定的受試者施用分離的miR基因 產(chǎn)物的合適的給藥方案。例如，可對受試者施用一次(例如，作為單次注射或沉積 (cbp0Siti0n))miR基因產(chǎn)物?？蛇x擇地，可以每天1次或2次對受試者施用miR基因產(chǎn)物， 進(jìn)行大約3至大約28天，特別地大約7至大約10天的時(shí)期。在特定的給藥方案中，每天1 次施用miR基因產(chǎn)物，進(jìn)行7天。當(dāng)給藥方案包括多次施用時(shí)，應(yīng)理解，對受試者施用的miR 基因產(chǎn)物的有效量可包括在整個(gè)給藥方案期間施用的基因產(chǎn)物的總量。如本文中使用的，“分離的”miR基因產(chǎn)物是合成的或通過人工介入從天然狀態(tài)改 變或取出的miR基因產(chǎn)物。例如，合成的miR基因產(chǎn)物，或部分或完全從其天然狀態(tài)的共存 材料分離的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”。分離的miR基因產(chǎn)物可以以大體上純化的形 式存在，或可以存在于已將所述miR基因產(chǎn)物遞送入其中的細(xì)胞中。因此，有意地被遞送至 細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR前 體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是“分離的”分子。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方案，本文所 描述的分離的miR基因產(chǎn)物可用于制造用于治療受試者(例如，人)中的肺癌的藥物。分離的miR基因產(chǎn)物可使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得。例如，可使用本領(lǐng)域已知的方法 化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞磷酰 胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成RNA分子或合成試劑的提供商包 括例如 Proligo (Hamburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A. )、Pierce Chemical(part of Perbio Science,Rockford,IL,U. S. A. )>Glen Research(Sterling,VA, U. S. A. ) > ChemGenes (Ashland, MA, U. S. A.)禾口 Cruachem (Glasgow, UK)?？蛇x擇地，可使用任何合適的啟動(dòng)子從重組環(huán)形或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn) 物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適的啟動(dòng)子包括例如TO或HI RNA pol III啟動(dòng)子序列或巨 細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其他合適啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì) 粒還可包括用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或可調(diào)控的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物。還 可將從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞并且在其中直接表達(dá)。下面更詳細(xì)地論 述重組質(zhì)粒將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。miR基因產(chǎn)物可從分開的重組質(zhì)粒表達(dá)，或它們可從相同的重組質(zhì)粒表達(dá)。在一個(gè) 實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)為RNA前體分子，然后通過合適的加工系統(tǒng)(包 括但不限于癌細(xì)胞中現(xiàn)有的加工系統(tǒng))將該前體分子加工成功能性miR基因產(chǎn)物。其他合 適的加工系統(tǒng)包括例如體外果蠅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)(例如，如屬于Tuschl等人的美國公開專 利申請2002/0086356中所描述的，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文)和大腸桿菌RNA 酶III系統(tǒng)(例如，如屬于Yang等人的美國公開專利申請2004/0014113中所描述的，其全 部公開內(nèi)容通過引用合并入本文)。適合用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇、用于將核酸序列插入質(zhì)粒以表達(dá)基 因產(chǎn)物的方法以及將重組質(zhì)粒遞送至目的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。參 見，例如，Zeng 等(2002)，MolecularCell 9 :1327_1333 ；Tuschl (2002)，Nat. Biotechnol, 20 446-448 ；Brummelkamp 等(2002)，Science 296 :550_553 ；Miyagishi 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 497-500 ；Paddison 等(2002)，Genes Dev. 16948-958 ；Lee 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 :500_505 ；和 Paul 等(2002)，Nat. Biotechnol. 20 :505_508，其全部公 開內(nèi)容通過引用合并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在CMV立即早期啟動(dòng)子 (intermediate-early promoter)控制下編碼miR前體RNA的序列。如本文中所使用的， “在啟動(dòng)子的控制下”是指編碼miR基因產(chǎn)物的核酸序列位于啟動(dòng)子的3'端，以便啟動(dòng)子 可起始miR基因產(chǎn)物編碼序列的轉(zhuǎn)錄。miR基因產(chǎn)物還可從重組病毒載體表達(dá)。預(yù)期miR基因產(chǎn)物可從兩個(gè)分開的重組 病毒載體或從相同的病毒載體表達(dá)?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組病 毒載體表達(dá)的RNA或所述RNA可在癌細(xì)胞中直接表達(dá)。下面更詳細(xì)地論述重組病毒載體將 miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。 本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列和用于表達(dá)RNA序列的任何 合適的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括但不限于U6或H1RNA pol III啟動(dòng)子序列，或巨細(xì)胞病 毒啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載 體還可包含用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或可調(diào)控的啟動(dòng)子?？墒褂媚軌蚪邮躮iR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如，來源于腺病毒 (AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒(LV)、彈狀病毒(Rhabdoviruses)、鼠白 血病病毒)、皰疹病毒等的載體?？赏ㄟ^用來自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化 載體或通過置換不同的病毒衣殼蛋白(如果合適)來改變病毒載體的趨向性。例如，可用來自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒 (Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本發(fā)明的慢病毒載體。可通過對載體 進(jìn)行工程改造以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型來制備本發(fā)明的AAV載體，使之靶向不同的細(xì) 胞。例如，在血清型2型基因組上表達(dá)血清型2型衣殼的AAV載體稱為AAV 2/2。AAV 2/2 載體中的該血清型2型衣殼基因可用血清型5型衣殼基因替換，從而產(chǎn)生AAV 2/5載體。用 于構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)；參見， 例如，Rabinowitz，J. E.，等(2002)，J. Virol. 76 :791_801，其全部公開內(nèi)容通過引用合并 入本文。適合用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇、用于將用于表達(dá)RNA的核酸序列 插入載體的方法、將病毒載體遞送至目的細(xì)胞的方法和表達(dá)的RNA產(chǎn)物的回收在本 領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。參見，例如，Dornburg(1995)，Gene Therapy 2:301-310; Eglitis(1988),Biotechniques 6:608-614 ；Miller(1990)，Hum. Gene Therapy1 :5_14 ；禾口 Anderson(1998)，Nature 392 :25_30，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。特別合適的病毒載體是來源于AV和AAV的載體。用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適 的AV載體、用于構(gòu)建重組AV載體的方法以及用于將載體遞送至靶細(xì)胞的方法描述于Xia 等(2002)，Nat. Biotech. 20 :1006-1010，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。用于表達(dá) miR基因產(chǎn)物的合適的AAV載體、用于構(gòu)建重組AAV載體的方法以及用于將載體遞送至靶細(xì) 胞的方法描述于 Samulski 等(1987)，J. Virol. 61 :3096_3101 ；Fisher 等(1996)，J. Virol, 70 520-532 ；Samulski 等(1989)，J. Virol. 63 :3822_3826 ；美國專利 5，252，479 ；美國專利 5，139,941 ；國際專利申請W0 94/13788 ；和國際專利申請W093/24641，其全部公開內(nèi)容通 過引用合并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含CMV立即早期啟動(dòng)子的單個(gè)重組AAV載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包含在人TO RNA啟動(dòng)子控制下的 與polyT終止序列有效連接的編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“與polyT 終止序列有效連接”是指編碼有義或反義鏈的核酸序列以5 ‘方向與polyT終止信號緊密 鄰接。在從載體轉(zhuǎn)錄miR序列的過程中，polyT終止信號用于終止轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的治療方法的其他實(shí)施方案中，可對受試者施用有效量的至少一種抑制 miR表達(dá)的化合物。如本文中所使用的，“抑制miR表達(dá)”是指治療后miR基因產(chǎn)物的前體 和/或活性成熟形式的產(chǎn)量低于治療前產(chǎn)生的量。通過使用例如上述用于診斷方法的測定 miR轉(zhuǎn)錄物水平的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定miR的表達(dá)在癌細(xì)胞中是否已被抑 制。抑制可在基因表達(dá)的水平上(即，通過抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或 在加工的水平上(例如，通過抑制miR前體至成熟的活性miR的加工)發(fā)生。如本文中所使用的，抑制miR表達(dá)的化合物的“有效量”是足以在患有癌癥(例如， 肺癌)的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖的量。通過考慮因素，例如受試者的大小和體重；疾病 侵入的程度；受試者的年齡、健康和性別；施用的途徑以及施用是局部的還是全身性的，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對給定的受試者施用的miR表達(dá)抑制化合物的有效量。例如，表達(dá)抑制化合物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的大致重量，如本文中所 描述的。抑制miR表達(dá)的化合物的有效量還可基于待治療的受試者的大致的或估計(jì)的體 重，如本文中所描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可容易地確定用于對給定的受試者施用抑制miR表達(dá)的化合 物的適當(dāng)?shù)慕o藥方案。用于抑制miR基因表達(dá)的合適的化合物包括雙鏈RNA(例如短或小干擾RNA或 “siRNA”)、反義核酸和酶促RNA分子例如核酶。這些化合物中的每一種可被靶向給定的miR 基因產(chǎn)物并且干擾靶miR基因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，抑制其翻譯，誘導(dǎo)其切割或破壞)。例如，給定的miR基因的表達(dá)可通過用分離的雙鏈RNA( “dsRNA”)分子誘導(dǎo)miR 基因的RNA干擾來抑制，所述雙鏈RNA分子與miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90%、例 如至少95%、至少98%、至少99%或100%的序列同源性。在特定的實(shí)施方案中，dsRNA分 子是“短或小干擾RNA”或“siRNA”。用于本方法的siRNA包括長度大約17個(gè)核苷酸至大約29個(gè)核苷酸、優(yōu)選長度大 約19至大約25個(gè)核苷酸的短雙鏈RNA。siRNA包含通過標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick堿基配對相互 作用(在下文中稱為“堿基配對”)退火在一起的有義RNA鏈和互補(bǔ)反義RNA鏈。有義鏈包 含與靶miR基因產(chǎn)物內(nèi)包含的核酸序列大體上同一的核酸序列。如本文中所使用的，siRNA中與靶mRNA內(nèi)包含的靶序列“大體上同一”的核酸序列 是與靶序列同一的核酸序列或與靶序列相異于1或2個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的有義 和反義鏈可包括兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子或可包括其中兩個(gè)互補(bǔ)部分堿基配對并且通過 單鏈“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”區(qū)域共價(jià)連接的單個(gè)分子。siRNA還可以是與天然存在的RNA相異于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和 /或改變的經(jīng)改變的RNA。這樣的改變可包括非核苷酸材料的添加(例如至siRNA的末端 或至siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸的添加)，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修飾或用脫氧 核糖核苷酸對siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。
siRNA的一條或兩條鏈還可包含3'懸突。如本文中所用的，“3'懸突”是指從雙 鏈RNA鏈的3'-末端延伸的至少一個(gè)未配對的核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，siRNA 包含至少一個(gè)長度為1至大約6個(gè)核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)、長度為 1至大約5個(gè)核苷酸、長度為1至大約4個(gè)核苷酸或長度為大約2至大約4個(gè)核苷酸的3 ‘ 懸突。在特定的實(shí)施方案中，3'懸突存在于siRNA的兩條鏈上，且其長度為2個(gè)核苷酸。例 如，siRNA的各條鏈可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“im”)的3'懸突。siRNA可通過化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上文對分 離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于 屬于Gewirtz的美國公開專利申請2002/0173478和屬于Reich等人的美國公開專利申請 2004/0018176，兩者的全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。給定的miR基因的表達(dá)還可通過反義核酸抑制。如本文中所使用的，“反義核酸” 是指通過RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用與靶RNA結(jié)合的核酸分子，其改變靶 RNA的活性。適合用于本方法的反義核酸是通常包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列互 補(bǔ)的核酸序列的單鏈核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、肽核酸(PNA))。反義核酸可 包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)或95-100%互補(bǔ)的核 酸序列。不希望受任何理論束縛，據(jù)信，反義核酸激活RNA酶H或降解miR基因產(chǎn)物/反義 核酸雙鏈體的另一種細(xì)胞核酸酶。反義核酸還可包含對核酸主鏈或?qū)μ呛蛪A基部分(或它們的等價(jià)物)的修飾，從 而增加靶特異性、核酸酶抗性、遞送或與分子的功效相關(guān)的其他性質(zhì)。此類修飾包括膽固醇 部分、雙鏈體嵌入劑例如吖啶或一種或多種抗核酸酶基團(tuán)。反義核酸可通過化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上文 對分離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測的示例性方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力 之內(nèi)；參見，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 261 1004以及屬于Woolf等人的美國專 利5，849，902，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。給定的miR基因的表達(dá)還可通過酶促核酸(enzymatic nucleicacid)抑制。如本 文中所使用的“酶促核酸”是指包含與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列具有互補(bǔ)性的底物結(jié) 合區(qū)并且能夠特異性切割miR基因產(chǎn)物的核酸。酶促核酸底物結(jié)合區(qū)可以例如與miR基因 產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100%互補(bǔ)、75-100%互補(bǔ)或95-100%互補(bǔ)。酶促核酸還可包括 在堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)上的修飾。用于本方法的示例性酶促核酸包括從頭甲基轉(zhuǎn)移酶包括DNMT3A和DNMT3B，如本 文中的實(shí)施例中所描述的。酶促核酸可通過化學(xué)或生物方法產(chǎn)生，或可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)，如上 文對分離的miR基因產(chǎn)物所描述的。用于產(chǎn)生和檢測dsRNA或siRNA分子的示例性 方法描述于 Werner 和 Uhlenbeck (1995)，Nucl. Acids Res. 23 2092-96 ；Hammann 等人 (1999)，Antisense andNucleic Acid Drug Dev. 9 :25_31 ；以及屬于 Cech 等人的美國專利 4，987，071，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一種用于抑制miR表達(dá)的化合物的施用將在患有肺 癌的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖。
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如本文中所使用的，“抑制癌細(xì)胞的增殖”是指殺死細(xì)胞或永久性或暫時(shí)地阻止或 減緩細(xì)胞的生長。如果受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目在施用miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化 合物后保持恒定或減少，那么可推斷癌細(xì)胞增殖被抑制。如果癌細(xì)胞的絕對數(shù)目增加但腫 瘤生長的速度下降，則也可推斷癌細(xì)胞增殖被抑制。受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞數(shù)目可通過直接測量或通過對原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤塊的大 小的估計(jì)來確定。例如，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目可通過免疫組織學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)或經(jīng)設(shè) 計(jì)用于檢測癌細(xì)胞的特征表面標(biāo)志物的其他技術(shù)來測量。腫瘤塊的大小可通過直接目測觀察或通過診斷成像法例如X射線、磁共振成像、 超聲和閃爍造影術(shù)(scintigraphy)來測定?？稍谑褂迷煊皠┗虿皇褂迷煊皠┑那闆r下使 用用于測定腫瘤塊的大小的診斷成像法，這在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。腫瘤塊的大小還可通過 物理方法例如組織塊的觸診或利用測量儀器例如測徑器測量組織塊來測定。可通過適合用于將此類化合物遞送至受試者的癌細(xì)胞的任何方法來對受試者施 用miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物。例如，可通過適合于用此類化合物或用包含 編碼此類化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者的細(xì)胞的方法來施用miR基因產(chǎn)物或miR表達(dá)抑 制化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合 物的序列的質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，包括例如核酸至細(xì)胞的細(xì)胞核或 前核(pronucleus)的直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或由親脂材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo) 的核酸遞送、基因槍或微粒加速、磷酸鈣沉淀以及由病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。例如，細(xì)胞可用質(zhì)脂體轉(zhuǎn)移化合物例如DOTAP (N- [ 1- (2，3_ 二油酰氧基)丙基]-N， N，N-三甲基-甲基硫酸銨，Boehringer-Mannheim)或等價(jià)物例如LIP0FECTIN進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使 用的核酸的量對于實(shí)施本發(fā)明不是至關(guān)重要的；可接受的結(jié)果可用0. 1-100微克核酸/IO5 個(gè)細(xì)胞來獲得。例如，可使用在3微克DOTAP中的大約0. 5微克質(zhì)粒載體/IO5個(gè)細(xì)胞的比 例。還可通過任何合適的腸內(nèi)或胃腸外施用途徑對受試者施用miR基因產(chǎn)物或miR基 因表達(dá)抑制化合物。用于本方法的合適的腸內(nèi)施用途徑包括例如口服、直腸或鼻內(nèi)遞送。合 適的胃腸外施用途徑包括例如血管內(nèi)施用(例如，靜脈內(nèi)團(tuán)注(bolus injection)、靜脈內(nèi) 輸注、動(dòng)脈內(nèi)團(tuán)注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和至脈管系統(tǒng)內(nèi)的導(dǎo)管滴注)；組織外周(peri-tissue)和 組織內(nèi)注射(例如，腫瘤外周和腫瘤內(nèi)注射，視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或 沉積，包括皮下輸注(例如通過滲透泵)；對目的組織的直接施用，例如通過導(dǎo)管或其他安 置裝置(例如，視網(wǎng)膜丸劑(retinal pellet)或栓劑或包含多孔的、無孔的或凝膠狀材料 的植入物)；以及吸入。特別合適的施用途徑是注射、輸注和直接注射入腫瘤。在本方法中，miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物可以以裸露的RNA形 式、與遞送試劑一起或以包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或miR基因產(chǎn)物表達(dá)抑制化合物的序列的 核酸(例如，重組質(zhì)粒或病毒載體)的形式對受試者進(jìn)行施用。合適的遞送試劑包括例如 Mirus TransitTKO 親脂試劑、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚陽離子(例如， 多聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。含有表達(dá)miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載體以及用于將此類質(zhì)粒和載體遞送至癌細(xì)胞的技術(shù)在本文中進(jìn)行了論述和/或在本領(lǐng)域內(nèi) 是熟知的。 在特定的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體用于將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物 (或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至受試者。脂質(zhì)體還可增加基因產(chǎn)物或核酸的血 液半衰期?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體，所述脂質(zhì)通常 包括中性的或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。脂質(zhì)的選擇通常通過考慮因素例如期 望的脂質(zhì)體大小和脂質(zhì)體在血流中的半衰期來進(jìn)行指導(dǎo)。已知許多用于制備脂質(zhì)體的方 法，例如如 Szoka 等人(1980)，Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 467 ；和美國專利 4，235，871、 4，501，728,4, 837，028和5，019，369 (其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文)中所描述的方 法。用于本方法的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。結(jié)合在癌細(xì)胞中普 遍的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。用于本方法的脂質(zhì)體還可進(jìn)行修飾以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(“匪S”)和網(wǎng)狀 內(nèi)皮系統(tǒng)(“RES”)清除。此類經(jīng)修飾的脂質(zhì)體在表面具有調(diào)理作用-抑制部分或所述部 分被整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用-抑制 部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用-抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的巨大 的親水聚合物。如本文中所使用的，調(diào)理作用-抑制部分，當(dāng)其通過化學(xué)或物理方式(例如 通過將脂溶性錨嵌入膜本身或通過與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合)附著至膜時(shí)，與脂質(zhì)體 膜“結(jié)合”。此類抑制調(diào)理作用的親水聚合物形成了顯著減少脂質(zhì)體被MMS和RES吸收的保 護(hù)性表面層；例如，如美國專利4，920，016中所描述的，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本 文。適合于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是具有大約500至大約40，000道爾 頓，更優(yōu)選大約2，000至大約20，000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合 物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG 硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；線性的、分支的或樹枝 狀聚酰胺-胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，例如與羧基或氨基化學(xué)連接的聚木糖 醇和聚乙烯醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，例如神經(jīng)節(jié)苷脂GMl。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其 衍生物的共聚物也是合適的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多 糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物還可以是包含 氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神 經(jīng)氨酸、褐藻酸、角叉菜膠(carrageenan)；胺化的多糖或低聚糖(線性或分支的)；或羧基 化的多糖或低聚糖，例如與碳酸的衍生物反應(yīng)從而與羧基連接的多糖或低聚糖。優(yōu)選，調(diào)理 作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“PEG 化的脂質(zhì)體”?？赏ㄟ^許多熟知的技術(shù)中的任一種將調(diào)理作用抑制部分結(jié)合至脂質(zhì)體膜。例如， 可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯與磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)可溶性錨結(jié)合，然后再與膜結(jié)合。類 似地，可使用Na(CN)BH3和溶劑混合物(例如以30 12比例的四氫呋喃和水)在60°C下 通過還原胺化作用，用硬脂酰胺脂質(zhì)可溶性錨衍生葡聚糖(dextran)聚合物。
用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體保持更長時(shí)間。因此，此類脂質(zhì)體有時(shí)稱為“隱形(stealth)”脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體在通過多孔或“滲 漏”微脈管系統(tǒng)供養(yǎng)的組織中積累。因此，由此類微脈管系統(tǒng)缺陷表征的組織例如肺腫瘤 將有效地積累這些脂質(zhì)體；參見 Gabizon 等(1988)，Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α. , 18 6949-53。此外，減少的通過RES的吸收通過阻止脂質(zhì)體在肝和脾中的大量積累來降低隱形 脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用-抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別適合用于將miR基因產(chǎn)物 或miR基因表達(dá)抑制化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細(xì)胞?？稍趯κ茉囌呤┯们?，按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)將miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑 制化合物配制為藥物組合物，有時(shí)稱為“藥劑”。因此，本發(fā)明包括用于治療肺癌的藥物組合 物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物或其分離的變 體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。在特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物 相應(yīng)于在肺癌細(xì)胞中，相對于適當(dāng)?shù)膶φ占?xì)胞具有減少的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物。在某 些實(shí)施方案中，分離的miR基因產(chǎn)物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種miR表達(dá)抑制化合物。在 特定的實(shí)施方案中，至少一種miR基因表達(dá)抑制化合物對于miR基因(所述miR基因的表 達(dá)在肺癌細(xì)胞中比在對照細(xì)胞中高)是特異性的。在某些實(shí)施方案中，miR基因表達(dá)抑制 化合物對于一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物是特異性 的。本發(fā)明的藥物組合物的特征在于至少是無菌的且無熱原的。如本文中所用的， “藥物組合物”包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。制備本發(fā)明的藥物組合物的方法在本領(lǐng)域 技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，例如如Remington' s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany, Easton, Pa. (1985)中所描述的，其全部公開內(nèi)容通過引用合并入本文。本藥物組合物包含至少一種與藥學(xué)上可接受的載體混合的miR基因產(chǎn)物或miR基 因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)(例如，按重量計(jì)算0. 1至 90% )，或其生理學(xué)上可接受的鹽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物額外包含一種 或多種抗癌劑(例如，化學(xué)治療劑)。本發(fā)明的藥物制劑還可包含至少一種被脂質(zhì)體封裝的 miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)和藥 學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含為miR29a、miR-29b和miR-29c的 一種或多種的miR基因或基因產(chǎn)物。特別適合的藥學(xué)上可接受的載體是水、緩沖的水、生理鹽水、0.4%的鹽水、0.3%
的甘氨酸、透明質(zhì)酸等。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種抗核酸酶降解的miR基 因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列的核酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過將一個(gè)或多個(gè)在2'-位置上進(jìn)行修飾的核糖核苷酸摻 入miR基因產(chǎn)物來容易地合成抗核酸酶的核酸。適當(dāng)?shù)?'-修飾的核糖核苷酸包括在 2'-位置上用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的核糖核苷酸。本發(fā)明的藥物組合物還可包含常規(guī)藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑(osmolalityadjusting agent)、緩沖劑和pH調(diào)節(jié) 齊U。合適的添加劑包括例如生理上生物相容性緩沖劑(例如，氨丁三醇鹽酸鹽)、螯合劑(例 如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合絡(luò)合物(例如，DTPA鈣、CaNaDTPA-雙酰胺)的添加， 或任選地，鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的添加。本發(fā)明的 藥物組合物可以以液體形式包裝使用或可以進(jìn)行凍干。對于本發(fā)明的固體藥物組合物，可使用常規(guī)無毒性的固體的藥學(xué)上可接受的載 體例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸 鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物可包含上文所列的任何載體和賦形劑以及 10-95%，優(yōu)選25% -75%的至少一種miR基因產(chǎn)物或miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少 一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可包含封裝在 上文所述的脂質(zhì)體中的按重量計(jì)算0.01-20%，優(yōu)選-10%的至少一種miR基因產(chǎn)物或 miR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和噴射劑。需要時(shí)還 可包含載體例如卵磷脂以用于鼻內(nèi)遞送。本發(fā)明的藥物組合物還可包含一種或多種抗癌劑。在特定的實(shí)施方案中，組合物 包含至少一種HliR基因產(chǎn)物或HliR基因表達(dá)抑制化合物(或至少一種含有編碼它們的序列 的核酸)和至少一種化學(xué)治療劑。適合于本發(fā)明的方法的化學(xué)治療劑包括但不限于DNA-烷 化劑、抗腫瘤抗生素劑、抗代謝劑(anti-metabolic agent)、微管蛋白穩(wěn)定劑、微管蛋白去 穩(wěn)定劑、激素拮抗劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、蛋白激酶抑制劑、HMG-CoA抑制劑、CDK抑制劑、細(xì) 胞周期蛋白抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、反義核酸、三鏈螺旋DNA、核酸 適體和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素劑(exotoxic agent) 0用于本發(fā)明的組合物的適當(dāng) 的試劑的實(shí)例包括但不限于阿糖胞苷(cytidinearabinoside)、甲氨蝶呤、長春新堿、依托 泊苷(VP-16)、多柔比星(阿霉素(adriamycin))、順鉬(CDDP)、地塞米松、arglabin、環(huán)磷 酰胺、溶肉瘤素(sarcolysin)、甲基亞硝脲、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶(5FU)、長春堿、喜樹堿、 放線菌素D、絲裂霉素C、過氧化氫、奧沙利鉬、伊立替康、托泊替康、亞葉酸、卡莫司汀、鏈佐 星、CPT-11、紫杉醇、它莫西芬、達(dá)卡巴嗪、利妥昔單抗、柔紅霉素、l-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶 (arabinofuranosylcytosine)、伊馬替尼、氟達(dá)拉濱、多西他賽、F0LF0X4。本文中還提供了鑒定腫瘤發(fā)生抑制劑的方法，所述方法包括給細(xì)胞提供測試試劑 和測量細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括給細(xì)胞提供測 試試劑和測量至少一種在癌細(xì)胞中具有減少的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物的水平。在提供試 劑后，相對于適當(dāng)?shù)膶φ占?xì)胞(例如，未提供試劑)，細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物的水平的增加表示 測試試劑是腫瘤發(fā)生的抑制劑。在特定的實(shí)施方案中，至少一種在癌細(xì)胞中具有減少的表 達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。在其他實(shí)施方案中，方法包括給細(xì)胞提供測試試劑和測量至少一種在癌細(xì)胞中具 有增加的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物的水平。在提供試劑后，與適當(dāng)?shù)膶φ占?xì)胞(例如，未提 供試劑)相比較，細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物水平的減少表示測試試劑是腫瘤發(fā)生的抑制劑。在特 定的實(shí)施方案中，至少一種在癌細(xì)胞中具有增加的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物選自miR29a、 miR-29b、miR-29c 和其組合。適當(dāng)?shù)脑噭┌ǖ幌抻谒幬?例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸)。試劑可重組產(chǎn)生、合成產(chǎn)生，或其可從天然來源分離(即，純化)。用于給細(xì)胞提供此類試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，且下文中描述了幾種這樣的方法。 用于檢測至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法(例如，Northern印跡、原位雜交、RT-PCR、 表達(dá)特征譜分析)在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。在下文中也描述了幾種此類方法?，F(xiàn)通過下列非限定性實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。實(shí)施例1在肺癌患者中，MiR-29的表達(dá)與MMT3A和3B呈負(fù)相關(guān)。此外，miR-29直接靶向 DNMT3A和3B。肺癌細(xì)胞系中增強(qiáng)的miR-29的表達(dá)恢復(fù)DNA甲基化的正常模式，誘導(dǎo)甲基 化沉默的腫瘤抑制基因(TSG)例如ΠΠΤ和WffOX14的再表達(dá)，并在體外和體內(nèi)抑制致瘤性。
這些發(fā)現(xiàn)支持miR-29在NSCLC的表觀遺傳調(diào)控中的作用，從而為開發(fā)用于治療肺 癌的基于miR的策略提供了理論依據(jù)。利用組織微陣列(TMA)的免疫組織化學(xué)分析來分析172個(gè)配對的非腫瘤性/原發(fā) 性NSCLC組織對。如圖5所示，更高的DNMT3A蛋白的表達(dá)與更低的總存活顯著相關(guān)(P = 0. 029)。在該患者群體中未觀察到DNMTl和DNTM3B與存活的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。為了在體內(nèi)驗(yàn)證這些miRNA-靶相互作用，將DNMT3A和DNTM3B的互補(bǔ)位點(diǎn)克 隆入螢火蟲螢光素酶基因的3 ‘ UTR并且與miR-29a、mi-R29b或miR-29c —起共轉(zhuǎn)染入 A459 (NSCLC)細(xì)胞。如圖2a中所示，相對于混雜寡核苷酸，所有3種miRNA(miR_29a、mi_R29b或 miR-29c)顯著減少螢光素酶的活性。為了估計(jì)單個(gè)miR-29序列的異位表達(dá)是否誘導(dǎo)內(nèi)源 DNMT3A和DNTM3B mRNA水平的下調(diào)，我們還在用混雜RNA或用miR-29轉(zhuǎn)染的A549和H1299 肺癌來源的細(xì)胞中進(jìn)行了定量RT-PCR(qRT-PCR)。單個(gè)miR-29的過表達(dá)誘導(dǎo)了 DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的顯著降低(圖2b，上 圖)，然而用反義分子沉默miR-29誘導(dǎo)了 DNMT3A和DNMT3B mRNA水平的上調(diào)(圖2b，下 圖)(只顯示A549細(xì)胞的結(jié)果)。為了證明miR-29的過表達(dá)可下調(diào)Dnmt3A和3B蛋白的表達(dá)，我們使用GFP-報(bào)告 載體 QBI-GFP25。簡而言之，我們將DNMT3A和DNMT3B的3 ‘ UTR克隆到QBI-GFP25載體的GFP 編碼序列的下游，從而允許含有DNMT3A或DNMT3B的3' UTR的融合GFP蛋白表達(dá)。用 GFP-3A/3B-3 ‘ UTR-載體和miR_29a、29b、29c或混雜寡核苷酸共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。在用 miR-29轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到GFP蛋白，特別地GFP-3B-3' UTR蛋白的表達(dá)顯著降低(圖 2c)；蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果與通過qRT-PCR獲得的結(jié)果一致，其中內(nèi)源DNMT3BmRNA因miR-29的 表達(dá)而更顯著降低(圖2b)。然而不希望受理論束縛，現(xiàn)認(rèn)為與DNMT3A相比，DNMT3B的優(yōu)先下調(diào)可能歸因于 miR-29與3B 3' -UTR的預(yù)測的配對“種子”的數(shù)目(對于29a，3個(gè)；對于29b，1個(gè)；對于 29c，l個(gè))總體上比與3A 3' -UTR的(對于各miR-29，1個(gè))更多。此外，DNMT3B 3' UTR為miR_29a和為29b/c配對提供了相異不超過1個(gè)核苷酸 的配對位點(diǎn)。因此，根據(jù)miRNA可通過一個(gè)基因上的多個(gè)靶位點(diǎn)協(xié)同作用的“協(xié)同原理”，使 用miR-29家族的任何成員的轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致對DNMT3B比對DNMT3A更強(qiáng)的沉默1(1'23。為了顯示DNMT3B 3' UTR與miR_29b的直接的功能性相互作用，通過使用miRNA作為內(nèi)源細(xì)胞質(zhì)引物在mRNA模板上合成cDNA，將最近描述的檢測方法用于檢測真核細(xì)胞 中的miRNA-mRNA復(fù)合物24。內(nèi)源miR_29b，在Pictar-預(yù)測的與3 ‘ UTR相互作用的位點(diǎn) 上8，能夠用作起始DNMT3B mRNA的逆轉(zhuǎn)錄的“天然”引物(圖2d)。然后確定DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達(dá)在原發(fā)性NSCLC組織中與miR-29的水平 是否呈負(fù)相關(guān)。通過qRT-PCR25就DNMT3A和DNMT3B mRNA的表達(dá)水平以及就miR_29a、29b 和 29c 的表達(dá)分析 14 (14)個(gè) NSCLC。在 DNMT3A mRNA 與 miR_29a (P = 0. 02)和 miR_29c (P =0. 02)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的負(fù)相關(guān)(圖6)。觀察到DNMT3B mRNA 水平與 miR_29a(P = 0. 02)和 miR_29c (P = 0. 04)的相似的 負(fù)相關(guān)性。雖然DNMT3A和DNMT3B mRNA水平與miR_29b水平存在朝向負(fù)相關(guān)的趨勢，但相 關(guān)性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著(DNMT3A P = 0. 14,DNMT3B P = 0. 09)，這可能歸因于分析的癌癥數(shù) 量較少或歸因于這樣的事實(shí)，即雖然miR-29a和29c分別只從第7和第1號染色體上的一 個(gè)染色體位置轉(zhuǎn)錄，但成熟miR_29b可從不同染色體上的兩個(gè)不同原始轉(zhuǎn)錄本(7q32. 3上 的 miR-29b-l/miR-29a 簇和 lq32. 2 上的 miR-29b_2/miR-29c 簇)轉(zhuǎn)錄。用于 qRT-PCR 以 測定miR-29b的成熟產(chǎn)物的探針不能區(qū)別29b-l或29b_2基因產(chǎn)物。miR-29靶向DWT3A和DWT3B的發(fā)現(xiàn)顯示此類miRNA的表達(dá)促成了癌癥中的DNA 表觀遺傳修飾。為了闡明該問題，用miR-29a、miR-29b、miR-29C或混雜寡核苷酸轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞，然后使用LC-MS/MS方法26在48和72小時(shí)后分析總DNA甲基化。如圖3a中所示，相對于對照，所有三種miR-29減少總DNA甲基化。miR_29b的作 用顯示更強(qiáng)，在48小時(shí)后產(chǎn)生30%的減少，在72小時(shí)后產(chǎn)生40%的減少。在用miR_29b 處理的細(xì)胞中觀察到的總甲基化減少的百分?jǐn)?shù)與利用DNMT1抑制劑例如地西他濱26觀察到 的相當(dāng)，并且對于任一方法來說都是不完全的。然而不希望受理論束縛，本發(fā)明者在本文中 現(xiàn)認(rèn)為可通過將地西他濱(或其他核苷類似物)與miR-29組合來獲得更強(qiáng)的總DNA低甲 基化，從而阻斷從頭和維持DNMT途徑。為了表征甲基化變化對基因表達(dá)的作用，分析在肺癌中通常被啟動(dòng)子甲基化沉默 的兩種TSG，F(xiàn)HIT和WW0X14的mRNA表達(dá)水平。如圖3b上圖中所示，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后48小時(shí)，H1IT表達(dá)分別被miR_29a、29b和 29c的表達(dá)增加大約65%、89%和74%，并且WWOX mRNA水平分別被miR_29a和29b增加大 約40%和60% ；在H1299細(xì)胞中觀察到相似的趨勢(圖3b，下圖)。在兩個(gè)細(xì)胞系中也都觀察到raiT和WW0X蛋白的增加的表達(dá)(圖3c)。為確定miR-29是否通過改變這些基因的啟動(dòng)子甲基化來調(diào)控H1IT和WW0X的表 達(dá)，使用MassARRAY系統(tǒng)27(定量高通量DNA甲基化分析)在用miR_29b轉(zhuǎn)染的A549和 H1299細(xì)胞中檢查HUT和WW0X的調(diào)控區(qū)域的甲基化狀態(tài)。設(shè)計(jì)兩個(gè)亞硫酸氫鹽反應(yīng)(每 個(gè)基因CpG島一個(gè))，對于HUT和WW0X，其分別覆蓋7個(gè)CpG和11個(gè)CpG。在miR_29b轉(zhuǎn) 染的H1299和A549細(xì)胞中，F(xiàn)HIT的MassARRAY分析分別顯示平均19. 和54. 3%的甲基 化減少，然而在H1299中對于WW0X，與混雜寡核苷酸相比較，顯示平均32. 的減少(圖 3d)。還估量了 miR-29的再表達(dá)對A549細(xì)胞的致瘤性的作用。miR-29在A549中的異 位表達(dá)在體外抑制細(xì)胞生長(圖4a)，并且相對于混雜對照轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(圖4b)。還在體內(nèi)觀察到miR-29對A549的致瘤性的抑制作用。相對于模擬對照和混雜寡
28核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，利用miR-29的轉(zhuǎn)染抑制了 A549移植腫瘤的生長(圖4c，4d，4e)，從而 說明了此類miRNA的可能的抗瘤作用。因此，本實(shí)施例顯示miR-29家族成員的表達(dá)在肺癌中與DNMT3A和DNMT3B的表達(dá) 呈負(fù)相關(guān)并且此類miRNA下調(diào)兩種酶的表達(dá)水平。此外，肺癌細(xì)胞中此類miRNA的增強(qiáng)的表達(dá)導(dǎo)致減少的總DNA甲基化，恢復(fù)TSG的 表達(dá)，且在體外和體內(nèi)抑制致瘤性。這些結(jié)果可用于開發(fā)單獨(dú)地或與其他療法組合使用合 成的miR-29的新型表觀遺傳療法，以在肺癌中重新激活腫瘤抑制基因，并且使異常的甲基 化模式恢復(fù)正常。由于在其他常見人惡性腫瘤中觀察到miR-29家族成員的表達(dá)的喪失，因 此可將該方法擴(kuò)展至其他人惡性腫瘤的治療。方法。樣品我們從The Ohio State University 的 Pathology Core Facility 獲得 172 個(gè) 肺癌樣品，包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、大細(xì)胞癌和神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞癌(統(tǒng)稱為非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC))，以進(jìn)行關(guān)于DNMT表達(dá)的組織微陣列(TMA)。這些患者的臨床特征(組織學(xué)診斷、 性別、年齡、 M狀態(tài)和存活時(shí)間)是可獲得的。從 Cooperative Human Tissue Network-Midwestern Division，Columbus，OH 購 得原發(fā)性肺癌組織(8個(gè)鱗狀細(xì)胞癌和6個(gè)腺癌)以進(jìn)行qRT-PCR分析。按照廠商說明書， 利用 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA)提取法來分離總 RNA。組織微陣列組織微陣列(TMA)各陣列包含每一個(gè)肺癌的4個(gè)樣品以及多個(gè)適當(dāng)?shù)姆魏推渌?正常組織的點(diǎn)。用抗DNMT1、DNTM3A和DNMT3B蛋白的抗血清對TMA染色(通常對于每一種抗 血清使用2個(gè)TMA)，將肺癌中每一個(gè)此類酶的表達(dá)與臨床特征相比較以尋找顯著相關(guān)性。 使用 1 150 的稀釋度的 GeneTex 的 DNMT1 抗血清(GTX13537，San Antonio，TX)、1 25 的 稀釋度的 Novus Biologicals 的 DNMT3A 抗血清(ab-4897，Littleton，CO)和 1 32 的稀釋 度的 Abgent 的 DNTM3B 抗血清(AP1035a，San Diego, CA)在肺癌 TMA 上估量 DWT1、DWT3A 和DNMT3B蛋白的表達(dá)。將來自TMA塊的4微米切片置于帶正電荷的載玻片上，置于60°C烘 箱中1小時(shí)，然后冷卻，然后通過二甲苯和梯度乙醇溶液(進(jìn)行至水)而脫蠟和再水化。將 載玻片在3%過氧化氫中淬滅5分鐘以封閉內(nèi)源過氧化物酶。在TRS(Dako，Carpinteria, CA)溶液中于95°C下收回(retrieve)抗原，進(jìn)行25分鐘。將載玻片于室溫下暴露于第一 抗血清進(jìn)行1小時(shí)，然后于室溫下暴露于第二抗血清(1 200)進(jìn)行20分鐘；第二抗血清 是山羊抗小鼠(對于DNMT1)和山羊抗兔(對于DNMT3A和DMT3B)。在應(yīng)用生物素化的第 二抗血清之前，針對內(nèi)源生物素封閉所有載玻片。使用Vectastain Elite (Vector, cat# PK-6100)進(jìn)行生色團(tuán)檢測，進(jìn)行30分鐘。底物生色團(tuán)是DAB+(Dako，cat# K3468)。使用蘇 木精對載玻片進(jìn)行復(fù)染，通過梯度乙醇溶液脫水，然后蓋上蓋玻片。由對臨床特征不知情的病理學(xué)家閱讀TMA并且對其打分；通過將個(gè)體樣品中的陽 性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)乘以染色強(qiáng)度來測定表達(dá)評分；以1至3的等級評估染色強(qiáng)度，其中1是最 低強(qiáng)度的染色，3是最高強(qiáng)度。例如，具有10%的強(qiáng)度為3的陽性細(xì)胞的樣品被賦予30的 評分，與具有30%的強(qiáng)度為1的陽性細(xì)胞的樣品評分相同。定量RT-PCR。按照廠商說明書，使用TaqMan MicroRNA測定試劑盒(AppliedBiosystems, Foster City, CA)以一式三份進(jìn)行 miRNA 的定量 RT-PCR(qRT-PCR)分析。將 18S RNA用于標(biāo)準(zhǔn)化；如之前所述1進(jìn)行其他目的基因的qRT-PCR分析。利用基因特異 性引物和 IQ SYBRGreen Supermix (Biorad, Hercules, CA)將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。GAPDH 用作標(biāo)準(zhǔn)化對照。關(guān)于miR-29的沉默，按照廠商的方案通過使用Lipofectamine 2000 試劑(Invitrogen)，用 100nM(終)反義 miR-29a、29b_l、29c 或混雜反義 miR(Fidelity Systems, Gaithersburg, MD)在 6 孔板中轉(zhuǎn)染 A549 和 H1299 細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)。將來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)的A549和H1299肺 癌細(xì)胞維持在具有10% FBS和抗生素(100U/ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素)的RPMI培養(yǎng) 基1640中。靶向DNMT 3' UTR的螢光素酶報(bào)告基因測定法。為了進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因?qū)?驗(yàn),通過PCR從人基因組DNA擴(kuò)增979bp的DNMT3A 3' UTR區(qū)段和978bp的DNMT3B 3 ‘ UTR 區(qū)段，然后利用緊在螢光素酶的終止密碼子上游的Xbal位點(diǎn)，將其插入具有SV40啟動(dòng)子的 PGL3-對照載體(Promega)。使用下列引物組產(chǎn)生特定片段DWT3A-UTR Fw :5，-GCTCTAGAGCCGAAAAGGGTTGGACATCAT-3’, [SEQ ID NO 15]DWT3A-UTR Rv :5，-GCTCTAGAGCGCCGAGGGAGTCTCCTTTTA-3’ ； [SEQ ID NO 16]DWT3B-UTR Fw :5，-GCTCTAGAGCTAGGTAGCAACGTGGCTTTT-3’, [SEQ ID NO 17]DWT3B-UTR Rv :5，-GCTCTAGAGCGCCCCACAAAACTTGTCAAC-3' . [SEQ ID NO 18]DNMT 3A的擴(kuò)增的3' UTR在位點(diǎn)583上含有Xbal限制性位點(diǎn)，因此我們將上游 3' UTR(DWT 3A 3' -UTRup = 583bp)和下游片段(DNMT3A3‘ -UTRdown = 396bp)分開 地克隆入PGL3載體。預(yù)測的miR-29的配對種子位于DNMT3A 3' -UTR下游片段，將其用于 進(jìn)行螢光素酶測定。按照廠商的方案，通過使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)，用0. 4 ii g螢 火蟲螢光素酶報(bào)告載體和0. 08 y g含有海腎螢光素酶的對照載體pRL-TK載體(Promega) 在12孔板中共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。對于每一個(gè)孔，使用100nM(終)的前體miR-29a、29b_l、 29c或混雜miR(Ambi0n)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，通過使用雙重-螢光素酶測定法(Promega) 連續(xù)測量螢火蟲和海腎螢光素酶活性。以一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。評估DNMT 3' UTR對蛋白質(zhì)表達(dá)的作用的GFP-抑制構(gòu)建體。對于GFP-抑制，通 過 PCR 從人基因組 DNA 擴(kuò)增 1472bp 的 DNMT3A 3 ‘ UTR 區(qū)段和 1566bp 的 DNMT3B 3 ‘ UTR 區(qū)段(相應(yīng)于3' UTR的全長)，然后利用位于載體(其在GFP編碼序列的末端沒有終 止密碼子)的GFP編碼序列的3’的BamHI-EcoRI克隆位點(diǎn)，將其插入QBI-GFP25載體 (Autofluorescent Proteins，Canada)。使用下列引物組產(chǎn)生特定片段DWT3A-GFP Fw 5' -CGGGATCCGCAGGATAGCCAAGTTCAGC-3’，[SEQID N0 19]DWT3A-GFP Rv :5，-CCCAAGCTTAAGTGAGAAACTGGGCCTGA-3‘ ； [SEQ ID NO 20]DWT3B-GFP Fw 5' -CGGGATCCCTCGATCAAACAGGGGAAAA-3’，[SEQID N0 21]DWT3B-GFP Rv 5' -CCCAAGCTTGTTACGTCGTGGCTCCAGTT-3’ [SEQID NO 22].按照廠商的方案使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)，用2 ii g含有 DNMT3A 的 3 ‘ UTR (QBI-GFP25-DWT3A)或 DNMT3B 的 3 ‘ UTR (QBI-GFP25-DWT3B)的 GFP 抑 制載體和lOOnM(終)的前體miR29a、29b-l、29c或混雜寡核苷酸(Ambion)在12孔板中共 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。作為另外的對照，還用GFP載體(無miR)轉(zhuǎn)染一組細(xì)胞。在24小時(shí)后收獲細(xì)胞。如之前所述2進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和免疫印跡分析。使用下列第一抗血清兔多克隆 抗-GFP，1 1000 (Novus Biologicals，Littleton，CO)。miR 29b_DNMT3B RNA復(fù)合物的檢測。為了檢測miR-29b_DNMT3BRNA復(fù)合物，我們 使用由Vatolin S.等描述的方法3來確定內(nèi)源miR-29b在A549細(xì)胞中是否能夠用作逆轉(zhuǎn) 錄DNMT3B mRNA的引物。將cDNA克隆入pCR2. 1-T0P0載體(Invitrogen)。使用下列引物 組和接頭(adapter)序列(GSP意指基因特異性引物)GSP-DWT3B :5，-GAGATGACAGGGAAAACTGC-3，； [SEQ ID NO 23]GSP-DNMT3B 5N :5，-ACAGGGAAAACTGCAAAGCT-3，； [SEQ ID NO 24]接頭5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGACATGGACTGAAGGAGTAGAAA-3，； [SEQ IDN0 25]接頭:5N:5，-CTGAAGGAGTAGAAA-3，[SEQ ID NO 26].引物5N代表來自用于使PCR條帶的檢測更靈敏的GSP序列和接頭的嵌套引物 (nested primer)0總甲基化研究。如之前所述4測定在用混雜miRNA和用miR_29轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞 的總甲基化狀態(tài)。對于該測定，如上對于螢光素酶測定所描述的，轉(zhuǎn)染2 X 106個(gè)A549細(xì)胞， 48和72小時(shí)后收集細(xì)胞。定量DNA甲基化。使用EpiTYPER甲基化分析測定法(Sequenom，San Diego, CA) 進(jìn)行HUT和WWOX的調(diào)控區(qū)域的定量DNA甲基化分析。設(shè)計(jì)兩個(gè)亞硫酸氫鹽反應(yīng)(每個(gè)基 因CpG島一個(gè)反應(yīng))，對于raiT和WW0X其分別覆蓋7個(gè)CpG和11個(gè)CpG。在轉(zhuǎn)染后48小 時(shí)提取混雜_或miR-29b-轉(zhuǎn)染的A549/H1299的DNA，對1 y g DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，體 外轉(zhuǎn)錄，用RNA酶A進(jìn)行切割，然后經(jīng)歷基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-T0F)質(zhì)譜 分析以確定甲基化模式，如所描述的5。使用下列引物擴(kuò)增raiT和WW0X基因的調(diào)控區(qū)FHIT Fw 5' -GGGGAGGTAAGTTTAAGTGGAATATTGTT-3，[SEQ ID NO 27]FHIT Rv 5' -CACCCCCAAAACCAAAAACTATAAC—3，[SEQ ID NO 28]WWOX Fw 5' -TTGAAAGAAAGTTTTTTAAAATTAGGAAAT-3，[SEQ IDN0 29]WWOX Rv 5' -TCAAAAAAACAAAACCTAAAAAAAA—3，[SEQ ID NO :30].j^ffi fi Stanford UniversityHeatmap builder versionl. 03d c^ 的熱圖(heatmap)。FHIT和WWOX蛋白的Western印跡分析。如之前所述2進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和免疫印 跡分析。使用下列第一抗血清兔多克隆抗_FHIT，1 1000 (Zymed, San Francisco, CA)； 小鼠單克隆抗-WffOX，1 500 (如參考文獻(xiàn)2中)。使用Molecular Dynamics Personal Densitometer SI 禾口 IMAGEQUANT 5. 2 (Image Products International, Chantilly, VA)進(jìn)行FHIT、WWOX和Gapdh的信號的定量。細(xì)胞生長曲線。將A549細(xì)胞(5X104)涂板在6x多孔板中，24小時(shí)后，按照廠商 的方案，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，用終濃度100nM的來自Ambion的混雜寡 核苷酸或miR-29寡核苷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)染。作為對照，還包括未轉(zhuǎn)染的(模擬)細(xì)胞。收獲細(xì)胞， 以24小時(shí)的間隔使用ViCell計(jì)數(shù)器(Beckman Coulter, Fullerton，CA)計(jì)數(shù)細(xì)胞。各樣
品以一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞凋亡和流式細(xì)胞術(shù)研究。按照廠商的方案，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用100nM終濃度的來自Ambion的混雜寡核苷酸或miR-29寡核苷酸轉(zhuǎn) 染A549細(xì)胞(2X105)。24小時(shí)后，按照提供商的說明書，將細(xì)胞重懸浮于含有膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶的結(jié)合緩沖液(BD Biosciences, San Diego, CA)中， 然后使用 Beckman-Coulter model EPICS XL 細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Beckman-Coulter)通過流式細(xì) 胞術(shù)進(jìn)行估量。各樣品以一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)研究。按照制度化的指導(dǎo)方針(institutional guideline)進(jìn)行動(dòng)物研究。 按照廠商的方案通過使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)，A549細(xì)胞用100nM(終 濃度)的混雜(Scr)寡核苷酸或miR-29a、-29b或-29c體外轉(zhuǎn)染，或進(jìn)行模擬轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn) 染后48小時(shí)時(shí)，將3X 106個(gè)活細(xì)胞皮下注射入6周齡雌性裸小鼠(Charles RiverBreeding Laboratories,ffilmington,MA)的左脅腹，每組5只小鼠。在注射后7天測量腫瘤直徑，然 后每5天測量一次。在注射后第21天，殺死小鼠，在尸體剖檢后測量腫瘤的重量。通過使 用公式V(以mm3表示)=AXB2/2測定腫瘤體積，其中A是最大直徑，B是垂直直徑。統(tǒng)計(jì)分析。P值是雙向的(two-sided)，并使用SPSS軟件包(SPSS10. 0)來獲得。 從診斷的時(shí)間直至最后一次跟蹤觀察的日期計(jì)算總存活。檢查最后一次跟蹤觀察時(shí)活著 的患者的數(shù)據(jù)。為了進(jìn)行存活分析和產(chǎn)生Kaplan-Meier (KM)曲線，通過將樣品分成兩組 (高和低表達(dá)，按照DNMT評分< 10(低)或> 10(高))來將利用免疫組織化學(xué)染色測量 的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B水平轉(zhuǎn)變成離散變量?？色@得各組的存活曲線，并且通過使用 時(shí)序檢驗(yàn)(log-ranktest)進(jìn)行比較。為了評估m(xù)iRNA表達(dá)和DNMT表達(dá)之間的相關(guān)性，我 們使用皮爾森相關(guān)性(Pearson correlation)和線性回歸分析(SPSS軟件包)。這些函數(shù) 檢查每一對測量值(一個(gè)來自miRNA，另一個(gè)來自DNMT)以確定兩個(gè)變量是趨向于一起還是 反向移動(dòng)，即miRNA的更大的值(高表達(dá))是否與MMT表達(dá)的更低的值相關(guān)。實(shí)施例2用于診斷、分期、預(yù)后、監(jiān)控和治療肺癌相關(guān)疾病的方法、試劑和試劑盒。應(yīng)理解，本文所中有實(shí)施例在它們的范圍內(nèi)將被認(rèn)為是非限定性的。在下面部分 更詳細(xì)地描述各個(gè)方面。診斷方法在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了評估患者是否患有肺癌相關(guān)疾病或具有高于正常的發(fā) 生肺癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的診斷方法，所述方法包括將患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平與對照 例如來自無肺癌相關(guān)疾病的患者的樣品中的標(biāo)志物的正常表達(dá)水平相比較的步驟。與正常水平相比，患者樣品中顯著更高的標(biāo)志物表達(dá)水平表示患者患有肺癌相關(guān) 疾病或具有高于正常的發(fā)生肺癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。選擇標(biāo)志物以使該方法的陽性預(yù)測值為至少大約10%，在某些非限定性實(shí)施方案 中，大約25%、大約50%或大約90%。也優(yōu)選用于本方法的是與正常細(xì)胞相比較在至少大 約20%，在某些非限定性實(shí)施方案中，大約50%或大約75%的細(xì)胞中差異表達(dá)至少2倍的 標(biāo)志物。在一個(gè)評估患者是否患肺癌相關(guān)疾病的診斷方法(例如，新檢測(“篩查”)、復(fù) 發(fā)的檢測、反射測試(reflex testing))中，方法包括比較a)患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水 平，和b)對照非肺癌相關(guān)疾病樣品中標(biāo)志物的正常表達(dá)水平。與正常水平相比較患者樣品 中顯著更高的標(biāo)志物表達(dá)水平表示患者患有肺癌相關(guān)疾病。
還提供了用于評估抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的療法的效果的診斷方法。此類方法 包括比較a)在對患者提供至少一部分治療之前從患者獲得的第一樣品中標(biāo)志物的表達(dá)， 和b)在提供部分治療后從患者獲得的第二樣品中標(biāo)志物的表達(dá)。相對于第一樣品中標(biāo)志 物的表達(dá)水平，第二樣品中顯著更低的標(biāo)志物的表達(dá)水平表示療法對于抑制患者的肺癌相 關(guān)疾病是有效的。應(yīng)理解，在此類方法中，“療法”可以是治療肺癌相關(guān)疾病的任何療法，包括但不限 于藥物組合物、基因療法和生物療法例如抗體和趨化因子的施用。因此，本文中描述的方法可用于評估治療前、治療期間和治療后的患者，例如用于評估疾病狀態(tài)的減輕。在某些方面，診斷方法關(guān)注于使用化學(xué)或生物試劑的療法。此類方法包括比較a) 從患者獲得的并且在化學(xué)或生物試劑存在的情況下維持的第一樣品中標(biāo)志物的表達(dá)，和b) 從患者獲得的并且在所述試劑不存在的情況下維持的第二樣品中標(biāo)志物的表達(dá)。相對于第 一樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平，第二樣品中顯著更低的標(biāo)志物的表達(dá)水平表示試劑對于抑制 患者的肺癌相關(guān)疾病是有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二樣品可以是從患者獲得的 單個(gè)樣品的部分或從患者獲得的混合樣品的部分。評估預(yù)后的方法還提供了用于評估患者的肺癌相關(guān)疾病的進(jìn)展的監(jiān)控方法，所述方法包括a)在 第一時(shí)間點(diǎn)檢測患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)；b)在隨后的時(shí)間點(diǎn)及時(shí)重復(fù)步驟a)；和c)比 較步驟a)和b)中檢測的表達(dá)水平，從而監(jiān)控患者的肺癌相關(guān)疾病的進(jìn)展。與第一時(shí)間點(diǎn) 上的樣品的標(biāo)志物的表達(dá)水平相比，在隨后的時(shí)間點(diǎn)上的樣品中顯著更高的標(biāo)志物的表達(dá) 水平表示肺癌相關(guān)疾病已向前發(fā)展，而顯著更低的表達(dá)水平表示肺癌相關(guān)疾病已消退。還提供了用于確定肺癌相關(guān)疾病是否已惡化或可能在將來惡化的診斷方法，所述 方法包括比較a)患者樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平，和b)對照樣品中標(biāo)志物的正常表達(dá)水 平。與正常水平相比較，患者樣品中顯著更高的表達(dá)水平表示肺癌相關(guān)疾病已惡化或可能 在將來惡化。評估抑制性、治療性和/或有害組合物的方法還提供了用于選擇抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的組合物的檢測方法。該方法包括步 驟a)從患者獲得含有細(xì)胞的樣品；b)在多種受試組合物存在的情況下分別維持樣品的等 分；C)比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)；和d)選擇其中的一種受試組合物，所述組合物，相對于 在其他受試組合物存在的情況下標(biāo)志物的表達(dá)水平，顯著減少含有該受試組合物的等分中 標(biāo)志物的表達(dá)水平。另外提供了評估化合物在引起肺癌相關(guān)疾病中的有害潛能的檢測方法。該方法包 括步驟a)在化合物存在和不存在的情況下維持分開的細(xì)胞等分；和b)比較各等分中標(biāo)志 物的表達(dá)。相對于在化合物不存在的情況下維持的等分中標(biāo)志物的表達(dá)水平，在化合物存 在的情況下維持的等分中顯著更高的標(biāo)志物的表達(dá)水平表示化合物具有這樣的有害潛能。此外，還提供了抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的方法。該方法包括步驟a)從患者獲 得含有細(xì)胞的樣品；b)在多種組合物存在的情況下分別維持樣品的等分；c)比較各等分中 標(biāo)志物的表達(dá)；和d)對患者施用至少一種組合物，所述組合物，相對于在其他組合物存在 的情況下標(biāo)志物的表達(dá)水平，在含有該組合物的等分中顯著降低標(biāo)志物的表達(dá)水平。樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平可以例如通過檢測下列物質(zhì)在樣品中的存在來估量相應(yīng)的標(biāo)志物蛋白或所述蛋白的片段(例如，通過使用特異性結(jié)合所述蛋白或蛋白片段的試 劑，例如抗體、抗體衍生物、抗體片段或單鏈抗體)、相應(yīng)的標(biāo)志物核酸(例如，核苷酸轉(zhuǎn)錄 物或其互補(bǔ)序列)或所述核酸的片段(例如，通過將從樣品獲得的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸與在其 上附著有一個(gè)或多個(gè)具有完整的所述核酸的序列或其區(qū)段或其互補(bǔ)序列的核酸的基質(zhì)接 觸)、由相應(yīng)的標(biāo)志物蛋白直接(即，催化)或間接產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物?？墒褂弥辽僖粋€(gè)或多個(gè)(例如，2、3、5或10或更多個(gè))肺癌相關(guān)疾病標(biāo)志物進(jìn)行 任何上述方法。在此類方法中，將多個(gè)標(biāo)志物(其中至少一個(gè)是標(biāo)志物)中的每一個(gè)在樣 品中的表達(dá)水平與多個(gè)標(biāo)志物中的每一個(gè)在從未患有肺癌相關(guān)疾病的對照人獲得的相同 類型的樣品中的正常表達(dá)水平相比較。相對于該標(biāo)志物的相應(yīng)的正?；?qū)φ账?，一個(gè)或 多個(gè)標(biāo)志物或其一些組合在樣品中顯著改變的(即，如在上述使用單個(gè)標(biāo)志物的方法中所 詳細(xì)說明的增加或減少)表達(dá)水平表示患者患有肺癌相關(guān)疾病。對于所有上述方法，選擇 標(biāo)志物以使方法的陽性預(yù)測值是至少大約10%。候選試劑的實(shí)例候選試劑可以是本領(lǐng)域已知的藥理學(xué)試劑(pharmacologicagent)或可以是之前 未知的具有任何藥理活性的試劑。試劑可以是天然產(chǎn)生的或?qū)嶒?yàn)室中設(shè)計(jì)的。它們可從微 生物、動(dòng)物或植物分離，或可重組產(chǎn)生或通過任何適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法合成。它們可以是小分 子、核酸、蛋白質(zhì)、肽或模擬肽(p印tidomimetics)。在某些實(shí)施方案中，候選試劑是具有大 于50且小于大約2，500道爾頓的分子量的小有機(jī)化合物。候選試劑包含與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性 相互作用所必需的官能團(tuán)。還在生物分子中發(fā)現(xiàn)候選試劑，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、 類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合?？蓮亩喾N來源(包括合成的或天然化合物的文庫)獲得候選試劑。存在例如許 多可獲得用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子的方法，包括隨機(jī)化寡核苷酸和 寡肽的表達(dá)。備選地，以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物的形式存在的天然化合物的文庫是 可獲得的或可容易地產(chǎn)生。此外，天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物可容易地通過常規(guī)化學(xué)、 物理和生物學(xué)方法進(jìn)行修飾，并且可用于產(chǎn)生組合文庫。在某些實(shí)施方案中，候選試劑可 使用組合文庫方法領(lǐng)域中的許多方法中的任一方法來獲得，所述方法包括非限定性實(shí)例 生物文庫法；空間可定位平行固相或溶液相文庫法(spatially addressable parallel solidphase or solution phase libraries)；需要角軍卷禾只(deconvolution)白勺合成文庫 法；“一珠一化合物(one-bead one-compound) ”文庫法；和使用親和層析選擇的合成文庫 法。在某些其他實(shí)施方案中，可將某些藥理學(xué)藥劑經(jīng)歷定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，例如酰 化、烷化、酯化、酰胺化(amidification)等以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。用于鑒定治療肺癌相關(guān)疾病的治療劑的相同方法還可用于驗(yàn)證體外研究產(chǎn)生的 前導(dǎo)化合物(lead compound)/試劑。候選試劑可以是上調(diào)或下調(diào)一個(gè)或多個(gè)肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答途徑的試劑。在某些實(shí) 施方案中，候選試劑可以是影響這樣的途徑的拮抗劑。用于治療肺癌相關(guān)疾病的方法本文提供了用于治療、抑制、減輕或逆轉(zhuǎn)肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的方法。在本文所述的 方法中，對有此需要的個(gè)體施用干擾信號級聯(lián)的試劑，所述個(gè)體例如但不限于其中這樣的并發(fā)癥還不明顯的肺癌相關(guān)疾病患者和已具有至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的患者。在前一種情況下，這樣的治療用于預(yù)防此類肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的發(fā)生和/或減輕 它們發(fā)生的程度。在后一種情況下，這樣的治療用于減輕此類肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答發(fā)生的程 度，阻止它們進(jìn)一步發(fā)展或逆轉(zhuǎn)肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，干擾肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答級聯(lián)的試劑可以是對此類應(yīng)答特異的 抗體。標(biāo)志物的表達(dá)可以以許多方式抑制標(biāo)志物的表達(dá)，所述方式包括非限定性實(shí)例可對肺癌相關(guān) 疾病細(xì)胞提供反義寡核苷酸以抑制標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄、翻譯或兩者。備選地，可對細(xì)胞提供編碼 特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段并且與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子/調(diào)節(jié)子區(qū)域 有效連接的多核苷酸，以產(chǎn)生抑制所述蛋白的功能或活性的細(xì)胞內(nèi)抗體。標(biāo)志物的表達(dá)和/ 或功能還可通過用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體、抗體衍生物或抗體片段處理肺癌相關(guān)疾 病細(xì)胞來抑制。通過使用本文中描述的方法，可篩選多種分子，特別地包括足夠小以使它們 能夠穿過細(xì)胞膜的分子，以鑒定抑制標(biāo)志物的表達(dá)或抑制標(biāo)志物蛋白的功能的分子?？蓪?患者提供如此鑒定的化合物以抑制患者的肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞。任何標(biāo)志物或標(biāo)志物的組合，以及與所述標(biāo)志物組合的任何特定標(biāo)志物可用于本 文中描述的組合物、試劑盒和方法中。一般地，期望使用這樣的標(biāo)志物，對于所述標(biāo)志物，肺 癌相關(guān)疾病細(xì)胞中該標(biāo)志物的表達(dá)水平與正常肺細(xì)胞中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平之間的差 異盡可能大。雖然該差異可以小至用于估量標(biāo)志物的表達(dá)的方法的檢測極限，但期望差異 至少大于估量方法的標(biāo)準(zhǔn)誤，在一些實(shí)施方案中，與正常組織中相同標(biāo)志物的表達(dá)水平相 比，至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、100、500、1000 倍或更大的差異。已公認(rèn)，某些標(biāo)志物蛋白被分泌至圍繞細(xì)胞的細(xì)胞外空間。由于此類標(biāo)志物蛋白 可在肺癌相關(guān)體液樣品中檢測，因此將這些標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法的某些實(shí)施 方案，所述體液樣品可以比組織活檢樣品更容易地從人患者收集。此外，用于檢測標(biāo)志物蛋 白的體內(nèi)技術(shù)包括將抗所述蛋白的標(biāo)記抗體引入受試者。例如，抗體可用其在受試者中的 存在和定位可利用標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)來檢測的放射性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。為了確定任何特定的標(biāo)志物蛋白是否是分泌蛋白，在例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如人肺 細(xì)胞系中表達(dá)標(biāo)志物蛋白，收集細(xì)胞外液體，估量蛋白質(zhì)在細(xì)胞外液體中的存在或不存在 (例如，使用特異性結(jié)合所述蛋白的標(biāo)記抗體)。應(yīng)理解，含有肺細(xì)胞的患者樣品可用于本文中所述的方法。在這些實(shí)施方案中，標(biāo) 志物的表達(dá)水平可通過估量樣品中標(biāo)志物的量(例如，絕對量或濃度)來估量。當(dāng)然，可在 估量樣品中標(biāo)志物的量之前將細(xì)胞樣品經(jīng)歷多種收集后制備和貯藏技術(shù)(例如，核酸和/ 或蛋白質(zhì)提取、固定、貯藏、冷凍、超濾、濃縮、蒸發(fā)、離心等)。還應(yīng)理解，可使標(biāo)志物流出細(xì)胞進(jìn)入消化系統(tǒng)、血流和/或間質(zhì)間隙?？梢岳缤?過檢查血清或血漿來檢測流出的標(biāo)志物。組合物、試劑盒和方法可用于檢測標(biāo)志物蛋白的表達(dá)，所述標(biāo)志物蛋白具有至少 一個(gè)展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。例如，可將免疫學(xué)方法用于檢測完整細(xì)胞上的 此類蛋白，或可將基于計(jì)算機(jī)的序列分析法用于預(yù)測至少一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(即，包括分 泌蛋白和具有至少一個(gè)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))的存在?？蓹z測標(biāo)志物蛋白的表達(dá)而無需裂解細(xì)胞(例如，使用特異性結(jié)合蛋白的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記抗體)，所述標(biāo)志物蛋白 具有至少一個(gè)展示于表達(dá)其的細(xì)胞的表面上的部分。標(biāo)志物的表達(dá)可通過用多種用于檢測轉(zhuǎn)錄的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法中的任 一種來估量。此類方法的非限定性實(shí)例包括用于檢測分泌蛋白、細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白 或核蛋白的免疫學(xué)方法、蛋白質(zhì)純化法、蛋白質(zhì)功能或活性測定法、核酸雜交法、核酸逆轉(zhuǎn) 錄法以及核酸擴(kuò)增法。在特定的實(shí)施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)可使用特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段(包 括已經(jīng)歷所有或部分其正常翻譯后修飾的標(biāo)志物蛋白)的抗體(例如，放射性標(biāo)記的、發(fā)色 團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的抗體)、抗體衍生物(例如，綴合有底物或蛋白質(zhì)或蛋 白質(zhì)-配體對的配體的抗體)或抗體片段(例如，單鏈抗體、分離的抗體高變結(jié)構(gòu)域等)來估量。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，標(biāo)志物的表達(dá)通過下述來估量從患者樣品的細(xì)胞 制備mRNA/cDNA(S卩，轉(zhuǎn)錄的多核苷酸)，然后將mRNA/cDNA與為標(biāo)志物核酸的互補(bǔ)序列的參 照多核苷酸或其片段雜交。任選地，可在與參照多核苷酸雜交前使用多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 方法中的任一種來擴(kuò)增cDNA ；優(yōu)選，其不進(jìn)行擴(kuò)增。同樣可使用定量PCR檢測一個(gè)或多個(gè) 標(biāo)志物的表達(dá)以估量標(biāo)志物的表達(dá)水平。備選地，可使用檢測標(biāo)志物的突變或變體(例如， 單核苷酸多態(tài)性、缺失等)的許多方法中的任一種來檢測患者中標(biāo)志物的存在。在相關(guān)實(shí)施方案中，將獲自樣品的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸的混合物與在其上固定有多核 苷酸(其與標(biāo)志物核酸的至少一部分(例如，至少7、10、15、20、25、30、40、50、100、500或更 多個(gè)核苷酸殘基)互補(bǔ)或同源)的基質(zhì)接觸。如果可在基質(zhì)上差異地檢測到互補(bǔ)或同源的 多核苷酸(例如，可使用不同的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)檢測或固定至不同的選擇的位置)，那么可 使用單個(gè)基質(zhì)(例如，固定在所選擇的位置上的多核苷酸的“基因芯片”微陣列)同時(shí)估量 多個(gè)標(biāo)志物的表達(dá)水平。當(dāng)使用包括將一個(gè)核酸與另一個(gè)核酸雜交的估量標(biāo)志物表達(dá)的方 法時(shí)，期望在嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行雜交。在某些實(shí)施方案中，可使用質(zhì)譜法或表面等離子共振術(shù)進(jìn)行生物標(biāo)志物測定 (biomarker assay)。在不同的實(shí)施方案中，鑒定活性抗肺癌相關(guān)疾病的試劑的方法可包括 a)提供含有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物或其衍生物的細(xì)胞的樣品；b)從所述細(xì)胞制備提取物；c)將 所述提取物與含有標(biāo)志物結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)記核酸探針混合；和，d)在測試試劑存在或不存在 的情況下測定標(biāo)志物與核酸探針之間的復(fù)合物的形成。測定步驟可包括將所述提取物/核 酸探針混合物經(jīng)歷電泳遷移率試驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay)。在某些實(shí)施方案中，測定步驟包括選自酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基于熒光的測 定和超高通量測定，例如，表面等離子共振術(shù)(SPR)或熒光相關(guān)光譜(FCS)測定的測定。在 此類實(shí)施方案中，sra傳感器用于指導(dǎo)生物分子相互作用的實(shí)時(shí)觀察，因?yàn)閟ra對金屬-電 介質(zhì)表面上的微小折射率改變非常敏感。sra是對大約200nm的STO傳感器/樣品介面內(nèi) 的105至10_6折射率(RI)單位的改變敏感的表面技術(shù)。因此，sra光譜法用于監(jiān)控沉積在 傳感層上的薄有機(jī)薄膜的生長。因?yàn)榻M合物、試劑盒和方法依賴于一種或多種標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異的檢測， 因此期望標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著大于用于估量至少一種正常細(xì)胞和受肺癌影響的細(xì)胞中 的表達(dá)的方法的最小檢測極限。
應(yīng)理解，通過使用一種或多種標(biāo)志物對另外的患者樣品進(jìn)行常規(guī)篩選，將了解某 些標(biāo)志物在不同類型的細(xì)胞，包括特定的肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞中過表達(dá)。此外，通過就標(biāo)志物的表達(dá)評估更大數(shù)量的患者樣品，并且使從其獲得樣品的個(gè) 體患者的結(jié)果相互關(guān)聯(lián)，還將確認(rèn)某些標(biāo)志物的改變的表達(dá)與肺癌相關(guān)疾病強(qiáng)相關(guān)以及其 他標(biāo)志物的改變的表達(dá)與其他疾病強(qiáng)相關(guān)。從而組合物、試劑盒和方法可用于表征患者的 肺癌相關(guān)疾病的分期、分級、組織學(xué)類型和性質(zhì)中的一種或多種。當(dāng)組合物、試劑盒和方法用于表征患者的肺癌相關(guān)疾病的分期、分級、組織學(xué)類型 和性質(zhì)中的一種或多種時(shí)，期望選擇標(biāo)志物或標(biāo)志物組以使在至少大約20%，在某些實(shí)施 方案中，至少大約40%、60%或80%和基本上所有患者(其患有相應(yīng)分期、分級、組織學(xué)類 型或性質(zhì)的肺癌相關(guān)疾病)中獲得陽性結(jié)果?？蛇x擇本發(fā)明的標(biāo)志物或標(biāo)志物組以使對于 一般群體可獲得大于大約10%的陽性預(yù)測值(在非限定性的實(shí)例中，外加大于80%的測定 特異性)。當(dāng)多個(gè)標(biāo)志物用于組合物、試劑盒和方法時(shí)，可在單個(gè)反應(yīng)混合物(即，使用針對 各個(gè)標(biāo)記物的試劑，例如不同的熒光探針)或在相應(yīng)于一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物的單獨(dú)的反應(yīng)混 合物中，將患者樣品中各標(biāo)志物的表達(dá)水平與相同類型的非肺癌樣品中多個(gè)標(biāo)志物中的每 一個(gè)的正常表達(dá)水平相比較。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對于相應(yīng)的正常水平，樣品中一個(gè)以上 的標(biāo)志物的顯著增加的表達(dá)水平表示患者患有肺癌相關(guān)疾病。當(dāng)使用多個(gè)標(biāo)志物時(shí)，可使 用2、3、4、5、8、10、12、15、20、30或50或更多個(gè)單獨(dú)的標(biāo)志物；在某些實(shí)施方案中，可能期望 使用更少的標(biāo)志物。為了使組合物、試劑盒和方法的靈敏性最大化(即在干擾可歸因于患者樣品中非 肺來源的細(xì)胞的情況下)，期望本文中所使用的標(biāo)志物是具有受限制的組織分布(例如通 常不在非肺組織中表達(dá))的標(biāo)志物。應(yīng)認(rèn)識到，組合物、試劑盒和方法對于具有增加的發(fā)生肺癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的患 者和他們的醫(yī)學(xué)顧問將是特別有用的。被認(rèn)為具有增加的發(fā)生肺癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的患者 包括例如具有肺癌相關(guān)疾病家族史的患者?？梢砸远喾N方法估量正常人肺組織中標(biāo)志物的表達(dá)水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該 正常表達(dá)水平通過下述來估量估量一部分表現(xiàn)正常的肺細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)水平且將該 正常表達(dá)水平與一部分懷疑為異常的肺細(xì)胞中的表達(dá)水平相比較。備選地，特別是當(dāng)由于 常規(guī)進(jìn)行本文中所述的方法而可獲得進(jìn)一步的信息時(shí)，可使用標(biāo)志物的正常表達(dá)的群體平 均值。在其他實(shí)施方案中，標(biāo)志物的“正?！北磉_(dá)水平可通過估量標(biāo)志物在從未患有肺癌的 患者獲得的患者樣品、在懷疑肺癌相關(guān)疾病在患者中發(fā)作之前從患者獲得的患者樣品、編 檔保存的患者樣品等中的表達(dá)來進(jìn)行測定。本文中還提供了用于估量肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞在樣品(例如編檔保存的組織樣品 或從患者獲得的樣品)中的存在的組合物、試劑盒和方法。這些組合物、試劑盒和方法基本 上與上述的相同，除了必要時(shí)，使組合物、試劑盒和方法適用于除了患者樣品外的樣品。例 如，當(dāng)待使用的樣品是石蠟包埋的(parafinized)編檔保存的人組織樣品時(shí)，可能必需在 用于估量樣品中標(biāo)志物表達(dá)水平的組合物、試劑盒或方法中調(diào)整化合物的比例。產(chǎn)生抗體的方法本文中還提供了制備產(chǎn)生用于估量患者是否患有肺癌相關(guān)疾病的抗體的分離的雜交瘤的方法。在該方法中，合成或分離(例如通過從其中表達(dá)其的細(xì)胞純化或通過體內(nèi) 或體外轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸)含有完整標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽。 使用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、兔或綿羊。任選地(和優(yōu)選 地)可用蛋白質(zhì)或肽免疫脊椎動(dòng)物至少另外一次，從而使脊椎動(dòng)物呈現(xiàn)強(qiáng)烈的針對蛋白質(zhì) 或肽的免疫應(yīng)答。從免疫的脊椎動(dòng)物分離脾細(xì)胞，使用多種方法中的任一種將其與永生化 的細(xì)胞系融合從而形成雜交瘤。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法篩選以該方式形成的雜交瘤，從而鑒定 一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的雜交瘤。本文還提供了通過該方 法制備的雜交瘤和使用這樣的雜交瘤制備的抗體。估量功效的方法本文還提供了估量測試化合物抑制肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞的功效的方法。如上所述， 標(biāo)志物的表達(dá)水平的差異與肺細(xì)胞的異常狀態(tài)相關(guān)。雖然公認(rèn)，某些標(biāo)志物的表達(dá)水平的 變化可能由肺細(xì)胞的異常狀態(tài)引起，但同樣公認(rèn)，其他標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化誘導(dǎo)、維持 和促進(jìn)此類細(xì)胞的異常狀態(tài)。因此，抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的化合物將使一個(gè)或多個(gè)標(biāo) 志物的表達(dá)水平改變至更接近該標(biāo)志物的正常表達(dá)水平(即，所述標(biāo)志物在正常肺細(xì)胞中 的表達(dá)水平)的水平。因此本方法包括將在測試化合物存在的情況下維持的第一肺細(xì)胞樣品中的標(biāo)志 物的表達(dá)與在測試化合物不存在的情況下維持的第二肺細(xì)胞樣品中的標(biāo)志物的表達(dá)相比 較。在測試化合物存在的情況下標(biāo)志物的顯著減少的表達(dá)表示該測試化合物抑制肺癌相關(guān) 疾病。肺細(xì)胞樣品可以例如是獲自患者的正常肺細(xì)胞的單個(gè)樣品的等分、獲自患者的正常 肺細(xì)胞的混合樣品、正常肺細(xì)胞系的細(xì)胞、獲自患者的肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞的單個(gè)樣品的等 分、獲自患者的肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞的混合樣品、肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞系的細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是獲自患者的肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞，并且檢測多種據(jù)認(rèn)為 對于抑制各種肺癌相關(guān)疾病是有效的化合物，以鑒定可能最佳地抑制患者的肺癌相關(guān)疾病 的化合物。同樣可將該方法用于估量療法抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的功效。在該方法中，估 量一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物在樣品對(一個(gè)樣品經(jīng)歷療法，另一個(gè)不經(jīng)歷療法)中的表達(dá)水平。與 估量測試化合物的功效的方法一樣，如果療法誘導(dǎo)顯著更低的標(biāo)志物表達(dá)水平，則療法對 于抑制肺癌相關(guān)疾病是有效的。如上，如果來自選擇的患者的樣品用于本方法，那么可在體 外估量備選療法以選擇對于抑制患者的肺癌相關(guān)疾病最可能有效的療法。如本文中所描述的，人肺細(xì)胞的異常狀態(tài)與標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化相關(guān)。還提 供了用于評估測試化合物的有害潛能的方法。該方法包括在測試化合物存在和不存的情況 下維持分開的人肺細(xì)胞等分。比較各等分中標(biāo)志物的表達(dá)。在測試化合物存在的情況下維 持的等分中標(biāo)志物的顯著更高的表達(dá)水平(相對于在測試化合物不存在的情況下維持的 等分)表示測試化合物具有有害的潛能。各種測試化合物的相對有害潛能可通過比較相關(guān) 標(biāo)志物的表達(dá)水平的增強(qiáng)或抑制的程度，通過比較其表達(dá)水平被增強(qiáng)或抑制的的標(biāo)志物的 數(shù)目，或通過比較兩者來估量。分離的蛋白質(zhì)和抗體一個(gè)方面涉及分離的標(biāo)志物蛋白和其生物活性部分，以及適合用作免疫原以引發(fā) 抗標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然標(biāo)志物蛋白可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過適當(dāng)?shù)募兓桨笍募?xì)胞或組織來源分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含 有完整的標(biāo)志物蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。除重組表達(dá)外，可使 用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成此類蛋白質(zhì)或肽?！胺蛛x的，，或“純化的，，蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含細(xì)胞材料或來自細(xì)胞 或組織來源(所述蛋白質(zhì)源自于其)的其他污染性蛋白，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué) 前體或其他化學(xué)藥品。術(shù)語“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中將蛋白質(zhì)與從其分離或重組 產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞組分分離的蛋白質(zhì)制劑。因此，基本上不含細(xì)胞材料的蛋白 質(zhì)包括具有低于大約30%、20%、10%或5% (按干重計(jì)算)的異種蛋白質(zhì)(在本文中也稱 為“污染性蛋白”)的蛋白質(zhì)制劑。當(dāng)重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其生物活性部分時(shí)，其也優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，S卩，培養(yǎng)基 占據(jù)低于大約20%、10%或5%的蛋白質(zhì)制劑的體積。當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)，其優(yōu) 選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品，即，其與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其他化學(xué) 藥品分離。因此，此類蛋白質(zhì)制劑具有低于大約30%、20%、10%、5% (按干重計(jì)算)的化 學(xué)前體或除了目的多肽外的化合物。標(biāo)志物蛋白的生物活性部分包括含有與標(biāo)志物蛋白的氨基酸序列充分同一或源 自于其的氨基酸序列的多肽，其包含比全長蛋白質(zhì)更少的氨基酸，并且展示相應(yīng)的全長蛋 白質(zhì)的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應(yīng)的全長蛋白質(zhì)的至少一種活性的 結(jié)構(gòu)域或基序。標(biāo)志物蛋白的生物活性部分可以是其長度為例如10、25、50、100或更多個(gè) 氨基酸的多肽。此外，其中標(biāo)志物蛋白的其他區(qū)域被缺失的其他生物活性部分可通過重組 技術(shù)來制備，并且可就標(biāo)志物蛋白的天然形式的一種或多種功能活性對其進(jìn)行評估。在某 些實(shí)施方案中，有用的蛋白質(zhì)與此類序列之一基本上同一(例如，至少大約40%，在某些實(shí) 施方案中，50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一)并且保持相應(yīng)的天然發(fā)生的標(biāo) 志物蛋白的功能活性但因天然等位基因變異或誘變而在氨基酸序列上不同。此外，標(biāo)志物蛋白的區(qū)段文庫可用于產(chǎn)生用于篩選和隨后選擇變異標(biāo)志物蛋白或 其區(qū)段的多肽的多樣化(variegated)群體。預(yù)測醫(yī)學(xué)本文中還提供了動(dòng)物模型和標(biāo)志物在預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的用途，其中診斷測定、預(yù) 后測定、藥物基因組學(xué)和監(jiān)控臨床試驗(yàn)用于預(yù)后(預(yù)測)目的，從而預(yù)防性治療個(gè)體。因 此，本文中還提供了用于測定一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物蛋白或核酸的表達(dá)水平以確定個(gè)體是否處 于發(fā)生肺癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的診斷測定。此類測定可用于預(yù)后或預(yù)測目的，從而在肺癌 相關(guān)疾病發(fā)作之前預(yù)防性治療個(gè)體。在另一個(gè)方面，方法可用于相同個(gè)體的至少周期性篩查以觀察該個(gè)體是否已暴露 于改變他/她的表達(dá)模式的化學(xué)藥品或毒素。另一方面涉及監(jiān)控試劑(例如，被施用以抑制肺癌相關(guān)疾病或治療或預(yù)防任何其 他障礙的藥物或其他化合物(例如，以了解這樣的治療可能具有的任何系統(tǒng)性作用))在臨 床試驗(yàn)中對標(biāo)志物的表達(dá)或活性的影響。藥物基因組學(xué)標(biāo)志物還可用作藥物基因組學(xué)標(biāo)志物。如本文中所用的，“藥物基因組學(xué)標(biāo)志物” 是其表達(dá)水平與患者中特定臨床藥物應(yīng)答或易感性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥物基因
39組學(xué)標(biāo)志物表達(dá)的存在或量與預(yù)測的患者應(yīng)答和更特別地患者的腫瘤對用特定藥物或藥 物種類的療法的應(yīng)答相關(guān)。通過估量患者中一個(gè)或多個(gè)藥物基因組學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)的存在 或量，可選擇最適合于患者的或預(yù)測具有更大的成功程度的藥物療法。監(jiān)控臨床試驗(yàn)監(jiān)控試劑(例如，藥物化合物)對標(biāo)志物的表達(dá)水平的影響不僅可用于基礎(chǔ)藥物 篩選，而且還可用于臨床試驗(yàn)。例如，可在接受肺癌相關(guān)疾病治療的受試者的臨床試驗(yàn)中監(jiān) 控試劑影響標(biāo)志物表達(dá)的有效性。在一個(gè)非限定性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于監(jiān)控利用試劑(例如，激動(dòng)劑、拮 抗劑、模擬肽、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)治療受試者的有效性的方法， 該方法包括步驟(i)在施用試劑之前從受試者獲得施用前的樣品；(ii)檢測一個(gè)或多個(gè)選 擇的標(biāo)志物在施用前的樣品中的表達(dá)水平；(iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)施用后樣品； (iv)檢測標(biāo)志物在施用后樣品中的表達(dá)水平；(v)將施用前樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平與施 用后樣品中標(biāo)志物的表達(dá)水平相比較；以及(vi)相應(yīng)地改變試劑至受試者的施用。例如，在治療過程中增加的標(biāo)志物基因的表達(dá)可表明無效劑量，從而需要增加劑 量。相反地，減少的標(biāo)志基因的表達(dá)可表明有效治療，從而不需要改變劑量。電子設(shè)備可讀介質(zhì)、系統(tǒng)、陣列和使用其的方法如本文中所使用的，“電子設(shè)備可讀介質(zhì)”是指用于存儲、保存或包含可用電子設(shè) 備直接閱讀和存取的數(shù)據(jù)或信息的任何適當(dāng)介質(zhì)。此類介質(zhì)可包括但不限于磁性存儲 介質(zhì)，例如軟盤、硬盤存儲介質(zhì)以及磁帶；光學(xué)存儲介質(zhì)例如光盤；電子存儲介質(zhì)例如RAM、 R0M、EPR0M、EEPR0M等；以及普通硬盤和這些類別的混合體例如磁性/光學(xué)存儲介質(zhì)?？蓪?介質(zhì)進(jìn)行改造或設(shè)定以用于在其上記錄本文中所述的標(biāo)志物。如本文中所用的，術(shù)語“電子設(shè)備”旨在包括任何適當(dāng)?shù)挠?jì)算或處理設(shè)備或其他經(jīng) 改造或設(shè)定用于存儲數(shù)據(jù)或信息的裝置。適合用于本發(fā)明的電子設(shè)備的實(shí)例包括獨(dú)立的計(jì) 算設(shè)備；網(wǎng)絡(luò)，包括局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)絡(luò)(WAN)因特網(wǎng)、內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和外聯(lián)網(wǎng)；電子器具例如 個(gè)人數(shù)字助理(PDA)、手機(jī)、尋呼機(jī)(pager)等；以及局域和分布式處理系統(tǒng)。如本文中所使用的，“記錄”是指在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲或編碼信息的過程。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地采用任何用于在介質(zhì)上記錄信息的方法來產(chǎn)生包含本文中所述 的標(biāo)志物的材料。許多軟件程序和格式可用于在電子設(shè)備可讀介質(zhì)上存儲本發(fā)明的標(biāo)志物信息。 為了獲得或產(chǎn)生在其上記錄了標(biāo)志物的介質(zhì)，可使用許多數(shù)據(jù)處理程序構(gòu)建格式(data processor structuring format)(例如，文本文件或數(shù)據(jù)庫)。通過以可讀形式提供標(biāo)志 物，可常規(guī)存取用于多種目的的標(biāo)志物序列信息。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用可讀形式的 核苷酸或氨基酸序列來將靶序列或靶結(jié)構(gòu)基序與存儲在數(shù)據(jù)存儲工具中的序列相比較。搜 索工具用于鑒定匹配特定靶序列或靶基序的序列的片段或區(qū)域。因此，本文中還提供了用于保存進(jìn)行確定受試者是否具有肺癌相關(guān)疾病或?qū)?肺癌相關(guān)疾病的易感性的方法的說明書的介質(zhì)，其中所述方法包括步驟確定標(biāo)志物 的存在或不存在并且基于標(biāo)志物的存在或不存在來確定受試者是否具有肺癌相關(guān)疾 病或?qū)Ψ伟┫嚓P(guān)疾病的易感性和/或推薦用于肺癌相關(guān)疾病或肺癌相關(guān)疾病前狀況 (pre-lungcancer-related disease condition)白勺特定治療。
本文中還提供了電子系統(tǒng)和/或在網(wǎng)絡(luò)中提供了用于確定受試者是否患有肺癌 相關(guān)疾病或具有對與標(biāo)志物相關(guān)的肺癌相關(guān)疾病的易感性的方法，其中所述方法包括步 驟確定標(biāo)志物的存在或不存在，并且基于標(biāo)志物的存在或不存在來確定受試者是否患有 肺癌相關(guān)疾病或具有對肺癌相關(guān)疾病的易感性和/或推薦用于肺癌相關(guān)疾病或肺癌相關(guān) 疾病前狀況的特定治療。方法還可包括接收與受試者相關(guān)的表型信息和/或從網(wǎng)絡(luò)獲取與 受試者相關(guān)的表型信息的步驟。本文中還提供了網(wǎng)絡(luò)，用于確定受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病或具有對與標(biāo)志物 相關(guān)的肺癌相關(guān)疾病的易感性的方法，所述方法包括步驟接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息，接收 與受試者相關(guān)的表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或肺癌相關(guān)疾病的信息，并且基 于表型信息、標(biāo)志物和獲取的信息中的一個(gè)或多個(gè)，確定受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病或 具有對肺癌相關(guān)疾病的易感性。方法還包括推薦用于肺癌相關(guān)疾病或肺癌相關(guān)疾病前狀況 的特定治療的步驟。本文中還提供了用于確定受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病或具有對肺癌相關(guān)疾病 的易感性的商業(yè)方法，所述方法包括步驟接收與標(biāo)志物相關(guān)的信息，接收與受試者相關(guān)的 表型信息，從網(wǎng)絡(luò)獲取相應(yīng)于標(biāo)志物和/或肺癌相關(guān)疾病的信息，并且基于表型信息、標(biāo)志 物和獲得的信息中的一個(gè)或多個(gè)，確定受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病或具有對肺癌相關(guān)疾 病的易感性。方法還包括推薦用于肺癌相關(guān)疾病或肺癌相關(guān)疾病前狀況的特定治療的步 馬聚o本文中還提供了可用于測定陣列中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的陣列。在一個(gè)實(shí)施方 案中，陣列可用于測定組織中基因的表達(dá)，從而確定陣列中基因的組織特異性。這樣，可就 表達(dá)同時(shí)測定直至大約7000或更多個(gè)基因。這使得能夠產(chǎn)生顯示在一個(gè)或多個(gè)組織中特 異性表達(dá)的一組基因的特征譜。除了此類定性測定外，本文中還提供了基因表達(dá)的定量。因此，不僅組織特異性而 且一組基因在組織中的表達(dá)水平也是可確定的。因此，可基于基因本身的組織表達(dá)和在該 組織中的表達(dá)水平來對基因進(jìn)行分類。這可用于例如確定組織間基因表達(dá)的關(guān)系。因此， 可干擾一個(gè)組織，然后可測定對第二組織中的基因表達(dá)的影響。在本說明書中，可測定一種 細(xì)胞類型對另一種細(xì)胞類型(響應(yīng)生物刺激)的影響。此類測定可用于例如在基因表達(dá)的水平上了解細(xì)胞間相互作用的效果。如果試 劑被治療性施用以治療一種細(xì)胞類型但其對另一種細(xì)胞類型具有不期望的作用，則所述方 法提供了確定不期望的作用的分子基礎(chǔ)的測定，從而提供共施用中和劑(counteracting agent)或另外治療不期望的作用的機(jī)會。類似地，即使在單個(gè)細(xì)胞類型中，可在分子水平上 測定不期望的生物學(xué)效應(yīng)。因此，可確定和中和試劑對非靶基因的表達(dá)的作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，陣列可用于監(jiān)控陣列中一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的時(shí)程。如 本文中所公開的，這可發(fā)生在各種生物學(xué)背景(例如肺癌相關(guān)疾病的發(fā)生，肺癌相關(guān)疾病 的進(jìn)展)和過程(例如與肺癌相關(guān)疾病相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化)中。陣列還可用于確定基因的表達(dá)或其他基因的表達(dá)在相同細(xì)胞或不同細(xì)胞中的作 用。如果不能調(diào)控最終或下游靶，那么這提供了例如用于治療性干預(yù)的備選分子靶的選擇。陣列還可用于確定一個(gè)或多個(gè)基因在正常和異常細(xì)胞中的差異表達(dá)模式。這提供 了可用作診斷或治療性干預(yù)的分子靶的一組基因。
替代 + 示志物(Surrogate Marker)標(biāo)志物可用作一種或多種障礙或疾病狀態(tài)或?qū)е路伟┫嚓P(guān)疾病狀態(tài)的狀況的替代標(biāo)志物。如本文中所使用的，“替代標(biāo)志物”是與疾病或障礙的不存在或存在，或與疾病或 障礙的進(jìn)展相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。此類標(biāo)志物的存在或量不依賴于疾病。因此，此 類標(biāo)志物可用于指示特定的療程在減輕疾病狀態(tài)或障礙中是否有效。當(dāng)疾病狀態(tài)或障礙的 存在或程度難以通過標(biāo)準(zhǔn)方法來評估，或當(dāng)在達(dá)到潛在危險(xiǎn)的臨床終點(diǎn)之前期望評估疾病 進(jìn)展時(shí)，替代標(biāo)志物是特別有用的。標(biāo)志物還可用作藥效標(biāo)志物(pharmacodynamic marker)。如本文中所使用的，“藥 效標(biāo)志物”是與藥物作用特異性相關(guān)的目的生物化學(xué)標(biāo)志物。藥效標(biāo)志物的存在或量與將 對其施用藥物的疾病狀態(tài)或障礙無關(guān)；因此，標(biāo)志物的存在或量表示藥物在受試者中的存 在或活性。例如，藥效標(biāo)志物可表示藥物在生物組織中的濃度，因?yàn)闃?biāo)志物在該組織中表達(dá) 或轉(zhuǎn)錄，或者不表達(dá)或轉(zhuǎn)錄與藥物的水平相關(guān)。這樣，藥物的分布或吸收可通過藥效標(biāo)志物 來監(jiān)控。類似地，藥效標(biāo)志物的存在或量可與藥物的代謝產(chǎn)物的存在或量相關(guān)，這樣標(biāo)志物 的存在或量表示藥物在體內(nèi)的相對分解速率。藥效標(biāo)志物在增加藥物作用的檢測的靈敏性中特別有用，特別是當(dāng)以低劑量施用 藥物時(shí)。由于即使少量的藥物也可足以激活多輪的標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，因此擴(kuò)增的標(biāo)志物 可以以比藥物本身更容易檢測的量存在。同樣，標(biāo)志物由于其本身的性質(zhì)而可以更容易地 進(jìn)行檢測；例如，通過使用本文中描述的方法，可將抗體用于針對蛋白標(biāo)志物的基于免疫的 檢測系統(tǒng)，或可使用標(biāo)志物特異性放射性標(biāo)記探針來檢測mRNA標(biāo)志物。此外，藥效標(biāo)志物 的使用可提供由于藥物治療而產(chǎn)生的超出可直接觀察的范圍的風(fēng)險(xiǎn)的基于機(jī)制的預(yù)測。用于檢測的方案檢測肺癌相關(guān)疾病的方法包括例如在一段時(shí)間內(nèi)測量各標(biāo)志物基因在來自受試 者的生物樣品中的表達(dá)水平和將該水平與對照生物樣品中標(biāo)志物基因的水平相比較。當(dāng)標(biāo)志物基因是本文中描述的基因之一并且表達(dá)水平差異表達(dá)(例如，比對照中 的表達(dá)水平更高或更低)時(shí)，受試者被判斷為患有肺癌相關(guān)疾病。當(dāng)標(biāo)志物基因的表達(dá)水 平落在容許的范圍內(nèi)時(shí)，受試者不可能患有肺癌相關(guān)疾病?？赏ㄟ^測量對照中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平來預(yù)先測定對照的標(biāo)準(zhǔn)值，以比較表達(dá) 水平。例如，可基于上述標(biāo)志物基因在對照中的表達(dá)水平來測定標(biāo)準(zhǔn)值。例如，在某些實(shí)施 方案中，容許的范圍基于標(biāo)準(zhǔn)值采用士2S.D.。在測定標(biāo)準(zhǔn)值后，可通過只測量來自受試者 的生物樣品中的表達(dá)水平并將該值與測定的對照的標(biāo)準(zhǔn)值相比較來進(jìn)行檢測方法。標(biāo)志物基因的表達(dá)水平包括標(biāo)志物基因至mRNA的轉(zhuǎn)錄和至蛋白質(zhì)的翻譯。因此， 基于相應(yīng)于標(biāo)志物基因的mRNA的表達(dá)強(qiáng)度或由標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的比 較，進(jìn)行檢測肺癌相關(guān)疾病的一個(gè)方法?？筛鶕?jù)各種基因分析方法在肺癌相關(guān)疾病的檢測中測量標(biāo)志物基因的表達(dá)水平。 具體地，可使用例如利用與此類基因雜交的核酸作為探針的雜交技術(shù)，或利用與標(biāo)志物基 因雜交的DNA作為引物的基因擴(kuò)增技術(shù)?？苫跇?biāo)志物基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)用于檢測的探針或引物。本文中描述了各標(biāo) 志物基因的核苷酸序列的標(biāo)識號。此外，應(yīng)理解，高等動(dòng)物的基因通常伴有高頻率的多態(tài)性。也存在許多在剪接過程中產(chǎn)生含有相互不同的氨基酸序列的同種型的分子。與肺癌相關(guān)疾病相關(guān)的具有與標(biāo)志物 基因的活性相似的活性的任何基因包括在標(biāo)志物基因中，即使其由于多態(tài)性或?yàn)橥N型而 具有核苷酸序列差異。也應(yīng)理解，標(biāo)志物基因可包括除了人外的其他物種的同源物。因此，除非明確指出，否則表述“標(biāo)志物基因”是指對于物種獨(dú)特的標(biāo)志物基因的同源物或已被導(dǎo)入個(gè)體的外 源標(biāo)志物基因同樣，應(yīng)理解，“標(biāo)志物基因的同源物”是指來源于除了人以外的物種的基因，其在 嚴(yán)格條件下可作為探針與人標(biāo)志物基因雜交。這樣的嚴(yán)格條件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員(其可 通過實(shí)驗(yàn)或憑經(jīng)驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)臈l件來產(chǎn)生相同嚴(yán)格性)來說是已知的。含有標(biāo)志物基因的核苷酸序列或與標(biāo)志物基因的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)并且 具有至少15個(gè)核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸可用作引物或探針。因此，“互補(bǔ)鏈”是指由 A:T (對于RNA為U)和G:C堿基對組成的雙鏈DNA中相對于另一條鏈的一條鏈。此外，“互補(bǔ)”不僅意指與至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域完全互補(bǔ)的序列，而且還指 具有在某些情況下至少40 %，在某些情況下50 %，在某些情況下60 %，在某些情況下70 %， 至少80%、90%和95%或更高的核苷酸序列同源性的序列。核苷酸序列之間的同源性的程 度可利用算法BLAST等來測定。此類多核苷酸可用作檢測標(biāo)志物基因的探針，或用作擴(kuò)增標(biāo)志物基因的引物。當(dāng) 用作引物時(shí)，多核苷酸通常包含15bp至lOObp，在某些實(shí)施方案中15bp至35bp的核苷酸。 當(dāng)用作探針時(shí)，DNA包含標(biāo)志物基因的整個(gè)核苷酸序列(或其互補(bǔ)鏈)，或具有至少15bp核 苷酸的其部分序列。當(dāng)用作引物時(shí)，3'區(qū)域必須與標(biāo)志物基因互補(bǔ)，而5'區(qū)域可連接至限 制性內(nèi)切酶識別序列或標(biāo)簽(tag)。“多核苷酸”可以是DNA或RNA。此類多核苷酸可以是合成的或天然發(fā)生的。同樣， 通常也標(biāo)記用作雜交探針的DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解此類標(biāo)記方法。在本文中，術(shù)語 “寡核苷酸”意指具有相對低的聚合程度的多核苷酸。寡核苷酸也包括在多核苷酸內(nèi)。可使用例如Northern雜交、斑點(diǎn)印跡雜交或DNA微陣列技術(shù)進(jìn)行利用雜交技術(shù)的 肺癌相關(guān)疾病的檢測。此外，可使用基因擴(kuò)增技術(shù)例如RT-PCR法。通過在RT-PCR的基因 擴(kuò)增步驟中使用PCR擴(kuò)增監(jiān)控法，可更加定量地分析標(biāo)志物基因的表達(dá)。在PCR基因擴(kuò)增監(jiān)控法中，將檢測靶(DNA或RNA的反轉(zhuǎn)錄物)與用熒光染料和吸 收熒光的猝滅劑標(biāo)記的探針雜交。當(dāng)PCR進(jìn)行并且Taq聚合酶以其5' -3'外切核酸酶活 性降解探針時(shí)，熒光染料與猝滅劑彼此分離，從而檢測到熒光。實(shí)時(shí)檢測熒光。通過同時(shí)測 量其中靶的拷貝數(shù)是已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品，可利用循環(huán)數(shù)(其中PCR擴(kuò)增是線性的)測定受試 者樣品中靶的拷貝數(shù)。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)PCR擴(kuò)增監(jiān)控法可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒?來進(jìn)行。還可通過檢測標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)來進(jìn)行檢測肺癌相關(guān)疾病的方法。在下文 中，標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)被描述為“標(biāo)志物蛋白”。對于此類檢測方法，可通過使用結(jié)合 各標(biāo)志物蛋白的抗體來應(yīng)用例如，Western印跡法、免疫沉淀法和ELISA法。用于檢測的結(jié)合標(biāo)志物蛋白的抗體可通過任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來產(chǎn)生。同樣，為了檢 測標(biāo)志物蛋白，可適當(dāng)?shù)貥?biāo)記這樣的抗體。備選地，可不標(biāo)記抗體，而是標(biāo)記特異性結(jié)合抗 體的物質(zhì)例如蛋白A或蛋白G以間接檢測標(biāo)志物蛋白。更特別地，此類檢測方法可包括ELISA 法。 可以例如通過將標(biāo)志物基因或其部分插入表達(dá)載體，將構(gòu)建體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì) 胞來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化株以表達(dá)重組蛋白，然后從培養(yǎng)物或培養(yǎng)上清液純化表達(dá) 的重組蛋白來獲得用作抗原的蛋白質(zhì)或其部分肽。備選地，可化學(xué)合成由基因編碼的氨基 酸序列或含有由全長cDNA編碼的氨基酸序列的一部分的寡肽，以用作免疫原。此外，可通過使用指數(shù)(不僅生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平而且標(biāo)志物蛋白 的活性)來進(jìn)行肺癌相關(guān)疾病的檢測。標(biāo)志物蛋白的活性意指蛋白本身固有的生物活性。 可使用各種方法測量每一種蛋白的活性。即使在常規(guī)檢測中患者未被診斷為患有肺癌相關(guān)疾病(盡管癥狀暗示此類疾 病)，這樣的患者是否患有肺癌相關(guān)疾病也可通過按照本文中所述的方法進(jìn)行檢測來容易 地確定。更特別地，在某些實(shí)施方案中，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，其癥狀至 少暗示對肺癌相關(guān)疾病的易感性的患者中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加或減少表明癥狀 主要由肺癌相關(guān)疾病引起。此外，檢測可用于確定肺癌相關(guān)疾病是否在患者中得到改善。換句話說，本文中描 述的方法可用于判斷肺癌相關(guān)疾病治療的治療效果。此外，當(dāng)標(biāo)志物基因是本文描述的基 因之一時(shí)，已被診斷為患有肺癌相關(guān)疾病的患者中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加或減少意 味著疾病已向前發(fā)展。還可基于表達(dá)水平的差異測定肺癌相關(guān)疾病的嚴(yán)重性和/或易感性。例如，當(dāng)標(biāo) 志物基因是本文描述的基因之一時(shí)，標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的增加程度與肺癌相關(guān)疾病的 存在和/或嚴(yán)重性相關(guān)。此外，標(biāo)志物基因本身的表達(dá)可通過向基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)導(dǎo)入突變來控制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員理解此類氨基酸置換。同樣，被突變的氨基酸的數(shù)目不受特別限制，只要活性得 到保持即可。通常，其在50個(gè)氨基酸以內(nèi)，在某些非限定性實(shí)施方案中，在30個(gè)氨基酸以 內(nèi)，在10個(gè)氨基酸以內(nèi)，或在3個(gè)氨基酸以內(nèi)。突變的位點(diǎn)可以是任何位點(diǎn)，只要活性得到 保持即可。在另一個(gè)方面，本文中提供了治療肺癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的篩選方 法。一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物基因選自本文中描述的基因?？赏ㄟ^選擇能夠增加或減少標(biāo)志物基 因的表達(dá)水平的化合物來獲得肺癌相關(guān)疾病的治療劑。應(yīng)理解，表述“增加基因的表達(dá)水平的化合物”是指促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄、基因翻譯或蛋 白質(zhì)活性的表達(dá)的步驟中的任一步驟的化合物。另一方面，表述“減少基因的表達(dá)水平的化 合物”，如本文中所用的，是指抑制這些步驟中的任一步驟的化合物。在特定的方面，可在體內(nèi)或體外進(jìn)行篩選肺癌相關(guān)疾病的治療劑的方法。該篩選 方法可以例如通過下列步驟來進(jìn)行(1)對動(dòng)物受試者施用候選化合物；(2)測量動(dòng)物受試 者的生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平；或(3)選擇與對照(其未與候選化合物接觸)中 標(biāo)志物基因的表達(dá)水平相比較增加或減少標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的化合物。在另一個(gè)方面，本文中提供了這樣的方法，其通過將動(dòng)物受試者與候選化合物接 觸，然后監(jiān)控化合物對來源于動(dòng)物受試者的生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的作用來評 估藥劑的候選化合物對標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的功效。來源于動(dòng)物受試者的生物樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)水平的變化可使用與上述檢測方法中所用的相同的技術(shù)來監(jiān)控。此外，基 于評估，可通過篩選來選擇藥劑的候選化合物。試劑盒在另一個(gè)方面，提供了各種診斷和檢測試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒可用于 估量患者是否患有肺癌相關(guān)疾病。試劑盒包含用于估量標(biāo)志物的表達(dá)的試劑。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，試劑盒可用于估量化學(xué)或生物試劑用于抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的適合性。此 類試劑盒包含用于估量標(biāo)志物的表達(dá)的試劑，并且可包含一種或多種此類試劑。在另外的實(shí)施方案中，試劑盒可用于估量肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞的存在或治療肺癌相 關(guān)疾病。此類試劑盒包含特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或所述蛋白的片段的抗體、抗體衍生物或 抗體片段。此類試劑盒還可包含多種抗體、抗體衍生物或抗體片段，其中多種此類抗體試劑 特異性結(jié)合標(biāo)志物蛋白或所述蛋白的片段。在另外的實(shí)施方案中，試劑盒可用于估量肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞的存在，其中試劑盒 包含特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或所述核酸的片段的核酸探針。試劑盒還可包含多種探針，其 中每一種探針特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或所述核酸的片段。本文中所述的組合物、試劑盒和方法尤其可具有下列用途1)估量患者是否患有 肺癌相關(guān)疾病；2)估量人患者中肺癌相關(guān)疾病的分期；3)估量患者中肺癌相關(guān)疾病的分 級；4)估量患者中肺癌相關(guān)疾病的性質(zhì)；5)估量患者中發(fā)生肺癌相關(guān)疾病的可能性；6)估 量患者中與肺癌相關(guān)疾病相關(guān)的細(xì)胞的組織學(xué)類型；7)制備用于治療肺癌相關(guān)疾病和/或 評估患者是否患有肺癌相關(guān)疾病的抗體、抗體片段或抗體衍生物；8)估量肺癌相關(guān)疾病細(xì) 胞的存在；9)估量一種或多種測試化合物抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的功效；10)估量療法 抑制患者的肺癌相關(guān)疾病的功效；11)監(jiān)控患者的肺癌相關(guān)疾病的進(jìn)展；12)選擇抑制患者 的肺癌相關(guān)疾病的組合物或療法；13)治療患有肺癌相關(guān)疾病的患者；14)抑制患者的肺癌 相關(guān)疾?。?5)評估測試化合物的有害潛能；和16)在處于發(fā)生肺癌相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的患 者中預(yù)防肺癌相關(guān)疾病的發(fā)生。試劑盒可用于評估肺癌相關(guān)疾病細(xì)胞(例如在樣品例如患者樣品中)的存在。試 劑盒包含多種試劑，每一種所述試劑能夠特異性結(jié)合標(biāo)志物核酸或蛋白。適合于結(jié)合標(biāo)志 物蛋白的試劑包括抗體、抗體衍生物、抗體片段等。適合于結(jié)合標(biāo)志物核酸(例如基因組 DNA、MRNA、剪接的MRNA、cDNA等)的試劑包括互補(bǔ)核酸。例如，核酸試劑可包括固定至基質(zhì) 的寡核苷酸(標(biāo)記或未標(biāo)記的)、未與基質(zhì)結(jié)合的標(biāo)記的寡核苷酸、PCR引物對、分子信標(biāo)探 針等。試劑盒可任選地包含用于進(jìn)行本文中所述的方法的另外的成分。例如，試劑盒可 包含適合于使互補(bǔ)核酸退火或適合于使抗體與其特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合的液體(例如 SSC緩沖液)、一個(gè)或多個(gè)樣品隔室、描述方法的進(jìn)行的說明書、正常肺細(xì)胞樣品、肺癌相關(guān) 疾病細(xì)胞樣品等。動(dòng)物模型在廣泛的方面，提供了用于產(chǎn)生用于評估至少一種肺癌相關(guān)疾病的非人動(dòng)物模型 的方法。該方法包括將動(dòng)物暴露于重復(fù)劑量的至少一種據(jù)認(rèn)為引起肺癌的化學(xué)藥品。在某 些方面，該方法還包括收集一種或多種選擇的動(dòng)物樣品；和將收集的樣品與一種或多種潛 在的肺癌起始或發(fā)生的指示物(indicia)相比較。
在廣泛的方面，提供了產(chǎn)生動(dòng)物模型的方法，該方法包括在無特定化學(xué)藥品的 環(huán)境中維持動(dòng)物并且用至少一種據(jù)認(rèn)為引起肺癌的化學(xué)藥品敏化動(dòng)物。在某些實(shí)施方案 中，通過多次連續(xù)暴露敏化動(dòng)物的肺的至少一部分。在另一個(gè)廣泛的方面，提供了篩選有 效地抗至少一種肺癌相關(guān)疾病的試劑的方法。該方法通常包括對受試動(dòng)物施用至少一種 試劑，確定試劑是否減輕或加重肺癌相關(guān)疾病的一個(gè)或多個(gè)癥狀；使一個(gè)或多個(gè)癥狀的減 輕與試劑抗肺癌相關(guān)疾病的有效性相互關(guān)聯(lián)；或使一個(gè)或多個(gè)癥狀的減輕的不存在與試劑 的無效性相互關(guān)聯(lián)。動(dòng)物模型用于評估一個(gè)或多個(gè)代謝途徑，所述代謝途徑促成了至少一 種肺癌相關(guān)疾病的起始、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病狀、攻擊性、分級、活性、失能(disability)、死亡 率、發(fā)病率、疾病亞分類或其他潛在的致病或病理特征中的至少一種?？衫脤哟尉垲?(hierarchicalclustering)、特征網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建(signature network construction)、質(zhì)譜蛋 白組學(xué)分析、表面等離子共振術(shù)、線性統(tǒng)計(jì)建模、偏最小二乘法判別分析(partial leasts quares discriminant analysis)和多次線性回歸分析中的一種或多種來進(jìn)行分析。
在特定的方面，通過檢查一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物或其功能等同物的表達(dá)水平來就至少 一種肺癌相關(guān)疾病評估動(dòng)物模型。由本文中描述的方法產(chǎn)生的動(dòng)物模型將使得能夠篩選可用于治療或預(yù)防肺癌相 關(guān)疾病的治療劑。因此，方法可用于鑒定用于治療或預(yù)防肺癌相關(guān)疾病的治療劑。方法包 括對由本文中所述方法產(chǎn)生的動(dòng)物模型施用候選試劑，評估與未施用候選試劑的對照動(dòng)物 模型相比動(dòng)物模型中至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答。如果至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答在癥狀 上減輕或在發(fā)生上延遲，則候選試劑是用于治療或預(yù)防肺癌相關(guān)疾病的試劑。在另一個(gè)方面，本文中提供了肺癌相關(guān)疾病的動(dòng)物模型，其中一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志物 基因或功能上與標(biāo)志物基因等同的基因的表達(dá)水平在所述動(dòng)物模型中已被提高。如本文中 所用的，“功能上等同的基因”通常是編碼具有與由標(biāo)志物基因編碼的蛋白質(zhì)的已知活性相 似的活性的蛋白質(zhì)的基因。功能上等同的基因的代表性實(shí)例包括受試動(dòng)物的標(biāo)志物基因?qū)?應(yīng)物，其是動(dòng)物本身固有的。肺癌相關(guān)疾病動(dòng)物模型可用于檢測由于肺癌相關(guān)疾病而引起的生理學(xué)變化。在某 些實(shí)施方案中，動(dòng)物模型可用于揭示標(biāo)志物基因的另外的功能和評估其靶為標(biāo)志物基因的 藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，肺癌相關(guān)疾病動(dòng)物模型可通過控制對應(yīng)物基因的表達(dá)水平或 施用對應(yīng)物基因來產(chǎn)生。方法可包括通過控制選自本文中所述的基因的基因的表達(dá)水平來 產(chǎn)生肺癌相關(guān)疾病動(dòng)物模型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，方法可包括通過施用由本文中所描述 的基因編碼的蛋白質(zhì)或施用抗所述蛋白的抗體來產(chǎn)生肺癌相關(guān)疾病動(dòng)物模型。還應(yīng)理解， 在某些其他實(shí)施方案中，可過表達(dá)標(biāo)志物，以便可使用適當(dāng)?shù)姆椒y量標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肺癌相關(guān)疾病動(dòng)物模型可通過導(dǎo)入選自此類基因的基因， 或通過施用由這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，肺癌相關(guān)疾病可通過抑制選自此類基因的基因的表達(dá)或由 這樣的基因編碼的蛋白質(zhì)的活性來誘導(dǎo)。反義核酸、核酶或RNAi可用于抑制表達(dá)。蛋白質(zhì) 的活性可通過施用抑制所述活性的物質(zhì)例如抗體來有效地控制。動(dòng)物模型可用于闡明肺癌相關(guān)疾病背后的機(jī)制，還可用于檢測通過篩選獲得的化 合物的安全性。例如，當(dāng)動(dòng)物模型產(chǎn)生肺癌相關(guān)疾病的癥狀時(shí)，或當(dāng)牽涉某種肺癌相關(guān)疾病的測量值在動(dòng)物中改變時(shí)，可構(gòu)建篩選系統(tǒng)以探測具有減輕疾病的活性的化合物。如本文中所使用的，表述“表達(dá)水平的增加”是指下列情況的任一種在人工表達(dá)作為外源基因?qū)氲臉?biāo)志物基因的情況下；在受試動(dòng)物本身固有的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄和其 至蛋白質(zhì)的翻譯得到增強(qiáng)的情況下；或在作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被抑制的情況下。 如本文中所用的，表述“表達(dá)水平的減少”是指其中受試動(dòng)物的標(biāo)志物基因的轉(zhuǎn)錄和其至蛋 白質(zhì)的翻譯被抑制的狀態(tài)，或其中作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的水解被增強(qiáng)的狀態(tài)。基因的表 達(dá)水平可以例如通過DNA芯片上信號強(qiáng)度的差異來測定。此外，翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的活 性可通過與正常狀態(tài)中的活性相比較來測定。也在預(yù)期的范圍內(nèi)的是動(dòng)物模型可包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括例如其中已人工導(dǎo)入 并且表達(dá)標(biāo)志物基因的動(dòng)物；標(biāo)志物基因敲除動(dòng)物；和其中已用另一個(gè)基因置換標(biāo)志物基 因的基因敲入動(dòng)物。已向其中導(dǎo)入了標(biāo)志物基因的反義核酸、核酶、具有RNAi作用的多核 苷酸或用作誘餌核酸的DNA等的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還包括例 如這樣的動(dòng)物，在所述動(dòng)物中標(biāo)志物蛋白的活性已通過將突變導(dǎo)入基因的編碼區(qū)而被增強(qiáng) 或被抑制，或氨基酸序列已被修飾而變得抗水解或?qū)λ饷舾?。氨基酸序列中的突變包?置換、缺失、插入和添加。本文中所引用的所有專利、專利申請和參考文獻(xiàn)以其全文通過引用合并入本文。 雖然對于制備和使用其的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已十分詳盡地描述和例示了本發(fā)明，但各種 改變、修飾和改進(jìn)是顯然的，且不背離本發(fā)明的精神和范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，本 發(fā)明可進(jìn)行適當(dāng)?shù)馗淖円赃m合實(shí)現(xiàn)目的和獲得提及的目標(biāo)和有利方面以及其中固有的那些。本文中所描述的方法和試劑代表優(yōu)選實(shí)施方案，是示例性的，并且不意欲限制本 發(fā)明的范圍。其中的改進(jìn)和其他用途對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯然的。這些改進(jìn)包括在本 發(fā)明的精神內(nèi)并且由權(quán)利要求的范圍界定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，同樣極顯然的是可 對本文中公開的發(fā)明進(jìn)行各種替代和改進(jìn)而不背離本發(fā)明的范圍和精神。應(yīng)理解，雖然本發(fā)明已通過優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征明確地公開，但本領(lǐng)域技術(shù) 人員可采用本文中公開的概念的改進(jìn)和變化，并且此類改進(jìn)和變化被認(rèn)為在由所附權(quán)利要 求界定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。雖然通過參考各種和優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 可進(jìn)行各種變化并且可用等同物替代其元素而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進(jìn)行許 多改進(jìn)以使特定的情況或材料適合于本發(fā)明的教導(dǎo)而不背離本發(fā)明的基本范圍。因此，本發(fā)明不意欲限定于本文中公開的預(yù)期用于進(jìn)行本發(fā)明的特定實(shí)施方案， 而是意欲包括落在權(quán)利要求的范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案。本文中用于舉例說明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施的另外的詳細(xì)內(nèi)容的公開 案和其他材料通過引用合并入本文，并且為方便起見提供于下列參考書目中。本文中引用的任何文獻(xiàn)的引用不意欲作為任何前述內(nèi)容是相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。 關(guān)于日期的所有聲明和關(guān)于這些文獻(xiàn)的內(nèi)容的所有陳述基于申請人可獲得的信息，并且不 構(gòu)成關(guān)于這些文獻(xiàn)的日期或內(nèi)容的正確性的任何承認(rèn)。參考文獻(xiàn)1.Bartel, D. 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權(quán)利要求
用于在有此需要的受試者中恢復(fù)期望的DNA甲基化模式的方法，其包括施用有效量的一種或多種足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的miR-29。
2.用于在有此需要的受試者中誘導(dǎo)甲基化沉默的腫瘤抑制基因(TSG)的再表達(dá)的方 法，其包括施用有效量的一種或多種足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一種或多種的miR-29。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述TSG包括ΠΠΤ和WffOX中的一種或多種。
4.用于在有此需要的受試者中體外和體內(nèi)抑制致瘤性的方法，其包括施用有效量的一 種或多種足以靶向WMT3A和DNMT3B中的一種或多種的miR-29。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是肺癌患者。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述抑制方法包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的表觀遺傳調(diào)控。
7.內(nèi)源miR-29b用作起始DNMT3BmRNA的逆轉(zhuǎn)錄的引物的用途。
8.用于減少總DNA甲基化的方法，其包括施用有效量的一種或多種靶向DNMT3A和 DNMT3B的miR-29，其中所述miR-29的表達(dá)促成癌細(xì)胞中的DNA表觀遺傳修飾。
9.用于通過將至少一種核苷類似物與一種或多種足以阻斷從頭和維持DNMT途徑的 miR-29組合來獲得DNA低甲基化的方法。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述核苷類似物包括地西他濱。
11.用于增加腫瘤抑制基因(TSG)的表達(dá)的方法，其包括用一種或多種mi-R29轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述TSG包括ΠΠΤ和WffOX蛋白中的一種或多種。
13.相對于混雜對照，在細(xì)胞中體外抑制細(xì)胞生長和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其包括 用一種或多種miR-29轉(zhuǎn)染一種或多種細(xì)胞。
14.用于下調(diào)ΠΠΤ和/或WffOX酶的表達(dá)水平的方法，其包括通過用一個(gè)或多個(gè)miR-29 家族成員轉(zhuǎn)染細(xì)胞來調(diào)控DNMT3A和/或DNMT3B。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。
16.用于減少總DNA甲基化的方法，其包括在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)mi-R29的表達(dá)。
17.用于恢復(fù)TSG的表達(dá)的方法，其包括在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)mi-R29的表達(dá)。
18.用于體外和體內(nèi)抑制致瘤性的方法，其包括在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)mi-R29的表達(dá)。
19.用于開發(fā)表觀遺傳療法的方法，其單獨(dú)地或與其他治療組合使用合成的miR-29以 在癌細(xì)胞中再激活腫瘤抑制基因并且使異常的甲基化模式恢復(fù)正常。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。
21.診斷受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病、是否處在發(fā)生所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，或?qū)τ谒?疾病是否具有減少的存活預(yù)后的方法，該方法包括測量來自受試者的測試樣品中至少一種 miR基因產(chǎn)物的水平，其中相對于對照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平，測試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的 水平的改變表示受試者患有肺癌相關(guān)疾病或處于發(fā)生所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，其中至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合。
22.檢測至少肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的起始、對其的易感性、或?qū)τ谄涞臏p少的存活預(yù)后的 方法，該方法包括(1)測定來自測試受試者的樣品中至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平；所述至少一種標(biāo)志物 包括至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物；(2)將步驟(1)中測定的表達(dá)水平與來自健康受試者的樣品中標(biāo)志物的對照表達(dá)水平 相比較；和(3)當(dāng)步驟(2)中的比較的結(jié)果顯示i)測試受試者中所述至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平高于對照中的表達(dá)水平，或 )測試受試者中所述至少一種標(biāo)志物的表達(dá)水平低于對照中的表達(dá)水平時(shí)，判斷受試者患有肺癌相關(guān)疾病。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述樣品包括組織、血液、血漿、血清、尿和糞便中的一種 或多種。
24.權(quán)利要求22的方法，其中體外進(jìn)行所有方法步驟。
25.診斷受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病、是否處在發(fā)生所述疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，或?qū)τ谒?疾病是否具有減少的存活預(yù)后的方法，其包括(1)從獲自受試者的測試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA以提供一組靶寡脫氧核苷酸；(2)將所述靶寡脫氧核苷酸與含有miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供 測試樣品的雜交特征譜；和(3)將測試樣品雜交特征譜與從對照樣品產(chǎn)生的雜交特征譜相比較；其中至少一種miRNA的信號的改變表示所述受試者患有肺癌相關(guān)疾病、處在發(fā)生所述 疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，或?qū)τ谒黾膊【哂袦p少的存活預(yù)后；其中至少一種miRNA的信號，相對于從對照樣品產(chǎn)生的信號，被上調(diào)或下調(diào)，并且，其中所述微陣列包含針對一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的 miRNA的miRNA特異性探針寡核苷酸。
26.在受試者中抑制腫瘤發(fā)生的方法，所述受試者患有或懷疑患有肺癌相關(guān)疾病，其中 至少一種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物相對于對照細(xì)胞在所述 受試者的癌細(xì)胞中被下調(diào)或上調(diào)，所述方法包括(1)當(dāng)所述至少一種miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被下調(diào)時(shí)，對所述受試者施用有效量的 至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和其組合的分離的miR基因產(chǎn)物，從而在所述受試 者中抑制腫瘤發(fā)生；或(2)當(dāng)所述至少一種miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中被上調(diào)時(shí)，對所述受試者施用有效量的 至少一種用于抑制至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物的表 達(dá)的化合物，從而在所述受試者中抑制腫瘤發(fā)生。
27.權(quán)利要求26的方法，其中步驟(1)和/或步驟(2)中所述至少一種分離的miR基 因產(chǎn)物是miR29a、miR_29b、miR-29c或其分離的變體或生物活性片段或功能等同物，或與 其結(jié)合的抗體。
28.在患有肺癌的受試者中抑制腫瘤發(fā)生的方法，其包括(1)測定相對于對照細(xì)胞，受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量；和(2)通過下列方法改變癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量(i)如果癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量低于對照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量， 則對所述受試者施用有效量的至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和其組合的分離的 miR基因產(chǎn)物；或( )如果癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量高于對照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，則對所述受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的 化合物，從而在所述受試者中抑制腫瘤發(fā)生。
29.權(quán)利要求28的方法，其中步驟(i)中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物是miR29a、 miR-29b、miR-29c或其分離的變體或生物活性片段。
30.權(quán)利要求29的方法，其中步驟(ii)中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自iR29a、 miR-29b、miR-29c和其組合，或其分離的變體或生物活性片段。
31.鑒定腫瘤發(fā)生的抑制劑的方法，其包括 給細(xì)胞提供測試試劑，和測量至少一種與肺癌相關(guān)疾病中改變的表達(dá)水平相關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平， 其中相對于適當(dāng)?shù)膶φ占?xì)胞，細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加或減少表示所述 測試試劑是腫瘤發(fā)生的抑制劑；其中所述miR基因產(chǎn)物選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合。
32.鑒定腫瘤發(fā)生的抑制劑的方法，其包括 給細(xì)胞提供測試試劑，和測量至少一種與肺癌相關(guān)疾病中改變的表達(dá)水平相關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平， 其中相對于適當(dāng)?shù)膶φ占?xì)胞，細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的減少表示所述測試試 劑是腫瘤發(fā)生的抑制劑；其中所述miR基因產(chǎn)物選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述癌癥是肺癌。
34.用于評估一個(gè)或多個(gè)代謝途徑的標(biāo)志物，所述代謝途徑促成至少一種肺癌相關(guān)疾 病的起始、進(jìn)展、嚴(yán)重性、病狀、攻擊性、分級、活性、失能、死亡率、發(fā)病率、疾病亞分類或其 他潛在的致病或病理特征中的至少一個(gè)，其中所述標(biāo)志物包括一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物。
35.包含一種或多種前述權(quán)利要求的標(biāo)志物的組合物。
36.鑒定受試者中至少一種肺癌相關(guān)疾病的起始或發(fā)生的可能性的方法，所述方法測 量一種或多種前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物。
37.權(quán)利要求36的方法，其中一種或多種標(biāo)志物存在于分離的樣品中并且在體外進(jìn)行 所有方法步驟。
38.用于檢測肺癌相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含含有至少一種前述權(quán)利要求的 任一項(xiàng)的標(biāo)志物的核苷酸序列或與所述標(biāo)志物的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的多核苷酸。
39.用于檢測肺癌相關(guān)疾病的試劑，其中所述試劑包含識別由至少一種前述權(quán)利要求 的任一項(xiàng)的標(biāo)志物編碼的蛋白質(zhì)的抗體。
40.用于檢測肺癌相關(guān)疾病的DNA芯片，在所述芯片上已固定探針以測定至少一種前 述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物。
41.評估療法預(yù)防、診斷和/或治療至少一種肺癌相關(guān)疾病的有效性的方法，其包括 (1)將動(dòng)物經(jīng)歷其有效性有待評估的療法，和(2)通過評估至少一種前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物來測定被測試的療法在治療或 預(yù)防肺癌相關(guān)疾病中的有效性水平。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述候選治療劑包含藥物組合物、營養(yǎng)食品組合物和順 勢療法組合物中的一種或多種。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述待評估的療法用于人受試者。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法不是通過手術(shù)或療法治療人或動(dòng)物體的方法。
45.在動(dòng)物模型中就起始肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力估量至少一種材料的潛能的方法， 所述方法提供(1)在將所述動(dòng)物暴露于一種或多種在量上足以在所述動(dòng)物中起始肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答 的材料后，測量一種或多種被上調(diào)或下調(diào)的前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物；和(2)確定至少一種被上調(diào)或下調(diào)的標(biāo)志物是否具有起始肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的能力。
46.用于治療肺癌相關(guān)疾病的藥物組合物，其包含至少一種選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合的miR基因產(chǎn)物；和 藥學(xué)上可接受的載體。
47.權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物相應(yīng)于與適當(dāng)?shù)膶φ?細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞中被上調(diào)或下調(diào)的miR基因產(chǎn)物。
48.權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所述肺癌相關(guān)疾病是腺癌。
49.用于治療肺癌的藥物組合物，其包含 至少一種miR表達(dá)抑制化合物，和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述至少一種miR表達(dá)抑制化合物對于選自miR29a、miR_29b、miR_29c和其組合 的miR基因產(chǎn)物是特異性的。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述至少一種miR表達(dá)抑制化合物對于與適當(dāng)?shù)?對照細(xì)胞相比，在癌細(xì)胞中被上調(diào)或下調(diào)的miR基因產(chǎn)物是特異性的。
51.一種制品，其包含至少一種結(jié)合肺癌相關(guān)疾病的標(biāo)志物的捕獲試劑，所述標(biāo)志物 選自至少一種前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物。
52.用于篩選治療肺癌相關(guān)疾病的治療劑的候選化合物的試劑盒，其中所述試劑盒包含至少一種前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物的一種或多種試劑，和 表達(dá)至少一種標(biāo)志物的細(xì)胞。
53.權(quán)利要求52的試劑盒，其中使用含有特異性結(jié)合至少一種標(biāo)志物的抗體或抗體片 段的試劑檢測所述標(biāo)志物的存在。
54.權(quán)利要求53的試劑盒，其中所述試劑是標(biāo)記的、放射性標(biāo)記的或生物素標(biāo)記的，和 /或其中所述抗體或抗體片段是放射性標(biāo)記的、發(fā)色團(tuán)標(biāo)記的、熒光團(tuán)標(biāo)記的或酶標(biāo)記的。
55.權(quán)利要求54的試劑盒，其還包括裝有至少一種所述標(biāo)志物的容器。
56.權(quán)利要求55的試劑盒，其中所述試劑包含抗體、所述試劑連接或可連接至其的探 針和固定化的金屬螯合物中的一種或多種。
57.肺癌相關(guān)疾病的篩選試驗(yàn)，其包括將一種或多種前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物與此類標(biāo)志物的底物以及與測試試劑接觸，和確定所述測試試劑是否調(diào)節(jié)所述標(biāo)志物的活性。
58.權(quán)利要求57的篩選試驗(yàn)，其中在體外進(jìn)行所有方法步驟。
59.用于預(yù)測受試者中肺癌相關(guān)疾病的存在的微陣列，其包含抗至少一種前述權(quán)利要 求的任一項(xiàng)的標(biāo)志物的抗體。
60.權(quán)利要求59的微陣列，其中通過檢測轉(zhuǎn)錄的多核苷酸或其部分的存在來估量所述 標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中所述轉(zhuǎn)錄的多核苷酸包含所述標(biāo)志物的編碼區(qū)。
61.權(quán)利要求60的微陣列，其中所述樣品是肺癌相關(guān)體液或組織。
62.權(quán)利要求61的微陣列，其中所述樣品包含獲自所述患者的細(xì)胞。
63.用于在有此需要的個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制肺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的 方法，包括對所述個(gè)體施用干擾至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑，以足以干擾 此類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的量，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物。
64.干擾至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的試劑用于制造藥物的用途，所 述藥物用于在個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制肺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物。
65.用于在有此需要的個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制肺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性的 方法，包括對所述個(gè)體施用干擾至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的級聯(lián)的試劑，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物。
66.干擾至少一種肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的級聯(lián)的試劑用于制造藥物的用途，所述藥物用 于在個(gè)體中治療、預(yù)防、逆轉(zhuǎn)或限制肺癌相關(guān)疾病并發(fā)癥的嚴(yán)重性，其中所述試劑包含至少一種選自miR29a、miR-29b、miR-29c和其組合的miR基因產(chǎn)物。
67.包含具有多個(gè)數(shù)字編碼的參照特征譜的數(shù)據(jù)庫的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其中至少第一 參照特征譜代表了來自一個(gè)或多個(gè)展示肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的指標(biāo)的受試者的一個(gè)或多個(gè) 樣品中至少第一標(biāo)志物的水平，其中所述標(biāo)志物包括一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因 產(chǎn)物。
68.權(quán)利要求67的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包含至少第二參照特征譜，所述第二參照特征 譜代表了來自一個(gè)或多個(gè)展示肺癌相關(guān)疾病應(yīng)答的指標(biāo)的受試者或患有肺癌相關(guān)疾病的 受試者的一個(gè)或多個(gè)樣品中至少第二標(biāo)志物的水平。
69.用于確定受試者是否患有肺癌相關(guān)疾病、是否易于患有所述疾病或是否具有對于 所述疾病的不良存活預(yù)后的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包括前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)的數(shù)據(jù)庫，和包含計(jì)算機(jī)可執(zhí)行編碼的服務(wù)器，所述編碼使計(jì)算機(jī)接收受試者的特征譜，從數(shù)據(jù)庫 鑒定在診斷上與受試者特征譜相關(guān)的匹配的參照特征譜，并且產(chǎn)生受試者是否患有或易于 患有肺癌相關(guān)疾病的指示。
70.用于評估受試者中肺癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度的計(jì)算機(jī)輔助方法，包括(1)提供包含用于對來自從所述受試者獲得的樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類的模型或算法的計(jì) 算機(jī)，其中所述分類包括分析關(guān)于至少一種標(biāo)志物的存在、不存在或量的數(shù)據(jù)，和 其中所述標(biāo)志物包括一種或多種選自miR29a、miR_29b、miR-29c和其組合的miR基因 產(chǎn)物；(2)輸入來自從所述受試者獲得的生物樣品的數(shù)據(jù)；和(3)對所述生物樣品進(jìn)行分類以表明肺癌相關(guān)疾病的存在、不存在、性質(zhì)或程度。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物和其組合包括其分離的變體 或生物活性片段或功能等同物，或與其結(jié)合的抗體。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述肺癌相關(guān)疾病是腺癌。
73.肺癌的動(dòng)物模型，其中存在一種或多種選自miR29a、miR-29b、miR-29C和其組合的 miR基因產(chǎn)物的至少一種改變的表達(dá)。
74.權(quán)利要求73的動(dòng)物模型，其中所述動(dòng)物模型是非人脊椎動(dòng)物。
75.權(quán)利要求74的動(dòng)物模型，其中所述動(dòng)物模型是小鼠、大鼠、兔或靈長類動(dòng)物。
全文摘要
公開了通過施用有效量的一個(gè)或多個(gè)足以靶向DNMT3A和DNMT3B中的一個(gè)或多個(gè)的miR-29來恢復(fù)期望的DNA甲基化模式，誘導(dǎo)甲基化沉默的腫瘤抑制基因(TSG)的再表達(dá)，和/或在有此需要的受試者中體外和體內(nèi)抑制致瘤性的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101809169SQ200880108625
公開日2010年8月18日 申請日期2008年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日
發(fā)明者C·M·克羅斯, M·法布里 申請人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會