專利名稱：體轉(zhuǎn)基因生物成像的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過一種名為"體轉(zhuǎn)基因生物成l象(somatotransgenic bioimaging)"的新技術(shù)在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中建立病變模型、篩選調(diào)控這些病 變的化合物以及評(píng)估藥物代謝和毒性。
背景技術(shù)：
潛在治療劑(Potential therapeutics )的鑒定通常始于使用高通量體外 技術(shù)。然后需要在體內(nèi)例如在嚙齒動(dòng)物模型中驗(yàn)證成功的候選化合物，隨 后進(jìn)行全面的靈長類試驗(yàn)或者臨床試驗(yàn)。
傳統(tǒng)藥物試驗(yàn)倚賴對(duì)外周的、分泌的或排泄的體液或者活檢組織進(jìn)行 測量，并經(jīng)常倚賴終點(diǎn)分析(endpoint analyses )。對(duì)體液或組織進(jìn)行測量 倚賴合適的實(shí)驗(yàn)變量，即它們只在當(dāng)所述體液或組織中存在針對(duì)所述候選 化合物的給藥而變化的物質(zhì)時(shí)起作用。終點(diǎn)分析倚賴于動(dòng)物的殺死，這擾 亂了實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，并使得必須進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)以提供可靠的統(tǒng)計(jì)分析。轉(zhuǎn) 基因小鼠的出現(xiàn)通過提供遺傳工程疾病模型徹底改變了藥物驗(yàn)證方法。轉(zhuǎn) 基因疾病建模領(lǐng)域最近已經(jīng)發(fā)展形成了轉(zhuǎn)入有組織或表型特異性啟動(dòng)子控 制下的熒光素酶才艮告基因的小鼠(W. Zhang et al. 2001， Transgenic Research 10:423)。高精度生物成像使得研究者可以在動(dòng)物的整個(gè)生命周期 中在體內(nèi)定量追蹤特異性藥物目標(biāo)的遺傳激活(或抑制)。
由于自然特性，通過種系轉(zhuǎn)基因獲得的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在其體內(nèi)的每 個(gè)細(xì)胞中都包含所插入的遺傳物質(zhì)。體內(nèi)不同器官系統(tǒng)的大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)信 號(hào)傳遞過程是相同的，并且明顯地可在不同組織中具有對(duì)照作用。這種整 體活性導(dǎo)致成像過程中有明顯和復(fù)雜的背景千擾，這妨礙了這些用于有效、 連續(xù)生物成像的轉(zhuǎn)基因生物的應(yīng)用。在這些情況下，研究者會(huì)求助于對(duì)個(gè) 體死后的組織進(jìn)行終點(diǎn)分析。本發(fā)明解決了這些問題。
絲/七 #絲辨
藥物代謝是藥物清除的主要決定因素，藥物代謝細(xì)胞色素P450(CYP)的誘導(dǎo)性表達(dá)是最常見的導(dǎo)致藥物代謝動(dòng)力學(xué)變化的因素。這些包含血紅 素的酶在多種化學(xué)性質(zhì)不同的化合物(包括食物化合物、藥劑、致癌物和
環(huán)境污染物)的代謝(主要是氧化)中都起到重要作用。
通常有兩種方法可用于藥物代謝語的體外研究用肝臟微粒體孵育和 用有代謝能力的細(xì)胞孵育。
測定藥物在不同物種的肝臟微粒體中的代謝穩(wěn)定性，以評(píng)估這種化合 物由于I期代謝形成不想要的潛在毒素或在藥學(xué)上沒有活性的代謝物的可 能性，或者由于缺少或可以忽略不計(jì)的代謝降解而在體內(nèi)積聚的可能性。
因此對(duì)代T^I定性的測定是一種描述代謝歸宿的量度。肝臟 ^立體中代謝
穩(wěn)定性的測定總括了所有可能的反應(yīng)。肝臟孩i粒體是包含多種藥物代謝酶 (包括CYP)的亞細(xì)胞組分(主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng))。因此，它們被廣泛地用作 體外模型系統(tǒng)以研究外源物的代謝歸宿。人類肝臟微粒體包含以下參與藥 物代謝的CYP異構(gòu)酶CYP1A2、 2A6、 2B6、 2C8、 2C9、 2C19、 2D6、 2E1和3A4。這些異構(gòu)酶中，CYP3A4在外源物的代謝中起主務(wù)ft用，因 為其是人類肝臟中最豐富的CYP (約28%)，且其參與超過50%的在目
前的藥療中應(yīng)用的藥物的^a謝。
#*立體的主要局限是它們表現(xiàn)出I期的活性，但只表現(xiàn)出部分II期活 性，因而只能在短期孵育中^f吏用。
當(dāng)使用完整細(xì)胞時(shí)，基因表達(dá)、代謝途徑、輔助因子/酶和細(xì)胞質(zhì)膜都 被廣泛地保留，但需要使用完全分化的細(xì)胞如原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞，因?yàn)楦?瘤細(xì)胞系只有非常低和部分的CYP表達(dá)。
對(duì)CYP的抑制對(duì)于候選藥物是不想要的特征，并需要通過檢測所述候 選藥物是否抑制其他化合物的代謝或其他化合物是否抑制所述候選藥物的 代謝來確定。這些實(shí)驗(yàn)既可用微粒體進(jìn)行也可在細(xì)胞中進(jìn)行。微粒體的主 要局限是抑制參數(shù)不能精確地反映體內(nèi)情況，因?yàn)槲纯紤]藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 藥物-藥物相互作用可能的最佳情況可在有代謝能力的肝細(xì)胞中獲得。這需 要使用能夠完全轉(zhuǎn)錄和翻譯CYP基因、并可因?yàn)槊傅膍RNA或活性增加 而在體外監(jiān)測的細(xì)胞系統(tǒng)。原代培養(yǎng)的人類肝細(xì)胞在最初的幾天內(nèi)對(duì)酶誘 導(dǎo)物應(yīng)答良好；然后此能力消失。盡管幾種異構(gòu)酶的誘導(dǎo)已經(jīng)^L才艮道，但 肝瘤細(xì)胞系對(duì)誘導(dǎo)物的應(yīng)答很差。原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞在體外模式下仍然是 獨(dú)特的，并使得可對(duì)藥物的CYP誘導(dǎo)可能性進(jìn)行全面檢測。
潛在治療劑的鑒定通常始于使用高通量體外技術(shù)。然后需要在體內(nèi)例
9如在嚙齒動(dòng)物模型中驗(yàn)證成功的候選化合物，隨后進(jìn)行全面的靈長類試驗(yàn)
或者臨床試驗(yàn)。目前幾乎沒有可靠的用于分析因藥物代謝的CYP激活的體 內(nèi)試驗(yàn)系統(tǒng)。
CXR Biosciences建立的肝臟還原酶Null(HRN)小鼠是當(dāng)前一種用于測 量CYP對(duì)候選藥物代謝的影響的模型。為了發(fā)揮功能，CYP從電子供體 細(xì)胞色素P450還原酶接受電子。在所述HRN小鼠中，該還原酶活性^皮敲 除從而抑制任何CYP的活性。這提供了一個(gè)消除CYP活性的才莫型系統(tǒng)， 其可更清楚地分析替代代謝物或在無CYP代謝的情況下提供藥效分析。所 述應(yīng)用被限制在描述藥物代謝中的特異CYP活性的范圍之內(nèi)。
其他體內(nèi)方法包括生成具有"人源化"肝臟的小鼠。這避免了相關(guān)的人 類和嚙齒類CPY活性之間對(duì)給藥的應(yīng)答不同。Tateno等人(2004) (Tateno C. et al. Am J Pathol; 165: 3 p901)描述了 一種方法，通過這種方法，uPA/SCID 小鼠可經(jīng)歷宿主肝細(xì)胞的部分消融，然后用人類肝細(xì)胞重構(gòu)以建立人源化 小鼠。Katoh等人(2007) (Katoh， M. et al. J Pharm Sci; 96: 2， p428)最近已經(jīng) 實(shí)際使用了這種方法，以檢驗(yàn)在這些人源化小鼠中應(yīng)答高或低水平的人類 白蛋白的CYP2D6特異性代謝物。盡管此工作顯示了概念的精確證據(jù)，但 其倚賴在多態(tài)異構(gòu)酶中非特異的CYP抑制物，并倚賴血清中可定量的代謝 產(chǎn)物的分泌。外周血液取樣和生化分析要耗費(fèi)時(shí)間并受到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范的 限制。
本發(fā)明通過使用當(dāng)前文獻(xiàn)中良好表征的遺傳元件以對(duì)靶藥物在體內(nèi)的 代謝進(jìn)行建模從而解決了這些問題。所述方法是快速和易適應(yīng)的，因?yàn)榫?體CYP450的體轉(zhuǎn)基因生物可在幾周內(nèi)生成。讀取是實(shí)時(shí)的，這使得在動(dòng) 物個(gè)體中的測量可在給藥前、給藥時(shí)和給藥后進(jìn)行。此外，施藥和讀取可 在任何基因敲除模型、表型模型和疾病模型之上進(jìn)行，而不需要進(jìn)行耗時(shí) 的交配。我們的技術(shù)使得載體很容易定位到肝臟上并因此將任何生物成l象 讀取結(jié)果都只限于所選的器官。

發(fā)明內(nèi)容
我們已經(jīng)建立了一項(xiàng)被稱為"體轉(zhuǎn)基因生物成像"的新技術(shù)。在此技術(shù) 中，載體帶有一個(gè)由響應(yīng)病變或治療的遺傳元件驅(qū)動(dòng)的生物發(fā)光才艮告基因， 所述遺傳元件可對(duì)所述病變和/或治療介入的i^進(jìn)行建模。所述載體通過 靶向給藥到特定組織而被送遞到非人動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物中，并使所述動(dòng)
10物長到成年。所述生物發(fā)光報(bào)告基因的表達(dá)可在完整的活體動(dòng)物中被測量。 因此可使用同一動(dòng)物進(jìn)行任何數(shù)量的測量而不需殺死所述動(dòng)物。例如可對(duì) 疾病界定的分子事件進(jìn)行測量。又例如，可在給藥前進(jìn)行測量以獲得穩(wěn)態(tài) 數(shù)據(jù)，然后從給藥到所述藥物被完全代謝期間進(jìn)行測量，直到再次達(dá)到穩(wěn)
態(tài)。 、 ， - 、、
達(dá)。因此它可用于候選藥物化合物的驗(yàn)證。
此技術(shù)還可用于例如確定化合物是否調(diào)節(jié)控制藥物代謝或因給藥所致
毒性反應(yīng)的基因的表達(dá)。所述藥物代謝劑主要類型是細(xì)胞色素P450(CYP) 酶。細(xì)胞色素P450酶是很多化合物氧化代謝的主M化劑。CYP對(duì)藥物 的代謝影響到藥物清除、毒性、活化，并且可能的話，會(huì)影響到與其他藥 物的不良相互作用。被P450酶很快轉(zhuǎn)變并從體內(nèi)快速清除或轉(zhuǎn)化為毒性產(chǎn) 物的化合物是不好的候選藥物。誘導(dǎo)或抑制P450酶表達(dá)的藥物也對(duì)第二種 藥物的效力或毒性具有不利作用。根據(jù)本發(fā)明，可將生物發(fā)光才艮告基因置 于一個(gè)控制代謝酶如細(xì)胞色素P450酶的表達(dá)的遺傳元件的控制下，通過子 宮內(nèi)基因轉(zhuǎn)移將所述構(gòu)建體靶向到動(dòng)物肝臟，并通過4吏用整個(gè)動(dòng)物生物成
響。因此本發(fā)明可用于確定可能的清除速度并因此可能確定候選藥物的效 力、毒性，并且可能確定對(duì)其他共給藥的藥物的效力或毒性可能的影響。
我們之前已經(jīng)說明了經(jīng)卯黃血管將慢病毒基因送遞至嚙齒動(dòng)物胎兒的 有效基因送遞和持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)(S. N. Waddington et al. 2003， Gene Therapy 10:1234)。在此論文中，將高劑量減毒的編碼受控于CMV啟動(dòng)子 的P -半乳糖苷酶的VSV-G假型馬傳染性貧血病毒(EIAV)注射到有免疫能 力的MF1小鼠的胎兒循環(huán)中。有放基因送遞和持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)i兌明了所述 技術(shù)用于基因治療的可能性。子宮內(nèi)基因送遞這一技術(shù)被進(jìn)一步研究以確 定其是否可能專門靶向患迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良的主JI/L^(Gregory et al. 2004， Gene Therapy 11(14):1117-25)。 P-半乳糖苷酶基因向這些主M^的高度有 效轉(zhuǎn)移支持了子宮內(nèi)基因送遞用于肌營養(yǎng)不良的治療和長期預(yù)防或矯正的 可能性。子宮內(nèi)基因送遞使得人類因子IX基因可轉(zhuǎn)移到有免疫能力的血友 病小鼠的胎兒循環(huán)中，從而永久治療性矯正B型血友病(Waddington et al. 2004， Blood 104:2714-2721)。這些研究表明了子宮內(nèi)基因送遞用于耙向基因 送遞和基因治療的可能性。根據(jù)本發(fā)明，體轉(zhuǎn)基因生物成像是一種使組織可被特異性靶向的非侵 入式技術(shù)，其不需要?dú)⑺绖?dòng)物或者只是倚賴于外周的、分泌的或排泄的體 液或采取活檢組織。慢病毒構(gòu)建體用目標(biāo)遺傳元件控制下的生物發(fā)光報(bào)告 基因生成。所述基因構(gòu)建體可被特異地靶向到動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物的目標(biāo) 位點(diǎn)或組織。特異性靶向通過例如注射專門將所述載體送遞到動(dòng)物胎兒或 新生動(dòng)物的目標(biāo)位點(diǎn)或組織而實(shí)現(xiàn)。另一層面的特異性還可通過4吏用帶有 可增加基因轉(zhuǎn)移組織特異性的包膜進(jìn)行假型化的慢病毒而提供。生物發(fā)光 報(bào)告基因特異性靶向到目標(biāo)位點(diǎn)或組織減少了成像中明顯的和復(fù)雜的背景 干擾，而這在使用標(biāo)準(zhǔn)種系轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)由于報(bào)告基因在所有細(xì)胞中 表達(dá)而會(huì)出現(xiàn)。這是因?yàn)樗鲛D(zhuǎn)基因只在其通過載體被送遞到的組織中表 達(dá)，因此所觀察到的生物發(fā)光只來自于那些組織而不是所有組織。換言之， 由于所述載體被送遞到特定組織，因此可更精確和可靠地研究對(duì)那些特定 組織的病變或治療作用。體轉(zhuǎn)基因方法還會(huì)在給予藥物或代謝物的整個(gè)過 程中提供連續(xù)的讀出結(jié)果。
一旦目標(biāo)遺傳元件控制下的生物發(fā)光報(bào)告基因被耙向到動(dòng)物胎兒中要 求的位點(diǎn)或組織，就使所述動(dòng)物發(fā)育到出生和成年。在評(píng)估藥物代謝或毒 性的研究中，主要靶向組織是肝臟。隨后可監(jiān)測所述動(dòng)物中的所述生物發(fā) 光報(bào)告基因響應(yīng)受控事件的表達(dá)情況。本發(fā)明使得可進(jìn)行整個(gè)動(dòng)物成像， 避免了殺死動(dòng)物、復(fù)雜外科手術(shù)或?qū)ν庵艿?、分泌的或排泄的體液的倚賴。 慢病毒的使用特別引起了在所述動(dòng)物的整個(gè)生命周期中有效、 一體化的基 因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的基因表達(dá)，這使得可在所述動(dòng)物的任何生命階段進(jìn)行生物 成像。此外，出生前基因轉(zhuǎn)移使得動(dòng)物對(duì)轉(zhuǎn)基因材料有免疫耐受性。
此外，本發(fā)明的技術(shù)比傳統(tǒng)的體轉(zhuǎn)基因技術(shù)更快，因?yàn)樗枰木褪?制備栽體并將其送遞到動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物中的合適位點(diǎn)，然后4吏所述動(dòng) 物正常發(fā)育。在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，當(dāng)然必須在早得多的階段進(jìn)行基因 轉(zhuǎn)化。
另外，在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的所有細(xì)胞最終來自 于相同細(xì)胞中的相同轉(zhuǎn)化事件，即所述轉(zhuǎn)基因在每個(gè)細(xì)胞基因組中的位置 和方向均相同。在本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)在組織水平上進(jìn)行(體轉(zhuǎn)基因)， 因此在許多不同的各個(gè)細(xì)胞中存在許多不同的各個(gè)轉(zhuǎn)化事件。這意味著位 置效應(yīng)被避免。在傳統(tǒng)的種系轉(zhuǎn)基因中，如果所述栽體在一個(gè)不利的位置 整合，則在所述動(dòng)物的所有細(xì)胞中都會(huì)存在該不利的結(jié)果，并可在任何分析中得到誤導(dǎo)性的觀點(diǎn)。在本發(fā)明的體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，任何不利位置的插 入都會(huì)被其他有利位置的插入所補(bǔ)償。
本發(fā)明的另 一優(yōu)點(diǎn)是可使用任何合適的非整合載體，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因總 是需要一個(gè)整合事件，否則所述轉(zhuǎn)基因就不能凈皮復(fù)制到所得到動(dòng)物的每個(gè) 細(xì)胞中。
體轉(zhuǎn)基因術(shù)的另 一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是熒光素酶可被導(dǎo)入任何轉(zhuǎn)基因或基因敲除 的小鼠模型或者背景品系中。相反，傳統(tǒng)種系轉(zhuǎn)基因必須對(duì)這些不同的品 系進(jìn)行雜交，并通過最快的方法快速同源法達(dá)到遺傳同質(zhì)，但仍然需要至
少l(M義的時(shí)間。
本發(fā)明可使用體轉(zhuǎn)基因生物成像技術(shù)監(jiān)測模型動(dòng)物中病變的逸艮。進(jìn) 行子宮內(nèi)基因送遞的動(dòng)物的背景可有所變動(dòng)并用于確定對(duì)何種病變進(jìn)行建 模。生物成像的非侵入性質(zhì)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述報(bào)告基因的表達(dá)和所述病變 的發(fā)展可被連續(xù)監(jiān)測。表達(dá)可在例如病變界定事件之前、之中、之后或全 程被檢測。生物發(fā)光可在化合物的給藥之前和之后凈皮檢測，以確定所述化 合物對(duì)所述報(bào)告基因表達(dá)的影響。因此本發(fā)明可用于確定候選治療化合物 的效力?；衔飳?duì)動(dòng)物模型的作用可通過本發(fā)明技術(shù)提供連續(xù)生物發(fā)光讀 數(shù)的能力進(jìn)行詳細(xì)分析。本發(fā)明技^艮有利，因?yàn)槠淇稍谝阎鸵炎C明模 型的環(huán)境中進(jìn)行，從而可研究病變或治療對(duì)具體組織的影響。
Becker等人提供了用于監(jiān)測抗血管生成療法效果的子宮內(nèi)膜異位的非 ^^V模型(Am. J. Path.， 168:2074-2084)。用人類泛素C啟動(dòng)子控制下的熒 光素酶基因生成種系整合的表達(dá)熒光素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。所述小鼠顯示了 全身生物發(fā)光。通過外^"f術(shù)取出這些轉(zhuǎn)基因小鼠的子宮內(nèi)膜組織并移植 到不發(fā)光的受者上。所述模型提供了一種對(duì)子宮內(nèi)膜的損傷成像、監(jiān)測子 宮內(nèi)膜的生長和子宮內(nèi)膜異位治療中抗血管生成療法的效力的方法。此模 型與本發(fā)明有顯著的不同。本發(fā)明能夠分別靶向到多種組織并能夠進(jìn)行非 4h研究而無需外科手術(shù)。
因此本發(fā)明提供 一種用于確定報(bào)告基因的表達(dá)是否受到化合物調(diào)節(jié) 的方法，所述方法包括(a)將所述化合物給予非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新生時(shí)用載體對(duì)其一個(gè)或多個(gè)特異組織 進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成，所述栽體含有與響應(yīng)病變或治療的遺傳元件有效連接 的生物發(fā)光報(bào)告基因；和(b)測定所述化合物對(duì)所述報(bào)告基因在所述一個(gè)或 多個(gè)特異組織中表達(dá)的效果一_假設(shè)如果存在這一效果，所述測定包括檢
13測由于所述報(bào)告基因的基因產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
告基因的表:的用途，所i非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新生時(shí) 用載體對(duì)其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成，所述載體含有與響應(yīng)
病變或治療的遺傳元件有效連接的所述報(bào)告基因，方式是測定所述化合物 對(duì)所述報(bào)告基因在所述一個(gè)或多個(gè)特異組織中表達(dá)的效果_一假i殳如果存 在這一效果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基因產(chǎn)物的活性造成 的動(dòng)物生物發(fā)光。
本發(fā)明可應(yīng)用體轉(zhuǎn)基因生物成像技術(shù)在野生型動(dòng)物模型、外科手術(shù)或 化學(xué)誘導(dǎo)的疾病模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或人源化動(dòng)物模型中監(jiān)測藥物代謝或毒 性。進(jìn)行子宮內(nèi)基因送遞的動(dòng)物的背景可變化，以在與穩(wěn)定狀態(tài)不同的疾 病變態(tài)下檢測藥物代謝。 一個(gè)實(shí)例是在患晚期肝細(xì)胞癌的動(dòng)物中化療藥物 的代謝。生物成像的非侵入性質(zhì)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述報(bào)告基因的表達(dá)可被連 續(xù)監(jiān)測。 一個(gè)替代方案是使用宿主肝細(xì)胞部分或全部消融并且用人類肝細(xì)
胞重構(gòu)的"人源化，，小鼠模型。這種方案分別被Katoh等人(2007) (Katoh， M. et al. J Pharm Sci; 96: 2， p428)、 Turrini等人(2006) (Turrini， P. Transplant Proc; 38: 4 pll81)和Mitchell等人(2002) (Mitchell, C. Am J Pathol; 160: 1
p31)使用不同的技術(shù)所描述。人類和小鼠CYP響應(yīng)的不同表明這一人源化 小鼠模型對(duì)于在動(dòng)物模型中檢測人類CYP的相對(duì)表達(dá)是非常有價(jià)值的。我 們的方案是用病毒栽體在活體外遺傳操作人類胎兒、新生兒或成人肝細(xì)胞 使其具有CYP特異性報(bào)告基因的構(gòu)建體。然后用所述遺傳修飾的肝細(xì)胞重 構(gòu)鼠科動(dòng)物肝臟環(huán)境(niche),并將得到的動(dòng)物用于體轉(zhuǎn)基因生物成4象試 驗(yàn)以評(píng)估藥物代謝和/或作用。
本發(fā)明模型的可塑性是指具有確定啟動(dòng)子-增強(qiáng)子序列的任何CYP可 在人類或非人背景下，在疾病模型或毒性模型中被應(yīng)用，且在所述實(shí)驗(yàn)的 全部時(shí)間都可生成凝:據(jù)，避免了物種和個(gè)體差異。
因此本發(fā)明提供了一種評(píng)估化合物代謝和/或毒性的方法，包括
(a) 將所述化合物給予非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其 尚未出生時(shí)或新生時(shí)用載體對(duì)其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成， 所述載體含有與響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒性的遺傳元件有效連接的生物 發(fā)光報(bào)告基因；和
(b) 測定所述化合物對(duì)所述報(bào)告基因在所述一個(gè)或多個(gè)特異組織中表達(dá)的效果一 一若存在這一效果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基 因產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
本發(fā)明還提供了一種評(píng)估化合物代謝和/或毒性的方法，包括
(a) 將所述化合物給予非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通it^其 尚未出生時(shí)或新生時(shí)引入轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生成，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有與響應(yīng)藥 物代謝和/或藥物毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因；和
(b) 測定所述化合物對(duì)所述引入細(xì)胞或其所來源的細(xì)胞中的所述報(bào)告 基因表達(dá)的效果一一若存在這一效果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基 因的基因產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
光報(bào)告基因"表^的用途r所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新
生時(shí)用載體對(duì)其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成，所述載體含有與 響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因，方 式是測定所述化合物對(duì)于所述報(bào)告基因在所述一個(gè)或多個(gè)特異組織中表達(dá) 的效果一一若存在這一效果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基因 產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
本發(fā)明還提供一種非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于確定某種化合物是否會(huì)調(diào)節(jié)所 述報(bào)告基因的表達(dá)的用途，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通#其尚未出生時(shí)或新 生時(shí)引入轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生成，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有與響應(yīng)藥物代i射和/或藥物 毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因，方式是測定所述化合物對(duì) 所述報(bào)告基因在所述一個(gè)或多個(gè)特異組織中表達(dá)的效果一一假設(shè)如果存在 這一效果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基因產(chǎn)物的活性造成的 動(dòng)物生物發(fā)光。


圖1:說明了傳統(tǒng)分析、傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因生物成像和本發(fā)明的體轉(zhuǎn)基因生 物成像之間的不同。在全部三種分析中，上部陰影區(qū)示出了疾病誘導(dǎo)發(fā)生 的時(shí)間點(diǎn)，下部陰影區(qū)示出了治療分子或候選治療分子凈皮引入的時(shí)間。
左邊示出了傳統(tǒng)的非成像分析進(jìn)行了血漿試驗(yàn)，并最終殺死動(dòng)物以 收集其組織用于分子分析。
右邊示出了傳統(tǒng)(種系)轉(zhuǎn)基因生物成像。頂部示出了一個(gè)啟動(dòng)子熒 光素酶構(gòu)建體的克隆，其下示出了轉(zhuǎn)基因生物的形成，持續(xù)4個(gè)月以上。
15然后進(jìn)行生物成像。
中間示出了本發(fā)明的體轉(zhuǎn)基因生物成像的一個(gè)示例實(shí)施方案。與傳統(tǒng)
轉(zhuǎn)基因生物成像相比，持續(xù)4個(gè)月以上的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物形成步驟為制備f曼病 毒載體和該載體的子宮內(nèi)注射所代替代。這需要大約三周。
圖2:對(duì)新生小鼠進(jìn)行慢病毒載體的肌內(nèi)注射后的肌肉生物發(fā)光，其 中熒光素酶被一個(gè)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。上圖是正常圖像，下圖B肉生物 發(fā)光。
圖3:對(duì)新生小鼠進(jìn)行慢病毒載體的呼吸道灌注后的呼吸道生物發(fā)光， 其中熒光素酶被一個(gè)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。上圖是正常圖像，下圖是呼吸道 生物發(fā)光。
圖4:對(duì)新生小鼠進(jìn)行慢病毒栽體的顱內(nèi)注射后的顱部生物發(fā)光，其 中熒光素酶^皮一個(gè)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。上圖是正常圖# ，下圖是顱部生物 發(fā)光。
圖5:對(duì)新生小鼠進(jìn)行慢病毒載體的血管內(nèi)注射后的肝部生物發(fā)光， 其中熒光素酶被TGF-p感覺啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。上圖是正常圖像，下圖是肝部生 物發(fā)光。
圖6:闡釋了對(duì)新生小鼠進(jìn)行慢病毒載體的呼吸道灌注后在肺(呼吸 道)內(nèi)的長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)，其中熒光素酶被一個(gè)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。對(duì)第 1日齡的新生小鼠(11=5)進(jìn)行單劑量的gp64/HIV-熒光素酶( 3x107 iu)羊膜內(nèi) 給藥。這些動(dòng)物與未注射對(duì)照(11=2)在鼻內(nèi)給予50 jil的15 mg/ml熒光素后 進(jìn)行成像。(A)顯示了去掉背景(對(duì)照)值后肺內(nèi)的熒光素酶表達(dá)，這在本 研究期間(390天)均是可檢測的。(B)圖示了熒光素酶在上述小鼠肺內(nèi)和 鼻內(nèi)的表達(dá)。(B)的圖像是在第384日齡采集的。比例尺代表100nm。
圖7:用含有驅(qū)動(dòng)熒光素酶表達(dá)的TGF-p應(yīng)答元件的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 NIH-3T3細(xì)胞。然后用表達(dá)TGF-P3的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞。所 述SBE4應(yīng)答元件對(duì)通過smad2/3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化的TGF-P活化是特異的。 此Smad活化可進(jìn)一步描繪為使用ARE應(yīng)答元件連同爪蟾Fast-l反式作 用子(單ARE只對(duì)Samd2/3特異)的Smad2特異的轉(zhuǎn)錄活化。所述BMP 特異的應(yīng)答元件通過Smad1/5/8的活化激活并且不應(yīng)響應(yīng)TGF+3的活化。 最后，Samd7是一種抑制子Smad,已知其在一個(gè)TGF-|53活化的負(fù)反饋 環(huán)路中上調(diào)。轉(zhuǎn)基因TGF-P3的活化將SBE4元件上調(diào)至對(duì)照的大約1000 倍，并且ARE、 ARE/Fast-l應(yīng)答元件和Smad7啟動(dòng)子都顯示了明顯高于對(duì)照的響應(yīng)。陰性對(duì)照BMP應(yīng)答元件BRE在TGF-P3過表達(dá)時(shí)未顯示出 明顯高于對(duì)照的響應(yīng)。我們的結(jié)論是這些應(yīng)答元件在體外對(duì)TGF-p活化是 有活性的。
圖8:從原代小鼠真皮成纖維細(xì)胞生成驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶基因的合 成TGF-p應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。CAGA(12) Smad結(jié)合元件(SBE)被置 于最小啟動(dòng)子的上游，并將會(huì)對(duì)Smad2/3特異性轉(zhuǎn)錄激活響應(yīng)。用含有所 述CAGA(12)-Luc元件的慢病毒栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代鼠真皮成纖維細(xì)胞(MDF)。 然后在用表達(dá)TGF-p3或GFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDF的M培養(yǎng)基中 培養(yǎng)這些細(xì)胞。所述MDF-CAGA(12)-Luc細(xì)胞顯示了與對(duì)照相比熒光素 酶對(duì)TGF-P3 it^達(dá)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的明顯響應(yīng)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)我們能 夠從原代鼠細(xì)胞中形成響應(yīng)TGF-p活性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，
圖9:用Lenti/CAGA(12)-Luc載體轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)人類avp3整合素的 人類胚腎293T細(xì)胞和對(duì)照293T細(xì)胞以形成兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系。再將這些細(xì)胞 置于it^達(dá)TGF-P3的細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞的條件培養(yǎng)基中。與對(duì)照293T細(xì)胞 相比，avp3表達(dá)細(xì)胞系中的熒光素酶產(chǎn)量明顯加強(qiáng)。我們可以得出結(jié)論， avp3整合素的表達(dá)加強(qiáng)了 TGF-p3在293T細(xì)胞中的響應(yīng)度。
圖10:對(duì)新生小鼠進(jìn)行慢病毒載體的血管內(nèi)注射后的肝部生物發(fā)光， 其中熒光素酶被TGF-p感覺啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。上圖是對(duì)生物發(fā)光的定量。下圖 是標(biāo)準(zhǔn)化的生物發(fā)光圖像。用VSV-G-假型HIV熒光素酶栽體經(jīng)血管內(nèi)途 徑對(duì)小鼠胎兒(E17)進(jìn)行注射。所述熒光素酶轉(zhuǎn)基因被所述TGF-pi激活的 Smad特異的應(yīng)答元件CAGA(12)驅(qū)動(dòng)。得到的體轉(zhuǎn)基因后代在60天中檢 測4次，然后進(jìn)行膽道結(jié)扎，這是一種誘導(dǎo)肝臟損傷和纖維化的^H人方法。 當(dāng)肝臟纖維化進(jìn)行時(shí)，持續(xù)對(duì)小鼠進(jìn)行檢領(lǐng)，J。 J3M內(nèi)注射熒光素后5分鐘， 用CCD照相機(jī)對(duì)麻醉小鼠所攝取的影像構(gòu)成了熒光素酶表達(dá)試驗(yàn)。
具體實(shí)施方式
艦
本發(fā)明的優(yōu)選栽體是病毒栽體。本發(fā)明可應(yīng)用的病毒載體包括腺病毒 栽體、慢病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或單純皰療病毒 栽體。在許多情況下優(yōu)選慢病毒栽體。
對(duì)于許多組織尤其是肝臟和肺，優(yōu)選整合載體尤其是整合匱病毒載體。 在合適的情況下，也可使用非整合栽體(包括整合缺陷型慢病毒栽體)。非整合栽體例如AAV載體也可專門用于未分化組織如肌肉和腦中。
本發(fā)明的載體包括與 一個(gè)或多個(gè)響應(yīng)病變或治療的遺傳元件有效連接的一個(gè)或多個(gè)生物發(fā)光才艮告基因。
在一個(gè)替代實(shí)施方案中，所述載體包括與響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因。
優(yōu)選的生物發(fā)光才艮告基因是熒光素酶基因。眾所周知，熒光素酶作用于其底物熒光素導(dǎo)致生物發(fā)光。本發(fā)明可^"吏用的熒光素酶基因的實(shí)例為螢火蟲熒光素酶基因，其基因產(chǎn)物作用于熒光素導(dǎo)致發(fā)出可穿透身體組織的紅色(600nm波長)光并因此可^L檢測；海腎(w/w7/fl^mybrw/s)熒光素基因，其基因產(chǎn)物作用于海腎熒光素(腔腸熒光素)導(dǎo)致發(fā)出可檢測的藍(lán)色(466 nm波長)光。
通常，所述載體表達(dá)盒含有一個(gè)體內(nèi)優(yōu)化的帶有上游多克隆位點(diǎn)的熒光素酶基因，其中調(diào)控元件可克隆到所述多克隆位點(diǎn)中。這些調(diào)控元件包括因病變進(jìn)程或藥物代謝而被激活或抑制的基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子元件?？墒褂梅菃?dòng)子遺傳元件如小RNA限制表達(dá)。
通常，為研究藥物代謝或毒性，所述啟動(dòng)子是細(xì)胞色素P450(CYP450)啟動(dòng)子或與細(xì)胞色素P450活性有關(guān)的基因的啟動(dòng)子?？?吏用參與藥物^謝的任何CYP450基因的啟動(dòng)子，例如人類CYP450或與對(duì)其進(jìn)行所述試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物同一物種的CYP450的啟動(dòng)子。因此，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，優(yōu)選使用鼠源或人源啟動(dòng)子。例如，可使用來自CYP1A2、 2A6、 2B6、 2C8、2C9、 2C19、 2D6、 2E1或3A4中的任一個(gè)啟動(dòng)子。優(yōu)選CYP3A4啟動(dòng)子，尤其是人源或鼠源CYP3A4啟動(dòng)子。
逸歡
根據(jù)本發(fā)明，將所述栽體引入一個(gè)或多個(gè)特異組織，而使其他組織不受影響(或至少受到的影響很小以至于可在實(shí)際上認(rèn)為未被轉(zhuǎn)基因)。這與傳統(tǒng)生物成^f象中的位置不同，傳統(tǒng)生物成#>的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一種在所有組織的所有細(xì)胞中都包含轉(zhuǎn)基因的種系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。如本文所述，將所述載體引入到一個(gè)或多個(gè)特異組織中具有極大的優(yōu)點(diǎn)。
將本發(fā)明的載體特異地引入的優(yōu)選組織包括肝臟、心臟、腎臟、肌肉、腦、曱狀腺、肺、胰腺、血液、脾臟、胸腺、睪丸、消化道(如食管)、氣管、血管系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和眼部組織。尤其優(yōu)選肺和肝。
18如本文所述，可使用多種機(jī)制已將所述載體特異地耙向到特定組織上。動(dòng)參
本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)選地用于(非人)哺乳動(dòng)物。優(yōu)選嚙齒動(dòng)物如大鼠、
小鼠和兔；以及靈長類如猴。特別優(yōu)選小鼠，因?yàn)橛写罅筷P(guān)于轉(zhuǎn)基因小鼠的知識(shí)，包括全基因組序列的可得性和已有的小鼠疾病模型的廣泛可得性，并且實(shí)驗(yàn)方便。還存在若干具有人源化肝臟的小鼠模型從而使得在體內(nèi)環(huán)境中使用人類組織。也可使用小型豬或較小的靈長類。通常，較小的動(dòng)物要優(yōu)于較大的動(dòng)物，因?yàn)樵谳^小動(dòng)物中易于檢測組織的生物發(fā)光。需要利用不同的技術(shù)將載體最佳地送遞到不同動(dòng)物中。
她#，
通常，將載體送遞到動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物通過注射到相關(guān)組織或全身。
在小鼠中，全身注射已經(jīng)證明可將慢病毒特異地定位到脾臟、肝臟、肺和心臟。這種耙向可通過血管內(nèi)注射到胎兒卵黃嚢的血管中或注射到新生動(dòng)物的淺顳靜脈中實(shí)現(xiàn)。另一水平的靶向通過利用用來將慢病毒載體假型化的多種組織向性病毒包膜糖蛋白實(shí)現(xiàn)。
慢病毒栽體的一個(gè)吸引力一一某些其他載體也有一一在于可使用不同的表面受體以改變所述載體的組織和細(xì)胞向性( 一種被稱為假型化的方法)的可能性。盡管可將慢病毒栽體合成來含有其他病毒表面糖蛋白(下面做更詳細(xì)的解釋)，然而腺伴隨病毒載體和腺病毒栽體可用同屬其他血清型的包膜蛋白獲得以賦予不同的向性。例如，AAV血清型9與AAV血清型8相比可賦予心臟細(xì)胞更強(qiáng)的向性，而AAV血清型8可賦予肝臟細(xì)胞更強(qiáng)的向性。因此可使用不同的腺病毒血清型。還可使用具有其他血清型纖維的不同腺病毒血清型。
慢病毒載體用含有三或四個(gè)含有不同DNA組分的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備，以產(chǎn)生病毒樣載體顆粒。三質(zhì)粒系統(tǒng)包括由必要病毒組分組成的包裝質(zhì)粒，所述必要病毒組分包括用于病毒顆粒合成的gag和pol基因。第二質(zhì)粒含有"有效載荷"，例如由側(cè)翼為末端重復(fù)序列的選定啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶cDNA。這還包括一段確保所述有效載荷被整合到所述病毒顆粒中的包M列。第三質(zhì)粒編碼包覆所述包膜并賦予所述載體對(duì)特異細(xì)胞類型的向性的述(慢病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄家族的一個(gè)屬；HIV是一個(gè)亞屬)。這些假型包括水皰性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)，以及來自流感病毒、副流感病毒、埃博拉病毒、長臂猿白血病病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)和桿狀病毒(gp64)等的糖蛋白。
本發(fā)明人和其他人已經(jīng)觀察到對(duì)某些組織或器官的特異性依賴包被所述病毒的假型并依賴向幼小生物體的給藥途徑。例如，VSV-G在靜脈內(nèi)注射后賦予對(duì)動(dòng)物肝臟和脾臟的向性。gp64在羊膜內(nèi)或鼻內(nèi)給藥后賦予對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的向性，而鼻內(nèi)VSV-G給藥具有對(duì)肺泡細(xì)胞的向性?？袢?br> 病毒包膜糖蛋白在靜脈內(nèi)載體給藥后提供了對(duì)周圍神經(jīng)系統(tǒng)和背才Mt經(jīng)節(jié)強(qiáng)的向性。對(duì)肝細(xì)胞的靶向可利用合適的假型如Ebola、 gp64、 VSV-G和HA/HN來實(shí)現(xiàn)。
靶向也可通過在身體水平上控制送遞位點(diǎn)即通過將所述載體特異地送遞到有需要的組織中來實(shí)現(xiàn)。這可代替基于假型的方法，或與其同時(shí)使用。至少在小鼠中，肌內(nèi)注射會(huì)導(dǎo)致基因在后肢中表達(dá)，但并不;U/L肉特異的。胸內(nèi)注射靶向于呼吸肌，特別是重要隔膜。肋外注射也耙向于呼吸肌。腹膜內(nèi)注射可得到在皿間皮或者在，和橫隔的表達(dá)。羊膜內(nèi)注射可用于肺部和鼻部靶向。脊推內(nèi)和顱內(nèi)注射靶向周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)。肝內(nèi)注射靶向肝臟。
對(duì)于某些可根據(jù)本發(fā)明使用的組織特異性送遞方法的實(shí)例，參見S. N.Waddington et al. 2003， Gene Therapy 10:1234; Gregory et al. 2004， GeneTherapy ll(14):1117-25 (注射到胎兒后肢的骨骼肌中，通過胎兒卵黃嚢血管的全身注射、腹膜內(nèi)注射)；和Waddington et al. 2004， Blood104:2714-2721。對(duì)于一個(gè)可根據(jù)本發(fā)明使用的肝臟組織特異性送遞方法的實(shí)例，參見Waddington et al. 2004， Blood 104:2714-2721。
#絲忠
通常，用含有本發(fā)明的栽體(通常為病毒栽體)的溶液通過若干指定途徑在指定的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)注射動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物，優(yōu)選小鼠，以完成空間和時(shí)間上的組織靶向。所述注射提供一個(gè)整合的基因組或游離持續(xù)的轉(zhuǎn)基因，其是免疫耐受的并可作為任何剛出生的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的目標(biāo)組織類型的遺傳效應(yīng)器。此方法使研究者可以選擇讀出結(jié)果和背景。例如，可在一個(gè)疾病模型的基礎(chǔ)上建立一個(gè)加入了手術(shù)或化學(xué)誘導(dǎo)的疾病狀態(tài)以及藥物應(yīng)
20用的轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠，并提供一個(gè)清楚明確的對(duì)治療劑的指定下游標(biāo)記的實(shí)時(shí)讀出結(jié)果。
在小鼠胎兒中，才艮據(jù)所需送遞/耙向的精確類型，在20天，期內(nèi)注射的優(yōu)選時(shí)間通常是從懷孕后10天(dpc)到出生，如在11、 12、 13、 14、 15、16、 17、 18、 19dpc。對(duì)于送遞到肝臟，優(yōu)選12-17 dpc，特別優(yōu)選16dpc。在新生小鼠中，優(yōu)選的時(shí)間也倚賴送遞/耙向的精確類型，但通常^1從出生到出生后20天，如出生后1-10天，或出生后1到5天，尤其是出生后l、2或3天。對(duì)于其他動(dòng)物，可4^據(jù)其發(fā)育來確定相應(yīng)的時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明，可研究針對(duì)多種病變的候選藥物的活性。全部所需是現(xiàn)有的動(dòng)物模型，通常是小鼠模型；和響應(yīng)所述病變和/或響應(yīng)對(duì)所述病變的治療的遺傳元件，通常是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。許多情況下，這兩種所需的因素都是可得到的。使用本發(fā)明的病變應(yīng)答元件與生物發(fā)光報(bào)告基因有效連接的載體，通過本文討論的技術(shù)對(duì)動(dòng)物模型的胎兒或新生個(gè)體進(jìn)行體轉(zhuǎn)基因處理。選擇用于轉(zhuǎn)化的組織以使所述栽體靶向到一個(gè)或多個(gè)患有待研究病變的組織上。例如，如果需要te針對(duì)肝病的候選藥物，則通常耙向到肝臟。
所述體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成年時(shí)，它們不但保持模型特征而且在一個(gè)或多個(gè)在誘導(dǎo)時(shí)將會(huì)患病的組織中具有病變應(yīng)答元件/生物發(fā)光報(bào)告轉(zhuǎn)基因組合?？稍诖藭r(shí)進(jìn)行生物成像以作為對(duì)照。然后，如果必要，以合適的方法如通過化學(xué)和/或手術(shù)誘導(dǎo)所述病變。然后通常進(jìn)行生物成4象，以測量由所述病變/治療應(yīng)答元件的活性和所述活性在疾病狀態(tài)下引起的報(bào)告基因的表達(dá)所導(dǎo)致的生物發(fā)光。然后將所述候選化合物給予所述動(dòng)物，通常再次進(jìn)行生物成像并比較結(jié)果。如果所述候選化合物對(duì)所述病變具有效果，則可從所述比較中得出。通常，在所述候選化合物的給藥前和給藥后都會(huì)進(jìn)行生物成#^。在某些情況下，如當(dāng)能夠充分了解疾病狀態(tài)下的情況時(shí)，則在給藥前可不需進(jìn)行生物成像，而只在給藥后進(jìn)行。
可定性或定量地測定所述候選化合物對(duì)所述病變的效果一一如果存在這一效果。在某些情況下，只需測定是否有效果，在其他情況下，可測量所述效果的程度。
如此可測定候選化合物對(duì)病變的效果。也可研究病變對(duì)已知療法的反應(yīng)。
4妙微
可如此研究的病變包括肝臟、心臟、腎臟、肌肉、腦、曱狀腺、肺、 胰腺、血液、脾臟、胸腺、睪丸、消化道、氣管、血管系統(tǒng)、周圍或中樞 神經(jīng)系統(tǒng)和眼睛的病變。任何病變途徑都可被研究。優(yōu)選肺或肝的病變， 或者肌肉和/或神經(jīng)系統(tǒng)的病變。
優(yōu)選地，肺部病變選自呼吸道感染、哞喘和慢性阻塞性肺部疾病
(COPD)。所述呼吸道感染可由例如呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒 (PIV)或流感病毒(IV)引起。優(yōu)選地，肝部病變選自肝纖維化、肝硬化和丙 型肝炎感染。優(yōu)選地，肌肉和/或神經(jīng)系統(tǒng)病變是一種退化性疾病，如選自 迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良(DMD)、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良(MD)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病 (MND)、阿爾茨海默氏病(AD)和亨廷頓氏病(HD)的疾病。
可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行研究的疾病模型的一個(gè)實(shí)例是肝纖維化。肝纖維化 小鼠模型可通過向胎兒血管內(nèi)注射慢病毒制劑形成。所述慢病毒制劑包括 在熒光素酶報(bào)告基因上游的參與肝纖維化的一個(gè)或多個(gè)遺傳效應(yīng)器，如 ColI2a啟動(dòng)子、Smad7啟動(dòng)子或BRE增強(qiáng)元件。在通過漸進(jìn)性纖維化刺 激如膽道結(jié)扎或慢性纖維化刺激如給予CCLt來誘導(dǎo)疾病之前和之后可進(jìn) 行連續(xù)生物成寸象?？刹鹏迵?jù)生物發(fā)光讀出結(jié)果來確定試驗(yàn)化合物對(duì)所iiJt臟 纖維化模型的效果。
使用在遺傳元件如調(diào)控5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和/或受體表達(dá)的遺傳元件的控 制下表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的慢病毒載體，可研究候選抗憂郁藥物如氟西 汀(Prozac)對(duì)小鼠模型的效果。所述慢病毒制劑可通過胎兒顱內(nèi)注射來施 用。可通過在給予所述候選抗憂郁藥物之前、之中和之后進(jìn)行連續(xù)生物成 像來測定候選化合物的效果。
本發(fā)明還可用于病變?yōu)檠装Y或病變包括或會(huì)導(dǎo)致炎癥的情況，例如在 肝部、肺部或關(guān)節(jié)處，但也可能在別處。為評(píng)估候選化合物對(duì)炎癥的效果 —一如果存在這一效果，可在動(dòng)物模型動(dòng)物中用含有響應(yīng)炎癥和/或炎癥減 輕的遺傳元件(例如一個(gè)因炎癥上調(diào)的特異性啟動(dòng)子)的載體如本文討論 進(jìn)行體轉(zhuǎn)基因處理，所述動(dòng)物模型在例如肝臟、肺、關(guān)節(jié)、肌肉、心臟、 腦或其他器官具有炎癥或可使其具有炎癥。所述載體可被送遞到合適的組 織中，在此來自炎癥的信號(hào)會(huì)導(dǎo)致所述應(yīng)答元件被激活并表達(dá)所述生物發(fā)光基因，從而可進(jìn)行生物成像。然后可通過進(jìn)行生物成像來定性和/或定量 地評(píng)估所述候選化合物的效果，生物成〗象通常在給予所述化合物前后均進(jìn) 行，但是(參見上文)在一些情況下也可以僅在給予所述化合物之后進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，可使用在NFkB增強(qiáng)元件和鼠科最小啟動(dòng)子的控制下表 達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的慢病毒載體形成炎癥小鼠模型。所述慢病毒制劑可 通過胎兒羊膜內(nèi)注射來施用?？赏ㄟ^在成熟小鼠中，在給予抗炎藥物之前、 之中和之后進(jìn)行連續(xù)生物成像來對(duì)所述抗炎藥物的效果進(jìn)行建模。
秀拋'絲#財(cái)估
使用本發(fā)明的響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒性的遺傳元件與生物發(fā)光報(bào) 告基因有效連接的載體，通過本文討論的技術(shù)對(duì)動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物進(jìn)行 體轉(zhuǎn)基因處理。選擇組織以使所述載體靶向到 一個(gè)或多個(gè)受藥物代謝和/或 毒性影響的組織上。因此最感興趣的組織通常是肝臟，因?yàn)槠涫撬幬锎x 和解毒的主要場所，還是從中得到本發(fā)明優(yōu)選啟動(dòng)子的CYP450基因表達(dá) 的主要場所。
所述體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成年時(shí)，它們?cè)谝粋€(gè)或多個(gè)相關(guān)組織內(nèi)具有應(yīng)答元 件/生物發(fā)光報(bào)告轉(zhuǎn)基因組合?？稍诖藭r(shí)進(jìn)行生物成像以作為對(duì)照。然后， 給予候選化合物。然后通常進(jìn)行生物成像，以測量由所述應(yīng)答元件的活性
光r如果;i候選化合物已4代謝或已表現(xiàn)出4性,、則會(huì)觀察到所述應(yīng)答
元件的活性變化。通常，在所述候選化合物的給藥前和給藥后都會(huì)進(jìn)行生 物成像。在某些情況下，如當(dāng)能夠充分了解給藥前的情況時(shí)，則可不在給 藥前進(jìn)行生物成像，而只在給藥后進(jìn)行。
可定性或定量地測定所述候選化合物的效果——如果存在這一效果。 在某些情況下，只需測定是否有效果，在其他情況下，可測量所述效果的 程度。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以體轉(zhuǎn)基因術(shù)的方式通過全身注射將載體引 入小鼠胎兒或新生小鼠的肝臟內(nèi)，所述載體包含與生物發(fā)光報(bào)道基因如熒 光素酶基因有效連接的CYP450啟動(dòng)子或與CYP450活性有關(guān)的基因的啟 動(dòng)子，并在給予候選化合物之前和之后進(jìn)行生物成像；然后對(duì)這樣獲得的 測量進(jìn)行比較，用于確定所述啟動(dòng)子是否和/或以何種程度被所述候選化合 物激活，即候選化合物是否和/或以何種程度在肝臟中被代謝和/或表現(xiàn)出毒性。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的應(yīng)答元件/報(bào)告基因組合不直接通過載體
引入到所述動(dòng)物中；而是在所述動(dòng)物中引入包含所述組合的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。 在這些實(shí)施方案中，細(xì)胞例如動(dòng)物胎兒、新生動(dòng)物或成年動(dòng)物的細(xì)胞^L轉(zhuǎn) 導(dǎo)，并通常通過上面討論的注射引入所述動(dòng)物中。通常，這會(huì)用本發(fā)明的 病毒載體尤其是慢病毒栽體來完成，如上所述，但是可使用任何合適的載 體。
通常，將所述細(xì)胞引入它們自身起源的組織或器官。
在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是與它們將被引入的動(dòng)物同一物種的動(dòng) 物的細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞通常會(huì)被引入小鼠。
或者，所述細(xì)胞可為人源(胎兒、新生兒或成人)細(xì)胞并被引入相容 的非人動(dòng)物中，如一種"人源化，，動(dòng)物(見上)。此時(shí)對(duì)于肝細(xì)胞來說，這 意味著它們可被引入(通常通過注射)到野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(通常為小鼠) 或免疫抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正?；虿糠纸M織消融的肝臟中。通過宿主細(xì)胞的化 學(xué)或生物消融，或者通過使人類細(xì)胞在有利條件下重構(gòu)，可促進(jìn)用人類肝 實(shí)質(zhì)細(xì)胞重構(gòu)宿主肝臟。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是肝臟細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞。通常，這 些細(xì)胞會(huì)通過注射被引入所述動(dòng)物的肝臟。
為評(píng)估上述過程如給予候選化合物的結(jié)果，根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行生物成 像。例如，Contag， C.H.和Bachma叫M.H.的綜述(Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Ann. Rev. Biomed. Eng. 4:235-260; 2002);以及同作者的^Ui論文中描述了整體成像的方法。
利用熒光素酶，除了注射與熒光素酶作用產(chǎn)生生物發(fā)光的底物熒光素 以外，這種生物成像是非4^v性的。然而，也可通過喝水非^地而給予 熒光素，從而可在動(dòng)物清醒時(shí)進(jìn)行成像。
生物發(fā)光可用任何合適的方法檢測，如用電荷偶合元件(CCD)相機(jī)。
通常， 一旦進(jìn)行完所有需要的測量，就會(huì)殺死所述動(dòng)物。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)行闡釋。
24實(shí)施例 實(shí)施例1
進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定在小鼠中實(shí)現(xiàn)長期組織特異性轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可能性。
按照Seppen等人(Seppen J， Rijnberg M, Cooreman MP， Oude Elferink RP. Lentiviral vectors for efficient transduction of isolated primary quiescent hepatocytes. J Hepatol 2002; 36: 459-465)描述的方法命
備用于長期分析的gp64-假型化熒光素酶載體和vsvg-假型化熒光素酶載 體。
慢病毒的制備如下在每個(gè)T-150燒瓶中接種2xl07個(gè)293T生產(chǎn)細(xì)胞。 第二天，在每個(gè)T-150燒瓶中將以下量的質(zhì)粒DNA在OptiMEM (Invitrogen， Paisley, UK)中進(jìn)行混合并使最終體積為5 ml:栽體構(gòu)建體 (pHR.SINcpptSEW) 40將、pMDG.2/pHCMVwhvGP64 10照、pCMVA8.74 30照。將聚乙烯亞胺(PEI， 25 kDa) (Sigma, Poole, UK)加入5 ml OptiMEM 中，使終濃度為2fiM,并通過0.22 jrni的過濾器過濾。將所述DNA逐滴 加入到PEI溶液在并在室溫下溫育20分鐘。將所述DNA/PEI溶液加入到 所述293T細(xì)胞中，并在37°C、 5% C02下溫育4小時(shí)，然后用完全DMEM (Invitrogen)替換。再過48小時(shí)后收集上清液，如果必要，更換生長培養(yǎng)基 以在72小時(shí)后進(jìn)行第二次收集。
首先將病毒上清液用桌上型離心機(jī)(MSE， Germany)以2500 rpm離心 10分鐘，再通過0.22 的過濾器過濾，然后以23,000 rpm(約100,000 xg) 在4。C下超速離心2小時(shí)。小心地傾出培養(yǎng)基并在300 jil PBS培養(yǎng)基中重 懸浮病毒沉淀。最后，將病毒懸浮液用桌上型微量離心機(jī)以4000 rpm離心 10分鐘以除去任何殘留的碎片。所有病毒制劑都新鮮使用并通過前人 (Logan AC， Nightingale SJ， Haas DL， Cho GJ， Pepper KA， Kohn DB. Factors influencing the titer and infectivity of lentiviral vectors. Hum Gene Ther 2004; 15: 976-988)所述的逆轉(zhuǎn)錄酶qPCR和p24 ELISA試驗(yàn)進(jìn)行滴 定。
絲鄉(xiāng)
使用雄性和雌性MF1小鼠(Harlan，UK)。對(duì)于子宮內(nèi)給藥，通過吸入
25異氟醚(Abbott Laboratories, UK)將時(shí)間上匹配的懷孕小鼠麻醉。進(jìn)行中線 剖腹術(shù)并使懷孕子宮的兩個(gè)角都顯露出來。所有注射都通過經(jīng)子宮注射進(jìn) 行。
對(duì)于胎兒呼吸道給藥，用33號(hào)Hamilton Microliter SyringeT"注射器通 過穿透子宮壁、卵黃嚢和羊膜對(duì)每個(gè)羊膜腔都進(jìn)行注射(體積為50 pl)。對(duì) 于新生兒呼吸道給藥，將20 jil載體施加到鼻孔中(劑量為2x10 nl)從而 使所述新生兒吸入所述載體(結(jié)果示于圖3，上圖為正常圖像，下圖為呼 吸道生物發(fā)光；以及圖6,長期肺部生物發(fā)光，組成型和泛素啟動(dòng)子)。 對(duì)于胎兒血管內(nèi)注射，使用34號(hào)針頭(Hamilton， UK)將20 jil溶液經(jīng)子宮 注射到周圍卵黃嚢血管中。對(duì)于新生兒血管內(nèi)注射，對(duì)新生兒進(jìn)行低溫麻 醉并將40jil溶液注射到顳上靜脈中(結(jié)果示于圖5，上圖是正常圖像，下 圖是肝部生物發(fā)光；以及圖10，膽管結(jié)扎前后的生物成像，TGF-p感覺啟 動(dòng)子)。對(duì)于新生兒肌內(nèi)注射，將5 nl溶液直接注射到腿部肌肉中(結(jié)果 示于圖2，上圖是正常圖像，下圖^L肉生物發(fā)光)。對(duì)于胎兒顱內(nèi)注射， 將5 pl溶液直接注射到胎兒小鼠的左半球中(結(jié)果示于圖4，上圖是正常 圖像，下圖是顱部生物發(fā)光)。
對(duì)于所有胎兒注射，對(duì)每只孕鼠最多注射6個(gè)胎兒。注射后，將子宮 放回腹腔內(nèi)并用5/0 Mersilk縫線(E也icon， Brussels, Belgium)分兩層縫合腹 部。將動(dòng)物置于溫暖無干擾的籠中直到蘇醒和活動(dòng)。新生兒給藥后，使小 鼠在加熱墊上恢復(fù)然后回到它們的母親身邊。所有動(dòng)物工作都依照英國內(nèi) 政部條例進(jìn)行,并符合Imperial College London ethical review committee 的準(zhǔn)則。
體內(nèi)熒光素酶生物成4象
用異氟醚(Abbott Laboratories, IL， USA)將小鼠麻醉，通過鼻內(nèi)途徑給 予50 pi的15 mg/ml的D-熒光素(GoId Bio， MO， USA),并在5分鐘后用 CCD相機(jī)(IVIS, Xenogen， MA， USA)成像。獲得灰階圖像后，用12 cm視 場、分辨率8、光圈1/f并打開濾光鏡得到5分鐘生物發(fā)光影像。手動(dòng)定義 目標(biāo)區(qū)域(ROI)(在各種情況下都4吏用標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域)，用Living Image軟件 (Xenogen)計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度并以每秒光子數(shù)表達(dá)。從未給予載體的對(duì)照小鼠的 ROI制圖中確定背景光子通量。實(shí)施例2
為評(píng)估長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)，對(duì)第l日齡的新生小鼠(11=5)羊膜內(nèi)給予單劑 gp64/HIV熒光素酶(約3xl07 iu)。對(duì)小鼠進(jìn)行一年及以上的生物成像，并 將熒光素酶生物發(fā)光與對(duì)照比較(11=2)。如實(shí)施例l所述進(jìn)行體內(nèi)熒光素酶 生物成像。熒光素酶表達(dá)在整個(gè)分析中都顯著高于對(duì)照并在整個(gè)研究中持 續(xù)(圖6)。所述結(jié)果說明給藥后可在最長達(dá)一年內(nèi)檢測到明顯表達(dá)。
實(shí)施例3
在體外試驗(yàn)可用于動(dòng)物模型的遺傳生物效應(yīng)器(實(shí)施例3-5)。 用含有驅(qū)動(dòng)熒光素酶表達(dá)的TGF-P應(yīng)答元件的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì) 胞。然后用表達(dá)TGF-P3的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞。所述SBE4應(yīng) 答元件對(duì)通過smad2/3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化的TGF-p活化是特異的。此Smad 活化可進(jìn)一步描繪為使用ARE應(yīng)答元件連同爪蟾Fast-l反式作用子(單 ARE只對(duì)Samd2/3特異)的Smad2特異的轉(zhuǎn)錄活化。所述BMP特異的 應(yīng)答元件通過Smadl/5/8的活化激活并且不應(yīng)應(yīng)答TGF+3的活化。最后， Samd7是一種抑制子Smad，已知其在一個(gè)TGF-卩3活化的負(fù)反饋環(huán)路中 被上調(diào)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下
按lx106細(xì)胞/孔預(yù)置NIH-3T3細(xì)胞并通過標(biāo)準(zhǔn)磷酸鉀沉淀法用10照 才艮告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后用rKat.TGF-p3或者對(duì)照rKat.cmvGFP逆轉(zhuǎn)錄 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞?；贛LV的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pKat/rKat系統(tǒng)已經(jīng)為前人 所描述(Finer, M. H.， T. J. Dull, L. Qin， D. Farson， and M. R. Roberts. 1994. kat: a high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood 83:43-50)。逆轉(zhuǎn)錄病毒制備如下在每個(gè)T-150燒瓶中 接種2xl(f個(gè)293T生產(chǎn)細(xì)胞。在每個(gè)T-150燒瓶中將以下量的質(zhì)粒DNA 在OptiMEM (Invitrogen， Paisley, UK)中進(jìn)行混合并使最終體積為5 ml:栽 體構(gòu)建體40照、pKat 10照、rKat。將聚乙烯亞胺(PEI) (Sigma-Aldrich， Poole， UK)加入5 ml OptiMEM中使終濃度為2 nM并通過0.2 jim的過濾 器過濾。將所述DNA逐滴加入到PEI溶液在并在室溫下溫育20分鐘。將 所述DNA/PEI溶^i口入到所述293T細(xì)胞中并在37°C、 5% C02下溫育4 小時(shí)，然后用完全DMEM(Invitrogen)替換。24小時(shí)后更換生長培養(yǎng)基， 再過24小時(shí)后收集上清液，如果必要，再次更換生長培養(yǎng)基以進(jìn)行第二次 收集。將病毒上清液以5000 xg離心10分鐘以除去細(xì)J!W片然后通過0.22jim過濾器過濾。所有病毒制劑都新鮮使用并通過有限稀釋和GFP的FACS 分析來對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行滴定從而確定其生物滴度。用所述rKat逆轉(zhuǎn)錄病 毒轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞，48小時(shí)后除去條件培養(yǎng)基，在通過0.45 ^rni的尼龍 濾膜過濾，然后加入含質(zhì)粒的NIH-3T3細(xì)胞中。48小時(shí)后，在細(xì)胞裂解液 中測量熒光素酶表達(dá)。用Promega熒光素酶檢驗(yàn)試劑盒和Berthold Flash，n，Glow LB955光度計(jì)(Berthold， Herts, UK)檢驗(yàn)細(xì)胞裂解液中熒光 素酶的表達(dá)。按照廠商說明(BioRad， Herts, UK)，通過標(biāo)準(zhǔn)Bradford試驗(yàn) 測量總蛋白；相對(duì)總蛋白的相對(duì)熒光素酶活性可以任意單位表達(dá)。
結(jié)果示于圖7。轉(zhuǎn)基因TGF-P3的活化將SBE4元件上調(diào)至對(duì)照的大約 1000倍，并且ARE、 ARE/Fast-l應(yīng)答元件和Smad7啟動(dòng)子都顯示了明顯 高于對(duì)照的響應(yīng)度。陰性對(duì)照BMP應(yīng)答元件BRE在TGF-P3 it^達(dá)時(shí)未 顯示出明顯高于對(duì)照的響應(yīng)度。我們得出，這些應(yīng)答元件在體外對(duì)TGF-p 活化是有活性的。
實(shí)施例4
從原代小鼠真皮成纖維細(xì)胞生成驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶基因的合成 TGF-p應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。CAGA(12) Smad結(jié)合元件(SBE)被置于 最小啟動(dòng)子的上游，并將會(huì)響應(yīng)Smad2/3特異性轉(zhuǎn)錄激活。用含有所述 CAGA(12)-Luc元件的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代鼠真皮成纖維細(xì)胞(MDF)。然 后用表達(dá)TGF-P3或GFP的慢病毒栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDF的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng) 這些細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下
按DiPersio等人所述(DiPersio， C. M.， S. Shah， and R. O. Hynes. 1995. alpha 3A beta 1 integrin localizes to focal contacts in response to diverse extracellular matrix proteins. J Cell Sci 108 (Pt 6):2321畫36)分離鼠真皮成纖 維細(xì)胞(MDF),使其擴(kuò)展至約60%融合，再用在smad 2/3特異性CAGA(12) 啟動(dòng)子控制下表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的慢病毒栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)。如實(shí)施例1所述 制備慢病毒制劑。48小時(shí)后將細(xì)胞重置于無血清條件下并加入 rKat-TGF-p3逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體或?qū)φ誧mvGFP載體，再過48小時(shí)后裂解。 用Promega熒光素酶檢驗(yàn)試劑盒和Berthold Flash，n，Glow LB955 (Berthold, Herts, UK)光度計(jì)(Berthold， Herts, UK)檢驗(yàn)細(xì)胞裂解液中 熒光素酶的表達(dá)。按照廠商說明(BioRad， Herts, UK)，通過標(biāo)準(zhǔn)Bradford 試驗(yàn)測量總蛋白；相對(duì)總蛋白的相對(duì)熒光素酶活性可以任意單位表達(dá)。
28結(jié)果示于圖8。所述MDF-CAGA(12)-Luc細(xì)胞與對(duì)照相比顯示了熒光 素酶對(duì)TGF-P3 it^達(dá)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的明顯響應(yīng)。這些lt據(jù)證實(shí)本發(fā) 明人能夠從原代鼠細(xì)胞中形成響應(yīng)TGF-P活性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
實(shí)施例5
用Lenti/CAGA(12)-Luc栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定表i^A類avp3整合素的人類胚 腎293T細(xì)胞和對(duì)照293T細(xì)胞以形成兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系。然后，將這些細(xì)胞置 于it^達(dá)TGF-p3的細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞的條件培養(yǎng)基中。更多細(xì)節(jié)
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有(iv和P3整合素的人類293T細(xì)胞(293Tab)以及293T對(duì)照 都是美國UNC的John Olsen博士友好贈(zèng)送的。用Lenti-CAGA(12)-Luc 轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞和293Tab細(xì)胞，用表達(dá)人類TGF-p3iresGFP、突變 TGF+3iresGFP或GFP對(duì)照的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人類DF細(xì)胞。將細(xì)胞再培養(yǎng) 48小時(shí)，然后用胰蛋白酶消化，再以1: 1的比例混合293細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)的 DF細(xì)胞。將細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中再培育24小時(shí)，然后在添加有ITS+1 (Sigma-Aldrich)的不含血清的培養(yǎng)基中培育48小時(shí)。隨后將細(xì)胞進(jìn)行 FACS分析以評(píng)估293T細(xì)胞和DF細(xì)胞的比例，或者裂解以定量測定其熒 光素酶的表達(dá)。
結(jié)果示于表9。與對(duì)照293T細(xì)胞相比，avp3表達(dá)細(xì)胞系中的熒光素 酶產(chǎn)量明顯加強(qiáng)。我們可以得出結(jié)論，avp3整合素的表達(dá)加強(qiáng)了 TGF-p3 在293T細(xì)胞中的響應(yīng)度。
實(shí)施例6
已經(jīng)使用肝臟纖維化的小鼠模型對(duì)新的體轉(zhuǎn)基因生物成像技術(shù)對(duì)體內(nèi) 病變進(jìn)行建模的應(yīng)用進(jìn)行了初步確認(rèn)。TGF-p特異性促纖維化信號(hào)傳遞是 通過Smad信號(hào)傳遞介導(dǎo)的。我們選擇了文獻(xiàn)已確定并對(duì)這些通路特異的 最小增強(qiáng)子/啟動(dòng)子元件來模仿因膽總管永久閉合而導(dǎo)致的門肝臟纖維化 的分子結(jié)果進(jìn)行建模。此纖維化模型與如在膽道疾病和嚢性纖維化(CF) 肝病中觀察到的肝臟病變相當(dāng)。
參考圖10，用VSV-G-假型HIV熒光素酶載體經(jīng)血管內(nèi)途徑對(duì)小鼠胎 兒(E17)進(jìn)行注射。所述熒光素酶轉(zhuǎn)基因被所述TGF-pi激活的Smad特異 的應(yīng)答元件CAGA(12)驅(qū)動(dòng)。得到的體轉(zhuǎn)基因后代在60天中檢測4次，然 后進(jìn)行膽道結(jié)扎，這是一種誘導(dǎo)肝臟損傷和纖維化的公認(rèn)方法。當(dāng)肝臟纖
29維化進(jìn)行時(shí)，持續(xù)對(duì)小鼠進(jìn)行檢測。劇溪內(nèi)注射熒光素后5分鐘，用CCD 照相機(jī)對(duì)麻醉小鼠所攝取的影像構(gòu)成了熒光素酶表達(dá)試驗(yàn)。所述新技術(shù)第 一次在體內(nèi)顯示了 Smad2/3信號(hào)傳遞以一種脈沖的方式響應(yīng)。此前無法連 續(xù)監(jiān)測動(dòng)物個(gè)體時(shí)，此結(jié)果很可能被錯(cuò)過了。此外，即使對(duì)兩個(gè)動(dòng)物做同 樣的處理，它們也不是同步的。當(dāng)取平均時(shí)，這會(huì)消除任何不同的效果(圖 10)。
實(shí)施例7
可為肝硬化和丙型肝炎感染以及肺纖維化(PF)建立類似的疾病模型。 對(duì)人類和小鼠基因組的測序使得可表征和獲得可整合入報(bào)告基因表達(dá)盒的 高度特異的DNA效應(yīng)器和阻遏元件的價(jià)值。同樣可行的還包括使用增強(qiáng)子 /啟動(dòng)子元件以檢測肌肉或神經(jīng)再生/退化或神經(jīng)元脫髓鞘從而對(duì)神經(jīng)或肌 肉退化疾病進(jìn)行建模，所述神經(jīng)或肌肉退化疾病如多發(fā)性硬化癥(MS)、 強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良(MD)、肌營養(yǎng)不良癥(DMD/BMD)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病 (MND)、阿爾茨海默氏病(AD)和亨廷頓氏病(HD)。此外，本發(fā)明 人能夠使用假型慢病毒來靶向血管內(nèi)皮，促i^血管再生的體內(nèi)分析。
實(shí)施例8
最近嚢性纖維化(CF)的肺部病變已經(jīng)通過使用小分子藥物敲除ENaC ( 一種肺上皮鈉通道蛋白)的p亞基的表達(dá)或降低其活性而被解決。CF肺 病的精確模型已經(jīng)通#轉(zhuǎn)基因小鼠中^±^達(dá)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-ENaC而被 建立，從而驗(yàn)證其與疾病病理的相關(guān)性。此模型除了測量小分子療法的效 果以外還具有重大治療意義，因?yàn)橹靶枰獙?duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做終點(diǎn)分析。 P-ENaC基因轉(zhuǎn)移的肺部病變已被充分地研究，其中若干次級(jí)炎性反應(yīng)廣 泛地參與了早期疾病(特別是IL上調(diào))。利用這一現(xiàn)有知識(shí)，可利用本發(fā) 明的教導(dǎo)來選擇一個(gè)因局部炎癥而上調(diào)的特異性啟動(dòng)子，將其設(shè)計(jì)到本發(fā) 明的慢病毒表達(dá)盒中并進(jìn)行P-ENaC/啟動(dòng)子-生物成像體基因轉(zhuǎn)移術(shù)。隨后 這些動(dòng)物可利用下游活性作為藥物發(fā)逸的枱r驗(yàn)系統(tǒng)，用作病變發(fā)展的定量 檢驗(yàn)。
實(shí)施例9
作為另一個(gè)實(shí)施例，PIV/RSV和流感病毒(IV)引起的病理性肺部感染導(dǎo)致早期杯狀細(xì)胞增生/轉(zhuǎn)化和私液素基因如Muc5AC的過表達(dá)。這一病毒 引起的肺病的早期表現(xiàn)可用于追蹤疾病發(fā)展或治療性減退。使用體轉(zhuǎn)基因 生物成像，本發(fā)明人能夠跟蹤各種類型肺細(xì)胞和潛在的肺干細(xì)胞。因此， 可在疾病模型如p-ENaC轉(zhuǎn)基因模型中追蹤響應(yīng)疾病狀態(tài)或藥物治療或者 病毒和細(xì)菌感染組合的體內(nèi)Muc5AC表達(dá)。
實(shí)施例10
在疾病如肺纖維化、(肺)副流感病毒和丙型肝炎(肝)感染中的進(jìn) 行性肝/肺纖維化的治療性減退會(huì)從體轉(zhuǎn)基因生物成像中受益。在由TGF-p 信號(hào)傳遞或下游標(biāo)記激活的早期效應(yīng)器如膠原蛋白la2啟動(dòng)子控制下的遺 傳調(diào)控生物成像報(bào)告基因的產(chǎn)量會(huì)對(duì)疾病進(jìn)展/減退提供寶貴的數(shù)據(jù)。 TGF-p信號(hào)傳遞在包括肝和肺的許多器官中是早期纖維化所必需的。信號(hào) 傳遞通過下游Samd信號(hào)傳遞調(diào)節(jié)，所述下游Samd信號(hào)傳遞除了控制纖 維化及其他病變中的上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)，還控制促纖維化和抗纖維 化反應(yīng)。受體Smad(R-Smad)保持來自受刺激受體的信號(hào)傳遞，然后共激 活移至核內(nèi)并發(fā)起轉(zhuǎn)錄激活的效應(yīng)器Smad4。已知抑制子Smad既通過結(jié) 合R-Smad復(fù)合物又在轉(zhuǎn)錄水平上阻斷這一通路。可使用包括此通路各階 段的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件的體轉(zhuǎn)基因生物來追蹤這一完整過程。此夕卜，EMT 被不同的R-Smad及可隨時(shí)間在體內(nèi)再次模仿和追蹤的下游效應(yīng)所控制。 EMT涉及不同病變?nèi)缋w維化和癌癥。^^、蛋白la2沉積的特征在于肝臟纖 維化，并且是一個(gè)極好的預(yù)后標(biāo)記物。因此可通過化學(xué)(CCl4)或手術(shù)(膽管 結(jié)扎)方式使體轉(zhuǎn)基因生物的肝臟受到傷害，并在此環(huán)境下檢測治療劑， 用熒光素酶生物成〗象作為輸出結(jié)果。損傷前后以及處理前后的成〗象能力突 顯了此方法的連續(xù)性。
權(quán)利要求
1.一種用于確定報(bào)告基因的表達(dá)是否受到化合物調(diào)節(jié)的方法，所述方法包括(a)將所述化合物給予非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新生時(shí)用載體對(duì)其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成，所述載體含有與響應(yīng)病變或治療的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因；和(b)測定所述化合物對(duì)所述報(bào)告基因在所述一個(gè)或多個(gè)特異組織中表達(dá)的效果——若存在這一效果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基因產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述載體是病毒載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述病毒載體A^病毒載體、慢病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或單純皰滲病毒載體。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中用所述栽體對(duì)所述尚未出生時(shí)或新生時(shí)的動(dòng)物進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)包括(a) 獲得含有與響應(yīng)疾病或治療的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因的載體；并(b) 將所述載體送遞到動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)選定組織中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中送遞所述載體通過將所述栽體靶向到所述動(dòng)物的 一個(gè)或多個(gè)特異組織的注射。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述注射是全身性的，但所述載體被送遞到一個(gè)或多個(gè)特異組織中；或者其中所述注射B內(nèi)注射、胸內(nèi)注射、肋外注射、 內(nèi)注射或顱內(nèi)注射。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所述注射是血管內(nèi)注射，且當(dāng)所述動(dòng)物是動(dòng)物胎兒時(shí)，注射是全身注射且所述載體經(jīng)卵黃嚢血管靶向；或者，當(dāng)所述動(dòng)物是新生動(dòng)物時(shí)，所述注射經(jīng)淺顳靜脈。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒載體包括組織靶向的 糖蛋白外殼。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)特異組織是肝 臟、心臟、腎臟、肌肉、腦、曱狀腺、肺、胰腺、血液、脾臟、胸腺、 睪丸、消化道、氣管、血管系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)或眼組織。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是疾病和/或包 含基因敲除的模型；或其中所述動(dòng)物在肺、肝、關(guān)節(jié)、肌肉、心臟、 腦或其他器官中具有炎癥或可使其具有炎癥。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述哺乳動(dòng)物體是嚙齒動(dòng)物或靈長類。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述哺乳動(dòng)物體是小鼠、大鼠、兔或小 型豬。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在給予所述化合物之前誘導(dǎo)所 述病變。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述病變通過化學(xué)方式和/或手術(shù)誘導(dǎo)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其中在誘導(dǎo)所述病變之前和/或之后檢測所述報(bào)告基因的表達(dá)。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述報(bào)告基因是熒光素酶基因。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述響應(yīng)病變或治療的遺傳元 件是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)病變是肺部或肝部病變， 或者肌肉和/或周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述肺部病變選自呼吸道感染、肺纖維 化(PF)、哮喘和慢性阻塞性肺部疾病(COPD);或所述肝部病變選自 肝纖維化、肝硬化和丙型肝炎感染；或者所述肌肉和/或所述神經(jīng)系統(tǒng) 疾病為選自迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良(DMD)、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良(MD)、 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND)、阿爾茨海默氏病(AD)和亨廷頓氏病(HD) 的疾病。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述呼吸道感染可由呼吸道合胞病毒 (RSV)、副流感病毒(PIV)或流感病毒(IV)引起。
22. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述病變包括炎癥，且所述生 物發(fā)光測定測定所述炎癥對(duì)給予所述化合物的應(yīng)答一一若存在這一應(yīng) 答。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述炎癥包括肺、肝、關(guān)節(jié)、肌肉、心臟、腦或其他器官中的炎癥。
24. 非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于確定化合物是否會(huì)調(diào)節(jié)生物發(fā)光報(bào)告基因的表達(dá) 的用途，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新生時(shí)用栽體對(duì) 其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成，所述栽體含有與響應(yīng)病變 或治療的遺傳元件有效連接的所述報(bào)告基因，方式是測定所述化合物 對(duì)所述報(bào)告基因在所述特異組織中的表達(dá)的效果_一若存在這一效 果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基因產(chǎn)物的活性造成的動(dòng) 物生物發(fā)光。
25. —種評(píng)估化合物的代謝和/或毒性的方法，包括(a)將所述化合物給予非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其 尚未出生時(shí)或新生時(shí)用載體對(duì)其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn) 導(dǎo)生成，所述載體含有與響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因；和 (b)測定所述化合物對(duì)所述報(bào)告基因在所述特異組織中表達(dá)的效果一 一若存在這一效果，所述測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基因 產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述載體是病毒載體。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述病毒載體是慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體。
28. 根據(jù)前述權(quán)利要求25-27的方法，其中用所述載體對(duì)所述尚未出生時(shí)或 新生時(shí)的動(dòng)物進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)包括(a) 獲得含有與響應(yīng)藥物代謝和/或毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光凈艮告基因的載體；并(b) 將所述載體送遞到動(dòng)物胎兒或新生動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)選定組織中。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中送遞所述栽體通過將所述載體靶向到所 述動(dòng)物的 一個(gè)或多個(gè)特異性組織的注射。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中所述注射是全身性的，但所述載體被送 遞到 一個(gè)或多個(gè)特異組織。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29或30的方法，其中所述注射是血管內(nèi)注射，且當(dāng)所 述動(dòng)物是動(dòng)物胎兒時(shí)，注射是全身注射且所述載體經(jīng)卵黃嚢血管靶向； 或者，當(dāng)所述動(dòng)物是新生動(dòng)物時(shí)，所述注射經(jīng)淺顳靜脈。
32. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)特異組織是肝 臟組織。
33. —種評(píng)估化合物的代謝和/或毒性的方法，包括(a)將所述化合物給予非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其 尚未出生時(shí)或新生時(shí)引入轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生成，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有與響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因；和基因表達(dá)的效果^"一若存在這一i二，所》i測定包括檢測由于所述報(bào)告基因的基因產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述細(xì)胞通過以下方法獲得(a) 獲得含有與響應(yīng)藥物代謝和/或毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因的栽體；并(b) 將所述載體送遞到所述細(xì)胞。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33或34的方法，其中所述細(xì)胞來自動(dòng)物胎兒、新生動(dòng) 物或者成年動(dòng)物。
36. 根據(jù)權(quán)利要求33-35任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是與它們將被引入的 動(dòng)物同一物種的動(dòng)物的細(xì)胞，或者所述細(xì)胞被引入與它們自身起源的 組織和器官相同的組織和器官；或者所述細(xì)胞是人源的并^皮引入相容 的非人動(dòng)物中。
37. 根據(jù)權(quán)利要求33-36任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是肝細(xì)胞。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述肝細(xì)胞被引入所述動(dòng)物的肝臟中。
39. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述哺乳動(dòng)物體是嚙齒動(dòng)物或靈長類。
41. 根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述哺乳動(dòng)物體是小鼠、大鼠、兔或小 型豬。
42. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在給予所述化合物之前和之后 檢測所述報(bào)告基因的表達(dá)。
43. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述報(bào)告基因是熒光素酶基因。
44. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒 性的遺傳元件是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述啟動(dòng)子是細(xì)胞色素P450 (CYP450) 啟動(dòng)子或與細(xì)胞色素P450活性有關(guān)的基因的啟動(dòng)子。
46. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是人源化模型 和/或疾病模型和/或包括基因敲除的模型。
47.的用途^所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新生^用載體對(duì) 其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成，所述載體^^有與響應(yīng)藥物 代謝和/或藥物毒性的遺傳元件有效連接的所述報(bào)告基因的載體進(jìn)行 的，方式是測定所述化合物對(duì)所述報(bào)告基因在所述特異組織中的表達(dá) 的效果一一若存在這一效果，所述測定包括檢測由于所述才艮告基因的 基因產(chǎn)物的活性造成的動(dòng)物生物發(fā)光。
48.非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于確定化合物是否會(huì)調(diào)節(jié)生物發(fā)光報(bào)告基因的表達(dá) 的用途，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新生時(shí)引入轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞生成，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有與響應(yīng)藥物代謝和/或藥物毒性的遺 傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因，方式是測定所述化合物對(duì)所述 報(bào)告基因在所述特異組織中的表達(dá)的效果一_若存在這一效果，所述
全文摘要
本發(fā)明涉及通過一種由發(fā)明人建立的名為“體轉(zhuǎn)基因生物成像”的新技術(shù)在非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中建立病變模型、篩選調(diào)控這些疾病的化合物以及檢驗(yàn)藥物代謝和毒性。因此本發(fā)明提供一種用于確定報(bào)告基因的表達(dá)是否受到化合物調(diào)節(jié)的方法或者一種評(píng)估化合物的代謝和/或毒性的方法，所述方法包括(a)將所述化合物給予非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過在其尚未出生時(shí)或新生時(shí)用載體對(duì)其一個(gè)或多個(gè)特異組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)生成，所述載體含有與響應(yīng)病變或治療的遺傳元件或響應(yīng)藥物代謝和/或毒性的遺傳元件有效連接的生物發(fā)光報(bào)告基因；和(b)測定所述化合物是否對(duì)所述報(bào)告基因在所述一個(gè)或多個(gè)特異組織中的表達(dá)有效果，和/或測定任何這種效果的程度，所述測定包括檢測因所述報(bào)告基因的基因產(chǎn)物活性導(dǎo)致的動(dòng)物生物發(fā)光。在某些實(shí)施方案中，用本發(fā)明載體預(yù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞也可被引入所述動(dòng)物中，而不直接進(jìn)行所述載體的送遞。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101680032SQ200880015112
公開日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日
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