專利名稱：治療HPV感染的dsRNA組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸(dsRNA)及其在介導(dǎo)RNA干擾以治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染介導(dǎo)的病理過(guò)程(例如子宮頸癌、肛門癌、HPV相關(guān)癌前病變和生殖器疣)中的用途。

背景技術(shù)：
乳頭瘤病毒(PV)為誘導(dǎo)上皮過(guò)度增生性病變的無(wú)包膜DNA病毒。乳頭瘤病毒廣泛存在于自然界，并已在高等脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。特別是來(lái)自人、牛、兔、馬和狗的病毒已被表征。1993年，棉尾兔乳頭瘤病毒(CRPV)成為第一種被描述的乳頭瘤病毒。從此以后，棉尾兔乳頭瘤病毒和1型牛乳頭瘤病毒(BPV-1)一直被用作研究乳頭瘤病毒的實(shí)驗(yàn)原型。大多數(shù)動(dòng)物乳頭瘤病毒與單純的上皮增生性病變相關(guān)，并且動(dòng)物中的大多數(shù)病變是皮膚病變。在人類中，已經(jīng)鑒定出多于100種的乳頭瘤病毒(HPV)，并根據(jù)感染部位(皮膚上皮和粘膜上皮(口腔和生殖器粘膜))對(duì)其進(jìn)行了分類。皮膚相關(guān)疾病包括扁平疣和跖疣等。粘膜相關(guān)疾病包括喉乳頭狀瘤和肛門生殖器疾病，包括宮頸癌(Fields，1996，Virology，3rd ed.Lippincott-Raven Pub.，Philadelphia，N.Y.；Bernard，H-U.，2005.J.Clin.Virol.328S1-S6)。
人乳頭瘤病毒(HPV)感染是世界上最普遍的性傳播感染之一。大部分的HPV感染是無(wú)害的。一些類型的HPV會(huì)引起生殖器疣，表現(xiàn)為在男性和女性的生殖器區(qū)域(包括陰道、子宮頸、外陰(陰道之外的區(qū)域)、陰莖和直腸)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)腫塊。許多感染HPV的人沒(méi)有癥狀。
盡管大多數(shù)HPV亞型只造成良性病變，但是某些亞型被認(rèn)為是高危的，并會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的病變，例如子宮頸和肛門發(fā)育異常。15種類型的HPV近期被劃分為高危類型(Munoz，N.等人2003.N.Engl.J.Med.348(6)518-27)。這些高危亞型具有遺傳多樣性，主要的病毒衣殼蛋白的L1基因證明有＞10％的序列差異(Bernard，H-U.，2005.J.Clin.Virol.328S 1-S6)。
攜帶HPV感染的女性通常無(wú)癥狀，只有在子宮頸篩查之后才能發(fā)現(xiàn)她們的病變。子宮頸篩查主要采用巴氏試驗(yàn)(Pap test)進(jìn)行。巴氏試驗(yàn)是用來(lái)識(shí)別異常子宮頸細(xì)胞的子宮頸組織的組織學(xué)評(píng)價(jià)。作為巴氏試驗(yàn)的一部分，HPV感染的存在和具體的亞型可以使用基于核酸的分析來(lái)確定，例如PCR或商業(yè)化的雜交捕獲II技術(shù)(HCII)(Digene，Gaithersburg，馬里蘭，美國(guó))。
如果鑒別到異常的子宮頸細(xì)胞，則將其劃分為不同等級(jí)具有較低的發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的LSIL(低等級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變)(包括稱為CIN-1的細(xì)胞(“子宮頸上皮內(nèi)瘤-1”))；或具有較高的發(fā)展成癌癥的可能性的HSIL(高等級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變)，包括稱為CIN-2和CIN-3的細(xì)胞。
大約85％的低等級(jí)病變會(huì)自發(fā)恢復(fù)，其余的或者維持不變、或者發(fā)展成為高等級(jí)病變。如果不進(jìn)行治療的話，大約10％的高等級(jí)病變預(yù)期會(huì)轉(zhuǎn)化成為癌組織。盡管其它的幾種轉(zhuǎn)化HPV亞型也與發(fā)育異常相關(guān)，但是HPV-16和HPV-18最經(jīng)常與發(fā)育異常相關(guān)。
近期研究顯示多達(dá)89％的HIV陽(yáng)性的男性同性戀者有可能感染這些高危HPV亞型。HIV陽(yáng)性患者還更有可能同時(shí)感染多種亞型的HPV，這與高危發(fā)育異常進(jìn)展有關(guān)。
過(guò)去20年的證據(jù)使人們普遍接受這樣的觀點(diǎn)盡管感染HPV并不一定會(huì)導(dǎo)致子宮頸癌，但是子宮頸癌的發(fā)展是由HPV感染引起的。子宮頸癌中存在HPV的幾率估計(jì)為99.7％。與子宮頸癌一樣，肛門癌也被認(rèn)為在HPV感染與發(fā)展成為肛門發(fā)育異常以及肛門癌之間具有類似的關(guān)聯(lián)。在一項(xiàng)對(duì)HIV陰性的肛門癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)88％的肛門癌患者感染HPV。美國(guó)2003年估計(jì)發(fā)生子宮頸癌新病例12200例，子宮頸癌死亡4100例；肛門癌新病例4000例，肛門癌死亡500例。盡管在過(guò)去的40年中，由于廣泛開(kāi)展了預(yù)防性的篩查，使得子宮頸癌的發(fā)病率已有所下降，但是肛門癌的發(fā)病率卻在上升。肛門癌發(fā)病率的上升可能部分是由于HIV感染，因?yàn)镠IV陽(yáng)性的患者相比普通人群具有較高的肛門癌發(fā)病率。肛門癌在普通人群中的發(fā)病率是每100000人中發(fā)病0.9例，而肛門癌在男性同性戀人群中的發(fā)病率是每100000人中發(fā)病35例，在HIV陽(yáng)性的男性同性戀人群中的發(fā)病率是每100000人中發(fā)病70-100例。事實(shí)上，由于HIV感染的患者中肛門發(fā)育異常非常普遍并且發(fā)展為肛門癌的趨勢(shì)也逐漸增長(zhǎng)，《2003USPHA/IDSA Guidelines for theTreatment of Opportunistic Infections in HIV Positive Patients》中將會(huì)包括針對(duì)那些診斷為肛門發(fā)育異常的患者的治療方針。
目前尚沒(méi)有已知的治愈HPV感染的方法。現(xiàn)有一些治療生殖器疣的方法，盡管生殖器疣經(jīng)常會(huì)不治而愈。該治療方法取決于諸如生殖器疣的大小和位置等因素。治療包括使用咪喹莫特乳膏、20％鬼臼樹(shù)脂抗有絲分裂溶液、0.5％普達(dá)非洛溶液、5％5-氟尿嘧啶乳膏和三氯乙酸。孕婦不推薦使用鬼臼樹(shù)脂或普達(dá)非洛，因?yàn)樗鼈儽黄つw吸收，有可能導(dǎo)致出生缺陷。孕婦也不推薦使用5-氟尿嘧啶乳膏。可以通過(guò)冷凍(冷凍手術(shù))、灼燒(電灼術(shù))或激光治療來(lái)物理去除小的生殖器疣。對(duì)其它治療沒(méi)有響應(yīng)的大的疣可能只能通過(guò)手術(shù)切除。已知生殖器疣在物理切除之后還會(huì)復(fù)發(fā)；在這樣的情況下，曾經(jīng)直接向這些疣注射α干擾素。但是，α干擾素是昂貴的，并且其使用也并沒(méi)有降低生殖器疣的復(fù)發(fā)率。
因此，需要有效的HPV治療來(lái)滿足人們的需要。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了能夠滿足這種需要的化合物，并且提供了其它的益處。
近期，雙鏈RNA分子(dsRNA)已顯示在被稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守的調(diào)節(jié)機(jī)制中能夠阻斷基因的表達(dá)。WO99/32619(Fire等人)公開(kāi)了使用至少25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的dsRNA來(lái)抑制秀麗線蟲(C.elegans)中的基因表達(dá)。dsRNA也已顯示出能夠降解其它生物體中的靶RNA，包括植物(參見(jiàn)例如WO 99/53050，Waterhouse等人；和WO 99/61631，Heifetz等人)、果蠅(參見(jiàn)例如Yang，D.，等人，Curr.Biol.(2000)101191-1200)和哺乳動(dòng)物(參見(jiàn)WO 00/44895，Limmer；和DE 10100586.5，Kreutzer等人)。這種天然機(jī)制已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)用于治療由異常或不希望的基因調(diào)控引起的病癥的新型藥物制劑的焦點(diǎn)。
PCT公布WO 03/008573公開(kāi)了先前的開(kāi)發(fā)用于治療由HPV感染引起的疾病的基于核酸的藥物的嘗試。該公布報(bào)告了使用針對(duì)HPV mRNA的兩種siRNA來(lái)抑制基于細(xì)胞的系統(tǒng)中的HPV復(fù)制；相關(guān)公布見(jiàn)Jiang，M.等人2005.N.A.R.33(18)el51。
盡管在RNAi領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)步，在治療HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程中也取得了進(jìn)步，但是仍然需要能夠抑制HPV感染進(jìn)展以及能夠治療HPV感染相關(guān)疾病的制劑。該挑戰(zhàn)是非常嚴(yán)峻的，因?yàn)檫@樣的制劑必須設(shè)計(jì)成能夠抑制顯示出非常大的基因型多樣性的所有高危HPV亞型。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)來(lái)沉默化(silence)對(duì)HPV繁殖關(guān)鍵的基因表達(dá)，提供了解決治療HPV感染相關(guān)疾病中的問(wèn)題的方案。E6AP是人宿主種類中HPV增殖所需的保守基因。
本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及使用這樣的dsRNA抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中E6AP基因表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還提供了治療由E6AP基因的表達(dá)和HPV感染引起的病理狀態(tài)和疾病(例如子宮頸癌和生殖器疣)的組合物和方法。本發(fā)明的dsRNA包含RNA鏈(反義鏈)，該RNA鏈具有小于30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度(通常為19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)的區(qū)域，該區(qū)域與E6AP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分基本互補(bǔ)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制E6AP基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子。該dsRNA包含至少兩種相互互補(bǔ)的序列。dsRNA包括包含第一序列的有義鏈和包含第二序列的反義鏈。反義鏈包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的核苷酸序列，并且互補(bǔ)區(qū)具有小于30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，通常為19-24個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。一旦與表達(dá)E6AP的細(xì)胞相接觸，dsRNA可至少40％地抑制E6AP基因表達(dá)。
例如，本發(fā)明的dsRNA分子可以包含選自表1中有義序列的dsRNA的第一序列以及選自表1中反義序列的第二序列。本發(fā)明的dsRNA分子可以包含天然存在的核苷酸，或者可以包含至少一種修飾的核苷酸，例如2’-O-甲基修飾的核苷酸、包含5’-硫代磷酸基團(tuán)的核苷酸和與膽甾醇衍生物連接的末端核苷酸?？商娲?，修飾的核苷酸可以選自2’-脫氧-2’-氟修飾的核苷酸、2’-脫氧修飾的核苷酸、鎖定核苷酸、脫堿基核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然堿基的核苷酸。一般而言，這樣的修飾的序列將會(huì)基于選自表1中有義序列的所述dsRNA的第一序列和選自表1中反義序列的第二序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的一種dsRNA的細(xì)胞。該細(xì)胞一般為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人類細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制生物體(一般為人類受試者)中E6AP基因表達(dá)的藥物組合物，其包含一種或多種本發(fā)明的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體或遞送載體(delivery vehicle)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞中E6AP基因表達(dá)的方法，包括下述步驟 (a)將雙鏈核糖核酸(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，其中，該dsRNA包含至少兩種相互互補(bǔ)的序列。該dsRNA包括包含第一序列的有義鏈和包含第二序列的反義鏈。反義鏈包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，其中，互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸、一般為19-24個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，其中，一旦與表達(dá)所述E6AP的細(xì)胞相接觸，dsRNA會(huì)抑制E6AP基因的表達(dá)至少40％；和 (b)維持步驟(a)中產(chǎn)生的細(xì)胞一段足以獲得E6AP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解的時(shí)間，從而抑制細(xì)胞中E6AP基因的表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或控制由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程(例如癌癥或生殖器疣)的方法，包括給予需要這種治療、預(yù)防或控制的患者治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明的一種或多種dsRNA。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞中E6AP基因表達(dá)的載體，該載體包含與編碼本發(fā)明的一種dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列可操作地連接的調(diào)控序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含抑制細(xì)胞中E6AP基因表達(dá)的載體的細(xì)胞。該載體包含與編碼本發(fā)明的一種dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列可操作地連接的調(diào)控序列。



無(wú)附圖。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明通過(guò)使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)來(lái)沉默化對(duì)HPV增殖關(guān)鍵的基因表達(dá)，提供了解決治療HPV感染相關(guān)疾病中的問(wèn)題的方案。特別地，本發(fā)明的dsRNA沉默化人E6AP基因，一種人宿主種類中HPV增殖所需的保守基因。在此，這些基因有時(shí)被統(tǒng)稱為HPV靶基因。
本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及使用dsRNA來(lái)抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中E6AP基因表達(dá)的組合物和方法。本發(fā)明還提供了使用dsRNA來(lái)治療哺乳動(dòng)物中由E6AP基因的表達(dá)和HPV感染引起的病理狀態(tài)和疾病的組合物和方法。dsRNA通過(guò)被稱為RNA干擾(RNAi)的過(guò)程引導(dǎo)了序列特異性的mRNA降解。
本發(fā)明的dsRNA包含RNA鏈(反義鏈)，該RNA鏈包含小于30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(通常為19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)的區(qū)域，該區(qū)域與HPV靶mRNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分基本互補(bǔ)。這些dsRNA的使用使得哺乳動(dòng)物中與HPV復(fù)制和/或維持有關(guān)的基因的mRNA能夠發(fā)生靶向降解。使用基于細(xì)胞和基于動(dòng)物的分析，本發(fā)明人已經(jīng)證明極低劑量的這些dsRNA可以特異性地以及高效地介導(dǎo)RNAi，因而顯著抑制E6AP基因的表達(dá)。因此，通過(guò)靶向HPV生活周期中涉及的宿主因子基因，包含這些dsRNA的本發(fā)明的方法和組合物可用于治療由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程。
HPV靶標(biāo)的描述HPV E1和E6和人E6AP 人宿主的細(xì)胞遍在蛋白連接酶E6AP通過(guò)其與病毒E6蛋白質(zhì)的復(fù)合物參與HPV、特別是整合型(非附加型)HPV的復(fù)制。E6與許多調(diào)控細(xì)胞增殖途徑的蛋白質(zhì)相結(jié)合，并通常引起它們的降解(Chakrabarti，O.和Krishna，S.2003.J.Biosci.28337-348)。E6與E6AP復(fù)合，以靶向腫瘤抑制物p53，從而實(shí)現(xiàn)降解(Scheffner，M.等人，1990.Cell.631129-1136；和Scheffner，M.等人，1993.Cell75495-505)。通過(guò)使p53失活，病毒不但阻止了p53介導(dǎo)的感染細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(Chakrabarti和Krishna，2003)以及有利于可被p53阻斷的其DNA的復(fù)制(Lepik，D.等人1998.J.Virol.726822-6831)，而且通過(guò)降低p53介導(dǎo)的基因組完整性的控制而有利于腫瘤發(fā)生(Thomas，M.等人1999.Oncogene.187690-7700)。
E1和E6都已經(jīng)在Fundamental Virology，3rd ed.Bernard N.Fields，David M.Knipe，和Peter M.Howley，eds.Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996的第947-978頁(yè)的Peter M.Howley的“PapillomaviridaeThe Viruses and Their Replication”中進(jìn)行了詳細(xì)的描述。E1ORF編碼質(zhì)粒DNA復(fù)制所必需的68-76kD的蛋白質(zhì)。全長(zhǎng)E1產(chǎn)物為磷酸化的核蛋白，與BPV1的LCR中的復(fù)制起點(diǎn)相結(jié)合。E1還顯示與ATP相結(jié)合，并在體外與被稱為E2轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白(E2TA)的全長(zhǎng)E2蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而提高了病毒的轉(zhuǎn)錄。與E2的結(jié)合還加強(qiáng)了E1對(duì)DNA復(fù)制起點(diǎn)的親和力。在HPV-16中，E1對(duì)無(wú)限增殖化具有間接的影響。
E6是小的堿性細(xì)胞轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)(例如HPV16E6包含151個(gè)氨基酸)，大約為16-19kD，位于核基質(zhì)和非核膜部分。E6基因產(chǎn)物包含4個(gè)Cys-X-X-Cys基序，說(shuō)明有可能與鋅結(jié)合；它還可以作為核酸結(jié)合蛋白。在高危HPV(例如HPV-16)中，E6和E7蛋白質(zhì)是使它們的宿主——鱗狀上皮細(xì)胞無(wú)限增殖化的必要和充分條件。高危HPV的E6基因產(chǎn)物顯示與p53相復(fù)合，并促進(jìn)其降解。
下述的具體描述公開(kāi)了如何制備和使用dsRNA和包含dsRNA的組合物來(lái)抑制HPV靶基因的表達(dá)，以及用于治療由HPV感染引起的疾病和病癥(例如子宮頸癌和生殖器疣)的組合物和方法。本發(fā)明的藥物組合物包含具有反義鏈的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體，該反義鏈包含小于30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(一般為19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)的互補(bǔ)區(qū)，該互補(bǔ)區(qū)與HPV靶基因的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分基本互補(bǔ)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案在藥物制劑中聯(lián)合使用多于一種的dsRNA(可選地，靶向不同的HPV靶基因)。
因此，本發(fā)明的某些方面提供了包含本發(fā)明的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物、使用該組合物抑制一種或多種HPV靶基因表達(dá)的方法以及使用該藥物組合物治療由HPV感染引起的疾病的方法。
I.定義 為了方便起見(jiàn)，下面提供了說(shuō)明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求書中使用的某些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)的含義。如果在說(shuō)明書的其它部分使用的術(shù)語(yǔ)與此部分提供的定義存在明顯區(qū)別，以此部分的定義為準(zhǔn)。
每個(gè)“G”、“C”、“A”和“U”一般分別代表包含作為堿基的鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。但是，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)“核糖核苷酸”或“核苷酸”還可指如下文進(jìn)一步詳述的修飾的核苷酸，或者替代部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分替代，而不會(huì)顯著改變包含帶有這種替代部分的核苷酸的寡核苷酸的堿基配對(duì)性質(zhì)。例如，非限制性地，包含肌苷作為其堿基的核苷酸可以與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸堿基配對(duì)。因此，包含尿嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在本發(fā)明的核苷酸序列中被包含例如肌苷的核苷酸替代。包含這樣的替代部分的序列是本發(fā)明的實(shí)施方案。
此處所使用的“E6AP”是指遍在蛋白連接酶E3A(ube3A，還被稱為E6相關(guān)蛋白質(zhì)或E6AP)基因或蛋白質(zhì)。代表不同同工型的E6AP的人mRNA序列以GenBank登錄號(hào)NM 130838.1、NM 130839.1和NM 000462.2提供。
此處所使用的“E1”是指16型人乳頭瘤病毒(HPV 16)E1基因(GenBank登錄號(hào)NC 001526，核苷酸865至2813)。此處所使用的“E6”是指16型人乳頭瘤病毒(HPV16)E6基因(GenBank登錄號(hào)NC 001526，核苷酸65至559)。E1和E6基因的許多變體也已經(jīng)被公開(kāi)。意在使用“E1”和“E6”涵蓋這些和將來(lái)發(fā)表的E1和E6基因變體，除非文中特別排除。
此處所使用的“靶序列”是指在一種HPV靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的相鄰部分，包括作為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA加工產(chǎn)物的mRNA。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“包含序列的鏈”是指包含由使用標(biāo)準(zhǔn)核苷酸命名法表示的序列所描述的核苷酸鏈的寡核苷酸。
當(dāng)用于描述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列的關(guān)系時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，除非特別說(shuō)明，此處所使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交和形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的能力。這樣的條件例如可以是嚴(yán)格性條件，該嚴(yán)格性條件可以包括400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，在50℃或70℃下12-16小時(shí)，然后進(jìn)行洗滌。也可以使用其它的條件，例如生物體內(nèi)可能遇到的生理相關(guān)條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)雜交核苷酸的最終應(yīng)用能夠確定測(cè)試兩種序列互補(bǔ)性的最佳條件設(shè)置。
這包括將包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度內(nèi)進(jìn)行堿基配對(duì)。這些序列可被稱為相對(duì)于彼此“完全互補(bǔ)的”。但是，當(dāng)此處稱第一序列相對(duì)于第二序列“基本互補(bǔ)”時(shí)，這兩種序列可以為完全互補(bǔ)的，或者在雜交之后，它們可以形成一個(gè)或多個(gè)、但是通常不多于4個(gè)、3個(gè)或2個(gè)錯(cuò)配的堿基對(duì)，同時(shí)保持在與它們的最終應(yīng)用最相關(guān)的條件下雜交的能力。但是，當(dāng)兩種寡核苷酸被設(shè)計(jì)為在雜交之后形成一個(gè)或多個(gè)單鏈突出端(overhang)時(shí)，這樣的突出端在確定互補(bǔ)性時(shí)不應(yīng)該被認(rèn)為是錯(cuò)配。例如，包含21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的一種寡核苷酸和23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的另一種寡核苷酸的dsRNA，其中較長(zhǎng)的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補(bǔ)的21個(gè)核苷酸的序列，在本發(fā)明中也可以稱為“完全互補(bǔ)的”。
此處所使用的“互補(bǔ)的”序列還可以包括非Watson-Crick堿基對(duì)和/或由非天然和修飾的核苷酸形成的堿基對(duì)，或者完全由所述堿基對(duì)形成，只要上述對(duì)于其雜交能力的要求能夠滿足即可。
此處的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”、“完全互補(bǔ)的”和“基本互補(bǔ)的”可根據(jù)dsRNA的有義鏈和反義鏈之間的堿基配對(duì)或dsRNA的反義鏈和靶序列之間的堿基配對(duì)進(jìn)行使用，可根據(jù)所使用的上下文進(jìn)行理解。
此處所使用的與信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本互補(bǔ)的”多核苷酸是指與興趣mRNA(例如編碼E6AP)的相鄰部分基本互補(bǔ)的多核苷酸。例如，如果該序列與編碼E6AP的mRNA的非中斷部分基本互補(bǔ)的話，多核苷酸與E6AP mRNA的至少一部分互補(bǔ)。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“雙鏈RNA”或“dsRNA”是指核糖核酸分子復(fù)合物，其具有包含兩條反平行的并且如上定義的基本互補(bǔ)的核酸鏈的雙鏈體結(jié)構(gòu)。形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以為一個(gè)較大RNA分子的不同部分，或者它們也可以為單獨(dú)的RNA分子。如果是單獨(dú)的RNA分子，這樣的dsRNA在文獻(xiàn)中通常被稱為siRNA(“小干擾RNA”)。如果兩條鏈?zhǔn)且粋€(gè)較大分子的部分，并因此被位于一條鏈的3’末端和相對(duì)另一條鏈的5’末端之間的非間斷核苷酸鏈連接，形成雙鏈體結(jié)構(gòu)時(shí)，連接RNA鏈被稱為“發(fā)夾環(huán)”、“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”。當(dāng)兩條鏈通過(guò)除了位于一條鏈的3’末端和相對(duì)另一條鏈的5’末端之間的非間斷核苷酸鏈之外的手段共價(jià)連接而形成雙鏈體結(jié)構(gòu)時(shí)，該連接結(jié)構(gòu)被稱為“連接體”。RNA鏈可以包含相同或不同數(shù)目的核苷酸。堿基對(duì)的最大數(shù)目為dsRNA中最短鏈的核苷酸數(shù)目減去雙鏈體中存在的任何突出端。除了雙鏈體結(jié)構(gòu)之外，dsRNA可以包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸突出端。此外，本說(shuō)明書使用的“dsRNA”可以包括對(duì)于核糖核苷酸、核苷間聯(lián)接、端基、帽(cap)和偶聯(lián)部分的化學(xué)修飾，包括在多個(gè)核苷酸處的實(shí)質(zhì)修飾并且包括此處所公開(kāi)的或本領(lǐng)域已知的所有類型的修飾。在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，“dsRNA”包括用于siRNA類型分子中的任何這樣的修飾。
此處所使用的“核苷酸突出端”是指未配對(duì)的核苷酸，或者是指當(dāng)dsRNA中一條鏈的3’末端超出另一條鏈的5’末端伸長(zhǎng)或相反的情況下從dsRNA雙鏈體結(jié)構(gòu)中突出的核苷酸?！扳g”或“平端”是指在dsRNA的末端沒(méi)有未配對(duì)的核苷酸，即不存在核苷酸突出端?！捌蕉恕眃sRNA為在整個(gè)長(zhǎng)度中均為雙鏈的dsRNA，即分子的任一末端都不存在核苷酸突出端。為了清楚起見(jiàn)，在確定siRNA是具有突出端還是為平端時(shí)，不考慮與siRNA的3’末端或5’末端相連的化學(xué)帽或非核苷酸化學(xué)部分。
術(shù)語(yǔ)“反義鏈”是指包含與靶序列基本互補(bǔ)的區(qū)域的dsRNA的鏈。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)區(qū)”是指與此處所限定的序列(例如靶序列)基本互補(bǔ)的反義鏈上的區(qū)域。當(dāng)互補(bǔ)區(qū)與靶序列不完全互補(bǔ)時(shí)，錯(cuò)配出現(xiàn)在末端區(qū)域是最可以接受的，如果出現(xiàn)錯(cuò)配的話，通常出現(xiàn)在一個(gè)末端區(qū)域或兩個(gè)末端區(qū)域中，例如5’和/或3’末端的6、5、4、3或2個(gè)核苷酸之內(nèi)。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“有義鏈”是指包含與反義鏈區(qū)域基本互補(bǔ)的區(qū)域的dsRNA鏈。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，當(dāng)用于dsRNA時(shí)，“導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)”是指有利于向細(xì)胞內(nèi)的攝取或吸收。dsRNA的吸收或攝取可通過(guò)未輔助的擴(kuò)散性或主動(dòng)細(xì)胞過(guò)程進(jìn)行，或者通過(guò)輔助劑或裝置進(jìn)行。該術(shù)語(yǔ)的含義不局限于體外細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞是活生物體的部分時(shí)，dsRNA也可“被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)”。在這樣的情況下，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)將包括運(yùn)送到生物體中。例如，對(duì)于體內(nèi)遞送，可將dsRNA注射到組織部位或系統(tǒng)施用。在體外導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)包括本領(lǐng)域已知的方法，例如電穿孔和脂轉(zhuǎn)染。
用于HPV靶基因時(shí)，此處的術(shù)語(yǔ)“沉默化”和“抑制表達(dá)”是指至少部分抑制HPV靶基因的表達(dá)，表現(xiàn)為與第二細(xì)胞或細(xì)胞組相比，由可從第一細(xì)胞或細(xì)胞組中分離出來(lái)的HPV靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量降低，在該第一細(xì)胞或細(xì)胞組中，HPV靶基因被轉(zhuǎn)錄，并且該第一細(xì)胞或細(xì)胞組經(jīng)過(guò)處理，以使得HPV靶基因的表達(dá)受到抑制，而所述第二細(xì)胞或細(xì)胞組與所述第一細(xì)胞或細(xì)胞組基本相同，但是未經(jīng)這樣的處理(對(duì)照細(xì)胞)。抑制的程度通常表示為 (對(duì)照細(xì)胞中的mRNA)-(受處理細(xì)胞中的mRNA)·100％ (對(duì)照細(xì)胞中的mRNA) 可替代地，抑制的程度可以用與HPV靶基因轉(zhuǎn)錄功能上相關(guān)的參數(shù)的降低來(lái)表示，例如由細(xì)胞分泌的、HPV靶基因編碼的蛋白質(zhì)的量，或顯示某些表型例如細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的數(shù)量。原則上，HPV靶基因的沉默化可以在或者通過(guò)組成型或者通過(guò)基因工程表達(dá)靶標(biāo)的任何細(xì)胞中通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆治龃_定。但是，當(dāng)為了確定特定的dsRNA是否在某種程度上抑制HPV靶基因的表達(dá)而需要參考并因此包括在本發(fā)明中時(shí)，下述實(shí)施例中提供的分析可作為這樣的參考。
例如，在某些情況下，給予本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將抑制E6AP基因的表達(dá)至少大約20％、25％、35％或50％。在某些實(shí)施方案中，給予本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將抑制E6AP基因至少大約60％、70％或80％。在某些實(shí)施方案中，給予本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將抑制E6AP基因至少大約85％、90％或95％。表2給出了在體外試驗(yàn)中，使用不同濃度的不同E6AP dsRNA分子得到的寬范圍的轉(zhuǎn)錄抑制值。
在用于HPV感染時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療”等是指由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程的減輕或改善。這樣的描述包括使用本發(fā)明的治療劑來(lái)預(yù)防或防止HPV感染，以及由HPV感染引起的癥狀或病變的減輕。在本發(fā)明的內(nèi)容中，當(dāng)涉及下述其它任何狀況(除HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程以外)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“治療”等是指減輕或改善至少一種與這種狀況相關(guān)的癥狀，或者減緩或逆轉(zhuǎn)這種狀況的發(fā)展。
此處所使用的短語(yǔ)“治療有效量”和“預(yù)防有效量”是指在治療、預(yù)防或控制由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程或者由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程的明顯癥狀中提供治療益處的量。具體的治療有效量可由普通的醫(yī)師容易地進(jìn)行確定，并可根據(jù)本領(lǐng)域已知的因素進(jìn)行改變，例如由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程的類型、患者的病史和年齡、由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程的階段以及其它抗疾病藥劑的給藥。
此處所使用的“藥物組合物”包含藥理學(xué)上有效量的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。此處所使用的“藥理學(xué)上有效量”、“治療有效量”或簡(jiǎn)稱“有效量”是指能夠有效產(chǎn)生預(yù)期的藥理學(xué)、治療或預(yù)防結(jié)果的dsRNA的量。例如，如果在特定的臨床治療中，當(dāng)與疾病或病癥相關(guān)的可測(cè)量的參數(shù)至少降低25％才被認(rèn)為是有效時(shí)，那么，治療該疾病或病癥的藥物的治療有效量為實(shí)現(xiàn)該參數(shù)至少降低25％所需的量。
術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”是指用于給予治療劑的載體。這樣的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。該術(shù)語(yǔ)特別不包括細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)于口服給藥，藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣、磷酸鈉和碳酸鈣，以及乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸為合適的崩解劑。粘合劑可以包括淀粉和明膠，而如果存在潤(rùn)滑劑的話，一般為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。如果需要的話，片劑可由例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料包衣來(lái)延緩在胃腸道中的吸收。
此處所使用的“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”為已導(dǎo)入載體并可表達(dá)dsRNA分子的細(xì)胞。
II.雙鏈核糖核酸(dsRNA) 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制細(xì)胞或哺乳動(dòng)物中HPV靶基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中，該dsRNA包括包含與在表達(dá)HPV靶基因中形成的mRNA的至少一部分互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)的反義鏈，其中，該互補(bǔ)區(qū)小于30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，通常為19-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，其中，在與表達(dá)所述HPV靶基因的細(xì)胞相接觸之后，所述dsRNA抑制所述HPV靶基因的表達(dá)至少10％、25％或40％。
dsRNA包含足夠互補(bǔ)以雜交形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的兩條RNA鏈。dsRNA的一條鏈(反義鏈)包含與來(lái)自在表達(dá)HPV靶基因中形成的mRNA序列的靶序列基本互補(bǔ)、一般完全互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)，另一條鏈(有義鏈)包含與反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，因而在合適的條件下混合時(shí)，兩條鏈雜交并形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。一般而言，雙鏈體結(jié)構(gòu)為15至30個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度，更一般為28至25個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度，更一般為19至24個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度，最一般為19至21個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度。同樣地，與靶序列的互補(bǔ)區(qū)為15至30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，更一般為18至25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，更一般為19至24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，最一般為19至21個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。本發(fā)明的dsRNA還可以進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)單鏈核苷酸突出端?？梢允褂孟率霰绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)合成dsRNA，例如使用自動(dòng)DNA合成儀，例如Biosearch，Applied Biosystems，Inc.銷售的自動(dòng)DNA合成儀。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，HPV靶基因?yàn)槿薊6AP基因。在特定的實(shí)施方案中，dsRNA的反義鏈包含選自表1中有義序列的鏈，和選自表1中反義序列的第二序列。靶向表1提供的靶序列中的其它地方的替代反義試劑可以使用靶序列和側(cè)翼E6AP序列容易地確定。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，dsRNA包含選自表1中提供的序列的至少一種核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA包含選自該組的至少兩種序列，其中，所述至少兩種序列中的一種與所述至少兩種序列中的另一種互補(bǔ)，并且所述至少兩種序列中的一種與在表達(dá)E6AP基因中產(chǎn)生的mRNA的序列基本互補(bǔ)。一般而言，dsRNA包含兩種寡核苷酸，其中，一種寡核苷酸描述為表1中的有義鏈，第二種寡核苷酸描述為表1中的反義鏈。表1提供了每種優(yōu)選dsRNA的雙鏈體名稱和序列ID號(hào)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道包含20-23個(gè)、特別是21個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體結(jié)構(gòu)的dsRNA能夠特別有效地誘導(dǎo)RNA干擾(Elbashir等人，EMBO 2001，206877-6888)。但是，也有人發(fā)現(xiàn)更短或更長(zhǎng)的dsRNA也是有效的。在上述的實(shí)施方案中，由于表1中提供的寡核苷酸序列的性質(zhì)，本發(fā)明的dsRNA可以包含至少一條長(zhǎng)度最短為21nt的鏈?？梢院侠淼仡A(yù)期，表1中的一種序列只在其一端或兩端減去幾個(gè)核苷酸，包含該序列的較短dsRNA可與上述dsRNA類似地有效。因此，本發(fā)明涉及這樣的dsRNA其包含表1中一種序列的至少15、16、17、18、19、20或更多個(gè)相鄰核苷酸的部分序列，并且在下述FACS分析或其它分析中，抑制HPV靶基因表達(dá)的能力與包含全長(zhǎng)序列的dsRNA相比，抑制區(qū)別不超過(guò)5、10、15、20、25或30％。使用提供的參考序列和靶序列可以容易地制備在表1所提供的靶序列內(nèi)切割的其它dsRNA。
此外，表1提供的RNAi試劑能夠識(shí)別在對(duì)基于RNAi的切割敏感的相應(yīng)HPV靶mRNA中的位點(diǎn)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括在由本發(fā)明的一種試劑靶向的序列內(nèi)靶向的RNAi試劑。在此使用時(shí)，如果第二RNAi試劑在與第一RNAi試劑的反義鏈互補(bǔ)的mRNA內(nèi)的任意位置切割信使，則該第二RNAi試劑被稱為在第一RNAi試劑的序列內(nèi)靶向。這樣的第二試劑通常由來(lái)自表1中提供的一種序列的至少15個(gè)相鄰的核苷酸組成，這些核苷酸與來(lái)自與HPV靶基因中選擇的序列相鄰的區(qū)域的附加核苷酸序列連接。例如，SEQ IDNO1的最后15個(gè)核苷酸(減去添加的AA序列)加上后面的來(lái)自靶E6AP基因的6個(gè)核苷酸，產(chǎn)生了基于表1中提供的一種序列的包含21個(gè)核苷酸的單鏈試劑。
本發(fā)明的dsRNA可以包含一個(gè)或多個(gè)與靶序列的錯(cuò)配。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的dsRNA包含不多于3個(gè)錯(cuò)配。如果dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯(cuò)配的話，優(yōu)選該錯(cuò)配區(qū)域并非位于互補(bǔ)區(qū)的中心。如果dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯(cuò)配的話，優(yōu)選該錯(cuò)配局限于每個(gè)末端的5個(gè)核苷酸，例如互補(bǔ)區(qū)5’或3’端的5、4、3、2或1個(gè)核苷酸。例如，對(duì)于與HPV靶基因區(qū)域互補(bǔ)的23個(gè)核苷酸的dsRNA鏈而言，dsRNA通常在中心13個(gè)核苷酸內(nèi)不包含任何錯(cuò)配。本發(fā)明描述的方法可用于確定包含與靶序列的錯(cuò)配的dsRNA是否能夠有效地抑制HPV靶基因的表達(dá)。尤其是當(dāng)HPV靶基因中特定的互補(bǔ)區(qū)已知在病毒(如果是E1或E6的話)或人群(對(duì)于E6AP)中具有多態(tài)性序列差異時(shí)，考慮包含錯(cuò)配的dsRNA在抑制HPV靶基因表達(dá)中的有效性是非常重要的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA的至少一端具有包含1至4個(gè)、通常為1或2個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸突出端。具有至少一個(gè)核苷酸的突出端的dsRNA比它們的平端對(duì)應(yīng)物具有意想不到的好的抑制性能。此外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在僅一個(gè)核苷酸的突出端能夠加強(qiáng)dsRNA的干擾活性，而不會(huì)影響它的整體穩(wěn)定性。僅具有一個(gè)突出端的dsRNA證明在體內(nèi)，以及在多種細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基、血液和血清中特別穩(wěn)定和有效。一般而言，單鏈突出端位于反義鏈的3’末端或可選地位于有義鏈的3’末端。dsRNA還可以具有平端，通常位于反義鏈的5’末端。這樣的dsRNA具有提高的穩(wěn)定性和抑制活性，因而可以以低劑量-即小于每日5mg/kg接受者體重的劑量給藥。一般而言，dsRNA的反義鏈在3’末端具有核苷酸突出端，5’末端為平端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，突出端中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸由核苷硫代磷酸取代。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA經(jīng)化學(xué)修飾以提高其穩(wěn)定性。本發(fā)明的核酸可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)合成和/或修飾，例如在《Current protocols in nucleic acid chemistry》，Beaucage，S.L.等人(Edrs.)，John Wiley&Sons，Inc.，紐約，紐約州，美國(guó)中描述的那些方法，該文獻(xiàn)在此引入作為參考?；瘜W(xué)修飾可以包括但不限于2’修飾、寡核苷酸的糖或堿基的其它位點(diǎn)的修飾、非天然堿基引入寡核苷酸鏈、與配體或化學(xué)部分共價(jià)連接以及使用可選的連接(linkage)(例如硫代磷酸)來(lái)替代核苷酸之間的磷酸連接。還可以使用一種以上的這樣的修飾。
可以使用多種公知技術(shù)中的任一種實(shí)現(xiàn)兩個(gè)單獨(dú)的dsRNA鏈的化學(xué)連接，例如通過(guò)引入共價(jià)鍵、離子鍵或氫鍵；疏水相互作用、范得華力或堆積相互作用；通過(guò)金屬離子配位或通過(guò)使用嘌呤類似物。一般而言，可用于修飾dsRNA的化學(xué)基團(tuán)包括但不限于亞甲基藍(lán)；雙功能基團(tuán)，一般為雙-(2-氯乙基)胺；N-乙?；?N’-(對(duì)-乙醛?；郊柞；?胱胺；4-硫尿嘧啶；和補(bǔ)骨脂素。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體為六乙二醇連接體。在這種情況下，使用固相合成法生成dsRNA并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如Williams，D.J.，和K.B.Hall，Biochem.(1996)3514665-14670)引入六乙二醇連接體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，反義鏈的5’末端和有義鏈的3’末端通過(guò)六乙二醇連接體化學(xué)連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，dsRNA的至少一個(gè)核苷酸包含硫代磷酸或二硫代磷酸基團(tuán)。dsRNA末端的化學(xué)鍵通常由三螺旋鍵形成。表1提供了本發(fā)明的修飾的RNAi試劑的例子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩條單鏈中的一條或兩條的核苷酸可經(jīng)過(guò)修飾來(lái)預(yù)防或抑制細(xì)胞酶(例如但不限于某些核酸酶)的降解活性。用于抑制細(xì)胞酶降解核酸的活性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于2’-氨基修飾、2’-氨基糖修飾、2’-F糖修飾、2’-F修飾、2’-烷基糖修飾、不帶電的骨架的修飾、嗎啉代修飾、2’-O-甲基修飾和氨基磷酸酯(參考例如Wagner，Nat.Med.(1995)11116-8)。因而，dsRNA上核苷酸的至少一個(gè)2’-羥基基團(tuán)被化學(xué)基團(tuán)取代，通常被2’-氨基或2’-甲基取代。還可以修飾至少一個(gè)核苷酸來(lái)形成鎖定核苷酸。這樣的鎖定核苷酸包含連接核糖的2’-氧和核糖的4’-碳的亞甲基橋。包含鎖定核苷酸的寡核苷酸在Koshkin，A.A.，等人，Tetrahedron(1998)，543607-3630和Obika，S.等人，TetrahedronLett.(1998)，395401-5404中有描述。將鎖定核苷酸引入寡核苷酸中改善了對(duì)互補(bǔ)序列的親和力，并使解鏈溫度增加幾度(Braasch，D.A.和D.R.Corey，Chem.Biol(2001)，81-7)。
將配體與dsRNA偶聯(lián)能夠提高其細(xì)胞吸收，以及向特定組織的靶向，或者特定細(xì)胞類型(例如陰道上皮細(xì)胞)的攝取。在某些情況下，疏水配體與dsRNA偶聯(lián)，有利于直接透過(guò)細(xì)胞膜?？蛇x地，與dsRNA偶聯(lián)的配體為受體介導(dǎo)的胞吞作用的底物。這些方法已用于促進(jìn)反義寡核苷酸和dsRNA試劑的細(xì)胞透過(guò)。例如，膽固醇與不同的反義核苷酸偶聯(lián)之后，使得化合物與未偶聯(lián)的類似物相比具有顯著提高的活性。參考M.Manoharan Antisense&Nucleic Acid DrugDevelopment 2002，12，103。與寡核苷酸偶聯(lián)的其它親脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-雙-O-(十六烷基)甘油和甲醇。用于受體介導(dǎo)的胞吞作用的配體的一個(gè)例子是葉酸。葉酸通過(guò)葉酸-受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。攜帶葉酸的dsRNA化合物能夠通過(guò)葉酸-受體介導(dǎo)的胞吞作用有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。Li和合作者報(bào)告了葉酸與寡核苷酸的3’末端的連接使得寡核苷酸的細(xì)胞攝取增加了八倍。Li，S.；Deshmukh，H.M.；Huang，L.Pharm.Res.1998，75，1540。與寡核苷酸偶聯(lián)的其它配體包括聚乙二醇、碳水化合物組、交聯(lián)劑、卟啉配合物和遞送肽。
在某些情況下，陽(yáng)離子配體與寡核苷酸的偶聯(lián)導(dǎo)致提高的核酸酶抗性。代表性的陽(yáng)離子配體的例子包括丙基銨和二甲基丙基銨。有趣的是，當(dāng)陽(yáng)離子配體遍布核苷酸中分散時(shí)，據(jù)報(bào)告反義寡核苷酸能夠保持它們與mRNA的高結(jié)合親和力。參見(jiàn)M.ManoharanAntisense&Nucleic Acid Drug Development 2002，12，103和其中所引用的參考文獻(xiàn)。
可以使用具有懸垂反應(yīng)官能團(tuán)的dsRNA，例如連接分子連接到dsRNA上產(chǎn)生的dsRNA，來(lái)合成配體偶聯(lián)的本發(fā)明的dsRNA。這種反應(yīng)性的寡核苷酸可與市售配體、合成的帶有任一種保護(hù)基的配體或連接有連接部分的配體直接反應(yīng)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)使用已經(jīng)與配體適當(dāng)偶聯(lián)并且還可以進(jìn)一步連接到固體支持材料上的核苷單體，本發(fā)明的方法有利于合成配體偶聯(lián)的dsRNA。這些任選地與固體支持材料相連的配體-核苷偶聯(lián)物根據(jù)本發(fā)明的方法的一些優(yōu)選實(shí)施方案制備，是通過(guò)選擇的血清結(jié)合配體與位于核苷或寡核苷酸的5’位置上的連接部分的反應(yīng)。在某些情況下，具有與dsRNA 3’末端連接的芳烷基配體的dsRNA是這樣制備的首先通過(guò)長(zhǎng)鏈氨基烷基將單體結(jié)構(gòu)單元與可控孔度玻璃(controlled-pore-glass)支持物共價(jià)連接。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)將核苷酸與結(jié)合在固體支持物上的單體結(jié)構(gòu)單元相鍵合。單體結(jié)構(gòu)單元可以是與固相合成兼容的核苷或其它有機(jī)化合物。
可以使用公知的固相合成技術(shù)方便地和常規(guī)地制備在本發(fā)明的偶聯(lián)物中使用的dsRNA。用于這種合成的儀器由幾家銷售商提供，包括例如Applied Biosystems(Foster City，CA)。還可以另外地或可替代地使用本領(lǐng)域已知的用于這種合成的其它任何方式。也知道使用類似的技術(shù)來(lái)制備其它的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
關(guān)于合成特定的修飾寡核苷酸的教導(dǎo)可參考下述美國(guó)專利美國(guó)專利5,138,045和5,218,105，涉及聚胺偶聯(lián)的寡核苷酸；美國(guó)專利5,212,295，涉及用于制備具有手性磷連接的寡核苷酸的單體；美國(guó)專利5,378,825和5,541,307，涉及具有修飾的骨架的寡核苷酸；美國(guó)專利5,386,023，涉及骨架修飾的寡核苷酸及其通過(guò)還原偶聯(lián)的制備；美國(guó)專利5,457,191，涉及基于3-脫氮嘌呤環(huán)系統(tǒng)的修飾的核堿基及其合成方法；美國(guó)專利5,459,255，涉及基于N-2取代的嘌呤的修飾的核堿基；美國(guó)專利5,521,302，涉及用于制備具有手性磷連接的寡核苷酸的方法；美國(guó)專利5,539,082，涉及肽核酸；美國(guó)專利5,554,746，涉及具有β-內(nèi)酰胺骨架的寡核苷酸；美國(guó)專利5,571,902，涉及用于合成寡核苷酸的方法和材料；美國(guó)專利5,578,718，涉及具有烷基硫代基團(tuán)的核苷，其中這些基團(tuán)可用作與核苷多個(gè)位置中的任一位置連接的其它部分的連接體；美國(guó)專利5,587,361和5,599,797，涉及具有高手性純度的硫代磷酸連接的寡核苷酸；美國(guó)專利5,506,351，涉及用于制備2’-O-烷基鳥(niǎo)苷和相關(guān)化合物(包括2，6-二氨基嘌呤化合物)的方法；美國(guó)專利5,587,469，涉及包含N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美國(guó)專利5,587,470，涉及包含3-脫氮嘌呤的寡核苷酸；美國(guó)專利5,223,168和美國(guó)專利5,608,046，均涉及偶聯(lián)的4’-去甲基核苷類似物；美國(guó)專利5,602,240和5,610,289，涉及骨架修飾的寡核苷酸類似物；美國(guó)專利6,262,241和5,459,255，特別涉及合成2’-氟-寡核苷酸的方法。
在具有序列特異性連接的本發(fā)明的核苷的配體偶聯(lián)的dsRNA和配體分子中，使用標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸或核苷前體、或者已經(jīng)帶有連接部分的核苷酸或核苷偶聯(lián)物前體、已經(jīng)帶有配體分子的核苷酸或核苷偶聯(lián)物前體、或帶有非核苷配體的結(jié)構(gòu)單元，可以在合適的DNA合成儀上裝配寡核苷酸和寡核苷。
當(dāng)使用已帶有連接部分的核苷酸-偶聯(lián)物前體時(shí)，通常先完成序列特異性連接的核苷的合成，然后配體分子與連接部分反應(yīng)形成配體偶聯(lián)的寡核苷酸。帶有多種分子(例如類固醇、維生素、脂質(zhì)和受體分子)的寡核苷酸偶聯(lián)物以前已經(jīng)描述(參見(jiàn)Manoharan等人，PCT申請(qǐng)WO 93/07883)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸或連接的核苷是通過(guò)自動(dòng)合成儀合成的，其中除了使用可商購(gòu)獲得和寡核苷酸合成中常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺和非標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺以外，還使用來(lái)自配體-核苷偶聯(lián)物的亞磷酰胺。
在寡核苷酸的核苷中引入2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-烯丙基、2’-O-氨基烷基或2’-脫氧-2’-氟基團(tuán)使得寡核苷酸的雜交能力增強(qiáng)。此外，包含硫代磷酸骨架的寡核苷酸具有增強(qiáng)的核酸酶穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的功能化的、連接的核苷可以增加，以包括硫代磷酸骨架或者2’-O-甲基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-氨基烷基、2’-O-烯丙基或2’-脫氧-2’-氟基團(tuán)中的一個(gè)或兩個(gè)。例如PCT公布WO 200370918概括列舉了本領(lǐng)域已知的一些寡核苷酸修飾。
在一些實(shí)施方案中，使用DNA合成儀來(lái)制備在5’末端具有氨基的本發(fā)明的功能化核苷序列，然后與選擇的配體的活性酯衍生物反應(yīng)。活性酯衍生物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。代表性的活性酯包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。氨基和活性酯的反應(yīng)產(chǎn)生了寡核苷酸，在其5’位置上通過(guò)連接基團(tuán)與選擇的配體相連?？梢允褂?’-氨基-修飾物(5′-Amino-Modifier)C6試劑來(lái)制備5’末端的氨基。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用配體-核苷亞磷酰胺，配體分子可與寡核苷酸在其5’位置處偶聯(lián)，其中，配體與5’-羥基直接連接或通過(guò)連接體間接相連。這樣的配體-核苷亞磷酰胺通常在自動(dòng)合成程序的最后使用，以提供在5’末端帶有配體的配體偶聯(lián)的寡核苷酸。
修飾的核苷間連接或骨架的例子包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3’-烯基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫逐氨基磷酸酯、硫逐烷基磷酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和硼烷磷酸酯，它們具有正常的3’-5’連接，2’-5’連接的類似物，以及具有相反極性的那些，其中核苷單元的相鄰的配對(duì)為連接的3’-5’對(duì)5’-3’或2’-5’對(duì)5’-2’。還可以包括不同的鹽、混合鹽和游離酸形式。
涉及制備上述包含磷原子的連接的代表性的美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；和5,697,248，在此均引入作為參考。
不包括磷原子的修飾的核苷間連接或骨架的例子(即寡核苷)具有由短鏈烷基或環(huán)烷基糖間連接、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基糖間連接、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)糖間連接形成的骨架。包括具有嗎啉代連接(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲?；?formacetyl)和硫代甲?；羌?；亞甲基甲?；土虼柞；羌?；包含烯的骨架；氨基磺酸骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺胺骨架；酰胺骨架；和其它具有N、O、S和CH2混合組分的骨架。
涉及制備上述寡核苷的代表性的美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，在此均引入作為參考。
在某些情況下，寡核苷酸可由非配體基團(tuán)修飾。許多非配體分子已與寡核苷酸偶聯(lián)，以提高寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取，可在科技文獻(xiàn)中查閱到用于進(jìn)行這種偶聯(lián)的方法。這些非配體部分包括脂質(zhì)部分，例如膽固醇(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，866553)、膽酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，41053)、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，32765))、硫代膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.，1992，20533)、脂肪鏈(例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10111；Kabanov等人，F(xiàn)EBS Lett.，1990，259327；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，7549))、磷脂(例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基銨1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，183777))、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides，1995，14969)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，363651)、或棕櫚基部分(Mishra等人，Biochem.Biophys.Acta，1995，1264229)、或十八烷胺或己基氨基-羰基-羥膽甾醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277923)。以上已經(jīng)列舉了教導(dǎo)如何制備這樣的寡核苷酸偶聯(lián)物的代表性的美國(guó)專利。典型的偶聯(lián)方案包括合成在其序列的一個(gè)或多個(gè)位置上帶有氨基連接體的寡核苷酸。然后使用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑或活化劑，使氨基與將要偶聯(lián)的分子反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)可以使用仍然結(jié)合在固體支持物上的寡核苷酸進(jìn)行，也可以在溶液相中切下寡核苷酸后進(jìn)行。使用HPLC純化寡核苷酸偶聯(lián)物得到純的偶聯(lián)物。使用膽固醇偶聯(lián)物是特別優(yōu)選的，因?yàn)檫@種部分能夠增加向陰道上皮細(xì)胞(HPV感染部位)的靶向。
本發(fā)明描述了用于沉默化HPV靶基因并因此治療HPV相關(guān)病癥的dsRNA的多種實(shí)施方案。雖然特定治療劑的設(shè)計(jì)可以采用多種形式，某些功能特征將會(huì)從其它的dsRNA中區(qū)別出優(yōu)選的dsRNA。特別地，將測(cè)試本領(lǐng)域技術(shù)人員可進(jìn)行測(cè)量的例如良好的血清穩(wěn)定性、高效力、缺乏誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和良好的藥物樣行為等特征，以鑒定本發(fā)明優(yōu)選的dsRNA。在某些情況下，優(yōu)選的dsRNA并不會(huì)具有所有這些功能特征。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠優(yōu)化這些變量和其它因素來(lái)選擇本發(fā)明的優(yōu)選化合物。
雖然許多核苷酸修飾都是可能的，但是本發(fā)明人確定了一些化學(xué)修飾模式，它們能夠提供顯著提高的藥理學(xué)、免疫學(xué)和最終治療益處。表3示出了本發(fā)明表1中列出的雙鏈dsRNA優(yōu)選使用的化學(xué)修飾模式。
表3 編碼RNAi試劑的載體 本發(fā)明的dsRNA還可通過(guò)重組病毒載體在體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼本發(fā)明的dsRNA的序列和用于表達(dá)dsRNA序列的任何合適的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括例如U6或H 1RNA pol III啟動(dòng)子序列以及巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道其它合適的啟動(dòng)子的選擇。本發(fā)明的重組病毒載體還可以包含用于在特定的組織或特定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中表達(dá)dsRNA的誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。下面將會(huì)詳細(xì)描述如何使用重組病毒載體在體內(nèi)將本發(fā)明的dsRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明的dsRNA可以由重組病毒載體表達(dá)，或者表達(dá)為兩個(gè)單獨(dú)的互補(bǔ)RNA分子，或者表達(dá)為具有兩個(gè)互補(bǔ)區(qū)的單個(gè)RNA分子。
可以使用任何能夠接受將要表達(dá)的dsRNA分子的編碼序列的病毒載體，例如來(lái)自以下病毒的載體腺病毒(AV)；腺相關(guān)病毒(AAV)；逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒(LV)、彈狀病毒、鼠白血病病毒)；皰疹病毒等?？梢赃m當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)假型化(pseudotyping)具有來(lái)自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原的載體、或者通過(guò)取代不同的病毒衣殼蛋白來(lái)改變病毒載體的向性。
例如，來(lái)自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、莫科拉病毒等的表面蛋白可以假型化本發(fā)明的慢病毒載體。通過(guò)工程化載體使其表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型，本發(fā)明的AAV載體可靶向不同的細(xì)胞。例如，表達(dá)血清型2基因組上的血清型2衣殼的AAV載體被稱為AAV 2/2。AAV 2/2載體中的這種血清型2衣殼基因可被血清型5衣殼基因代替，而產(chǎn)生AAV 2/5載體。構(gòu)建表達(dá)不同衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，例如參見(jiàn)Rabinowitz J E等人(2002)，J Virol 76791-801，其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。
適用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇、將用于表達(dá)dsRNA的核酸序列插入載體中的方法，以及將病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)到興趣細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。例如參見(jiàn)Dornburg R(1995)，Gene Therap.2301-310；Eglitis M A(1988)，Biotechniques 6608-614；Miller A D(1990)，Hum Gene Therap.15-14；Anderson W F(1998)，Nature 39225-30；和Rubinson D A等人，Nat.Genet.33401-406，其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。
優(yōu)選的病毒載體為來(lái)自AV和AAV的載體。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明dsRNA表達(dá)為來(lái)自重組AAV載體的兩個(gè)單獨(dú)的、互補(bǔ)的單鏈RNA分子，該載體包含例如U6或H1RNA啟動(dòng)子，或巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。
用于表達(dá)本發(fā)明的dsRNA的合適的AV載體、構(gòu)建重組AV載體的方法和將載體轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞的方法已在Xia H等人(2002)，Nat.Biotech.201006-1010中描述。
用于表達(dá)本發(fā)明的dsRNA的合適的AAV載體、構(gòu)建重組AAV載體的方法和將載體轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞的方法已在Samulski R等人(1987)，J.Virol.613096-3101；Fisher K J等人(1996)，J.Virol，70520-532；Samulski R等人(1989)，J.Virol.633822-3826；美國(guó)專利5,252,479；美國(guó)專利5,139,941；國(guó)際專利申請(qǐng)WO 94/13788；和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 93/24641中描述，其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。
III.包含dsRNA的藥物組合物 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含此處所描述的dsRNA以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。包含dsRNA的藥物組合物可用于治療與HPV靶基因的表達(dá)或活性相關(guān)的疾病或病癥，例如由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程?；诮o藥方式配制這些藥物組合物。一個(gè)例子是配制成經(jīng)子宮頸局部給藥或者經(jīng)腸胃外遞送系統(tǒng)給藥的組合物。
本發(fā)明的藥物組合物以足以抑制HPV靶基因的表達(dá)的劑量給藥。本發(fā)明人已經(jīng)確定，由于其提高的有效性，包含本發(fā)明的dsRNA的組合物可以以令人驚訝的低劑量給藥。每日每千克接受者體重5mg dsRNA的劑量足以抑制或降低HPV靶基因的表達(dá)，對(duì)于針對(duì)疣或子宮頸或肛門的治療，可以直接對(duì)感染組織給藥。
一般而言，合適的dsRNA劑量范圍為每日每千克接受者體重0.01至5.0毫克，一般是每日每千克體重1微克至1毫克?？梢悦咳战o予一次藥物組合物，或者可以在一天當(dāng)中以適當(dāng)?shù)拈g隔作為兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)亞劑量給予dsRNA，或者甚至使用陰道凝膠的控制釋放制劑進(jìn)行連續(xù)輸注或遞送。在這種情況下，每個(gè)亞劑量中包含的dsRNA必然相應(yīng)地較低，以實(shí)現(xiàn)總的日劑量。劑量單元還可以配制供幾天給藥，例如，使用傳統(tǒng)的緩釋制劑使dsRNA在幾天的時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放。緩釋制劑是本領(lǐng)域已知的，特別適用于藥物的陰道給藥，例如可以用于本發(fā)明的藥物。在這個(gè)實(shí)施方案中，劑量單元包含相應(yīng)的多個(gè)每日劑量。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量和時(shí)間，包括但不限于疾病或病癥的嚴(yán)重性、之前的治療、受試者的總體健康和/或年齡和存在的其它疾病。此外，使用治療有效量的組合物治療受試者可以包括單次治療或一系列的治療?？梢允褂脗鹘y(tǒng)的方法或基于使用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型進(jìn)行的體內(nèi)測(cè)試來(lái)估計(jì)本發(fā)明包括的各dsRNA的有效劑量和體內(nèi)半衰期，如本文其它地方所述。
本發(fā)明人意識(shí)到，由于多種原因，包括HPV基因型的變異性，有可能需要同時(shí)使用多于一種的本發(fā)明的dsRNA來(lái)治療HPV感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇dsRNA的組合，使其能夠靶向最寬范圍的HPV基因型，同時(shí)具有最不復(fù)雜的dsRNA混合物。包含多于一種類型的dsRNA的本發(fā)明的藥物組合物預(yù)期包含此處所述的各dsRNA的劑量。
dsRNA的組合可以在單一劑型藥物組合物中一起提供?？蛇x地，dsRNA的組合可以在單獨(dú)的劑型中提供，在這種情況下，它們可以同時(shí)或不同時(shí)給藥，并且可能通過(guò)不同的方式給藥。因此，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的dsRNA的理想組合的藥物組合物；還涉及旨在作為聯(lián)合療法的一部分提供的單一dsRNA的藥物組合物。在后一情況下，聯(lián)合治療的發(fā)明因此是給藥方法，而不是物質(zhì)的組合物。
小鼠遺傳學(xué)的進(jìn)展產(chǎn)生了許多用于研究不同人類疾病(例如由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程)的小鼠模型。這些模型用于dsRNA的體內(nèi)測(cè)試，以及用于確定治療有效劑量。
可以使用任何方法將本發(fā)明的dsRNA給予到包含感染HPV的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物。例如，給藥可以是局部的(例如陰道、經(jīng)皮等)；口服的；或腸胃外的(例如皮下、心室內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，或者通過(guò)靜脈滴注)?？梢钥焖俳o藥(例如通過(guò)注射)，或者也可以在一段時(shí)間內(nèi)給藥(例如通過(guò)慢速輸注或給予緩釋制劑)。
典型地，當(dāng)治療攜帶感染HPV的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物時(shí)，dsRNA分子以陰道凝膠或乳膏的形式局部給藥。例如，配制的含或不含脂質(zhì)體的dsRNA可以直接局部給藥到子宮頸、肛道或HPV病變處，例如生殖器疣。對(duì)于局部給藥，可將dsRNA分子配制為組合物，例如滅菌和非滅菌水溶液、在普通溶劑(例如酒精)中的非水溶液，或在液體或固體油基中的溶液。這些溶液還可以包含緩沖液、稀釋劑和其它合適的添加劑。用于局部給藥的組合物可被配制成為透皮貼劑、軟膏、洗液、乳膏、膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末的形式?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的聚合物和透化劑來(lái)配制膠劑和乳膏。可以使用子宮頸帽、陰道隔膜、涂覆避孕套、手套等將包含dsRNA以及相關(guān)的賦形劑的膠劑和乳膏施用到子宮頸?？梢蕴砑觽鹘y(tǒng)的藥物載體、水溶液、粉末或油狀基質(zhì)、增稠劑等。
對(duì)于腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥，dsRNA分子可被配制到組合物中，例如滅菌水溶液，還可以包含緩沖液、稀釋劑和其它合適的添加劑(例如穿透增強(qiáng)劑、載體化合物和其它藥學(xué)上可接受的載體)。
此外，使用非病毒的方法(例如生物或非生物方式，例如在美國(guó)專利6,271,359中所述)，可以將dsRNA分子給予到包含HPV感染的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物中?？梢允褂枚喾N方法進(jìn)行非生物遞送，包括但不限于(1)將在此提供的dsRNA酸分子裝載到脂質(zhì)體中，和(2)將dsRNA分子與脂質(zhì)或脂質(zhì)體進(jìn)行復(fù)合以形成核酸-脂質(zhì)或核酸-脂質(zhì)體復(fù)合物。脂質(zhì)體可以包含通常用于體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的陽(yáng)離子和中性脂質(zhì)。陽(yáng)離子脂質(zhì)可以與帶負(fù)電的核酸復(fù)合(例如電荷結(jié)合)形成脂質(zhì)體。陽(yáng)離子脂質(zhì)體的例子包括但不限于lipofectin、lipofectamine、lipofectace、DOTAP(1，2-二油酰-3-三甲銨丙烷)、DOTMA(N-[1，2(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)、DOSPA(2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺甲酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨)、DOGS(二-十八烷基酰氨基甘氨酰精胺)和DC-chol(3，[N-N′，N-二甲基乙二胺)-氨基甲?；鵠膽固醇)。
形成脂質(zhì)體的程序是本領(lǐng)域已知的。脂質(zhì)體組合物可例如由磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油或二油酰磷脂酰乙醇胺形成。許多親脂性試劑可以商購(gòu)獲得，包括Lipofectin.RTM.(Invitrogen/Life Technologies，Carlsbad，Calif.)和Effectene.TM.(Qiagen，Valencia，Calif.)。此外，可以使用市售的陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如DDAB或DOTAP，每種都可以與例如DOPE或膽固醇的中性脂質(zhì)混合)來(lái)優(yōu)化系統(tǒng)遞送方法。在一些情況下，可以使用Templeton等人(Nature Biotechnology，15647-652(1997))描述的脂質(zhì)體。在另一些實(shí)施方案中，可以使用聚陽(yáng)離子(例如聚乙撐亞胺)來(lái)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)和離體的遞送(Boletta等人，J.Am Soc.Nephrol.71728(1996))。還可以在美國(guó)專利6,271,359、PCT公開(kāi)WO 96/40964和Morrissey，D.等人2005.Nat Biotechnol.23(8)1002-7中發(fā)現(xiàn)關(guān)于使用脂質(zhì)體遞送核酸的其它信息。
將dsRNA分子給予到包含HPV感染的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的其它非病毒方法包括基于陽(yáng)離子脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)(除了脂質(zhì)體以外)，例如脂復(fù)合物(lipoplex)和納米乳劑。此外，還可以使用縮合聚合物遞送系統(tǒng)(即DNA-聚合物復(fù)合物或“聚復(fù)合物(polyplex)”，包括但不限于殼聚糖、聚(L-賴氨酸)(PLL)、聚乙撐亞胺(PEI)、樹(shù)狀聚體(dendrimer)(例如聚乙二胺(PANAM)樹(shù)狀聚體)和泊洛沙胺。此外，還可以使用非縮合的聚合物遞送系統(tǒng)，包括但不限于泊洛沙姆、明膠、PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和PVA(聚乙烯醇)。
上述遞送或給藥技術(shù)的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，縮合聚合物遞送系統(tǒng)是通過(guò)與陰離子DNA分子容易地復(fù)合而起作用的；例如，聚(L-賴氨酸)(PLL)通過(guò)形成與負(fù)電細(xì)胞表面相互作用的帶正電荷復(fù)合物、然后發(fā)生快速內(nèi)在化而起作用。
可以使用多種方法完成生物遞送，包括但不限于使用病毒載體。例如，可以使用病毒載體(例如腺病毒和皰疹病毒載體)將dsRNA分子遞送到皮膚細(xì)胞和子宮頸細(xì)胞中?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將一種或多種此處提供的dsRNA導(dǎo)入到以前為了將核酸遞送到細(xì)胞內(nèi)而開(kāi)發(fā)的眾多不同病毒載體中的一種內(nèi)?？梢允褂眠@些產(chǎn)生的病毒載體將一種或多種dsRNA遞送到細(xì)胞內(nèi)，例如通過(guò)轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明的dsRNA可被配制在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中?！八帉W(xué)上可接受的載體”(在此也被稱為“賦形劑”)為藥學(xué)上可接受的溶劑、懸浮劑或其它任何藥理學(xué)惰性載體。藥學(xué)上可接受的載體可以為液體或固體，可以根據(jù)計(jì)劃的給藥方式進(jìn)行選擇，以提供理想的大規(guī)模、一致性和其它相關(guān)的遞送和化學(xué)性質(zhì)。典型的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于水；鹽溶液；粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如乳糖和其它糖、明膠或硫酸鈣)；潤(rùn)滑劑(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸鈉)；崩解劑(例如淀粉或淀粉羥乙酸鈉)和濕潤(rùn)劑(例如月桂基硫酸鈉)。
此外，靶向HPV靶基因的dsRNA可配制成為組合物，該組合物包含與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或核酸混合物相混合、膠囊化、偶聯(lián)或以其它方式結(jié)合的dsRNA。例如，包含靶向E6AP基因的一種或多種dsRNA試劑的組合物可以包含其它治療劑，例如消炎藥(例如非甾體消炎藥和皮質(zhì)類固醇)和抗病毒藥(例如利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)。在一些實(shí)施方案中，該組合物可以包含一種或多種具有與HPV靶基因互補(bǔ)的序列的dsRNA，以及角質(zhì)溶解劑。角質(zhì)溶解劑為分離或放松表皮角質(zhì)層的藥物。角質(zhì)溶解劑的例子包括但不限于水楊酸。美國(guó)專利5,543,417提供了其它的例子。可使用有效量的角質(zhì)溶解劑來(lái)提高dsRNA的穿透，例如進(jìn)入組織(例如皮膚)。例如，可以使用一定量的角質(zhì)溶解劑，使施用到生殖器疣的dsRNA可以滲入整個(gè)疣。
可以在細(xì)胞培養(yǎng)物或試驗(yàn)動(dòng)物中使用標(biāo)準(zhǔn)的藥物方法(例如確定LD50(種群的50％致死的劑量)和ED50(種群的50％治療有效的劑量))來(lái)確定這些化合物的毒性和治療有效性。毒性和治療效果之間的劑量比例為治療指標(biāo)，可以表示為L(zhǎng)D50/ED50之比。顯示高治療指標(biāo)的化合物為優(yōu)選化合物。
從細(xì)胞培養(yǎng)分析和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于確定人使用的劑量范圍。本發(fā)明的組合物的劑量通常在循環(huán)濃度的范圍之內(nèi)，包括ED50，具有非常少的毒性或沒(méi)有毒性。取決于使用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以在這個(gè)范圍內(nèi)變化。對(duì)于任何用于本發(fā)明的方法中的化合物而言，可以根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)分析初步估計(jì)治療有效劑量?？梢詫┝颗渲频絼?dòng)物模型中，從而達(dá)到化合物或(如果合適的話)靶序列的多肽產(chǎn)物(例如實(shí)現(xiàn)多肽濃度的降低)的循環(huán)血漿濃度范圍，包括在細(xì)胞培養(yǎng)中確定的IC50(即達(dá)到半數(shù)最大癥狀抑制的測(cè)試化合物的濃度)。這些信息可用于精確確定對(duì)人有用的劑量?？梢酝ㄟ^(guò)例如高效液相色譜來(lái)測(cè)量血漿中的水平。
除了上述單獨(dú)給藥或者組合給藥，本發(fā)明的dsRNA還可以與其它已知有效治療HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程的藥物聯(lián)合給藥。在任何情況下，醫(yī)生可以根據(jù)使用本領(lǐng)域已知或此處描述的有效性的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量獲得的結(jié)果來(lái)調(diào)節(jié)dsRNA給藥的量和時(shí)間。
使用與確定優(yōu)選的單個(gè)dsRNA相同的方法在體外和體內(nèi)測(cè)試dsRNA的組合?？梢詢H僅基于生物信息學(xué)來(lái)選擇這些組合，其中，選擇能夠覆蓋最寬的基因型范圍的最小數(shù)量的siRNA?；蛘撸梢园凑沾颂帉?duì)于單個(gè)dsRNA試劑所述，基于體外或體內(nèi)評(píng)價(jià)來(lái)選擇這些組合。用于測(cè)試dsRNA組合的優(yōu)選的分析是評(píng)價(jià)在HPV 16陽(yáng)性癌細(xì)胞系中(例如SiHa或Caski，例如在Hengstermann等人(2005)Journal Vir.79(14)9296；和Butz等人(2003)Oncogene 225938中描述)或者在器官型培養(yǎng)系統(tǒng)中(例如在Jeon等人(1995)JournalVir.69(5)2989中描述)的siRNA介導(dǎo)的HPV靶基因抑制(knockdown)的表型結(jié)果。
本發(fā)明人已經(jīng)確定了某些優(yōu)選的可用于治療HPV感染的dsRNA組合。最一般地來(lái)說(shuō)，dsRNA的組合包含多于一種選自表1的dsRNA。因此，本發(fā)明涉及選自表1的2、3、4、5或更多種dsRNA雙鏈體在聯(lián)合治療中的應(yīng)用。原則上，為了簡(jiǎn)化治療產(chǎn)品，最小數(shù)量的dsRNA是優(yōu)選的。這就促使dsRNA的選擇包含最大數(shù)量的有害或潛在有害的HPV基因型，并且事實(shí)上可以證明組合的選擇無(wú)需包括所有這些HPV基因型。
治療由HPV感染引起的疾病的方法 此處所描述的方法和組合物可用于治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病和病癥，該疾病和病癥可能是臨床或亞臨床乳頭瘤病毒感染的結(jié)果。這些疾病和病癥在此有時(shí)也被稱為“HPV相關(guān)病癥”或“由HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程”，包括例如上皮惡性腫瘤、皮膚癌(非黑素瘤或黑素瘤)、肛門生殖器惡性腫瘤(例如子宮頸癌)、HPV相關(guān)癌前病變(包括LSIL或HSIL子宮頸組織)、肛門癌、惡性病變、良性病變、乳頭狀瘤、乳頭狀腺囊瘤、神經(jīng)性乳頭瘤、乳頭狀瘤病、皮膚和粘膜乳頭瘤、濕疣、成纖維細(xì)胞瘤和其它與乳頭瘤病毒相關(guān)的病理狀況。
例如，此處所描述的組合物可用于治療由HPV引起的疣。這樣的疣包括例如普通疣(尋常疣)，例如手掌疣、跖疣、甲周疣；扁平疣和絲狀疣；肛門、口腔、咽、喉和舌乳頭狀瘤；性病濕疣(尖銳濕疣)也稱為生殖器疣(例如陰莖、外陰、陰道和子宮頸疣)，是最嚴(yán)重的HPV感染表現(xiàn)之一。HPV DNA可在所有級(jí)別的子宮頸上皮內(nèi)腫瘤(CIN I-III)中發(fā)現(xiàn)，HPV類型的特定亞組可在子宮頸的原位癌中發(fā)現(xiàn)。因此，患有生殖器疣、攜帶特定的HPV類型的女性被認(rèn)為具有發(fā)展成為子宮頸癌的高風(fēng)險(xiǎn)。
最常見(jiàn)的與乳頭瘤病毒感染相關(guān)的疾病為良性皮膚疣或普通疣。普通疣通常包含1、2、3、4或10型HPV。其它的由乳頭瘤病毒引起的病癥包括例如喉乳頭狀瘤，這是一種良性的喉上皮腫瘤。乳頭瘤病毒HPV-6和HPV-11為與喉乳頭狀瘤相關(guān)的最常見(jiàn)的兩種類型。此處所描述的組合物可用于治療這些疾病和病癥。
在此描述的組合物也可用于治療疣狀表皮發(fā)育不良(EV)，這是一種罕見(jiàn)的遺傳轉(zhuǎn)播疾病，其特征在于散布著小的紅色斑點(diǎn)的扁平疣。
此外，在此描述的組合物可用于治療以HPV作為病原的、由細(xì)胞轉(zhuǎn)化引起的病變，例如，用于治療子宮頸癌。
此處所描述的組合物還可用于治療HPV誘導(dǎo)的發(fā)育異常，例如陰莖、外陰、子宮頸、陰道、口、肛門和咽發(fā)育異常，和治療HPV誘導(dǎo)的癌癥，例如陰莖、外陰、子宮頸、陰道、肛門、口腔、咽和頭頸癌。
本發(fā)明還可以通過(guò)包括特定的dsRNA與另一種抗癌化療劑例如任何常規(guī)的化療劑聯(lián)合來(lái)實(shí)施。特定的結(jié)合劑與其它藥物的聯(lián)合使用可以加強(qiáng)化療方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以想到能夠向本發(fā)明的方法中加入的許多化療方案。可以使用任何化療劑，包括烷化劑、抗代謝物、激素和拮抗劑、放射性同位素和天然產(chǎn)物。例如，本發(fā)明的化合物可與抗生素(如阿霉素)和其它蒽環(huán)類類似物、氮芥(例如環(huán)磷酰胺)、嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶)、順鉑、羥脲、紫杉醇及其天然和合成衍生物等一起給藥。作為另一個(gè)例子，對(duì)于混合型腫瘤，例如乳腺的腺癌，其中，腫瘤包含依賴促性腺激素的和不依賴促性腺激素的細(xì)胞，該化合物可與亮丙瑞林或戈舍瑞林(LH-RH的合成肽類似物)共同給藥。其它的抗腫瘤方案包括使用四環(huán)素化合物和其它的治療方式，例如手術(shù)、放射等，在此也被稱為“輔助抗癌方式”。因此，本發(fā)明的方法可與這樣的常規(guī)治療聯(lián)合使用，具有降低副作用和提高有效性的優(yōu)點(diǎn)。
在另一個(gè)替代方案中，靶向E6AP的dsRNA可用于治療神經(jīng)障礙和行為異常。通過(guò)確定患有Angelman綜合征的患者中的E6AP突變，發(fā)現(xiàn)E6AP與神經(jīng)障礙和行為異常相關(guān)。Angelman綜合征(AS)為一種特別的神經(jīng)行為異常，其特征在于智力遲鈍、失語(yǔ)、過(guò)笑、癲癇發(fā)作、共濟(jì)失調(diào)和特有的EEG模式(Hitchins，M.P.等人2004.Am J Med Genet A.125(2)167-72)。推測(cè)誘導(dǎo)這種狀況不是治療的意圖；相反，正如在許多遺傳性缺陷中觀察到的一樣，E6AP在神經(jīng)和行為狀況中具有關(guān)鍵作用的這種證據(jù)也表明了該靶標(biāo)在人類病理學(xué)中可能具有多種作用，并且可能是這一類別的其它疾病的合適靶標(biāo)，在這一類疾病中，E6AP的沉默化將會(huì)彌補(bǔ)其它生化缺陷或疾病。此處所使用的“E6AP相關(guān)病癥”包括上述HPV相關(guān)病癥和其它的神經(jīng)和行為異常。
抑制E6AP基因表達(dá)的方法 另一方面，本發(fā)明提供了抑制哺乳動(dòng)物中E6AP基因的表達(dá)的方法。該方法包括給哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明表1中的組合物，以使靶基因E6AP的表達(dá)沉默化。由于它們的高特異性，本發(fā)明這些dsRNA特異性地針對(duì)靶基因E6AP的RNA(初級(jí)的或處理的)。使用這些dsRNA抑制這些E6AP基因表達(dá)的組合物和方法可如本文其它部分所述實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，此方法包括施用包含dsRNA的組合物，其中該dsRNA包含與將要治療的哺乳動(dòng)物的E6AP基因RNA轉(zhuǎn)錄物至少一部分互補(bǔ)的核苷酸序列。當(dāng)被治療的生物體是如人類的哺乳動(dòng)物時(shí)，該組合物可以使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方式給藥，包括但不限于口服或者腸胃外途徑，包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、呼吸道(氣溶膠)、經(jīng)鼻、直腸、陰道以及局部(包括口腔和舌下)給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物通過(guò)局部/陰道給藥或者靜脈輸液或注射給藥。
除非另外指出，此處所用的所有技術(shù)和科技術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同。盡管與此處的描述相似或等同的方法和材料也可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但是下面描述了合適的方法和材料。在此提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)在此全文引入作為參考。如果存在沖突，以本說(shuō)明書(包括定義部分)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為示例性的，并不意于局限本發(fā)明。
實(shí)施例 E6AP基因的基因步移(walking) 設(shè)計(jì)siRNA以鑒定靶向人遍在蛋白連接酶E3A(ube3A，還被稱為E6AP)的siRNA。使用代表不同同工型的人E6AP mRNA序列(NM_130838.1，NM_130839.1，NM_000462.2)。
對(duì)所有人E6AP同工型應(yīng)用BioEdit軟件的ClustalW多重序列對(duì)比功能(Thompson J.D.，等人，Nucleic Acids Res.1994，224673)以確定mRNA序列NM 130838.1為最短的序列，同時(shí)證實(shí)了參考序列的位點(diǎn)5至4491(末端位點(diǎn))的序列保守性，這是所有E6AP同工型有效靶向的條件。
確定了橫跨E6AP參考序列NM 130838.1的所有可能的重疊19聚體(代表siRNA有義鏈序列)，得到4473種19聚體的候選序列。綜合起來(lái)，這些候選靶序列覆蓋了E6AP mRNA的5′UTR、編碼區(qū)和3′UTR域，以及這些域的連接位點(diǎn)。
為了從候選序列的集合中排序和選擇siRNA，預(yù)測(cè)的與無(wú)關(guān)靶標(biāo)相互作用的可能性(脫靶可能性(off-target potential))被作為排序參數(shù)。具有低的脫靶可能性的siRNAs被確定為優(yōu)選的，并且假定更具有體內(nèi)特異性。
為了預(yù)測(cè)siRNA特異性的脫靶可能性，做出以下假設(shè) 1)在鏈的2至9位(從5′至3′)(種子區(qū)域)與靶基因的互補(bǔ)性可能足以讓該鏈與從該靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA發(fā)生相互作用以及隨后的表達(dá)下調(diào)(Jackson AL，等人Nat Biotechnol.2003Jun；21(6)635-7)。
2)每條鏈的1到19位與脫靶相互作用無(wú)關(guān) 3)種子區(qū)域?qū)γ摪锌赡苄缘呢暙I(xiàn)可能大于其他序列 4)一條鏈的切割位點(diǎn)區(qū)域位置10和11(從5′至3′)對(duì)于脫靶可能性的貢獻(xiàn)可能比位于切割位點(diǎn)3′的序列(非種子區(qū)域)的貢獻(xiàn)大，但是沒(méi)有種子區(qū)域的貢獻(xiàn)大 5)考慮假設(shè)1到4，基于siRNA鏈序列與基因序列的互補(bǔ)性以及錯(cuò)配的位置，可以計(jì)算每個(gè)基因和每條鏈的脫靶得分 6)假設(shè)有義鏈活性可能被引入的內(nèi)部修飾消除，只有反義鏈的脫靶可能性是相關(guān)的 7)siRNA的脫靶可能性可以從根據(jù)我們的標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)出最高同源性的基因(最佳脫靶基因)來(lái)推斷，因此可以表示為與相應(yīng)基因的脫靶得分 為了確定潛在的脫靶基因，將19聚體反義鏈序列對(duì)可公開(kāi)獲得的人mRNA序列進(jìn)行同源性檢索?；谶@個(gè)目的，使用所有的19聚體候選反義序列對(duì)人RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行FastA(3.4版本)檢索。使用Perl腳本(script)從候選19聚體序列中產(chǎn)生反義序列(perl腳本2)。為了在19聚體的全長(zhǎng)上考慮同源性，并格式化適合于下一步腳本分析的輸出，使用參數(shù)/數(shù)值對(duì)-g 30-f 30-L-i-H執(zhí)行FastA檢索。此檢索產(chǎn)生對(duì)于候選siRNA的可能的脫靶基因的列表。
進(jìn)一步，F(xiàn)astA檢索參數(shù)使用數(shù)值-E 15000，以使具有多于8個(gè)連續(xù)核堿基的數(shù)據(jù)庫(kù)條目與19聚體有義鏈序列相同，這些有義鏈序列很有可能被轉(zhuǎn)移到FastA輸出文件，同時(shí)顯示19聚體全長(zhǎng)的同源性(參見(jiàn)假設(shè)1)。
為了確定最佳的脫靶基因及其脫靶得分，分析FastA輸出文件。對(duì)每個(gè)可能的脫靶基因，提取每一個(gè)19聚體輸入序列的以下脫靶性質(zhì) 種子區(qū)域中的錯(cuò)配數(shù) 非種子區(qū)域中的錯(cuò)配數(shù) 切割位點(diǎn)區(qū)域中的錯(cuò)配數(shù) 每種脫靶基因的脫靶得分計(jì)算如下 (種子錯(cuò)配數(shù)乘以10)+(切割位點(diǎn)錯(cuò)配數(shù)乘以1.2)+非種子錯(cuò)配數(shù) 對(duì)每個(gè)輸入19聚體序列提取最低脫靶得分，并連續(xù)寫入輸出文件，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于輸入19聚體序列的所有siRNA的脫靶得分列表。
為了產(chǎn)生siRNA排序，將脫靶得分輸入結(jié)果表格。所有的siRNA最終根據(jù)脫靶得分按降序排列，并且從選擇中排除在同一行中包含多于3個(gè)G的延伸的序列。
選擇并分析了327個(gè)脫靶得分＞＝3的siRNA(表1)










dsRNA合成 試劑來(lái)源 在此沒(méi)有具體給出試劑的來(lái)源，這些試劑可以從任何分子生物學(xué)試劑供應(yīng)商處獲得，具有可應(yīng)用于分子生物學(xué)的質(zhì)量/純度標(biāo)準(zhǔn)。
siRNA合成 單鏈RNA是應(yīng)用Expedite 8909合成儀(Applied Biosystems，Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德國(guó))以及可控孔度玻璃(CPG，

Proligo Biochemie GmbH，漢堡，德國(guó))作為固相支持體，以1微摩爾的規(guī)模通過(guò)固相合成產(chǎn)生的。分別使用相應(yīng)的亞磷酰胺和2’-O-甲基亞磷酰胺(Proligo Biochemie GmbH，漢堡，德國(guó))通過(guò)固相合成產(chǎn)生RNA和含有2’-O-甲基核苷酸的RNA。應(yīng)用例如記載于Current protocols in nucleic acid chemistry，Beaucage，S.L.等人(Ed rs.)，John Wiley&Sons，Inc.，紐約，紐約，美國(guó)中的標(biāo)準(zhǔn)核苷亞氨基磷酸酯化學(xué)法，這些結(jié)構(gòu)單元被添加到寡核糖核苷酸鏈的序列的所選位置上。通過(guò)用含Beaucage試劑(Chruachem Ltd，Glasgow，UK)的乙腈溶液(1％)代替碘氧化劑溶液，引入硫代磷酸連接。其它輔助試劑從Mallinckrodt Baker(Griesheim，德國(guó))獲得。
根據(jù)確定的操作步驟，使用陰離子交換HPLC進(jìn)行寡核糖核苷酸粗品的脫保護(hù)以及純化。使用分光光度計(jì)(DU 640B，BeckmanCoulter GmbH，Unterschleiβheim，Germany)測(cè)量相應(yīng)RNA溶液在260nm波長(zhǎng)下的紫外吸收，由此確定收率和濃度。雙鏈RNA如下產(chǎn)生將等摩爾的互補(bǔ)鏈溶液在退火緩沖液(20mM磷酸鈉，pH 6.8；100mM氯化鈉)中混合，在85-90℃水浴中加熱3分鐘，經(jīng)3-4小時(shí)冷卻至室溫。退火的RNA溶液儲(chǔ)存于-20℃直至使用。
為了合成3′-膽固醇-偶聯(lián)的siRNA(在此稱為-Chol-3′)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)修飾的固相支持體用于RNA合成。該修飾的固相支持體如下制備 2-氮雜丁-1，4-二甲酸二乙酯AA
將4.7M氫氧化鈉水溶液(50mL)加入攪拌的、冰冷的甘氨酸乙酯鹽酸鹽(32.19g，0.23mol)水溶液(50mL)中。接著，加入丙烯酸乙酯(23.1g，0.23mol)并在室溫下攪拌混合物，直至由TLC確定反應(yīng)完成。19小時(shí)后，使用二氯甲烷(3×100mL)將溶液分層。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾并蒸發(fā)。殘余物蒸餾生成AA(28.8g，61％)。
3-{乙氧羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧羰基-氨基)-己?；鵠-氨基}-丙酸乙酯AB
Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g，25.83mmol)溶于二氯甲烷(50mL)并用冰冷卻。在0℃下，將二異丙基碳二亞胺(3.25g，3.99mL，25.83mmol)加入此溶液中。繼而加入氮雜丁-1，4-二甲酸二乙酯(5g，24.6mmol)和二甲氨基吡啶(0.305g，2.5mmol)。待此溶液至室溫，攪拌6小時(shí)。由TLC確定反應(yīng)完成。反應(yīng)混合物在真空下濃縮，并加入乙酸乙酯沉淀二異丙基尿素。過(guò)濾懸浮液。用5％鹽酸水溶液、5％碳酸氫鈉及水洗滌濾過(guò)物。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥并濃縮成粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物用柱色譜法純化(50％EtOAC/己烷)，得到AB 11.87g(88％)。
3-[(6-氨基-己酰基)-乙氧羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC
在0℃下，將3-{乙氧羰基甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯AB(11.5g，21.3mmol)溶解于含20％哌啶的二甲基甲酰胺中。繼續(xù)攪拌溶液1小時(shí)。反應(yīng)混合物真空濃縮，加水至殘留物中，產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取。粗產(chǎn)物通過(guò)轉(zhuǎn)化成其鹽酸鹽純化。
3-({6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己酰基}乙氧羰基甲基-氨基)-丙酸乙酯AD
3-[(6-氨基-己?；?-乙氧羰基甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的鹽酸鹽(4.7g，14.8mmol)吸收于二氯甲烷中。懸浮液用冰冷卻至0℃。二異丙基乙胺(3.87g，5.2mL，30mmol)加入此懸浮液中。向得到的溶液中加入膽固醇氯甲酸酯(6.675g，14.8mmol)。攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。用二氯甲烷稀釋反應(yīng)混合物，并用10％鹽酸溶液清洗。產(chǎn)物通過(guò)急驟色譜法純化(10.3g，92％)。
1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己?；鶀-4-氧代-吡咯-3-甲酸乙酯AE
將叔丁醇鉀(1.1g，9.8mmol)在30mL干甲苯中成漿?；旌衔镉帽鋮s至0℃，20分鐘內(nèi)邊攪拌邊緩慢加入5g(6.6mmol)二酯AD。添加過(guò)程中，溫度保持在5℃以下。繼續(xù)在0℃攪拌30分鐘，加入1mL冰醋酸后立即加入溶于40mL水的4g NaH2PO4.H2O。產(chǎn)生的混合物用每次100mL二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)層，用每次10mL磷酸鹽緩沖液清洗兩次，干燥，蒸發(fā)至干。剩余物溶于60mL甲苯，冷卻至0℃，用三份50mL的冷pH 9.5碳酸鹽緩沖液萃取。用磷酸調(diào)節(jié)水提取物至pH 3，用五份40mL的氯仿萃取，合并，干燥，蒸發(fā)至干。剩余物用柱色譜法純化(使用25％乙酸乙酯/己烷)，生成1.9g b-酮酯(39％)。
[6-(3-羥基-4-羥甲基-吡咯烷-1-基)-6-氧代-己基]-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊并[a]菲-3基酯AF
1小時(shí)內(nèi)，將甲醇(2mL)逐滴加入回流的b-酮酯AE(1.5g，2.2mmol)與硼氫化鈉(0.226g，6mmol)在四氫呋喃(10mL)中的混合物中。在回流溫度下繼續(xù)攪拌1小時(shí)。冷卻至室溫后，加入1N HCl(12.5mL)，混合物用乙酸乙酯萃取(3×40mL)。合并的乙酸乙酯層用無(wú)水硫酸鈉干燥，并真空濃縮，產(chǎn)物用柱色譜法純化(10％MeOH/CHCl3)(89％)。
(6-{3-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-4-羥基-吡咯-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基-2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊并[a]菲-3基酯AG
二醇AF(1.25g 1.994mmol)通過(guò)在真空下與吡啶(2×5mL)蒸發(fā)干燥。邊攪拌邊加入無(wú)水吡啶(10mL)和4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.724g，2.13mmol)。室溫反應(yīng)過(guò)夜。加入甲醇終止反應(yīng)。反應(yīng)混合物真空濃縮，向剩余物中加入二氯甲烷(50mL)。有機(jī)層用1M的碳酸氫鈉水溶液清洗。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮。殘余的吡啶通過(guò)與甲苯蒸發(fā)而除去。粗產(chǎn)物用柱色譜法(2％甲醇/氯仿，Rf＝0.5，在5％甲醇/氯仿中)純化(1.75g，95％)。
琥珀酸單(4-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1，5-二甲基-己基)-10，13-二甲基2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17-十四氫-1H-環(huán)戊并[a]菲-3-基氧羰基氨基]-己酰基}-吡咯-3-基)酯AH
化合物AG(1.0g，1.05mmol)與琥珀酸酐(0.150g，1.5mmol)和DMAP(0.073g，0.6mmol)混合，于40℃過(guò)夜真空干燥。將混合物溶解于無(wú)水二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g，0.440mL，3.15mmol)，并在氬氣氛下室溫?cái)嚢?6小時(shí)。然后用二氯甲烷(40mL)稀釋，用冰冷檸檬酸水溶液(5wt％，30mL)以及水(2×20mL)清洗。用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)相，濃縮至干。剩余物用于下一步反應(yīng)。
膽固醇衍生化的CPG AI
將琥珀酸酯AH(0.254g，0.242mmol)溶于二氯甲烷/乙腈(3∶2，3mL)混合物中。在此溶液中依次加入DMAP(0.0296g，0.242mmol)的乙腈(1.25mL)溶液、2，2′-二硫-雙(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)的乙腈/二氯甲烷(3∶1，1.25mL)溶液。在所生成的溶液中再加入溶于乙腈(0.6ml)的三苯基膦(0.064g，0.242mmol)溶液。反應(yīng)混合物變?yōu)轷r桔色。溶液用機(jī)械腕搖床短暫搖動(dòng)(5mins)。加入長(zhǎng)鏈烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mM)。將懸浮液搖動(dòng)2小時(shí)。用燒結(jié)漏斗過(guò)濾CPG，并依次用乙腈、二氯甲烷和乙醚清洗。未反應(yīng)的氨基用乙酸酐/吡啶掩蔽(masked)。獲得的CPG的載量通過(guò)進(jìn)行紫外測(cè)量而確定(37mM/g)。
含有5′-12-月桂酸雙癸基酰胺基團(tuán)(在此稱為″5′-C32-″)或者5′-膽固醇衍生基團(tuán)(在此稱為″5′-Chol-″)的siRNAs按照WO2004/065601所述合成，不同之處是對(duì)于膽固醇衍生物，為了在核酸寡聚體的5′端引入硫代磷酸連接，氧化步驟使用Beaucage試劑完成。
dsRNA表達(dá)載體 在本發(fā)明的另一方面，調(diào)控E6AP基因表達(dá)活性的E6AP特異性dsRNA分子由插入DNA或RNA載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)(參見(jiàn)例如，Couture，A，等人，TIG.(1996)，125-10；Skillern，A.，等人，國(guó)際PCT公布WO 00/22113，Conrad，國(guó)際PCT公布WO 00/22114，和Conrad，美國(guó)專利6,054,299)。這些轉(zhuǎn)基因可以作為線性構(gòu)建體、環(huán)狀質(zhì)粒或病毒載體引入，它們可以并入宿主基因組并作為整合至宿主基因組中的轉(zhuǎn)基因遺傳。這些轉(zhuǎn)基因也可以構(gòu)建為允許作為染色體外質(zhì)粒遺傳(Gassmann，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)921292)。
dsRNA的各鏈可由位于兩個(gè)分別的表達(dá)載體上的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄并且共轉(zhuǎn)染進(jìn)一個(gè)靶細(xì)胞內(nèi)。或者，dsRNA的各鏈可以由均位于同一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒上的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，dsRNA表達(dá)為通過(guò)連接體多核苷酸序列連接的反向重復(fù)，使得dsRNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
重組dsRNA表達(dá)載體通常是DNA質(zhì)?；蛘卟《据d體。表達(dá)dsRNA的病毒載體可以基于但不限于腺相關(guān)病毒(綜述見(jiàn)Muzyczka，等人，Curr.Topics Micro.Immunol.(1992)15897-129))、腺病毒(見(jiàn)，例如，Berkner，等人，BioTechniques(1998)6616)，Rosenfeld等人(1991，Science 252431-434)，和Rosenfeld等人(1992)，Cell68143-155))或α病毒以及本領(lǐng)域已知的其他病毒進(jìn)行構(gòu)建。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被用于在體內(nèi)和/或在體外將多種基因引入許多不同的細(xì)胞型中，包括上皮細(xì)胞(見(jiàn)，例如，Eglitis，等人，Science(1985)2301395-1398；Danos和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)856460-6464；Wilson等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA853014-3018；Armentano等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876141-6145；Huber等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888039-8043；Ferry等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888377-8381；Chowdhury等人，1991，Science 2541802-1805；vanBeusechem.等人，1992，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 897640-19；Kay等人，1992，Human Gene Therapy 3641-647；Dai等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等人，1993，J.Immunol.1504104-4115；美國(guó)專利4,868,116；美國(guó)專利4,980,286；PCT申請(qǐng)WO 89/07136；PCT申請(qǐng)WO 89/02468；PCT申請(qǐng)WO 89/05345；和PCT申請(qǐng)WO 92/07573)?？梢酝ㄟ^(guò)將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組轉(zhuǎn)染至合適的包裝細(xì)胞系，例如PA317和Psi-CRIP(Comette等人，1991，Human Gene Therapy 25-10；Cone等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816349)，來(lái)產(chǎn)生能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)插入細(xì)胞基因組的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可用于感染易感宿主(如大鼠、倉(cāng)鼠、狗和黑猩猩)中的多種細(xì)胞和組織(Hsu等人，1992，J.Infectious Disease，166769)，同時(shí)具有感染無(wú)需有絲分裂活躍細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。
在本發(fā)明的DNA質(zhì)?；虿《据d體中驅(qū)動(dòng)dsRNA表達(dá)的啟動(dòng)子可以是真核RNA聚合酶I(如核糖體RNA啟動(dòng)子)、RNA聚合酶II(如CMV早期啟動(dòng)子或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或U1snRNA啟動(dòng)子)，或者一般的RNA聚合酶III啟動(dòng)子(如U6snRNA或7SK RNA啟動(dòng)子)，或原核啟動(dòng)子，比如T7啟動(dòng)子，只要該表達(dá)質(zhì)粒也編碼由T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄所需的T7RNA聚合酶。該啟動(dòng)子也可以將轉(zhuǎn)基因表達(dá)引導(dǎo)至胰腺(參見(jiàn)，例如，胰腺內(nèi)的胰島素調(diào)控序列(Bucchini等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832511-2515))。
另外，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可被精確調(diào)控，比如，使用誘導(dǎo)型調(diào)控序列和表達(dá)體系，比如對(duì)特定生理調(diào)節(jié)因素(如循環(huán)葡萄糖水平或者激素(Docherty等人，1994，F(xiàn)ASEB J.820-24)敏感的調(diào)節(jié)序列。這些適用于控制轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞或者哺乳動(dòng)物中表達(dá)的誘導(dǎo)型表達(dá)體系包括由蛻皮素、雌激素、孕酮、四環(huán)素、二聚化化學(xué)誘導(dǎo)劑以及異丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(EPTG)的調(diào)控。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)dsRNA轉(zhuǎn)基因的預(yù)期用途選擇合適的調(diào)節(jié)/啟動(dòng)子序列。
一般來(lái)講，能夠表達(dá)dsRNA分子的重組載體如下所述遞送，并且保持在靶細(xì)胞中?；蛘?，可以使用提供dsRNA分子的瞬時(shí)表達(dá)的病毒載體。這些載體可根據(jù)需要重復(fù)使用。一旦被表達(dá)，dsRNA就結(jié)合在靶RNA上，并且調(diào)節(jié)其功能或者表達(dá)。表達(dá)dsRNA的載體可以系統(tǒng)遞送，例如通過(guò)靜脈內(nèi)或者肌肉內(nèi)施用，通過(guò)向從患者中外植出的靶細(xì)胞施用并隨后重新引入患者體內(nèi)，也可通過(guò)允許引入所需的靶細(xì)胞內(nèi)的其他任何方法。
dsRNA表達(dá)DNA質(zhì)粒通常是作為與陽(yáng)離子脂質(zhì)載體(如Oligofectamine)或基于非陽(yáng)離子脂質(zhì)的載體(如Transit-TKOTM)的復(fù)合物而被轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞內(nèi)。本發(fā)明也涉及在一周或者更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)針對(duì)單個(gè)E6AP基因或者多個(gè)E6AP基因不同區(qū)域的dsRNA介導(dǎo)的抑制的多脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。本發(fā)明的載體向宿主細(xì)胞內(nèi)的成功引入可以通過(guò)各種已知方法進(jìn)行監(jiān)控。比如，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以用報(bào)告子作為信號(hào)，比如熒光標(biāo)記，如綠色熒光蛋白(GFP)。離體細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以使用給轉(zhuǎn)染細(xì)胞提供對(duì)特定環(huán)境因素(如抗生素和藥物)的抗性(如潮霉素B抗性)的標(biāo)記來(lái)確定。
E6AP特異的sRNA分子也可以插入載體中，并作為應(yīng)用于人類患者的基因治療載體?；蛑委熭d體可以通過(guò)如靜脈注射、局部給藥(見(jiàn)美國(guó)專利5,328,470)或者立體定向注射(參見(jiàn)，例如Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057)給予受試者?；蛑委熭d體的藥物制劑可以包括在可接受的稀釋劑中的基因治療載體，或者可以包含包埋基因遞送載體的緩釋基質(zhì)?？蛇x擇地，當(dāng)完整基因遞送載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)可由重組細(xì)胞完整地產(chǎn)生時(shí)，藥物制劑可以包括產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的一個(gè)或者多個(gè)細(xì)胞。
在HCT-116細(xì)胞中的E6AP siRNA篩選 HCT-116細(xì)胞從DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)(Braunschweig，Germany，cat.No.ACC 581)得到，在37℃和5％CO2氣氛的潮濕溫箱中，在添加了10％胎牛血清(FCS)、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml及2mML-谷氨酰胺的McCoys(Biochrom AG，Berlin，Germany，cat.No.F1015)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
對(duì)于siRNA的轉(zhuǎn)染，將HCT-116細(xì)胞以2.0×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板上并立即轉(zhuǎn)染。按供應(yīng)商提供的方法，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染(對(duì)于單劑量篩選為30nM和3nM)。
轉(zhuǎn)染后24小時(shí)將HCT-116細(xì)胞裂解，按照標(biāo)準(zhǔn)方案、使用Quantigene Explore試劑盒(Panomics，Inc.(Fremont，CA)(以前為Genospectra，Inc.))定量測(cè)定E6AP mRNA的表達(dá)水平。E6AP mRNA水平針對(duì)GAP-DH mRNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。每一個(gè)siRNA采集四個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。使用與E6AP基因不相關(guān)的siRNA雙鏈體作為對(duì)照。特定E6AP特異性siRNA雙鏈體的活性表示為處理細(xì)胞中的E6APmRNA濃度相對(duì)于用對(duì)照siRNA雙鏈體處理的細(xì)胞中的E6APmRNA濃度的百分比。
下面的表2給出了結(jié)果。確定了許多靶向E6AP基因的活性siRNA分子。
表2靶向E6AP的dsRNA的活性。




本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉本說(shuō)明書中具體公開(kāi)的方法和組合物以及其它方法和組合物，從而能夠在隨后所附的權(quán)利要求書的全部范圍內(nèi)實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞中人E6AP基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中，所述dsRNA包含至少兩種相互互補(bǔ)的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)的第二序列，其中，所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達(dá)所述E6AP的細(xì)胞相接觸，會(huì)抑制所述E6AP基因的表達(dá)至少40％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dsRNA，其中，所述第一序列選自表1，所述第二序列選自表1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dsRNA，其中，所述dsRNA包含至少一種修飾的核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的dsRNA，其中，所述dsRNA包含至少一種修飾的核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述修飾的核苷酸選自2’-O-甲基修飾的核苷酸、包含5’-硫代磷酸基團(tuán)的核苷酸和與膽甾醇衍生物或十二烷酸雙癸酰胺連接的末端核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述修飾的核苷酸選自2’-脫氧-2’-氟修飾的核苷酸、2’-脫氧修飾的核苷酸、鎖定核苷酸、脫堿基核苷酸、2’-氨基修飾的核苷酸、2’-烷基修飾的核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然堿基的核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的dsRNA，其中，所述第一序列選自表1，所述第二序列選自表1。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的dsRNA，其中，所述第一序列選自表1，所述第二序列選自表1。
9.一種包含權(quán)利要求1所述的dsRNA的細(xì)胞。
10.一種用于抑制生物體中E6AP基因表達(dá)的藥物組合物，包含dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體，其中，dsRNA包含至少兩種相互互補(bǔ)的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)的第二序列，其中，所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達(dá)所述E6AP的細(xì)胞相接觸，會(huì)抑制所述E6AP基因的表達(dá)至少20％。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中，所述dsRNA的所述第一序列選自表1，所述dsRNA的所述第二序列選自表1。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中，所述dsRNA的所述第一序列選自表1，所述dsRNA的所述第二序列選自表1。
13.一種抑制細(xì)胞中E6AP基因表達(dá)的方法，該方法包括
(a)將雙鏈核糖核酸(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，其中，該dsRNA包含至少兩種相互互補(bǔ)的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)的第二序列，其中，所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達(dá)所述E6AP的細(xì)胞相接觸，會(huì)抑制所述E6AP基因的表達(dá)至少40％；和
(b)維持步驟(a)中產(chǎn)生的細(xì)胞一段足以獲得E6AP基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解的時(shí)間，從而抑制細(xì)胞中E6AP基因的表達(dá)。
14.一種治療、預(yù)防或控制HPV感染介導(dǎo)的病理過(guò)程的方法，包括給予需要這種治療、預(yù)防或控制的患者治療或預(yù)防有效量的dsRNA，其中，該dsRNA包含至少兩種相互互補(bǔ)的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)的第二序列，其中，所述互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸，其中，一旦所述dsRNA與表達(dá)所述E6AP的細(xì)胞相接觸，會(huì)抑制所述E6AP基因的表達(dá)至少40％。
15.一種抑制細(xì)胞中E6AP基因表達(dá)的載體，所述載體包含與編碼dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列可操作地連接的調(diào)控序列，其中，所述dsRNA的一條鏈與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)，其中，所述dsRNA的長(zhǎng)度小于30個(gè)堿基對(duì)，其中，一旦所述dsRNA與表達(dá)所述E6AP的細(xì)胞相接觸，會(huì)抑制所述E6AP基因的表達(dá)至少40％。
16.一種包含權(quán)利要求16所述的載體的細(xì)胞。
17.一種用于降低細(xì)胞中人E6AP基因表達(dá)水平的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中，所述dsRNA包含至少兩種相互互補(bǔ)的序列，其中，有義鏈包含第一序列，反義鏈包括包含與編碼E6AP的mRNA的至少一部分基本互補(bǔ)的互補(bǔ)區(qū)的第二序列，其中，一旦所述dsRNA與表達(dá)所述E6AP的細(xì)胞相接觸，會(huì)降低所述E6AP基因的表達(dá)水平。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的dsRNA，其中，所述接觸降低了所述E6AP基因的表達(dá)水平至少40％。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的dsRNA，其中，所述接觸以30nM或更低的濃度在體外進(jìn)行。
20.一種用于降低生物體中E6AP基因表達(dá)水平的藥物組合物，包含權(quán)利要求17所述的dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體。
21.一種治療HPV相關(guān)病癥的方法，包括給予需要這種治療的患者治療有效量的權(quán)利要求17所述的dsRNA。
22.一種治療E6AP相關(guān)病癥的方法，包括給予需要這種治療的患者治療有效量的權(quán)利要求17所述的dsRNA。
23.一種藥物組合物，包含至少兩種選自權(quán)利要求2所述的dsRNA中的dsRNA。
24.一種治療HPV相關(guān)病癥的方法，包括給予需要這種治療的患者治療有效量的權(quán)利要求23所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染的雙鏈核糖核酸(dsRNA)。dsRNA包含具有小于30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(通常的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸)的核苷酸序列的反義鏈，該核苷酸序列與選自人E6AP基因的HPV靶基因的至少一部分基本互補(bǔ)。本發(fā)明還涉及一種包含dsRNA和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物；通過(guò)使用該藥物組合物治療由HPV感染和E6AP基因的表達(dá)引起的疾病的方法；以及抑制細(xì)胞中HPV靶基因表達(dá)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101743311SQ200880015038
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者J·本森, K·菲茲格拉爾德, B·布拉姆拉格, P·坦恩, H-P·福恩洛赫爾 申請(qǐng)人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司