專利名稱：轉基因生物發(fā)光植物的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及轉基因生物發(fā)光植物。更具體而言，本發(fā)明涉及經(jīng)農(nóng)桿菌或其他本領域公知的途徑已轉染有編碼熒光素酶和熒光素的核酸分子以致所得植物整體或部分發(fā)光的植物細胞。核酸分子可通過該分子已被可操作連接的啟動子區(qū)進行調(diào)節(jié)，所述啟動子區(qū)的設計是調(diào)節(jié)遺傳工程的生物發(fā)光的定時和持續(xù)時間。
現(xiàn)有技術本領域已有一段時間知道某些稱為熒光素酶的酶在諸如熒光素的底物的存在下會生物發(fā)光。熒光素酶包括一大類尤其在細菌、水母、熒火蟲以及多種其他生物體產(chǎn)生的蛋白。編碼熒光素酶的核酸分子已得以鑒定，而且其生物發(fā)光的活性已廣泛用于研究基因調(diào)節(jié)和表達。實際上，通過將熒光素酶蛋白編碼序列插入到待研究啟動子的下游，人們可容易地告知啟動子什么時候已受到所得生物熒光的激活。
熒光素往往是復合有機分子。據(jù)認為，其中有些通過復雜代謝途徑形成，而有些，諸如腔腸素(coelenterazine)，則由多肽氨基酸的環(huán)化產(chǎn)生。直到最近，編碼熒光素的核酸分子才是已知的。這意味著，為了檢測熒光素酶，將熒光素直接施用于表達熒光素酶的生物體。熒光素不得不被靶吸收，其結果是，細胞和相對稀少的組織培養(yǎng)物，包括非常小的秧苗，是唯一合適的宿主。通常，使表達熒光素酶的生物體裂解，然后與熒光素溶液接觸。顯而易見，這殺死宿主生物體。
在研究基因表達中改進使用熒光素酶已經(jīng)做了大量的工作，然而，在實驗室環(huán)境之外和在更大的生物體中，如果不添加化學物質，就不能產(chǎn)生體內(nèi)生物發(fā)光，所有努力都是有限的。
引作參考的授權給Inouye等的U.S.專利No.5,093,240公開了轉基因使用稱為水母素及其衍生物的熒光素酶。該專利公開了在設計用于批量生產(chǎn)的載體中使用熒光素酶。該專利提示大量的熒光素酶可生長于細菌培養(yǎng)物中。但該專利未公開生產(chǎn)胞內(nèi)熒光素的核酸分子，也未預期或公開合適的方法用于將編碼熒光素的序列插入到植物細胞中。
引作參考的授權給Cormier的U.S.專利No.5,162,227還公開了其中已插入編碼熒光素酶的序列的重組DNA載體。同樣，上述專利預期使用這些載體用于在細菌培養(yǎng)物中批量生產(chǎn)熒光素酶。其預計使用熒光素酶基因作為標記基因序列，或選擇基因序列。但其未預期將熒光素編碼的序列加入載體，體內(nèi)生物發(fā)光或者形成適用于植物細胞的轉染載體。
同樣在此引作參考的授權給Cormier等的U.S.專利No.5,422,266公開了很相似于上述段落中所述的發(fā)明。其公開了將熒光素酶基因插入到適于微生物使用的載體中。同上述專利類似，其未預期另插入熒光素編碼的序列，體內(nèi)生物發(fā)光，或使用適于插入到植物細胞中的載體。
引作參考的授權給McElroy等的U.S.專利5,583,024公開了使用在轉錄分析中有用的第二熒光素酶。該專利預期使用熒光素酶定量確定多種不同的啟動子序列的轉錄水平。它要求轉化細胞的裂解，由此死亡。但其未預期體內(nèi)生物發(fā)光或使用熒光素編碼的序列。
引作參考的授權給Szalay等的U.S.專利NO.5,976,796公開了包括熒光素酶和發(fā)熒光蛋白的融合蛋白。專利預期在轉錄分析中使用熒光素酶蛋白作為雙標記。其未提供胞內(nèi)熒光素或體內(nèi)生物發(fā)光。
同樣引作參考的授權給Legocki等的U.S.專利5,221,623公開了在多種不同啟動子的轉錄分析中使用勒克斯細菌熒光素酶基因。但其未預期成熟植物的體內(nèi)生物發(fā)光或使用熒光素編碼序列。此外，勒克斯生物發(fā)光機制要求大量的有機醛。該專利公開了給微生物施用醛蒸汽。這在本發(fā)明中是不實用的。
引作參考的皆授權給Bryan的U.S.專利5,876,995和6,247,995公開了在多種新型項目中使用生物發(fā)光熒光素酶/熒光素機制。將熒光素酶加入到大量產(chǎn)物中，隨后加入熒光素。該專利未公開對熒光素酶/熒光素重組DNA的重組用途，然而，該專利的說明書也非常有用，其對整個生物發(fā)光領域給出了很詳細的課本似的描述。
引作參考的授權給Ward等的U.S.專利No.5,741,668公開了體內(nèi)能夠自發(fā)形成熒光素腔腸素的多肽。該專利公開了通過表達編碼序列，適當?shù)男蛄幸约笆占玫牡鞍锥可a(chǎn)。其未預期將腔腸素編碼序列與熒光素酶組合在單一載體中，以及使用此載體形成生物發(fā)光生物體，諸如成熟植物。
因此，想要的是提供使成熟多細胞生物體，諸如植物，生物發(fā)光的方法。
還想要的是提供誘導生物發(fā)光而無需給生物體施用化學物質的方法。
還想要的是在實驗室設置之外以及無需施用特殊的化學物質就能夠生物發(fā)光的成熟植物。
還想要的是在生物發(fā)光的定時受到控制的地方提供能夠生物發(fā)光的成熟植物。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及使用生物發(fā)光機制創(chuàng)建能夠生物發(fā)光的轉基因生物體，諸如多細胞植物。對諸如糧食作物的生物發(fā)光植物有可預知的優(yōu)勢。能夠產(chǎn)生光的作物利于夜間收獲。一旦收獲，它們最終會停止發(fā)光。因此，作物可在任何時候，包括在較涼的晚間加以收獲。當收獲是可能的時候，這利于收獲并且延長時間段。
優(yōu)選的是，溫室植物和景觀植物用于本發(fā)明。本發(fā)明增強了景觀植物的審美質量。
為了便于植物的生物發(fā)光，至少有兩個編碼序列必須要添加到植物中。第一個編碼序列編碼熒光素酶，而第二個編碼序列編碼熒光素酶的底物熒光素。自然界中發(fā)現(xiàn)有許多不同類型的熒光素酶。不同的熒光素酶以不同的熒光素作為其底物，而熒光素和熒光素酶的適當配對對本領域專業(yè)人員而言是已知的。
熒光素酶和相應的熒光素已在螢火蟲，水母和生活在海洋底部的海洋生命。多年以來，這些組合一直被科學家用來研究基因在多種生物體中的調(diào)節(jié)和表達。由于表達方便檢測，熒光素酶用作極好的標記。
在當今的涉及生物發(fā)光的基因表達分析中，將熒光素酶編碼序列放置在待研究啟動子區(qū)的下游。然后，該重組DNA插入到載體中，再用于轉化植物，動物或細菌細胞。熒光素酶基因的表達或不表達取決于啟動子的活性。接著，細胞裂解在生物發(fā)光緩沖液中，加入熒光素。測量發(fā)射光譜。如果樣品發(fā)光，則表明啟動子區(qū)已誘導表達。本領域技術人員會懂得，這些是常見的表達分析。
體內(nèi)產(chǎn)生熒光素的方法直到最近才已知。這就是為何細胞不得不被裂解并向其中加入熒光素的原因。然而，近來，如授權給Ward等的U.S.專利NO.5,741,668所公開，闡述了形成熒光素coelenterrazine的代謝途徑。coelentenazine為一小組水母中發(fā)現(xiàn)的熒光素酶的底物。這使得熒光素在活細胞中產(chǎn)生。由于此，通過使用合適的核酸分子，任何易受轉化影響的生物體現(xiàn)在可被誘導發(fā)光。
根據(jù)本發(fā)明，熒光素酶和前腔腸素(pre-coelenterazine)在植物細胞內(nèi)表達。優(yōu)選的是，它們僅在植物葉子內(nèi)表達。為了完成此項工作，將熒光素酶和前腔腸素的編碼序列借助載體插入植物細胞中。一個使基因表達限制至葉子細胞的方法必須包括僅特異于葉子細胞表達的上游啟動子區(qū)。已被成功轉染的體細胞或其他植物細胞長成成熟植物。從單個植物細胞中生產(chǎn)成熟植物的方法在本領域是眾所周知的。將控制序列，諸如rubisco小單元啟動子區(qū)，或Cab2啟動子(另一已知的生物鐘啟動子)序列插入熒光素酶和前腔腸素編碼區(qū)的上游。這確保兩個基因僅在植物葉子中表達。Rubisco和Cab2在夜晚下調(diào)。這意味著兩個插入基因在黑暗中也將是下調(diào)的。這防止插入基因的表達給植物施加太大的壓力。由于腔腸素為易損的有機分子，其半衰期為1.5-2小時，植物的生物發(fā)光活性將在黃昏后3-4小時內(nèi)停止。
在某些情形下，對編碼基因需要使用不同的啟動子。具體而言，理想的是使用僅在黑暗中誘導表達的啟動子。這將導致生物發(fā)光夜晚開始和拂曉結束。本領域技術人員會意識到，存在大量的啟動子引起下游表達條件。哪種啟動子最理想將依賴于植物品種以及獨特于考慮之中的情形的額外因素，并且不需在此加以闡述。
為了誘導生物發(fā)光，除了熒光素酶外，腔腸素還需要O2和鈣離子。因此，理想的是使熒光素酶和腔腸素肽靶向特異細胞器官。本領域技術人員會意識到，存在多種多樣的已知靶序列可被加入到多肽N端。通過把編碼靶序列的多核苷酸序列插入編碼序列的5’端而完成此項工作。當這被表達時，靶序列會包括在翻譯的多肽中。然后，靶序列將導向多肽至特異細胞器官。為了保證存在任何需要的輔助因子，這可能是需要的。此外，所有多肽在最適pH下起作用。某些細胞器官的內(nèi)在pH可能對熒光素酶和熒光素是更優(yōu)選的。多種不同的細胞器官還可能提供改進多肽穩(wěn)定性的環(huán)境。本領域技術人員會認識到，這些僅是許多可使熒光素酶和熒光素靶向到特異細胞器官的因子中的一些。
本領域技術人員還會意識到，可能需要將一種或多種其他序列添加到載體中，用于轉染。為了活化或鈍化，一些用于調(diào)節(jié)插入的生物發(fā)光基因的啟動子有可能需要其他蛋白。通常需要轉染載體包括選擇序列。選擇序列編碼的基因賦予諸如卡那霉素和鏈霉素的多種抗生素抗性。這種選擇序列一般用于分離已被成功轉染的細胞。生物發(fā)光也可用作指示劑。因此，使用選擇序列是不必要的。已被成功轉染的細胞可誘導生物發(fā)光，從而從沒有被轉染的細胞中挑選出來。可能需要包括其他序列，諸如編碼轉運蛋白或其他目的蛋白的序列。
附圖簡述

圖1為本發(fā)明重組DNA載體的簡圖。
圖2為形成本發(fā)明轉基因植物的方法的簡圖。
發(fā)明詳述在描述本發(fā)明時，下列術語將使用如下所述的定義。這些術語對本領域技術人員是眾所周知的。
“重組多核苷酸”是指基因組源，cDNA源，半合成源，或合成源的多核苷酸，依據(jù)其來源或操作，所述多核苷酸(1)不與所有或部分同其天然相連的多核苷酸相連，和/或(2)與除了同其天然連接之外的多核苷酸連接，或(3)自然界中不出現(xiàn)。
“多核苷酸”是指任何長度的核苷酸的聚體形式，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。該術語僅涉及分子的一級結構。因此，該術語包括雙鏈和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA。這也包括修飾(“修飾”表示，例如，通過甲基化，磷酸化和/或通過加帽而修飾)和未修飾形式的多核苷酸?！皬椭谱印笔侵溉魏芜z傳元件，例如，在細胞內(nèi)的行為象自動的多核苷酸復制單元一樣；即能夠在其自我控制下復制的質粒，染色體，病毒。
本發(fā)明所用的“載體”是指其中連接著另一多核苷酸區(qū)段以使連接的區(qū)段復制和/或表達的復制子。載體可具有一個或多個多核苷酸或重組多核苷酸以及一個或多個控制序列，如本發(fā)明所用的載體總是包括以可操作連接有編碼序列的啟動子。
“控制序列”是指多核苷酸序列，其必須對所連接的編碼序列的表達和/或分泌施加影響。這類控制序列的性質的差異取決于宿主生物體。在原核生物中，這類控制序列一般包括啟動子，核糖體結合位點和終止子。在真核生物中，這類控制序列一般包括啟動子，終止子，以及在某些情形下還包括增強子。此外，在原核生物和真核生物中，一些控制序列將表達的多肽導向至細胞內(nèi)的特定位置或多細胞生物體內(nèi)的區(qū)域。術語“控制序列”最低目的包括所有對表達必要的組分，并且也可包括影響蛋白表達的其他多核苷酸系列。
“啟動子”是指表達的多核苷酸上游的多核苷酸序列。啟動子序列對細胞機制發(fā)信號以表達其下游的多核苷酸。一些啟動子象開關一樣操作，并且僅向細胞發(fā)信號以在一定的條件下表達下游多核苷酸，諸如當生物體受到昆蟲/病原體進攻，處于環(huán)境中一定溫度之上，或在存在諸如IPTG的特殊化學物質的時候。
“宿主細胞”，“微生物細胞”，“細胞”和其他表示微生物或培養(yǎng)成單細胞實體的高級真核細胞系的術語，可交互使用，是指可用作或已用作重組載體或其他轉移多核苷酸的受體的細胞，并且包括已被轉染的原始細胞的子代。由于意外或故意突變，單個親本細胞在形態(tài)學或基因組或總DNA補體上可以與原始親本細胞不必完全相同，這是可以理解的。與親本有足夠相似的親本細胞的子代可表征為相關屬性，諸如存在編碼目的肽的核苷酸序列，包括在由此定義的子代中，并且由上述術語覆蓋。
“轉化”或“轉染”是指外源多核苷酸插入到微生物細胞，或諸如植物的多細胞生物體的細胞，不管插入所用的方法，例如，直接吸收，轉導，f-接合，粒子轟擊或細菌介導的基因轉移。外源多核苷酸可作為非整合載體，例如質粒，得以維持，或者，可整合到宿主基因組中。
“多肽”是指編碼在多核苷酸內(nèi)的序列的氨基酸產(chǎn)物，而不涉及特定長度的產(chǎn)物。因此，肽，寡肽和蛋白包括在多肽的定義范圍內(nèi)。該術語也不是指多肽的表達后修飾，例如，糖基化作用，乙?；饔?，磷酸化作用，唾液酸化作用等。然而，多肽可被如此修飾。
“轉化多核苷酸”是指本領域已知并用于轉化細胞的任何大量的多核苷酸結構。它們包括但不限于，質粒，噬菌粒，粘粒以及細菌人工染色體(BAC)。它們包括Ti質粒和能夠轉化植物細胞的其他結構，以及其他類型的細胞。
為了多核苷酸的表達需要啟動子這樣的控制序列。有許多已知的啟動子。對給定轉基因生物體而言，哪種啟動子最好，將取決于表達所需的水平以及轉化中的生物體類型。
本領域技術人員會意識到，除了可用于本發(fā)明所述技術的各種載體外，還有多種控制序列可添加到多核苷酸序列上。在一些或所有植物中，生物發(fā)光有可能通過將熒光素酶和相應的熒光素導向至植物內(nèi)的特定位置而得以增強。利用在蛋白N端或C端添加氨基酸所產(chǎn)生的控制序列而完成此項工作。這些添加的氨基酸利用植物內(nèi)的機制以使與它們連接的蛋白導向至植物細胞的特定區(qū)域。例如，有些控制序列導向蛋白至葉綠體，而有些導致蛋白連接到細胞膜。利用這些控制序列將某些蛋白導向至特定位置的技術對本領域技術人員而言是眾所周知的。
本領域眾所周知的是，控制序列也可用于調(diào)節(jié)多核苷酸序列的翻譯和轉錄。這些控制序列可用于調(diào)節(jié)蛋白在其表達的生物體內(nèi)的濃度。給任何給定的載體添加多種類型的這些控制序列是相對簡單的程序。
一些控制序列要求添加第二種調(diào)節(jié)序列。例如，只有在存在抑制劑蛋白時，一些控制序列抑制基因翻譯。在此情形下，必須把編碼抑制劑蛋白的序列添加到載體中。該抑制劑蛋白序列在其上游或下游又有自己的控制序列。為了正確發(fā)揮作用，對抑制劑蛋白序列而言，甚至有可能具有要求第二抑制劑蛋白序列的控制序列。此外，就象有要求抑制劑蛋白的控制序列一樣，也有要求增加基因翻譯的活化蛋白的控制序列。這些控制序列要求添加活化蛋白。
還有在轉錄階段調(diào)節(jié)編碼序列表達的控制序列。這些序列抑制或促進核糖體對mRNA的活性。所有這些機制對本發(fā)明技術人員而言都是眾所周知的。
哪種控制序列，啟動子和載體可用于特定植物將取決于轉化的方法，載體導入的植物以及個人判斷力。
“熒光素酶”是指多種使相應的熒光素氧化從而導致生物發(fā)光的任何酶。本發(fā)明通常被吸引到某些水母中所發(fā)現(xiàn)的熒光素酶上來。術語熒光素酶也指螢火蟲，細菌，魚，烏賊和其他能夠生物發(fā)光的生物體中發(fā)現(xiàn)的氧化酶。
“熒光素”是指其他化合物，其中一些衍生自寡肽，易受到熒光素酶的氧化。在下述具體的實施方案中，腔腸素是優(yōu)選的熒光素，然而，本領域技術人員會意識到，任何在植物細胞內(nèi)可成功生產(chǎn)的熒光素都適用于本發(fā)明。除了水母外，不同的熒光素發(fā)現(xiàn)在水母，細菌，魚，烏賊和其他生物體，并且所有在此引作參考。
“綠色熒光蛋白”或“GFP”是指吸收由coelenterate熒光素酶發(fā)射的藍光，并且借助熒光發(fā)射綠光。福斯特能量轉移效應據(jù)認為可使藍光高度有效地轉化成綠光。通常GFP非共價地結合到熒光素酶/熒光素復合物。改變生物發(fā)光的波長的目的尚未知曉。本發(fā)明公開的前腔腸素多肽具有與GFP一樣的序列，除了在其氨基酸序列中有單個改變以外。
“選擇序列”是指眾多可放置在載體中以使成功轉染的細胞區(qū)別于沒有被轉染的細胞的任何多核苷酸序列。這樣一種選擇序列的例子為編碼啟動子的多核苷酸序列，并且是一種賦予卡那霉素抗性的多核苷酸序列。本領域技術人員會意識到，有多種編碼抗生素抗性的序列，它們常用于選擇轉染的細胞。本領域技術人員還會意識到，除了那些編碼抗生素抗性的序列以外，還有其他選擇序列。
“不育操縱子”是指一種或多種添加到轉染載體導致植物或其他生物體不能夠繁殖的基因。本領域技術人員會意識到，成功的不育操縱子已由Monsanto公司開發(fā)，并正以其ROUNDUP READYTM大豆使用。本領域技術人員還會意識到，這僅僅是許多在植物或其他生物體內(nèi)誘導不育的方法中的一種。這種方法描述在U.S.專利Nos.5,723,765，6,297,426和6,228,643中，所有專利引作參考。
本發(fā)明涉及使用兩種或多種核苷酸序列以構建植物細胞內(nèi)的生物發(fā)光機制。所得植物將發(fā)光至少部分給定時段。優(yōu)選的是讓植物在晚上發(fā)光或至少數(shù)小時發(fā)光。
本發(fā)明可施用給任何類型的植物。在景觀植物和室內(nèi)植物中，本發(fā)明是尤其理想的。樹木，灌木，花草是本發(fā)明所用的理想植物。這些植物通常發(fā)現(xiàn)在居家庭園的景觀中，其中增加的安全性和令人愉快的外觀是高度理想的。單子葉植物，諸如草和棕櫚，以及雙子葉植物，諸如樹和大多數(shù)花，可用于本發(fā)明中。下述的當今植物轉化技術為遺傳修飾任何類型的植物提供了手段。
熒光素酶為本領域所知已有一段時間。它們的多核苷酸和氨基酸序列，染色體座位，晶體結構以及活性位點已得以闡述。水母熒光素酶通常以腔腸素作為底物，在其活性位點處具有酪氨酸肽。以腔腸素為其底物的水母熒光素酶家族包括發(fā)光蛋白質，奧貝林(obelin)和海腎(renilla)熒光素酶。這些熒光素酶稱作coelenterate熒光素酶，都適用于本發(fā)明。在氧和鈣存在下，它們能夠氧化腔腸素。這使得它們尤其適于使用前腔腸素編碼序列。
一旦選擇了合適的熒光素酶/熒光素生物發(fā)光機制，則利用適當?shù)暮塑账嵝蛄修D化或“轉染”真核生物細胞。本領域技術人員會意識到，有眾多方法用于轉染植物細胞。最常見轉染植物細胞的方法是利用來自根瘤農(nóng)桿菌(Agro-bacterium tumefaciens)的“TI”質粒。TI質粒含有T-DNA區(qū)段，TI質粒將其轉移到已轉染植物細胞的染色體中。野生型農(nóng)桿菌的T-DNA可被長達25Kb的多核苷酸替換。在本發(fā)明中，可插入熒光素酶基因，熒光素基因，啟動子，以及任選的選擇序列和任選的附加控制序列，包括靶向序列，來代替T-DNA。然后，農(nóng)桿菌轉染將產(chǎn)生植物細胞，其中這些多核苷酸序列已被整合到其基因組。通過使植物細胞接觸于合適量的激素和營養(yǎng)物，完全成熟的植物可自單個細胞中發(fā)育出來。
根瘤農(nóng)桿菌TI質粒僅轉染雙子葉植物細胞，限制了其應用，然而，利用相似的TI質粒，已發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agro-bacteriumrhizogenes)可成功轉染單子葉植物細胞。本領域技術人員會意識到，為了成功轉染植物細胞，不同類型的植物細胞要求不同類型的質粒和細菌。
其他轉化植物細胞的方法也是存在的。例如，生物彈(biolistics)已用于轉化植物細胞。在此方法中，金屬微顆粒包被有所需的重組DNA。所述重組DNA可能是上述相同的多核苷酸。接著，DNA包被的微顆粒利用火藥，氦氣或其他本領域技術人員公知的方法加速至一速度，以致它們可滲透植物細胞。生物彈的優(yōu)點之一在于，它可用于任何植物細胞上。
微注射是另一轉化植物的方法。該方法包括使用顯微針滲透和直接注射DNA至植物細胞核。
另一適于所有類型植物細胞的轉化方法是電穿孔。電穿孔包括使用強大的電脈沖使植物細胞休克。其立刻破壞植物細胞膜導致其中形成孔。然后，周圍溶液中的重組多核苷酸由這些孔進入植物細胞。
另一轉化植物細胞的方法是將它們接觸聚乙烯醇(PEG)。植物細胞葉綠體接觸PEG使得它們立刻可滲透。象電穿孔一樣，該方法也使周圍溶液中的DNA方便地滲透到細胞中。
本領域技術人員會意識到，還有其他轉化植物細胞的方法，包括使用硅化纖維(silicone fibers)。哪種轉化方法最適用，將取決于多種本領域技術人員公知的因素。這些因素包括但不限于，在轉化植物細胞的類型，在用熒光素酶和熒光素基因的類型，待插入重組DNA分子的大小，可用的設備以及方法的相對耗費。
細菌人工染色體“BAC”可與長達350Kb的重組多核苷酸片段一起用于轉化植物細胞。此外，已發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌的TI質?？沙晒D染單子葉植物細胞。二元載體，如同pBIN 20載體，為含有TI質粒和毗連序列的質粒，讓它們也轉染植物細胞。
在轉化和長成成熟植物的植物細胞中，由重組DNA編碼的生物發(fā)光機制將依據(jù)所用的啟動子加以表達，從而導致植物生物發(fā)光。
在本發(fā)明一個具體的實施方案中，參照附圖1，重組TI質粒10用于轉染植物細胞。質粒10包括毒力編碼區(qū)12，插入?yún)^(qū)52和非編碼區(qū)50。非編碼區(qū)50不編碼任何肽，并且沒有控制序列。復制(replacation)起點區(qū)48含有可被DNA聚合酶識別的序列，并且是質粒開始復制的點。
毒力區(qū)12為相對大的含有多核苷酸序列的操縱子，所述多核苷酸序列編碼導致根瘤農(nóng)桿菌侵入植物細胞的蛋白。這些序列包括virA14，virB 16，virG 18，virC 20，virD 22，virE 24，virF 26和virH 28。由這些基因編碼的蛋白和酶檢測已受傷植物釋放的化學物質。其后，它們連接并侵入植物細胞。它們是TI質粒為了成功轉染植物細胞所必須的組分。插入?yún)^(qū)52含有全部待插入植物基因組的編碼和控制序列。左邊32和右邊30分別由25個堿基對多核苷酸序列組成，所述序列負責把插入?yún)^(qū)52插入到植物基因組中。限制區(qū)54各自包括一系列限制性位點。本領域技術人員對限制性位點十分熟悉。它們是很短的序列，為核酸內(nèi)切酶所識別，并且利于把多核苷酸序列剪接到T-DNA區(qū)。本領域技術人員會意識到，對TI質粒農(nóng)桿菌有許多公知的修飾。至少有幾十種版本的TI質粒，而限制區(qū)54上存在的真正限制性位點將根據(jù)使用哪種修飾的TI質粒，通常，使用哪種限制性位點以向其中剪接所需的插入?yún)^(qū)DNA，而得以確定。質粒沒有區(qū)別。一般而言，理想的是使用插入?yún)^(qū)重組DNA的5’和3’端上的不同限制性位點。這可防止質粒自身連接而不是同插入?yún)^(qū)連接。還有可能在5和3端使用相同的限制性酶。
序列36編碼熒光素酶基因。其受到啟動子序列34的調(diào)節(jié)。在該具體的實施方案中，靶向序列46位于熒光素酶基因序列36的5’端。靶向序列46編碼添加到熒光素酶N’端的其他肽序列。該靶向序列導致胞內(nèi)機構把熒光素酶導向至細胞的特定細胞器官或區(qū)域。靶向序列可導向蛋白至多種細胞器官，包括但不限于，高爾基體，線粒體，葉綠體，溶酶體，過氧化物酶體，核小體，或其他細胞器官。包括靶向序列46是任選的，因為熒光素酶/熒光素反應會發(fā)生在胞液中，但是，將酶及其底物靶向到特定的細胞器官由于許多原因可能是有利的。多種不同的細胞器官具有最適的pH，更高濃度的O2，ATP和/或鈣。同樣，將所有熒光素酶和熒光素導向至細胞器官會導致相對濃度更高的酶，從而加速反應。其結果縮短了消耗熒光素所需的時間，但是也增加了生物發(fā)光植物的亮度。
啟動子區(qū)34可以是多種本領域公知的任何啟動子序列。在此具體的實施方案中，使用a/b光活性復合物的Cab2啟動子區(qū)。當夜幕降臨時，Cab2啟動子下調(diào)下游序列。這表明熒光素酶序列將在黃昏前后終止表達。下調(diào)外源序列使得植物使用其能量以及其他天然功能用的氨基酸和核糖體。有可能使用其他從不關閉的啟動子，即組成型啟動子。還有可能使用在晚間上調(diào)而在日間下調(diào)的啟動子。本領域公知有眾多涉及生物鐘的啟動子區(qū)，根據(jù)它們所接觸到的日光量而調(diào)節(jié)表達。由于這些植物的生物發(fā)光只在黑暗中可見，因此優(yōu)選的是生物發(fā)光由它們所接觸到的光量進行調(diào)節(jié)。然而，這不是必須的，可使用任何需要的啟動子。
多種植物啟動子是公知的，并且可用于促進生物發(fā)光機構在植物內(nèi)多種位置中的表達。在開花植物中，誘導花自身生物發(fā)光可能是理想的。或者，在結果植物中，僅誘導果實生物發(fā)光可能是理想的。生物發(fā)光所需的位置，所需的持續(xù)時間以及植物物種將確定所用的啟動子。
熒光素編碼區(qū)40相似地受到啟動子區(qū)38的調(diào)節(jié)。優(yōu)選的是，啟動子序列34和啟動子序列38是部分相同序列，但這不是必要的。在此具體的實施方案中，熒光素酶利用腔腸素，而編碼區(qū)40編碼前腔腸素肽，例如授權給Ward等的’668專利中所述的肽，所述專利引作參考。一旦基因轉錄并被翻譯成多肽，前腔腸素多肽自發(fā)地與自身反應，導致由兩個酪氨酸和一個苯丙氨酸組成的環(huán)三肽形成腔腸素。腔腸素的半衰期相對較短，即大約1個半小時到兩個小時，因此，理想的是，對啟動子38使用不同于啟動子序列34的啟動子序列。該啟動子區(qū)38包括Cab2或其他在晚間關閉的生物鐘啟動子。照此，該具體實施方案的生物發(fā)光僅在黃昏后持續(xù)數(shù)小時。更理想的是利用黃昏時開啟的啟動子。還優(yōu)選使用不依賴于生物鐘的啟動子。
在這具體的實施方案中，熒光素基因40編碼前腔腸素。本領域技術人員會意識到，為了形成胞內(nèi)熒光素，其他熒光素要求代謝途徑以及一種基因以上的操縱子。本領域技術人員會意識到，本發(fā)明可包括其他更多的復合操縱子代替單個多肽。正如本領域還已知和在此所述，使用其他的熒光素需要使用替代的熒光素酶基因36。
該具體的實施方案也包括編碼卡那霉素抗性的選擇序列42。本領域技術人員會意識到，這僅是若干可能的選擇序列中的一種。其他遍在抗生素抗性選擇序列包括那些給鏈霉素和潮霉素賦予抗性的選擇序列。本領域技術人員還會意識到，選擇序列本身是不必要的，因為生物發(fā)光本身可用作選擇標記。如果需要，使用抗生素抗性或其他選擇標記也是可能的。
某些啟動子區(qū)要求附加基因以幫助調(diào)節(jié)。在插入?yún)^(qū)52中有可能包括這些基因。在這具體的實施方案中，使用Cab2啟動子區(qū)，而其他控制序列是非必需的。本領域技術人員會意識到，使用Cab2表明，該質粒對于轉化擬南芥(arabidopsis)以及其他植物是適當?shù)?。采用何種啟動子將取決于在轉化植物的類型以及生物發(fā)光所需的定時。
圖2示出了利用圖1所示的質粒形成生物發(fā)光植物的方法。將質粒10插入到根瘤農(nóng)桿菌，并且與葉片62一起置于接種溶液64中。葉片62撕成部分72，其中葉子已受傷。一旦葉片62被接種，將其轉移至含有生長培養(yǎng)基76的培養(yǎng) 66中。生長培養(yǎng)基76具有的營養(yǎng)足以使轉染的細胞保持存活。沿著受傷的部分72，葉片62現(xiàn)在具有轉染細胞74的區(qū)域。將熟化溶液68反復添加到培養(yǎng)皿66中。熟化溶液68包括使轉染細胞發(fā)育成成熟植物的營養(yǎng)物和激素。在這具體的實施方案中，轉染細胞遺留在葉片62上，從而產(chǎn)生單個轉基因植物70。本領域技術人員會意識到，各個轉染細胞可自動被分離和長成成熟植物。本領域技術人員會意識到，該圖表是簡化的過程，以及含有許多步驟并且需要若干周或數(shù)月的時間才能發(fā)育成幼株。在轉基因樹和大型灌木的情形下，在開發(fā)出成熟轉基因生物發(fā)光植物之前，需要幾年時間。
理想的是，這些轉基因生物發(fā)光植物是不育的。如果植物不能繁殖，那些反對基因修飾生物體的人們可能更能接受它們。本領域技術人員會意識到，用于使遺傳修飾的生物體不育的方法已被開發(fā)出來了。這些方法描述在U.S.專利Nos.5,723,765，6,297,426和6,228,643，參照同上。胚胎學領域技術人員會意識到，有若干啟動子序列受到生物體年齡的調(diào)節(jié)。當植物第一次發(fā)芽時，有些啟動子開啟，而有些啟動子關閉。隨著植物老化，這些啟動子中有些將最終關閉，而有些啟動子則開啟。含有待插入到植入基因組中的基因的重組對核苷酸包括受早期發(fā)育啟動子序列活化的操縱子。這將導致如圖1中示為操縱子44的操縱子誘導生成殺死秧苗的毒素，從而阻止植物產(chǎn)生后代。
在這具體的實施方案中，毒素基因序列44編碼抑制胞內(nèi)機構的核糖體抑制蛋白(RIP)。啟動子58具有眾多本領域技術人員公知的任何啟動子序列，這些序列在萌芽時具有活性，但在其后不久就失活。序列58和44是任選的。
不是所有的熒光素代謝途徑都已得以闡述。然而，本領域技術人員會認識到，完成此項工作有多種方法。一個優(yōu)選的方法是利用基因組文庫。例如，特定物種的整個基因組可被切成若干較短的DNA鏈。染色體與一種或多種限制性酶混合，導致染色體被切成多條DNA鏈。然后，限制性酶通過變性或其他本領域公知的方法鈍化。接著，DNA鏈插入到質粒，噬菌粒，粘?；駼AC。本領域技術人員會認識到，該方法常用于形成多種物種的基因組文庫。單個植物細胞可以培養(yǎng)皿，液體培養(yǎng)基或其他本領域公知的手段進行培養(yǎng)。利用TI質?；蛉缟纤龅钠渌椒▽λ鼈冞M行轉化。通過轉化插入編碼熒光素酶蛋白的DNA。使用控制序列，諸如上述卡那霉素抗性，是選擇性生長僅被轉化的植物細胞的常見方法。成功轉化的植物細胞能夠表達熒光素酶。Cab2啟動子，溫度敏感啟動子，或其他手段可用于調(diào)節(jié)熒光素酶基因的翻譯和轉錄。利用由上述方法創(chuàng)建的基因組文庫，這些其中具有編碼的熒光素酶基因的植物細胞可被第二次轉化。本領域技術人員顯而易見的是，用于初始轉化植物細胞的熒光素酶必須來自DNA文庫衍生的同一物種。生物發(fā)光領域的技術人員懂得，多種物種的熒光素酶一般與其他物種的熒光素不相容。
位于質粒，噬菌粒，粘?；駼AC內(nèi)的控制序列用于制備文庫，優(yōu)選區(qū)別于初始轉化中所用的控制序列。例如，如果初始質粒具有卡那霉素抗性，則優(yōu)選的是，第二種轉化用多核苷酸序列編碼針對另一抗生素，諸如慶大霉素的抗性。然后，轉化的植物細胞可生長在既含有卡那霉素又含有慶大霉素的培養(yǎng)基中，以致僅對含有兩個質粒的植物細胞加以選擇。這導致對其中已摻入熒光素酶基因和部分基因組文庫的植物進行選擇。本領域技術人員會意識到，編碼熒光素代謝途徑的操縱子有可能存在于至少一種雙轉化的植物細胞中。植物細胞生長在為熒光素基因和基因組文庫基因提供表達的條件下。任何代謝熒光素的植物細胞將生物發(fā)光。這些植物細胞可長成會生物發(fā)光的成熟植物。
此外，理想的是分離生物發(fā)光的植物細胞，并且鑒定對熒光素代謝負責的多核苷酸序列。一旦分離出熒光素代謝操縱子，可將其摻入到同樣的質粒，噬菌粒，粘?；駼AC中作為原始熒光素酶基因。這個新轉化多核苷酸可用于轉化植物細胞，由此通過單次轉化途徑提供生物發(fā)光植物細胞。所述細胞可長成生物發(fā)光的成熟植物。
上述方法可用于闡述許多物種的熒光素酶/熒光素基因。
為了利于生物發(fā)光，對植物細胞進行附加修飾的一個例子是把勒克斯操縱子加入植物中。通常，勒克斯操縱子據(jù)信在植物細胞中是無效的。這部分是由于缺乏可用的黃素單核苷酸，所述黃素單核苷酸不與黃素蛋白結合，在胞液內(nèi)是游離的，并且以其還原態(tài)存在。FMNH2為勒克斯生物發(fā)光反應所需的底物。為了確保有足夠的FMNH2存在于胞液中，可采取兩個步驟。第一步，將FMN還原酶基因摻入轉化多核苷酸中。其可通過相同或不同于調(diào)節(jié)熒光素酶和/或熒光素基因所用的啟動子加以調(diào)節(jié)。一般而言，理想的是，還原酶蛋白的表達量足以提供足量的FMNH2來促進生物發(fā)光反應。本領域技術人員會意識到，還原酶蛋白的過表達可能會破壞胞內(nèi)化學。
另一調(diào)節(jié)胞內(nèi)FMNH2的量的方法是在轉化多核苷酸內(nèi)包括編碼對FMNH2代謝所必需的蛋白的操縱子。為了在胞液中提供足量的游離FMNH2，可使用適當?shù)膯幼有蛄小Ｔ摬倏v子可以或不可以包括FMN還原酶基因。
另一在胞液中提供游離FMNH2的方法是在轉化多核苷酸中包括控制序列，所述控制序列在植物細胞內(nèi)上調(diào)天然FMNH2代謝途徑。這個上調(diào)控制序列自身可受到啟動子區(qū)的調(diào)節(jié)，所述啟動子區(qū)控制天然FMNH2代謝操縱子的上調(diào)程度。
盡管本發(fā)明參照附圖已經(jīng)加以描述，但是應該理解，在本發(fā)明的實質和范圍內(nèi)，除了在此所示或暗示的之外，還可進行其他和進一步的修飾。
權利要求
1.一種制備轉基因生物發(fā)光植物的方法，其包括用至少一種編碼熒光素酶的基因和熒光素的基因的載體轉染至少一種植物細胞，所述熒光素與編碼的熒光素酶相容；將所述至少一種植物細胞生長成成熟植物；以及提供調(diào)節(jié)所述編碼熒光素酶的基因和所述編碼熒光素的基因的表達的手段。
2.權利要求1的方法，其中所述編碼熒光素酶的基因為編碼發(fā)光蛋白的基因。
3.權利要求1的方法，其中所述編碼熒光素酶的基因為編碼奧貝林的基因。
4.權利要求1的方法，其中所述編碼熒光素酶的基因為編碼海腎熒光素酶的基因。
5.權利要求1的方法，其中所述編碼熒光素的基因編碼腔腸素前體。
6.權利要求1的方法，其中所述載體進一步包括不育操縱子，并且不能繁殖。
7.權利要求6的方法，其中所述不育操縱子編碼至少一種毒素基因序列，在所述毒素基因序列的上游具有啟動子序列，所述啟動子序列在萌芽時被活化，但在成熟植物中不被活化。
8.權利要求7的方法，其中所述毒素為核糖體抑制劑蛋白。
9.權利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)所述編碼熒光素酶的基因和所述編碼熒光素的基因的表達的手段為rubisco 5’啟動子區(qū)。
10.權利要求1的方法，其中所述編碼熒光素酶的基因進一步包括靶向序列，以致表達的多肽被導向至特定的細胞器官。
11.權利要求10的方法，其中所述特定細胞器官選自高爾基體，線粒體，葉綠體，溶酶體，過氧化物酶體和核小體。
12.權利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)所述編碼熒光素酶的基因和所述編碼熒光素的基因的表達的手段為rubisco 5’啟動子區(qū)。
13.一種通過權利要求1的方法形成的轉基因植物，其中所述熒光素酶編碼基因編碼發(fā)光蛋白，而所述熒光素編碼基因編碼前腔腸素蛋白，以及其中所述熒光素酶編碼基因和所述熒光素編碼基因受rubisco小單元5’啟動子區(qū)的調(diào)節(jié)。
14.權利要求1的方法，其中所述調(diào)節(jié)所述編碼熒光素酶的基因和所述編碼熒光素的基因的表達的手段為Cab2啟動子區(qū)。
15.一種轉基因生物發(fā)光植物，包括至少一種植物細胞；重組DNA區(qū)段，其摻入所述至少一種植物細胞的基因組中；其中所述重組DNA包括至少一種編碼熒光素酶的基因和至少一種編碼至少一種能夠形成胞內(nèi)熒光素的蛋白的基因；以及至少一種位于所述編碼熒光素酶的基因上游的5’啟動子序列，以及至少一種位于所述至少一種編碼至少一種能夠形成胞內(nèi)熒光素的蛋白的基因上游的5’啟動子序列。
16.權利要求15的植物，其中所述編碼熒光素酶的基因編碼發(fā)光蛋白。
17.權利要求15的植物，其中所述編碼熒光素酶的基因編碼奧貝林。
18.權利要求15的植物，其中所述編碼熒光素酶的基因編碼海腎熒光素酶。
19.權利要求15的植物，其中所述編碼熒光素的基因編碼腔腸素前體。
20.權利要求15的植物，其中所述重組DNA區(qū)段進一步包括不育操縱子，并且不能夠繁殖。
21.權利要求20的植物，其中所述不育操縱子包括編碼毒素的基因，所述毒素的基因具有在萌芽時被活化但在成熟植物中被鈍化的5’啟動子序列。
22.權利要求15的植物，其中所述至少一種位于所述編碼熒光素酶的基因上游的5’啟動子序列以及所述至少一種位于所述至少一種編碼至少一種能夠形成胞內(nèi)熒光素的蛋白的基因上游的5’啟動子序列選自Cab2啟動子區(qū)和rubisco啟動子區(qū)。
23.一種制備生物發(fā)光植物的方法，包括用具有編碼熒光素酶基因的轉化多核苷酸轉化植物細胞；用來自基因組文庫的轉化多核苷酸第二次轉化植物細胞；選擇能夠生物發(fā)光的植物細胞；以及使生物發(fā)光植物細胞長成成熟植物。
24.一種制備生物發(fā)光植物的方法，包括在植物細胞的胞液中提供游離還原型黃素單核苷酸；用其中摻有勒克斯操縱子的轉化多核苷酸轉化植物細胞；以及使植物細胞長成成熟植物。
全文摘要
本發(fā)明創(chuàng)建了轉基因植物，其中摻入有熒光素酶基因和相應的熒光素底物基因。調(diào)節(jié)這些基因，從而黑暗后經(jīng)過一定時間，這些基因被表達而導致生物發(fā)光。熒光素/熒光素酶的不同組合可用于這些轉基因植物中，這取決于所需的波長和轉染的植物物種。
文檔編號C12N15/82GK1668747SQ03817064
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月10日 優(yōu)先權日2002年7月15日
發(fā)明者布魯斯·埃里克·胡德金斯 申請人:布魯斯·埃里克·胡德金斯