專利名稱：：修飾的突變體膠原蛋白酶及其在脂肪溶解和疤痕減少中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于脂肪溶解和疤痕減少的修飾的突變體膠原蛋白酶。
背景技術(shù)：
：1)脂肪減少肥胖日益成為影響美觀和健康的重大問題。很多醫(yī)藥公司正在開發(fā)能夠減輕人們體重的藥物。脂肪抽吸是一種主要的擺脫過量脂肪的治療方法，在美國每年有700,000例脂肪抽吸手術(shù)。然而，脂肪抽吸非常具有侵害性，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。脂肪分解霜是一種非介入性的方法，用來改善含有過量脂肪的身體各區(qū)域的外觀。但是市場(chǎng)上并沒有有效的脂肪分解霜?，F(xiàn)有的脂肪分解霜僅有可能暫時(shí)地縮小脂肪細(xì)胞，而不能清除它們。脂肪抽吸是一種利用真空(在負(fù)壓環(huán)境下)通過機(jī)械手段去除皮下脂肪的方法。美容行業(yè)運(yùn)用脂肪抽吸術(shù)來去除男性和女性人體特定區(qū)域的過量脂肪。脂肪抽吸術(shù)很容易導(dǎo)致感染、瘀傷、外表變形和皮下組織的機(jī)械損傷。因此使用機(jī)械力作用的脂肪抽吸術(shù)不能令人滿意。皮下脂肪團(tuán)對(duì)人們來說是個(gè)大問題。雖然目前自稱能減少或消滅皮下脂肪團(tuán)的產(chǎn)品正在迅速增加，但關(guān)于它們功效的研究卻依然非常少?？偟恼f來，這些研究清楚地表明這些產(chǎn)品沒有效果，但是，很遺憾，人們很難抵抗這些藥劑的誘惑。事實(shí)上，根據(jù)美國皮膚病學(xué)會(huì)的研究，皮下脂肪團(tuán)是成年女性身體內(nèi)儲(chǔ)存脂肪的天然途徑。對(duì)于一些婦女，尤其是非常痩的婦女而言，只有箍縮皮膚才能看到皮下脂肪團(tuán)，但是對(duì)于大多數(shù)婦女來說，總是可以看到一定數(shù)量的脂肪團(tuán)。皮下脂肪團(tuán)被認(rèn)為是由于脂肪細(xì)胞的累積形成的，這些脂肪細(xì)胞突出或交錯(cuò)于可能被衰弱了的皮膚層。很多出售抗-皮下脂肪團(tuán)產(chǎn)品的公司將其稱之為"被囚禁的脂肪"，這實(shí)際上是一種不錯(cuò)的類比。能夠絕對(duì)肯定的是女性較之男性更加容易形成皮下脂肪團(tuán)，很可能是因?yàn)樗齻兊耐尾亢痛笸炔坑懈嗟钠は轮炯?xì)胞(來源JournalofAppliedPhysiology,2002年4月，第1611-1618頁)。有一份很長(zhǎng)的產(chǎn)品名單，聲稱將它們涂抹到皮膚上就能夠以某種方式解離身體脂肪并改善膚色，以消滅或減少皮下脂肪團(tuán)的出現(xiàn)。雖然這些洗液和藥劑受到大眾歡迎，但是有兩個(gè)問題仍然沒有解決(1)不同產(chǎn)品之間缺乏處方的連貫性，和(2)沒有證據(jù)表明這些產(chǎn)品的功效(來源:SkinResearchandTechnology,2002年5月，第118-124頁)。歐洲皮膚病學(xué)雜志(TheEuropeanJournalofDermatology,2000年12月，第596-603頁)研究了32種消脂產(chǎn)品，其分別含有4到31種成分，其間很少有相似點(diǎn)。"44種不同的植物性藥材和39種不同的潤(rùn)膚劑被用于32種產(chǎn)品中。存在于14種產(chǎn)品中的咖啡因是最常用的添加劑，其似乎代表了一種'活性'成分。在其它方面，這些產(chǎn)品的組分與護(hù)膚霜類似。"化妝品公司所做的是在沒有證據(jù)表明它們能夠起作用的情況下隨機(jī)加入植物成分，但是那些暗示性的聲明卻在誘惑消費(fèi)者來嘗試一種又一種神奇的抗-皮下脂肪團(tuán)藥劑。氨茶堿，一種支氣管擴(kuò)張?zhí)幏剿?打開肺部通道)，因?yàn)榭怯诜逝职Y研究(ObesityResearch,1995年11月，附頁561S-568S)的一篇論文，作為脂肪分解霜的一種成分得以聞名。然而，刊登于塑料和重建外科(PlasticandReconstructiveSurgery,1999年9月，第1110-1114頁)的一篇論文提出了對(duì)氨茶堿價(jià)值的懷疑，這篇論文描述了對(duì)于三組不同的婦女使用三種不同的皮下脂肪團(tuán)處理方法的雙盲研究。因此，氨茶堿看上去并不是能夠解決脂肪團(tuán)的答案，雖然它在一些脂肪分解霜中仍然存在。咖啡因，由于是氨茶堿的"遠(yuǎn)親"，而被用作脂肪分解霜的一種成分。有兩組研究表明咖啡因?qū)ο幸嫣?，但是其中一組研究是由Johnson&Johnson進(jìn)行的，其擁有RoC和Neutrogena兩個(gè)公司，二者均出售含咖啡因的脂肪分解霜；另一組研究是由出售抗-皮下脂肪團(tuán)化合物的化妝品成分制造商進(jìn)行的(來源JournalofCosmeticScience,2002年7-8月，第209-218頁)。沒有其他獨(dú)立的研究表明咖啡因?qū)τ谔幚砥は轮緢F(tuán)有益處，也沒有研究指明需要多少咖啡因才能夠產(chǎn)生效果。2)疤痕減少疤痕是由創(chuàng)傷愈合后膠原蛋白過度生長(zhǎng)形成的。大多數(shù)除疤產(chǎn)品包含片狀或凝膠狀的硅膠，以及洋蔥提取物(Mederma皮膚護(hù)理產(chǎn)品)。通常需要超過3個(gè)月才能看到一些效果，因?yàn)檫@些產(chǎn)品不包含有效地活性成分，例如任何形式的膠原蛋白酶，其靶向疤痕形成的原因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種組合物，包括一種修飾的單一突變體膠原蛋白酶ColH-FM，其中的ColH-FM是一種溶組織梭狀芽胞桿菌(6VostrjW，力A^^/"'c"孤)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)，并在ColH(Glu451Asp)前附加有肽基序CKGGRAKDC-G(x)，x等于2-6。所述組合物可以進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體，例如那些選自由生理鹽水、葡聚糖水溶液、和羥乙基淀粉水溶液所組成的組。5在另一方面，本發(fā)明提供一種ColH(Glu451Asp)在制備減少身體指定位置脂肪組織數(shù)量的藥物中的用途，其包括向所述藥物引入有效量的單一ColH(Glu451Asp)，或附加有N-末端或C-末端標(biāo)簽的CKGGRAKDC-G(2-6個(gè)G)的相同的突變體膠原蛋白酶，或任何能夠靶向人體和動(dòng)物體內(nèi)白色脂肪維管結(jié)構(gòu)的其它肽類。進(jìn)一步地，ColH(Glu451Asp)或被修飾的ColH(Glu451Asp)可以用于制備減少和消除脂肪瘤的藥物，以及減少疤痕的藥物。本發(fā)明還涉及一種減少體內(nèi)指定位置的脂肪組織數(shù)量的方法，其包括向所述組織引入有效量的突變體膠原蛋白酶，或附加有N-末端或C-末端標(biāo)簽CKGGRAKDC-G(2-6個(gè)G)的相同的突變體膠原蛋白酶，或任何能夠靶向人體和動(dòng)物體內(nèi)白色脂肪維管結(jié)構(gòu)的其它肽類。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的脂肪組織是皮下的。優(yōu)選的，突變體全長(zhǎng)ColH來自于溶組織梭狀芽胞桿菌(C7o^nVi鵬/^t^7"c咖)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的突變體ColH是突變于E451D。具體的，在展開的序列中ColH第451位的谷氨酸被突變成天冬氨酸(440DRLTWYEEGGAE451)，其中ColH突變體的活性是野生型ColH的20%。或者所述的突變體ColH是在Glu451處突變?yōu)槠渌?0種氨基酸殘基的任何一種，特別是E451A和E451Q。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述在藥學(xué)上可接受的載體中的突變體膠原蛋白酶被注射到所述脂肪組織中，優(yōu)選的，使用液體的藥學(xué)上可接受的載體中的突變體膠原蛋白酶溶液進(jìn)行注射，優(yōu)選的，所述載體為水溶液，更加優(yōu)選的，所述脂肪組織是皮下的，所述溶液透過皮膚在一個(gè)位置或多個(gè)相近位置進(jìn)行注射。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾的突變體膠原蛋白酶在表皮的藥學(xué)上可接受載體中，其可以通過透皮給藥技術(shù)，例如Hydroxysome技術(shù)，被送到皮下的白色脂肪細(xì)胞或凸起的疤痕中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，突變體膠原蛋白酶的用量為每克待治療的脂肪組織大約1到30ABC單位的突變體膠原蛋白酶(肥胖大鼠中1-50單位每脂肪墊)。膠原蛋白酶ABC活性單位在37'C下使用WorthingtonBiochem的膠原蛋白酶分析流程(保溫5小時(shí))進(jìn)行計(jì)算。優(yōu)選的，突變體膠原蛋白酶在液體的藥學(xué)上可接受載體中以濃度為5到大約500ABC單位每毫升被引入。此外優(yōu)選的，突變體膠原蛋白酶在表皮霜?jiǎng)┑乃帉W(xué)上可接受載體中以濃度為5到大約500ABC單位每毫升被引入。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述藥學(xué)上可接受載體中的突變體膠原蛋白酶被注射入所述脂肪瘤中。所述藥學(xué)上可接受載體中的突變體膠原蛋白酶作為一種化學(xué)的脂肪抽吸劑被注射入脂肪墊。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的突變體膠原蛋白酶可以伴隨透皮技術(shù)用作脂肪分解霜，或替代脂肪抽吸術(shù)的表皮霜?jiǎng)蚩捎糜诎毯蹨p少的霜?jiǎng)?。換言之，本發(fā)明提供一種新的方法來減少過量的不美觀和/或冗余的皮下脂肪組織，其為非-介入性的方法，例如注射或表皮霜?jiǎng)?。本產(chǎn)品可以通過注射或表皮脂肪分解霜被用作化學(xué)的脂肪抽吸劑。當(dāng)生物工程突變體ColH被引入活體動(dòng)物的皮下脂肪組織中的時(shí)候，在該部位脂肪組織發(fā)生分解和減少。該方法既溫和又精確，其不會(huì)對(duì)人體造成外傷，也不會(huì)產(chǎn)生感染。本發(fā)明還致力于脂肪瘤的減少和清除，不論脂肪瘤是發(fā)現(xiàn)于皮膚表面、皮膚內(nèi)部、皮下、或是身體的任何其它部位。脂肪瘤一般地是脂肪組織的良性腫瘤。目前，脂肪瘤通過手術(shù)進(jìn)行去除，其潛在地造成被手術(shù)的病人的疼痛和血腫。本發(fā)明通過向脂肪瘤引入有效量的突變體ColH而避免了這些問題。該突變體蛋白比野生型ColH更加穩(wěn)定，而具有更低的活性。其以緩慢柔和的方式溶解脂肪，且在肥胖大鼠的解剖實(shí)驗(yàn)中很少觀察到出血。ColH突變體可以被開發(fā)為藥物，因?yàn)樗且环N單一的物質(zhì)，易于進(jìn)行CMC(化學(xué)品生產(chǎn)控制)。本發(fā)明額外的應(yīng)用是疤痕減少，無論疤痕是否發(fā)現(xiàn)于皮膚表面。突變體膠原蛋白酶能夠消化凸起的疤痕組織中過度生長(zhǎng)的膠原蛋白，從而減少疤痕的高度和外觀。純化自商業(yè)來源的膠原蛋白酶(包括來自溶組織梭狀芽胞桿菌的)是由5-6種膠原蛋白酶組成的混合物。即使經(jīng)過高度純化，具有相似的分子量和等電點(diǎn)(PIs)的ColH和ColG也是很難進(jìn)行分離的。因此，來自溶組織梭狀芽胞桿菌的高度純化版本的膠原蛋白酶仍然包括ColG和ColH的混合物。在我們進(jìn)行的肥胖大鼠實(shí)驗(yàn)中，通過常規(guī)過程純化的野生型膠原蛋白酶誘導(dǎo)了大量出血。本發(fā)明還可以被用于治療脂肪瘤和其它脂肪組織，其可以在人和動(dòng)物體內(nèi)、在野生動(dòng)物中、在人類家庭中、或在動(dòng)物園里。人類含有一層脂肪組織，其主要由我們皮下相互連接的脂肪細(xì)胞組成。本發(fā)明通過向脂肪組織中引入有效量的單一突變體ColH(溶組織梭狀芽胞桿菌)，能夠減少我們皮下脂肪組織的數(shù)量。在來自于"組織進(jìn)展(AdvanceTissues公司)"的專利中，他們使用了一種來自于溶組織梭狀芽胞桿菌的膠原蛋白酶混合物，其在我們進(jìn)行的大鼠實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)了大量出血。1)為了降低膠原蛋白消化活性的ColH突變基礎(chǔ)因?yàn)槿芙M織梭狀芽胞桿菌膠原蛋白酶廣泛的底物專一性和在培養(yǎng)物濾液中的大量存在，它已經(jīng)被普遍地用于可聯(lián)結(jié)組織的分解和組織培養(yǎng)細(xì)胞的分離(Seglen，P.O.1976，Preparationofisolatedratlivercells.MethodsCellBiol.13:29-83)。然而，至少六種具有分子量范圍為68-125kD的不同形式(膠原蛋白酶)存在于商業(yè)制備的產(chǎn)品中(Bond,M.D.，禾口VanWart,H.E.，1984，CharacterizationofindividualcollagenasesfromC7o5^"Vi"孤力i5^0J7Wc諷Biochemistry23:3085-3091)。將單一的酶進(jìn)行分離的困難和市售膠原蛋白酶制備中不同批次的差異限制了它的實(shí)際應(yīng)用?；瘜W(xué)品生產(chǎn)控制(CMC)在藥物開發(fā)中是非常重要的。每一批次的制備都應(yīng)當(dāng)是一致的。因此，這種純化困難導(dǎo)致將直接純化自溶組織梭狀芽胞桿菌的膠原蛋白酶作為藥物施用于人體的過程出現(xiàn)了潛在的問題。ColH基因編碼116kD的膠原蛋白酶(Yoshihara，K.,Matsushita,0.，Minami，J.，禾口0kabe，A.CloningandnucleotidesequenceanalysisofthecolHgenefrom67asWo7咖力isz^j^ic"/ffencodingacollagneaseandagelatinase.J.Bacteriol.176:6489-6496)。在ColH的C-末端含有110個(gè)殘基的膠原蛋白-結(jié)合域(Wilson,J.J.，Matsushita,0.，Okabe，A.，禾口Sakon,J".，Abacterialcollagen-bindingdomainwithnovelcalcium-bindingmotifcontrolsdomainorientation,EMB0J.2003，22(8):1743-1752)，其在體外結(jié)合不溶性的I型膠原蛋白(Matsushita,0.，Yoshihara，K.，Katayama,SA.,Minami，J.，禾口Okabe,A.1994.PurificationandcharacterizationofaC7o5^ric/i鵬/j'5^cJj^j'c脂120-kilodaltoncollagenaseandnucleotidesequenceofthecorrespondinggene.J.Bacteriol.176:149-156)，并在體內(nèi)結(jié)合膠原纖維(Nishi，N.，Matsushita,K.，Yuube,H.，Miyanaka，A.，Okabe，A.，禾口Wada，F(xiàn).1998.Collagen-bindinggrowthfactors:productionandcharacterizationoffunctionalfusionproteinshavingacollagen-bindingdomain.Proc.Natl.Acad.,Sci.USA95:7018-7023)。因此ColH非常專一性地切斷脂肪細(xì)胞之間的膠原蛋白。ColH能夠切斷PXGP序列中甘氨酸殘基的氨基一側(cè)的肽鍵(Peterkofsky,B.，1982.Bacterialcollagenase.MethodsEnzymol.82:453-471)。原子吸收分光光度測(cè)定法和螯合劑金屬置換等研究已經(jīng)表明，每分子ColH包含一個(gè)催化所必需的鋅原子(Angelton,E.L.,和VanWart，H.E.1988.PreparationandreconstitutionwithdivalentmetalionsofclassIandclassII^70"7"1'6//"/力j'sf(xZj^c麗appocollagenases.Biochemistry27:7406-7412)，因此ColH被認(rèn)為是一種鋅金屬蛋白酶。N-末端的80kD包括ColH的活性位點(diǎn)(Matsushita,0.，Jung,C-M.,Minami,J.，Katayama,S.，Nishi，N.禾口OkabeA.1998.Astudyofthecollagenase-bindingdomainofa116-kDa6VosWc/j'"/Z7力i"oJy"-c"/zcollagenase.J.Biol.Chem.273:3643-3648)。這一肽段包括序列HEXXH，其為鋅金屬蛋白酶(zincin)的共有基序，存在于大多數(shù)鋅金屬蛋白酶中。鋅金屬蛋白酶超家族包括脊椎動(dòng)物膠原蛋白酶(基質(zhì)金屬蛋白酶(醒Ps))作為基質(zhì)金屬蛋白酶亞家族。對(duì)同工型膠原蛋白酶ColA、ColG和ColH的氨基酸序列比對(duì)表明，它們保守于序列E446(ColG為D)E"7XXXE4"的鋅金屬蛋白酶基序C-末端序列。這可能是另一個(gè)鋅結(jié)合位點(diǎn)。因此當(dāng)我們尋找一種較野生型活性降低的ColH時(shí)，我們將目標(biāo)定位于HEXXXH和E446EXXXE451。根據(jù)Jung等人的研究(Jung，C-M.等.IdentificationofmetalligandsintheC7osWo7，力istoZ/"'c鵬ColHcollagnease,J.Bacteriology,1999May:2816-2822)，作為所有Glu446和Glu451突變體中酶活性降低最多的兩個(gè)突變體，E446A和E451A突變的ColH的Km值沒有發(fā)生顯著變化(分別為0.957和0.91)，這表明它們的底物結(jié)合(例如與膠原蛋白)沒有被削弱。因此，看起來突變沒有改變酶的球狀三維結(jié)構(gòu)。另一方面，它們的Kcat值顯著下降，這表明催化作用被削弱了。因此我們選擇的突變體ColHE451D按照正常的方式與底物結(jié)合。其具有降低的催化活性，這意味著它比野生型ColH較慢地剪切膠原蛋白。(注Km定義為真實(shí)的酶底物復(fù)合體解離常數(shù)；Kcat定義為酶-底物復(fù)合物化學(xué)轉(zhuǎn)化為酶-產(chǎn)物復(fù)合物的一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù))。推測(cè)的ColH催化中心的結(jié)構(gòu)如圖2所示。2)突變體ColH注射入脂肪細(xì)胞選擇藥學(xué)上可接受的載體，包括對(duì)突變體ColH呈惰性的載體，是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。例如生理鹽水、葡聚糖水溶液和羥乙基淀粉水溶液等，優(yōu)選適合緩沖至中性pH?？梢允褂美w維蛋白膠作為載體，其包括纖維蛋白或纖維蛋白前體，例如纖維蛋白原加凝血酶；參見美國專利No.5,279,825。此外，載體的選擇和劑型制備的方法也是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段。雖然水和鈣離子是酶的激活所必需的，但是存在于皮下組織中的含水的組織間隙液已經(jīng)足夠做到這一點(diǎn)。上述載體適合權(quán)利要求1中的突變體ColH的注射輸送。醫(yī)師首先選擇他/她所想要治療的身體的部位。為了限制一次注入體內(nèi)的酶的數(shù)量，以及允許對(duì)結(jié)果進(jìn)行初步評(píng)定，可以在初步治療的時(shí)候選擇有限的區(qū)域一其可以小于全部區(qū)域。治療用的溶液透皮注射到皮下脂肪組織，如果醫(yī)師或病人強(qiáng)烈要求的話，在注射前實(shí)行輕度局部麻醉。為了一定數(shù)量的酶溶液能夠發(fā)揮其最大功效，其應(yīng)當(dāng)在區(qū)域內(nèi)的多個(gè)相鄰點(diǎn)位處分別進(jìn)行少量注射，優(yōu)選間距不大于大約2厘米，甚至更小。要獲得最佳效果需要分時(shí)注射，例如每3天注射一次或每周注射2到3次。本發(fā)明的突變體ColH來自于生物工程化的ColH菌株，使用E.coli作為宿主。突變體ColH的效能測(cè)定是根據(jù)其在pH7.2和37'C下對(duì)于非變性膠原蛋白(來自牛筋)消化5小時(shí)的結(jié)果得到的。所裂解的肽鍵數(shù)量通過與茚三酮的反應(yīng)測(cè)得。胰蛋白酶消化對(duì)照所釋放的氨基被從中扣除。一個(gè)凈的ABC單位的膠原蛋白酶能夠溶解的茚三酮反應(yīng)物質(zhì)相當(dāng)于每分鐘1.09納摩爾亮氨酸?？山邮茌d體中的濃度根據(jù)下述原則進(jìn)行選擇含有足夠多的液體以能夠在皮下的脂肪組織中充分?jǐn)U散，而不多于足夠攜帶所需數(shù)量的活性物進(jìn)入待治療的區(qū)域。每毫升大約50到500ABC單位膠原蛋白酶的濃度范圍是合適的，而特定環(huán)境下選擇在此范圍內(nèi)和相當(dāng)多地超出該范圍也是可能的。因?yàn)閿U(kuò)散進(jìn)入脂肪組織和由此帶來的脂肪解離很少是徹底的，一般需要重復(fù)該治療至少一次。其可以在幾天以后進(jìn)行，例如3天或一周后。注射權(quán)利要求1中的突變體膠原蛋白酶可以替代脂肪抽吸術(shù)或被用于脂肪抽吸術(shù)的輔助手段。該治療導(dǎo)致脂肪組織的充分破壞，使之更容易被抽吸清除。脂肪抽吸階段將在施用本發(fā)明的1到3天后實(shí)施。脂肪瘤一般通過手術(shù)或脂肪抽吸進(jìn)行清除。通過使用突變體ColH，脂肪瘤的腫塊可以被徹底清除。以上所述的流程、載體、劑量和濃度可應(yīng)用到脂肪瘤的治療中。3)表皮抗-皮下脂肪團(tuán)和疤痕減少霜?jiǎng)?quán)利要求l中的修飾的突變體ColH可以通過合適的透皮傳遞方法通過表皮被送到脂肪細(xì)胞中。定位突變體膠原蛋白酶到脂肪細(xì)胞維管結(jié)構(gòu)的信號(hào)肽有助于繞開皮膚內(nèi)的所有膠原蛋白(NatureMedicine10(6)，p625-632，2004)。70%的人體蛋白是由膠原蛋白組成。因此該信號(hào)肽能夠消除表皮膠原蛋白酶變體干擾皮膚結(jié)構(gòu)的副作用。迄今為止只有很少的透皮技術(shù)能夠遞送大的蛋白質(zhì)進(jìn)入皮膚，特別是當(dāng)它大于40kD的時(shí)候。本發(fā)明的修飾的突變體膠原蛋白酶大小為120kD。然而，一種新的透皮技術(shù)使用Hydroxysome，或陶瓷羥基磷灰石(化學(xué)純磷酸鈣，美國專利號(hào)#6,096，324和專利號(hào)tt6,120,782)，能夠遞送大的蛋白質(zhì)，例如900KD的膠原蛋白進(jìn)入表皮層、真皮層和脂肪細(xì)胞區(qū)域。因此結(jié)合恰當(dāng)?shù)耐钙鬟f方法，本發(fā)明中的修飾的突變體膠原蛋白酶是一種有效的抗-皮下脂肪霜?jiǎng)淠軌虻竭_(dá)脂肪細(xì)胞并有效地溶解脂肪。另外，結(jié)合恰當(dāng)?shù)耐钙の辗椒?，本發(fā)明中的修飾的突變體膠原蛋白酶是一種有效的傷痕減少霜?jiǎng)?，其能夠慢慢地消化疤痕組織中過度生長(zhǎng)的膠原蛋白。圖1描述了突變體ColH和修飾的突變體ColH蛋白和DNA序列，使用Xa因子進(jìn)行酶切。圖2描述了推測(cè)的ColH活性位點(diǎn)。鋅-配位鍵和氫鍵分別使用粗箭頭和點(diǎn)線標(biāo)注。細(xì)箭頭表示反應(yīng)機(jī)理的第一步(來自J.Bacteriology,May1999，p.2816-2822).圖3是純化的ColH(E451D)的7.5%PAGE凝膠電泳圖，以及野生型ColH和突變體ColH(E451D)的穩(wěn)定性結(jié)果。第l道(lane1)為天然的ColH(10ug)加入胰蛋白酶(lug)進(jìn)行保溫，第2道為加入胰蛋白酶(2ug)保溫，二者均在4'C下保溫1小時(shí)。第3道ColH(E451D，10ug)加入胰蛋白酶(O.5ug)進(jìn)行保溫，第4道加入胰蛋白酶(lug)保溫，第5道加入胰蛋白酶(2ug)保溫，均在4'C下保溫1小時(shí)。在l小時(shí)的保溫后，使用0.5ul的0.1MPMSF終止消化反應(yīng)。每個(gè)保溫結(jié)果通過7.5%SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。圖4表示使用ColH(E451D)注射的脂肪組織分解。所處理的脂肪墊位于大鼠后腿的后部。左側(cè)的脂肪墊注射用生理鹽水稀釋的5個(gè)單位的E451D，右側(cè)只注射生理鹽水。圖5表示使用ColH-FM和Hydroxysome表皮霜?jiǎng)┑拇笫笾緣|的減少，解剖結(jié)果。圖6表示使用ColH(E451D)和Hydroxysome表皮霜?jiǎng)┑陌毯鄣臏p少。具體實(shí)施例方式1.ColH的克隆(GST-ColH，使用pGEX5T-3質(zhì)粒)1)ColH的DNA，來自日本可川醫(yī)學(xué)校(KagawaMedicalSchool)的Dr.Matsushita(2ug，pCHCII)2)使用下列引物、ColH的DNA(來自Dr.Matsushita)作為模板進(jìn)行PCR，得到2.95kbDNA片段。Y0181:AAAGGATCCGTACAAAATGAAAGTY0182:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC3)使用限制性內(nèi)切酶(來自NewEnglandBiolabs)BamHI和Xhol酶切A87片段和pGEX-5T-3載體。連接酶切得到的載體和片段。轉(zhuǎn)化T0P10細(xì)胞，涂布于氨節(jié)青霉素(0.1mg/ml)瓊脂糖平板。4)經(jīng)過小型制備和DNA測(cè)序確認(rèn)平板上的一個(gè)菌落攜帶有野生型ColH的正確序列。5)使用pGEX5T-3-ColH(野生型)轉(zhuǎn)化BL21(E3)/pLysS(來自Invitrogen)。2)引入E451D突變體。a)PCR片段4:使用下列引物、ColH野生型cDNA作為模板進(jìn)行PCR:Y0181:AAAGGATCCCCGTACAAAATGAAAGTY0208:CCTGCAAATAAATCTGCTCCACCTTCTTCATACCAAG片段5:使用下列引物、ColH野生型cDNA作為模板進(jìn)行PCR:Y0209:GTGGAGCAGATTTATTTGCAGGTTCTACTAGAACTTCY0182:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC片段6:使用下列引物、片段1和2作為模板進(jìn)行PCR:Y0181:AAAGGATCCCCGTACAAAATGAAAGTY0182:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACCb)使用限制性內(nèi)切酶(來自NewEnglandBiolabs)BamHI和Xhol酶切片段6和pGEX-5T-3載體。連接酶切得到的載體和片段。轉(zhuǎn)化T0P10細(xì)胞，涂布于氨卡青霉素(0.1mg/ml)瓊脂糖平板。c)經(jīng)過小型制備和DNA測(cè)序確認(rèn)平板上的一個(gè)菌落攜帶有ColHE451D的正確序列。d)使用pGEX5T-3-ColH(E451D)轉(zhuǎn)化BL21(E3)/pLysS(來自Invitrogen)，涂布于含氨芐青霉素(O.1mg/ml)和氯霉素(0.1mg/ml)的瓊脂糖平板。結(jié)論對(duì)野生型和突變體ColH質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)序列的可靠性。3)在突變體ColH(E451D)N-末端引入CKGGRAKDC-GG(命名ColH-FM)1)使用下列引物、pGEX5T-3-ColH(E451D)作為模板(見上一節(jié))進(jìn)行PCR，得到2.95kbDNA片段。LH1:AAAGGATCCTGTAAGGGAGGAAGAGCTAAGGATTGTGGAGGAGTACAAAATGAAAGTLH2:AAACTCGAGTTATCTTCCTACTGAACC2)使用限制性內(nèi)切酶(來自NewEnglandBiola2s)BamHI和Xhol酶切片段LH12和pGEX-5T-3載體。連接酶切得到的載體和片段。轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素(O.1mg/ml)瓊脂糖平板。3)挑選菌落，進(jìn)行小型制備獲得DNA，測(cè)序4)使用pGEX4T-3-修飾的ColH(E451D)轉(zhuǎn)化BL21(E3)/pLysS(來自Invitrogen)。2.純化試劑PGEX5T-3-ColH451突變體和pGEX5T-3-修飾的ColH(E451D)LB肉湯(高壓滅菌)IPTG，氨芐青霉素，氯霉素，DTT,PMSF。谷胱甘肽瓊脂糖珠(50%乙醇漿，Pharmacia)Xa因子(AmershanBioscience,400單位，用水稀釋至1單位/ul,4度)細(xì)胞裂解液PBS+0.1%NP40+5mMDTT+0.1mMPMSF洗滌緩沖液PBS+5mMDTT裂解緩沖液50mMTrispH8.0，100mMNaCl，2.5mMCaC12+1mMDTT方法1)在新制的LB+氨芐青霉素(0.1mg/ml)+氯霉素(0.1mg/ml)瓊脂糖平板上劃線接種用甘油保藏的PGEX5T-3-ColH451。37'C培養(yǎng)過夜。2)挑一個(gè)菌落，開始5ral的LB+氨芐青霉素(Amp)+氯霉素培養(yǎng)，37。C振蕩4小時(shí)。3)將5ral培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到100mlLB+Amp+氯霉素的搖瓶中，37。C振蕩過夜。4)使用4X25ml過夜的培養(yǎng)物接種4X1LLB+Amp+氯霉素的搖瓶(在2.8L的大搖瓶中)，37'C振蕩，O.D.600=0.6-1的時(shí)候使用IPTG(0.2mM)進(jìn)行誘導(dǎo)。5)室溫下振蕩過夜大約16小時(shí)。6)500rpm下離心10分鐘收獲細(xì)胞。7)4'C下用40ml細(xì)胞裂解液重懸。8)4'C超聲打碎細(xì)胞。9)4°C、17000rpm下離心30分鐘。將上清液保存在50ml的Falcon管中。10)在上清液管中添加4ml50%的谷胱甘肽瓊脂糖珠。4"保溫過夜。11)將所有上清液和珠粒傾入小柱子。4'C下使用每次10ml洗滌緩沖液洗滌，共三次。12)4'C下使用10ml裂解緩沖液洗滌柱子一次。13)封閉柱子底部，4t:下向柱子中加入4ml裂解緩沖液，其中加入200ul(Xa因子，1單位/1ul)。4T:保溫過夜。Xa因子4'C下在裂解緩沖液中過夜，l單位裂解大約100ugGST標(biāo)簽蛋白。14)打開柱子底部，洗脫蛋白，將洗脫液保存在15mlfalcon管中。再用2ml裂解緩沖液洗滌柱子l次，將洗脫液保存在同一根15mlfalcon管中。結(jié)論在一步親和純化后純度大約90%。3.突變體ColH和修飾的突變體ColH的活性檢測(cè)試劑0.05MTES(三羥甲基氨基甲烷(羥甲基)-甲基-2-氨基乙烷磺酸鹽)緩沖液添加0.36mM氯化f丐，pH7.54%茚三酮的甲氧基乙醇溶液0.2M檸檬酸鈉緩沖液添加0.71mM氯化亞錫，pH5.0茚三酮-檸檬酸混合物通過將50ml4%茚三酮的甲氧基乙醇溶液和50mlpH5.0的添加0.71mM氯化亞錫的0.2M擰檬酸鹽緩沖液混合而成。混合物攪拌5分鐘。50%正丙醇'底物Worthington牛跟腱膠原蛋白(編碼CL)和不含維生素的酪蛋白流程1)稱重5份25mgWorthington牛膠原蛋白分別放入5個(gè)試管。包括至少2個(gè)試管用于空白對(duì)照，其中不含酶。2)將5.0ml0.05MTES緩沖液加入試管中，37°C保溫15分鐘。向目標(biāo)試管中加入0.1ml商業(yè)的膠原蛋白酶或突變體ColH酶稀釋物(不同濃度)開始反應(yīng)。3)5小時(shí)后，將0.2ml溶液(剩下膠原蛋白)轉(zhuǎn)移到含有1.0ml茚三酮-檸檬酸混合物的試管中停止膠原蛋白酶反應(yīng)。包括一個(gè)酶空白對(duì)照(用O.lmlTES緩沖液代替酶，與膠原蛋白保溫)。4)在沸水浴中加熱20分鐘。冷卻后，用5ml50%正丙醇進(jìn)行稀釋。放置15分鐘，讀取600nm處的吸光度。根據(jù)L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定氨基酸微摩爾數(shù)相當(dāng)于釋放的亮氨酸的量。結(jié)論E451D為來自Worthington-biochem膠原蛋白酶活性的20%。4.ColH變體的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)使用蛋白酶胰蛋白酶來評(píng)價(jià)ColH的穩(wěn)定性。1)制備lug/ul胰蛋白酶(來自Sigma)2)將10ug野生型或突變體ColH置于Eppendorf管中，用PBS稀釋到1ug/ul。3)對(duì)于每種蛋白，在管1中，加入O.5ul1ug/ul胰蛋白酶；在管2中，加入lul1Ug/ul胰蛋白酶；在管3中，加入2Ul1ug/ul胰蛋白酶。4)在冰上保溫1小時(shí)。5)7.5%SDSPAGE檢測(cè)。結(jié)論E451D的穩(wěn)定性是野生型ColH的兩倍。5.突變體ColH(E451D)溶脂(注射)的肥胖大鼠實(shí)驗(yàn)a)肥胖大鼠喂養(yǎng)流程購買大約50g的S.D.大鼠。按照以下方式喂養(yǎng)食物每100g主食中，加入豬油10g，奶粉125g，蛋60g，魚油10滴。在開始的1-2周，每只大鼠每天供給13g食物。在第3周，每只大鼠每天供給15g。在第4周，每只大鼠每天供給17g。等等諸如此類。第8周后，大鼠重量大約200-300g,準(zhǔn)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。b)注射流程將0.1ml的液體注射入后腿的每個(gè)脂肪墊上。一般地，可以觀察到對(duì)于每脂肪墊進(jìn)行透皮注射大約3到大約50ABC單位的膠原蛋白酶的劑量，能夠在24小時(shí)后有效地溶解注入端的脂肪墊，而只伴隨著極少量的出血。可以看出隨著劑量的增加，溶脂效果和空隙的出血量也趨向于增加。超過50ABC單位和更高的劑量導(dǎo)致相當(dāng)多的局部出血，但是在劑量為5到50ABC單位下出血量非常小，甚至沒有。動(dòng)物模型S.D.大鼠，雄性和雌性。使用的突變體E451DColH材料每克膠原蛋白酶的ABC單位163,000溶劑滅菌的生理鹽水麻醉，通過腹部注射(I.P.)實(shí)驗(yàn)過程通過腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠。對(duì)于每只雄性大鼠，在一條腿后面的一個(gè)脂肪墊被注射入生理鹽水，在另一條腿后面的一個(gè)脂肪墊被注射入5個(gè)單位的突變體膠原蛋白酶ColHE451D。在2天或3天后額外注射相同的活性單位。20只S.D.肥胖大鼠，IO只雌性，IO只雄性(自50g開始進(jìn)行8周的喂養(yǎng))，重量為200-300g。使用5u的ColHE451D按照5種不同的方案對(duì)它們進(jìn)行注射。每種方案使用4只大鼠，2只雌性2只雄性。實(shí)驗(yàn)A大鼠的數(shù)量4只S.D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠l:雄性，261g;大鼠2:雄性，312g;大鼠3:雌性，232g;大鼠4:雌性，239g。測(cè)試液5uColHE451D溶于0.1mL生理鹽水使用22標(biāo)準(zhǔn)直徑(gauge)，8〃的針注射將溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第l天結(jié)果在第3天對(duì)四只大鼠進(jìn)行解剖。位置l(后腿后面的一側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2(后腿后面的另一側(cè))5u。注射區(qū)域的大多數(shù)脂肪被溶解。只觀察到非常少的出血。沒有影響到肌肉膜。在注射位點(diǎn)觀察到數(shù)量可觀的油狀物，其反映了脂肪細(xì)胞的減少或破壞。實(shí)驗(yàn)B大鼠的數(shù)量4只S.D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠l:雄性，256g;大鼠2:雄性，249g;大鼠3:雌性，221g;大鼠4:雌性，250g。測(cè)試液5uColHE451D溶于0.1mL生理鹽水使用22標(biāo)準(zhǔn)直徑(gauge)，8〃的針注射第1天，將溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針結(jié)果在第4天對(duì)四只大鼠進(jìn)行解剖。位置l(后腿后面的一側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2(后腿后面的另一側(cè))5u。注射區(qū)域附近的脂肪被徹底溶解。周圍的脂肪容易破碎和分解。沒有影響到肌肉膜。只觀察到非常少的出血。實(shí)驗(yàn)c大鼠的數(shù)量4只S.D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠l:雄性，252g;大鼠2:雄性，249g;大鼠3:雌性，255g;大鼠4:雌性，206g。測(cè)試液5uColHE451D溶于0.1mL生理鹽水使用22標(biāo)準(zhǔn)直徑(gauge)，8〃的針注射將5u的溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第1天將5u的溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第3天結(jié)果在第5天對(duì)四只大鼠進(jìn)行解剖。位置l(后腿后面的一側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2(后腿后面的另一側(cè))5u。注射區(qū)域的大多數(shù)脂肪(大于50%)被溶解。觀察到少量的出血。在注射位置觀察到數(shù)量可觀的油狀物。剩余的脂肪是分離的、易碎的和不活潑的。實(shí)驗(yàn)D大鼠的數(shù)量4只S.D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠l:雄性，240g;大鼠2:雄性，253g;大鼠3:雌性，244g;大鼠4:雌性，26Gg。測(cè)試液5uColHE451D溶于0.1mL生理鹽水使用22標(biāo)準(zhǔn)直徑(gauge)，8〃的針注射將5u的ColHE451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第1天將5u的ColHE451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第4天結(jié)果在第6天對(duì)四只大鼠進(jìn)行解剖。位置l(后腿后面的一側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2(后腿后面的另一側(cè))5u。注射區(qū)域附近的脂肪被徹底溶解。沒有影響到肌肉膜。觀察到痕量的血液。大鼠1:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1.46g;ColHE451D注射區(qū)域脂肪的重量1.09g。大鼠2:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1.28g;ColHE451D注射區(qū)域脂肪的重量1.17g。大鼠3:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1.43g;ColHE451D注射區(qū)域脂肪的重量1.16g。大鼠4:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1.47g;ColHE451D注射區(qū)域脂肪的重量1.23g。實(shí)驗(yàn)E大鼠的數(shù)量4只S.D.大鼠，兩只雌性兩只雄性。大鼠l:雄性，240g;大鼠2:雄性，266g;大鼠3:雌性，216g;大鼠4:雌性，238g。測(cè)試液5uColHE451D溶于0.1mL生理鹽水使用22標(biāo)準(zhǔn)直徑(gauge)，8〃的針注射將5u的ColHE451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第1天將5u的ColHE451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第3天將5u的ColHE451D溶液慢慢地注入脂肪墊，抽針。第5天結(jié)果在第6天對(duì)四只大鼠進(jìn)行解剖。位置l(后腿后面的一側(cè))生理鹽水觀察到正常的脂肪墊。位置2(后腿后面的另一側(cè))5u。注射區(qū)域附近的脂肪被徹底溶解。沒有影響到肌肉膜。剩余痕量的血液。大鼠1:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量0.925g;ColHE451D注射區(qū)域脂肪的重量0.75g。大鼠3:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1.12g;ColHE451D注射區(qū)域脂肪的重量1.04g。大鼠4:鹽水注射區(qū)域脂肪的重量1.56g;ColHE451D注射區(qū)域脂肪的重量1.38g。6.突變體ColH(E451D)霜?jiǎng)?N-末端引入CKGGRAKDC-GG，ColH-FM)與hydroxysome透皮吸收方法結(jié)合使用溶解脂肪(表皮)的肥胖大鼠實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性大鼠，重85-95g，斷乳后1周1.2食物基本膳食由動(dòng)物中心提供。高脂肪飲食成分55%基本膳食，12%豬油，10%蛋，全脂奶粉8%，蔗糖5%，花生5%，芝麻油3%，和鹽2%。1.3肥胖大鼠模型構(gòu)建-購買了35只大鼠，喂養(yǎng)一周，使其熟悉生存環(huán)境。接下來將這些大鼠分為2組1)對(duì)照大鼠組(5只大鼠)，喂給基本膳食；和2)肥胖大鼠組(30只大鼠)，喂給高脂肪飲食，另皮下注射15%MSG鹽水溶液3g/kg(每天1次)，持續(xù)5天。在MSG注射后的第21天，肥胖大鼠組被分成6組，a)肥胖大鼠模型組，b)注射高劑量組，c)注射中等劑量組，d)表皮高劑量組，e)表皮中等劑量組，f)表皮低劑量組。這些大鼠生活在干凈環(huán)境中，每天有12小時(shí)的黑暗和12小時(shí)的日光，并具有舒適的溫度和良好的通風(fēng)。大鼠可以自由地吃食物和喝水。1.4觀測(cè)參數(shù)常規(guī)參數(shù)食物攝入，排尿和面部分泌，以及日?；顒?dòng)。生長(zhǎng)參數(shù)重量，體長(zhǎng)，尾巴長(zhǎng)度，和Lee參數(shù)(Lee'sparameters)。1.5測(cè)試藥物1.5.1HAX(hydroxysome)溶液0.1g/ml，新鮮制備，將0.5gHAX溶于5ml實(shí)驗(yàn)用蒸餾水制得。1.5.2測(cè)試藥物溶液2.3mlHAX溶液(O.1g/ml)與2ml0ulian蛋白樣品(ColH-FM)混合。5u0ulian樣品(ColH_FM)=18ul混合的溶液1.5.3對(duì)照溶液2.3mlHAX溶液(0.1g/ml)與2mlPBS或生理鹽水溶液混合。實(shí)驗(yàn)方法2.1分組將30只肥胖大鼠隨機(jī)分為6組，每組5只大鼠。對(duì)生殖器官的脂肪墊施用測(cè)試藥物溶液1.5.2和對(duì)照溶液。2.2劑量和持續(xù)時(shí)間對(duì)于每個(gè)劑量，連續(xù)9天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行注射或表皮施用測(cè)試藥物溶液，每天一次。對(duì)照組每天對(duì)表皮只施用對(duì)照溶液，共9天。在第10天，殺死大鼠用于鑒定。2.3鑒定脂肪減少的功效鑒定是通過肉眼觀察和對(duì)受測(cè)區(qū)域脂肪墊的稱重來完成的。結(jié)果脂肪減少的解剖圖如圖5所示。表l.ColH-FM溶脂產(chǎn)品對(duì)于肥胖大鼠模型的效果(X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)論1)表皮施用ColH-FM(修飾的突變體膠原蛋白酶)與Hydroxysome透皮技術(shù)的結(jié)合能夠有效地清除動(dòng)物的皮下脂肪。2)在中等劑量(10單位/大鼠)下，注射和表皮施用ColH-FM的溶脂效果是相似的。7.突變體ColH(E451D)霜?jiǎng)?Co1H-FM)與hydroxysome透皮傳遞方法結(jié)合使用溶解脂肪(表皮)的人體實(shí)驗(yàn)ColH-FM霜?jiǎng)┑娜梭w實(shí)驗(yàn)是2005年10月在中國北京進(jìn)行的。醫(yī)師是Dr.Yu,HaiZhou。對(duì)15名肥胖對(duì)象進(jìn)行不同活性單位的CoH-FM霜?jiǎng)┑臏y(cè)試，每天夜間針對(duì)肥胖的腹部區(qū)域施用一次霜?jiǎng)掷m(xù)2周。用超聲波檢驗(yàn)脂肪組織的厚度，得到如下結(jié)果。表2.ColH-FM溶脂產(chǎn)品對(duì)于受試人的影響表皮施用突變體膠原蛋白酶的人體實(shí)驗(yàn)小結(jié)中國，2005年10月姓名COL單位脂肪厚度血脂皮膚反饋食欲增變化(mm)變熱變緊變松加YAN，F(xiàn)azhen40-2正常無2-4d5d-結(jié)束5d-結(jié)束YU，Yinchun40-2正常l-2d4-5d7d-結(jié)束6dCHEN，Shizhen40—3正常l-2d4-5d6d-結(jié)束4dCHENG,20-4正常Id4-5d6d-結(jié)束無Yaqun20-5正常3d無無無QIN，.Ling20-4正常Id無5d-結(jié)束4dFAN,HuiwenWU，Jianchun100正常l-2d3-4d5d-結(jié)束4dZHUANG,103正常l-2d無無無Ming10-3正常無無6d-結(jié)束5dLIU，WenhuaCHENG,Yi50正常Id無無無CHEN,Qiping正常Id無7d無XU，Juying55高無無無無WANG,Li2.50高無無無無JI,Rongrong2.5-3正常無無無無SUN,Dongling2.51Xl-2dXXX結(jié)論1)表皮施用ColH-FM(修飾的突變體膠原蛋白酶)結(jié)合Hydroxysome透皮技術(shù)能夠有效地清除人皮下脂肪。2)表皮產(chǎn)品是安全的，不會(huì)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)或增加血脂。8.突變體ColH(E451D)霜?jiǎng)┡chydroxysome透皮傳遞方法聯(lián)合使用減少疤痕(表皮)的人體實(shí)驗(yàn)用法23對(duì)疤痕區(qū)域每天兩次施用霜?jiǎng)?少量)，一早一晚。結(jié)果-1)疤痕歷史男性，38歲。手上的傷疤是1999年由尖刀造成的。當(dāng)時(shí)對(duì)傷口進(jìn)行的唯一處理是止血，沒有進(jìn)行縫合。后來形成的傷疤大小長(zhǎng)度5cm，寬度0.8cm。2)結(jié)果，使用霜?jiǎng)┣?，傷疤為白色，其顏色與正常皮膚完全不同。傷疤是凸起的。，使用霜?jiǎng)?天后，傷疤顏色與正常皮膚接近，傷疤大小減少40%。*使用30天后，傷疤幾乎變平，且有清晰的皮膚紋理。請(qǐng)參見圖6.3)來自另兩個(gè)測(cè)試對(duì)象的結(jié)果*男性，10歲，前額凸起的傷疤，由車禍和低水平的治療造成。施用40天后，凸起的傷疤幾乎變平。*男性，2歲，肘部凸起的傷疤。施用20天后，凸起的傷疤變平到一定程度。參考文獻(xiàn)1.Kolonin，M.etal.,Reversalofobesitybytargetedablationofadiposetissue,NatureMedicine10(6),June2004,p.625-632.2.Methodsofdeliveringmaterialintotheskin,andcompositionusedtherein,專禾U號(hào)6,096,324(Hydroxysome技術(shù))3.Methodsofdeliveringmaterialintotheskin,andcompositionusedtherein,專禾U號(hào)6,120,782(Hydroxysome技術(shù))4.Seglen，P.O.1976,Preparationofisolatedratlivercells.MethodsCellBiol.13:29-835.Yoshihara，K.,Matsushita,O.,Minami,J.,andOkabe,A.CloningandnucleotidesequenceanalysisofthecolHgenefromC7o^str/d/wm/zh/o(y"ct/mencodingacollagenaseandagelatinase.J.Bacteriol.176:6489-64966.Wilson,J.J.，Matsushita,O.,Okabe,A.,andSakon,.J.Abacterialcollagen-bindingdomainwithnovelcalcium-bindingmotifcontrolsdomainorientation,EMBOJ.2003，22(8):1743-17527.Bond,M.D.,andVanWart,H.E.,1984,CharacterizationofindividualcollagenasesfromC/asfrzW/wwZn'Wo(y"cww.Biochemistry23:3085-30918.Peterkofsky,B.，1982.Bacterialcollagenase.MethodsEnzymol.82:453-4719.Angelton,E.L.，andVanWart,H.E.1988.PreparationandreconstitutionwithdivalentmetalionsofclassIandclassIIC7cwfrzW/wm/z/Wo(y/"/ct/OTappocollagenases.Biochemistry27:7406-741210.Matsushita,O.,Jung,C-M.，Minami，J.,Katayama,S.,Nishi,N.,andOkabeA.1998.Astudyofthecollagenase-bindingdomainofa116-kDaC/c^/n'tZ/wm/n\sto(y/7'ci/mcollagenase.J.Biol.Chem.273:3643-364811.Jung,C-M.etal"IdentificationofmetalligandsintheC/ostn't^wm/z/Wo/;W7'cwwColHcollagnease,J.Bacteriology,1999May:2816-282212.Matsushita,O.，Yoshihara,K.，Katayama,SA.，Minami,J.,andOkabe,A.1994.PurificationandcharacterizationofaC7o>s^*/c^wot/u'5to(y".cww120-kilodaltoncollagenaseandnucleotidesequenceofthecorrespondinggene.J.Bacteriol.176:149-156序列表<110>YolareDermaceuticalsInc.<120>修飾的突變體膠原蛋白酶及其在脂肪溶解和疤痕減少中的應(yīng)用<130>rimeng-002<150>US60/901，145<151>2007-02-14<160>1<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>936<212>PRT<213>溶組織梭狀芽胞桿菌<220><221>MISC一FEATURE<222>(12)..(12)<223>n=2-6<220〉<221>misc—feature<222>(13)..(13)<223>Xaa可以是1-6個(gè)Gly<400>1GlySerCysLysGlyGlyArgAlaLysAspCysGlyXaaValGinAsn151015GluSerLysArgTyrThrValSerTyrLeuLysThrLeuAsnTyrTyr202530AspLeuValAspLeuLeuValLysThrGlulieGluAsnLeuProAsp354045LeuPheGinTyrSerSerAspAlaLysGluPheTyrGlyAsnLysThr505560ArgMetSerPhelieMetA印GlulieGlyArgArgAlaProGinTyr65707580ThrGlulieA印HisLysGlylieProThrLeuValGluValValArg859095AlaGlyPheTyrLeuGlyPheHisAsnLysGluLeuAsnGlulieAsn100105110LysArgSerPheLysGluArgVa'llieProSerlieLeuAlalieGin115120125LysAsnProAsnPheLysLeuGlyThrGluValGinAspLyslieVal130135140SerAlaThrGlyLeuLeuAlaGlyAsnGluThrAlaProProGluVal145150155160ValAsnAsnPheThrProlieLeuGinAspCyslieLysAsnlieAsp165170175ArgTyrAlaLeuAspAspLeuLysSerLysAlaLeuPheAsnValLeu180185190AlaAlaProThrTyrAsplieThrGluTyrLeuArgAlaThrLysGlu195200205LysProGluAsnThrProTrpTyrGlyLyslieAspGlyPhelieAsn210215220GluLeuLysLysLeuAlaLeuTyrGlyLyslieAsnAspAsnAsnSer225230235240TrplielieAspAsnGlylieTyrHislieAlaProLeuGlyLysLeu245250255HisSerAsnAsnLyslieGlylieGluThrLeuThrGluValMetLys260265270ValTyrProTyrLeuSerMetGinHisLeuGinSerAlaAspGinlie275280285LysArgHisTyrAspSerLysAspAlaGluGlyAsnLyslieProLeu290295300A印LysPheLysLysGluGlyLysGluLysTyrCysProLysThrTyr305310315320ThrPheAspAspGlyLysVallielieLysAlaGlyAlaArgValGlu325330335GluGluLysValLysArgLeuTyrTrpAlaSerLysGluValAsnSer340345350GinPhePheArgValTyrGlylieAspLysProLeuGluGluGlyAsn355360365ProAspA印lieLeuThrMetVallieTyrAsnSerProGluGluTyr370375380LysLeuAsnSerValLeuTyrGlyTyrA印ThrAsnAsnGlyGlyMet385390395400TyrlieGluProGluGlyThrPhePheThrTyrGluArgGluAlaGin405410415GluSerThrTyrThrLeuGluGluLeuPheArgHisGluTyrThrHis420425430TyrLeuGinGlyArgTyrAlaValProGlyGinTrpGlyArgThrLys435440445LeuTyrAspAsnAspArgLeuThrTrpTyrGluGluGlyGlyAlaAsp450455460LeuPheAlaGlySerThrArgThrSerGlylieLeuProArgLysSer465470475480lieValSerAsnlieHisAsnThrThrArgAsnAsnArgTyrLysLeu485490495SerAspThrValHisSerLysTyrGlyAlaSerPheGluPheTyrAsn500505510TyrAlaCysMetPheMetAspTyrMetTyrAsnLysAspMetGlylie515520525LeuAsnLysLeuAsnAspLeuAlaLysAsnAsnAspValAspGlyTyr530535540AspAsnTyrlieArgAspLeuSerSerAsnTyrAlaLeuAsnAspLys545550555560TyrGinAspHisMetGinGluArglieAspAsnTyrGluAsnLeuThr565570575HisAlaTyrLysAsn580585590ProAsnGlulieTyrSerGlulieSerGluValAlaLysLeuLysAsp595600605AlaLysSerGluValLysLysSerGinTyrPheSerThrPheThrLeu610615620ArgGlySerTyrThrGlyGlyAlaSerLysGlyLysLeuGluAspGin625630635640LysAlaMetAsnLysPhelieAspAspSerLeuLysLysLeuAspThr645650655TyrSerTrpSerGlyTyrLysThrLeuThrAlaTyrPheThrAsnTyr660665670LysValAspSerSerAsnArgValThrTyrAspValValPheHisGly675680685TyrLeuProAsnGluGlyAspSerLysAsnSerLeuProTyrGlyLys690695700lieAsnGlyThrTyrLysGlyThrGluSerSerValSerThrThrThr705710715720AlaGlulieLysAspLeuSerGluAsnLysLeuProVallieTyrMet725730735HisValProLysSerGlyAlaLeuAsnGinLysValValPheTyrGly740745750LysGlyThrTyrAspProA印GlySerlieAlaGlyTyrGinTrpAsp755760765PheGlyA印GlySerAspPheSerSerGluGinAsnProSerHisVal770775780TyrThrLysLysGlyGluTyrThrValThrLeuArgValMetAspSer785790795800SerGlyGinMetSerGluLysThrMetLyslieLyslieThrA印Pro805810815ValTyrProlieGlyThrGluLysGluProAsnAsnSerLysGluThr820825830AlaSerGlyProlieValProGlylieProValSerGlyThrlieGlu835840845AsnThrSerAspGinAspTyrPheTyrPheAspVallieThrProGly850855860GluValLyslieAsplieAsnLysLeuGlyTyrGlyGlyAlaThrTrp865870875880ValValTyrAspGluAsnAsnAsnAlaValSerTyrAlaThrAspAsp885890895GlyGinAsnLeuSerGlyLysPheLysAlaAspLysProGlyArgTyr900905910TyrlieHisLeuTyrMetPheAsnGlySerTyrMetProTyrArglie915920925AsnlieGluGlySerValGlyArg93093權(quán)利要求1、一種包含一種修飾的單一突變體膠原蛋白酶ColH-FM的組合物，其中ColH-FM是一種溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridiumhistolyticum)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)、并在ColH(Glu451Asp)前附加有肽基序CKGGRAKDC-G(x)，其中x等于2-6。2、權(quán)利要求l的組合物，其中的膠原蛋白酶Co舊-FM具有序列SEQIDNO.l。3、權(quán)利要求l和2任意一項(xiàng)的組合物，進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。4、權(quán)利要求3的組合物，其中所述載體選自由生理鹽水、葡聚糖水溶液、和羥乙基淀粉水溶液組成的組。5、權(quán)利要求1-2的ColH-FM在制備靶向減少脂肪組織數(shù)量的藥物中的用途。6、權(quán)利要求1-2的ColH-FM在制備用于減少和/或消除脂肪瘤的藥物中的用途。7、權(quán)利要求5-6任意一項(xiàng)的用途，其中的用途是注射或表皮施用。8、權(quán)利要求7的用途，其中的表皮施用包括使用劑型為霜?jiǎng)?、漿液或液體形式的透皮吸收系統(tǒng)。9、權(quán)利要求1-2的ColH-FM在制備用于疤痕減少的藥物中的用途。10.一種減少體內(nèi)指定位置的脂肪組織數(shù)量的方法，包括向所述組織引入有效量的突變體膠原蛋白酶，或附加有N-末端或C-末端標(biāo)簽CKGGRAKDC-G(x)(其中x是2-6)的相同的突變體膠原蛋白酶，或任何能夠靶向人體和動(dòng)物體內(nèi)白色脂肪維管結(jié)構(gòu)的其它肽類。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的脂肪組織是皮下組織。12.權(quán)利要求10的方法，其中突變的全長(zhǎng)ColH來自溶組織梭狀芽胞桿菌(C/o欣,W/謂/z/Wo/,.c謂)。13.包含溶組織梭狀芽胞桿菌(C/oWnW/ww/n'Wo(y"CMw)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制備靶向減少脂肪組織數(shù)量的藥物中的用途。14.包含溶組織梭狀芽胞桿菌(C/o^7W/ww/z"to/_y"cwm)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制備用于減少和/或消除脂肪瘤的藥物中的用途。15.包含溶組織梭狀芽胞桿菌(C/oWnWww/z/Wo(y"cwm)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)蛋白序列的蛋白在制備用于疤痕減少的藥物中的用途。16.權(quán)利要求13,14或15的用途，其中的用途是注射或表皮施用。17.權(quán)利要求16的用途，其中的表皮施用包括使用劑型為霜?jiǎng){液或液體形式的透皮吸收系統(tǒng)。18.突變體ColH是在Glu451處突變?yōu)槠渌?0種氨基酸殘基的任何一種，特別是E451A和E451Q。全文摘要一種變異溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridiumhistolyticum)膠原蛋白酶ColH(Glu451Asp)，當(dāng)注射入身體指定位置時(shí)可以溶解脂肪組織。這種蛋白產(chǎn)品在肥胖大鼠實(shí)驗(yàn)中溶解脂肪墊非常有效，只有極少的副作用，觀察到很少量的出血。我們還發(fā)明了一種新的ColH突變體，該突變體在ColH(Glu451Asp)前連接有肽基序CKGGRAKDC-Gx(x為2-6個(gè)G)，稱為表皮ColH-FM，能夠靶向針對(duì)白色脂肪墊結(jié)構(gòu)。結(jié)合新穎的透皮吸收技術(shù)(例如Hydroxysome技術(shù))，我們開發(fā)了一種可以溶解脂肪的表皮蛋白霜?jiǎng)?。這種產(chǎn)品可以用作脂肪分解霜和化學(xué)吸脂劑。這種ColH-FM還可以注射入脂肪組織，作為脂肪抽吸術(shù)的替代手段或者輔助方法。因?yàn)橥蛊鸬陌毯凼怯赡z原蛋白的過度生長(zhǎng)形成的，本發(fā)明的變異ColH(Glu451Asp)或ColH-FM霜?jiǎng)┛梢杂糜跍p少疤痕。文檔編號(hào)C12N15/11GK101678088SQ200880005204公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年2月13日優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日發(fā)明者勇倉,瑞那托·瓊斯,嵐黃申請(qǐng)人:友萊爾皮膚產(chǎn)品有限責(zé)任公司