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修飾的rsvf蛋白及其使用方法

文檔序號:1180445閱讀:849來源:國知局
專利名稱:修飾的rsv f蛋白及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明一般地涉及修飾或突變的呼吸道合胞病毒融合(F)蛋白及其制備和使用方法,包括免疫原性組合物如疫苗以供治療和/或預(yù)防RSV感染。
背景技術(shù)
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒屬 (Pneumovirus)的成員。人RSV (HRSV)是幼兒中嚴(yán)重下呼吸道疾病的最主要原因,并在人中導(dǎo)致相當(dāng)?shù)陌l(fā)病率和死亡率。RSV還被認(rèn)為是在免疫妥協(xié)的成人和老人中重要的致病原。 由于天然感染之后感染宿主對RSV的不完全抗性,RSV可在兒童期和成人期多次感染。該病毒具有由單鏈反義RNA組成的基因組,其與病毒蛋白緊密相聯(lián)形成核殼。病毒包膜由質(zhì)膜來源、含有病毒編碼的結(jié)構(gòu)蛋白的脂雙層組成。在病毒粒體中包裹病毒聚合酶,其將基因組RNA轉(zhuǎn)錄為mRNA。RSV基因組編碼三個跨膜結(jié)構(gòu)蛋白F、G和SH,兩個基質(zhì)蛋白M和M2,三個核殼蛋白N、P和L,以及兩個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2。認(rèn)為HRSV和細胞膜的融合發(fā)生于細胞表面,并為感染早期病毒核糖核蛋白轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)所必需的步驟。該過程是由融合(F)蛋白介導(dǎo)的,其還促進受感染細胞的膜與鄰接細胞的膜融合以形成特征性的合胞體,其不僅為顯著的細胞病變效果,而且還是病毒擴散的另外手段。相應(yīng)地,中和融合活性在宿主免疫中是重要的。事實上,針對F蛋白開發(fā)的單克隆抗體已顯示中和病毒的感染性并抑制膜融合(Calder等,2000,Virology 271 122-131)。RSV的F蛋白與其他副粘病毒(paramyxovirus)的F糖蛋白分享結(jié)構(gòu)特征,和有限但卻顯著的氨基酸序列同一性。其作為無活性的574個氨基酸的前體(FO)合成,所述前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中在天冬酰胺上在翻譯的同時發(fā)生糖基化,在此處其裝配為同寡聚體。在到達細胞表面之前,F(xiàn)O前體由蛋白酶剪切為來自N端的F2和來自C端的Fl。F2和Fl鏈仍由一個或多個二硫鍵共價連接。已發(fā)現(xiàn)免疫親和純化的全長F蛋白以微團形式聚集(也表現(xiàn)為玫瑰花結(jié) (rosette)),類似于對其他全長病毒膜糖蛋白所觀察的一般(Wrigley等,1986,in Electron Microscopy of Proteins, Vol 5, p. 103-163, Academic Press, London)。在電子顯微鏡下,玫瑰花結(jié)中的分子表現(xiàn)為或者是倒轉(zhuǎn)的圓錐形桿狀物( 70% )或棒棒糖形狀( 30%)的結(jié)構(gòu),其較寬的端從玫瑰花結(jié)中央向外伸出。該桿狀構(gòu)象狀態(tài)與融合前 (pre-fusion)失活狀態(tài)的F糖蛋白相關(guān),而棒棒糖構(gòu)象狀態(tài)與融合后(post-fusion)、活性狀態(tài)的F糖蛋白相關(guān)。電子顯微術(shù)可用于區(qū)分融合前和融合后(或者命名為融合前的(prefusogenic)和融合的(fusogenic)構(gòu)象,如Calder等,2000,Virology271 :122-131所說明。融合前構(gòu)象還可與融合的(融合后)構(gòu)象通過脂質(zhì)體相關(guān)測定法來區(qū)分。此外,可使用特異性識別存在于RSV F蛋白的一種或另一種融合前或融合的形式,但不存在于其他形式的構(gòu)象表位的抗體(例如單克隆抗體)來區(qū)分融合前和融合的構(gòu)象。此種構(gòu)象表位可為由于分子表面上抗原決定簇的偏好性暴露所致?;蛘撸瑯?gòu)象表位可來自在直鏈多肽上非連續(xù)的氨基酸的并列。之前已顯示F前體在兩個位點被剪切(位點I,在殘基109之后,和位點II,在殘基136之后),兩者之前均為由弗林蛋白酶(furin)樣蛋白酶識別的基序。位點II鄰近融合肽,且F蛋白在兩個位點的剪切對于膜融合是必需的。(Gonzalez-Reyes等,2001,PNAS 98(17) =9859-9864)。當(dāng)在兩個位點剪切均完成時,認(rèn)為桿狀物從圓錐形狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘舭籼切螤睢?br>
發(fā)明內(nèi)容
如本文中所述,本發(fā)明已發(fā)現(xiàn),當(dāng)對RSV F蛋白的結(jié)構(gòu)進行某些修飾時,可實現(xiàn)令人驚訝的高水平融合(F)蛋白的表達。此類修飾還令人意想不到地減少了 RSV F蛋白在宿主細胞中的細胞毒性。此外,本發(fā)明經(jīng)修飾的F蛋白表現(xiàn)改善的展示融合后“棒棒糖”形態(tài)而非融合前“桿狀”形態(tài)的能力。因此,在一個方面,本發(fā)明經(jīng)修飾的F蛋白還可展示與野生型F蛋白相比改善的免疫原性。這些修飾顯然適用于疫苗的開發(fā)和使用該疫苗以供治療和/或預(yù)防RSV的方法。本發(fā)明提供了與野生型RSV F蛋白相比表現(xiàn)表達增加,細胞毒性減少和/或免疫原性增強的重組RSV F蛋白。在一個方面,本發(fā)明提供了與野生型RSV F蛋白相比包含修飾的或突變的氨基酸序列的重組RSV F蛋白。一般而言,這些修飾或突變使所述RSV F蛋白與野生型RSV F蛋白相比增加表達,減少細胞毒性和/或增強免疫原性。在某些示例性實施方案中,所述RSV F蛋白為人RSV F蛋白。所述RSV F蛋白優(yōu)選與野生型RSV F蛋白(例如示例于SEQ ID NO 2)相比包含修飾的或突變的氨基酸序列。在一個實施方案中,所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于野生型RSV F 蛋白(SEQ ID NO 2)位置P102的氨基酸處的修飾或突變。在另一個實施方案中,所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO⑵位置1379的氨基酸處的修飾或突變。在另一個實施方案中,所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)位置M447的氨基酸處的修飾或突變。在一個實施方案中,所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于上述位置的氨基酸處的兩個或更多個修飾或突變。在另一個實施方案中,所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于上述位置的氨基酸處的三個修飾或突變。在一個具體實施方案中,本發(fā)明涉及其中位置102處的脯氨酸由丙氨酸取代的 RSV F蛋白。在另一個具體實施方案中,本發(fā)明涉及其中位置379處的異亮氨酸由纈氨酸取代的RSV F蛋白。還在另一個具體實施方案中,本發(fā)明涉及其中位置447處的甲硫氨酸由纈氨酸取代的RSV F蛋白。在某些實施方案中,所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于這些具體實施方案中所述的位置的氨基酸處的兩個或更多個修飾或突變。在某些其他的實施方案中, 所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于這些具體實施方案中所述的位置的氨基酸處的三個修飾或突變。在一個示例性實施方案中,所述RSV蛋白具有SEQ ID NO :4中所述的氨基酸序列。在一個實施方案中,進一步優(yōu)化所述RSV F蛋白的編碼序列以增強其在合適宿主細胞中的表達。在一個實施方案中,所述宿主細胞是昆蟲細胞。在一個示例性實施方案中, 所述昆蟲細胞是Sf9細胞。在一個實施方案中,經(jīng)密碼子優(yōu)化的RSV F基因的編碼序列是SEQ IDNO :3。在另一個實施方案中,所述經(jīng)密碼子優(yōu)化的RSV F蛋白具有SEQ IDNO :4中所述的氨基酸序列。在一個實施方案中,所述RSV F蛋白進一步在F2的隱含多聚(A)位點包含至少一個修飾。在另一個實施方案中,所述RSV F蛋白進一步在主要剪切位點(⑶)包含一種或多種氨基酸突變。在一個實施方案中,所述RSV F蛋白在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)或經(jīng)密碼子優(yōu)化的RSV F蛋白(SEQ ID NO 4)的位置R133處含有修飾或突變。在另一個實施方案中,所述RSV F蛋白在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)或經(jīng)密碼子優(yōu)化的RSV F蛋白(SEQ ID NO 4)的位置R135處含有修飾或突變。還在另一個實施方案中,所述RSV F蛋白在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)或經(jīng)密碼子優(yōu)化的RSV F蛋白(SEQ ID NO 4)的位置Rl36處含有修飾或突變。在一個具體實施方案中,本發(fā)明涉及其中位置133處的精氨酸由谷氨酰胺取代的 RSV F蛋白。在另一個具體實施方案中,本發(fā)明涉及其中位置135處的精氨酸由谷氨酰胺取代的RSV F蛋白。還在另一個具體實施方案中,本發(fā)明涉及其中位置136處的精氨酸由谷氨酰胺取代的RSV F蛋白。在某些實施方案中,所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于這些具體實施方案中所述的位置的氨基酸處的兩個或更多個修飾或突變。在某些其他的實施方案中, 所述RSV F蛋白含有在對應(yīng)于這些具體實施方案中所述的位置的氨基酸處的三個修飾或突變。在一個示例性實施方案中,所述RSV蛋白具有SEQ ID NO :6中所述的氨基酸序列。在另一個實施方案中,所述RSV F蛋白進一步在融合域的N端一半(N-terminal half)中包含對應(yīng)于 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 的氨基酸 137-146 的缺失。在一個示例性實施方案中,所述RSV F蛋白具有SEQ ID NO :8中所述的氨基酸序列。 在一個替代實施方案中,所述RSV F蛋白具有SEQ ID NO 10中所述的氨基酸序列。進一步包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是除了人RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)之外的RSV F 蛋白,其含有對應(yīng)于那些如上所示的改變。此類RSV F蛋白可包括但不限于來自人RSV A 株、人RSV B株、牛RSV株和禽RSV株的RSV F蛋白。在一些實施方案中,本發(fā)明涉及在宿主細胞中相比野生型RSV F蛋白如SEQ ID NO :2所示的蛋白表現(xiàn)表達增加的修飾的或突變的RSV F蛋白。在其他實施方案中,本發(fā)明涉及在宿主細胞中相比野生型RSV F蛋白(如SEQ IDNO :2所示的蛋白)表現(xiàn)細胞毒性減少的修飾的或突變的RSV F蛋白。還在其他實施方案中,本發(fā)明涉及相比野生型RSV F蛋白(如SEQ ID NO 2所示的蛋白)表現(xiàn)免疫原性增加的修飾的或突變的RSV F蛋白。在其他方面,本發(fā)明提供了包含一種或多種如本文中所述的修飾的或突變的RSV F蛋白的免疫原性組合物。在一個實施方案中,本發(fā)明提供了由一種或多種修飾的或突變的 RSV F蛋白組成的微團(例如RSV F微團)。在另一個實施方案中,本發(fā)明提供了包含修飾的或突變的RSV F蛋白的病毒樣顆粒(VLP)。在一些實施方案中,所述VLP進一步包含一種或多種其他蛋白。在一個實施方案中,所述VLP進一步包含基質(zhì)(M)蛋白。在一個實施方案中,所述M蛋白來源于人RSV株。在另一個實施方案中,所述M蛋白來源于牛RSV株。在其他實施方案中,所述基質(zhì)蛋白可為來自流感病毒株的Ml蛋白。在一個實施方案中,所述流感病毒株是禽流感病毒株。在其他實施方案中,所述M蛋白可來源于新城疫病毒(NDV)株。在其他實施方案中,所述VLP進一步包含RSV糖蛋白G。在另一個實施方案中,所述VLP進一步包含RSV糖蛋白SH。還在另一個實施方案中,所述VLP進一步包含RSV核殼 N蛋白。所述修飾或突變的RSV F蛋白可用于預(yù)防和/或治療RSV感染。因此,在另一個方面,本發(fā)明提供了用于引發(fā)針對RSV的免疫應(yīng)答的方法。所述方法涉及將免疫學(xué)上有效量的含有修飾的或突變的RSV F蛋白的組合物施于受試者,如人或動物受試者。在另一個方面,本發(fā)明提供了包含修飾的或突變的RSV F蛋白的藥學(xué)上可接受疫苗組合物,包含修飾的或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含修飾的或突變的RSV F蛋白的VLP。在一個實施方案中,本發(fā)明包括包含至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F 蛋白的免疫原性配制物。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括包含至少一個有效劑量的包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團的免疫原性配制物。還在另一個實施方案中,本發(fā)明包括包含至少一個有效劑量的包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP的免疫原性配制物。在另一個實施方案中,本發(fā)明提供了包含充滿本發(fā)明的疫苗配制物的一種或多種成分的一個或多個容器的藥物包或試劑盒。在另一個實施方案中,本發(fā)明提供了配制誘導(dǎo)針對對哺乳動物的感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的疫苗或抗原性組合物的方法,包括將有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的 VLP添加至所述配制物。在一個優(yōu)選實施方案中,所述感染是RSV感染。本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白可用于制備刺激賦予針對傳染原的免疫或?qū)嶓w免疫的免疫應(yīng)答的組合物。因此,在一個實施方案中,本發(fā)明提供了在受試者中誘導(dǎo)針對感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSVF蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。還在另一個方面,本發(fā)明提供了在受試者中誘導(dǎo)針對RSV病毒感染或至少一種疾病癥狀的實體免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。本發(fā)明的組合物當(dāng)施于脊椎動物(例如人)時可在該脊椎動物中誘導(dǎo)實體免疫。 因此,在一個實施方案中,本發(fā)明提供了在受試者中誘導(dǎo)針對RSV病毒感染或至少一種疾病癥狀的實體免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。在另一個實施方案中,本發(fā)明提供了免疫接種哺乳動物免受RSV的方法,包括將誘導(dǎo)保護量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP施于所述哺乳動物。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括在受試者中誘導(dǎo)針對感染或其至少一種癥狀的保護性抗體應(yīng)答的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括在受試者中誘導(dǎo)針對RSV感染或其至少一種疾病癥狀的保護性細胞應(yīng)答的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括在受試者中誘導(dǎo)針對RSV感染或其至少一種疾病癥狀的保護性細胞應(yīng)答的方法,包括施用至少一個有效劑量的包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括在受試者中誘導(dǎo)針對RSV感染或其至少一種疾病癥狀的保護性細胞應(yīng)答的方法,包括施用至少一個有效劑量的VLP,其中所述VLP 包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。還在另一個方面,本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的分離的核酸。在一個示例性實施方案中,所述編碼經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的分離的核酸選自下組SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO :9。還在另一個方面,本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的核酸的分離的細胞。在一個示例性實施方案中,所述編碼經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的分離的核酸選自下組SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQID NO :7 或 SEQ ID NO :9。還在另一個方面,本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的核酸的載體。在一個示例性實施方案中,所述編碼經(jīng)修飾或突變的RSVF蛋白的分離的核酸選自下組SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO :9。在一個實施方案中, 所述載體是桿狀病毒載體。還在另一個方面,本發(fā)明提供了制備RSV F蛋白的方法,包括(a)轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達編碼本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的核酸;和(b)在有助于產(chǎn)生所述RSV F蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。在一個實施方案中,所述編碼經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的核酸選自下組SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO :9。在另一個實施方案中,所述宿主細胞是昆蟲細胞。在進一步的實施方案中,所述宿主細胞是用包含本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染的昆蟲細胞。還在另一個方面,本發(fā)明提供了制備RSV F蛋白微團的方法,包括(a)轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達編碼本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的核酸;和(b)在有助于產(chǎn)生所述RSV F 蛋白的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。在一個實施方案中,所述編碼經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的核酸選自下組SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO :9。在一個實施方案中,所述宿主細胞是昆蟲細胞。在一個示例性實施方案中,所述宿主細胞是用包含本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染的昆蟲細胞。


圖1描繪了野生型HRSV F0蛋白的結(jié)構(gòu)。圖2描繪了具有實施例3中所述的剪切位點突變的修飾的RSV F0蛋白的結(jié)構(gòu)。圖3描繪了修飾的HRSV F蛋白BV#541 (SEQ ID NO 6)的主要剪切位點中的保守取代(R133Q、R135Q 和 R136Q)。圖4描繪了修飾的HRSV F蛋白BV#541 (SEQ ID NO :6)的序列和結(jié)構(gòu)。圖5描繪了修飾的HRSV F蛋白BV#622 (SEQ ID NO :10)的序列和結(jié)構(gòu)。
圖6描繪了經(jīng)純化的重組HRSV F蛋白BV#622存在或不存在β ME時的SDS-PAGE 考馬斯染色的凝膠。圖7描繪了修飾的HRSV F蛋白BV#683 (SEQ ID NO 8)的結(jié)構(gòu)。圖8描繪了經(jīng)純化的重組HRSV F蛋白BV#622和BV#683存在或不存在β ME時的 SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠(左側(cè)),和它們的結(jié)構(gòu)。圖9描繪了經(jīng)純化的重組HRSV F蛋白BV#683存在或不存在β ME時的SDS-PAGE 考馬斯染色的凝膠(左側(cè))和Western印跡(右側(cè))分析。圖10描繪了用于通過掃描光密度法(左側(cè))和Western印跡(右側(cè))對經(jīng)純化的重組HRSV F蛋白BV#683的純度分析中的SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠。圖11描繪了在負(fù)染電子顯微鏡中攝取的經(jīng)純化的重組HRSV F蛋白BV#683微團 (玫瑰花結(jié))的照片。圖12描繪了 HRSV F蛋白BV#683微團的顆粒大小分析。圖13描繪了在粗細胞培養(yǎng)收獲物(胞內(nèi))或通過30%蔗糖梯度分離所沉淀的樣品中經(jīng)修飾的HRSV F蛋白BV#622和BV#623(SEQ ID NO :21)與或不與HRSV N禾口 BRSV M 蛋白共同表達時的SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠(左側(cè))和Western印跡(右側(cè))分析,以及BV#622和BV#623的結(jié)構(gòu)。圖14描繪了在粗細胞培養(yǎng)收獲物(胞內(nèi))樣品中的經(jīng)修飾的HRSV F蛋白BV#622、 雙串聯(lián)(double tandem)嵌合 BV#636 (BV#541+BRSV Μ)、BV#683、BV#684 (具有 YIAL L-域的BV#541)以及BV#685 (具有YKKL L-域的BV恥41)與或不與HRSV N和BRSV M蛋白共同表達時的SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠(左側(cè))和Western印跡(右側(cè))分析,以及每一個經(jīng)分析的經(jīng)修飾的HRSV F蛋白的結(jié)構(gòu)。圖15描繪了在通過30%蔗糖梯度分離的沉淀的樣品中的經(jīng)修飾的RSV F蛋白 BV#622 (SEQ ID NO 10)、雙串聯(lián)嵌合 BV#636 (BV#541+BRSV Μ)、BV#683 (SEQ ID NO :8)、 BV#684(具有HAL L-域的BV恥41)以及BV#685 (具有YKKL L-域的BV恥41)與或不與HRSV N和BRSV M蛋白共同表達時的SDS-PAGE考馬斯染色的凝膠(左側(cè))和^iestern印跡(右側(cè))分析,以及每一個經(jīng)分析的經(jīng)修飾的HRSV F蛋白的結(jié)構(gòu)。圖16描繪了實施例9中所述的每個經(jīng)修飾的RSV F蛋白的結(jié)構(gòu)、克隆名、描述、 Western印跡和SDS-PAGE考馬斯結(jié)果以及結(jié)論。圖17描繪了實施例10中所述的RSV攻擊研究的實驗過程。圖18描繪了在第31日和第46日用PBS、生活RSV、FI-RSVUug PFPUug PFP+AlumUOug PFPUOug PFP+Alum、30ug PFP和陽性對照(綿羊抗F)免疫接種的小鼠的 RSV中和測定結(jié)果。圖19描繪了在感染性RSV攻擊之后4日,用PBS、生活RSV、FI-RSVUug PFPUug PFP+AlumUOug PFPUOug PFP+Alum和30ug PFP免疫接種的小鼠的肺組織中的RSV效價。圖20描繪了在2-8°C儲藏0、1、2、4和5周的純化的重組RSV F蛋白BV#683的用考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠。圖21描繪了用生活RSV(RSV)、福爾馬林失活的RSV(FI-RSV)、具有或不具有鋁的 RSV-F蛋白BV#683 (PFP和PFP+鋁佐劑)和PBS對照免疫接種之后的RSVA和RSV B中和抗
體應(yīng)答。
圖22描繪了在用生活RSV(RSV)、福爾馬林失活的RSV(FI-RSV)、具有或不具有鋁的RSV-F蛋白BV#683 (F-微團(30ug)和F-微團(30ug) +鋁佐劑)和PBS對照免疫接種的大鼠中用RSV攻擊之后的肺部病理狀況(pathology)。
具體實施例方式定義如用于本文,術(shù)語“佐劑”指當(dāng)在配制物中與特定免疫原(例如經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP)組合使用時,會提高或者以其他方式改變或修飾所得的免疫應(yīng)答的化合物。免疫應(yīng)答的修飾包括加強或拓寬抗體和細胞免疫應(yīng)答之一或兩者皆是的特異性。免疫應(yīng)答的修飾亦可意指減少或抑制某些抗原特異性免疫應(yīng)答。如用于本文,術(shù)語“抗原性配制物”或“抗原性組合物”指當(dāng)施于脊椎動物特別是鳥或哺乳動物時,會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的制備物。如用于本文,術(shù)語“禽流感病毒”指主要見于禽類但亦可感染人或其他動物的流感病毒。在一些情況下,禽流感病毒可從一個人傳染或散布至另一個人。感染人的禽流感病毒具有引起流感流行,即人類發(fā)病和/或病死的潛力。當(dāng)新的流感病毒株(人對其不具有天然免疫的病毒)出現(xiàn)時,發(fā)生流行,散布至個別區(qū)域之外,可能遍及全球,并同時感染許多人。如用于本文“有效量”一般指足以誘導(dǎo)免疫、預(yù)防或減輕感染或減少感染或疾病的至少一種癥狀和/或增強另一劑的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP效力的本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSVF蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F 蛋白的VLP的量。有效劑量可指足以延遲或最小化感染或疾病發(fā)作的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP的量。有效劑量亦可指在治療或控制感染或疾病中提供治療益處的經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP的量。此外,有效劑量是在治療或控制感染或疾病中提供治療益處的針對本發(fā)明的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP自身的量,或與其他治療組合的量。有效劑量亦可為足以增強受試者(例如人)針對后續(xù)暴露于傳染原或疾病的本身的免疫應(yīng)答的量。免疫的水平可例如通過測量中和性的分泌和/或血清抗體(例如通過噬菌斑中和、補體結(jié)合、酶聯(lián)免疫吸附或微中和測定),或通過測量細胞應(yīng)答(如細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助T細胞、 樹突狀細胞和/或其他細胞應(yīng)答,但不限于此)來進行監(jiān)視。T細胞應(yīng)答可通過例如使用特異性標(biāo)記通過熒光流式細胞計數(shù)或T細胞測定法(如T細胞增殖測定、T細胞細胞毒性測定、TETRAMER測定和/或ELISP0T測定)來測量例如存在的CD4+和CD8+細胞的量來進行監(jiān)視。在疫苗的情況下“有效劑量”是預(yù)防疾病和/或減少癥狀嚴(yán)重性的劑量。如用于本文,術(shù)語“有效量”指實現(xiàn)所需生物作用所必須的或足以實現(xiàn)所需生物作用的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP的量。組合物的有效量會是實現(xiàn)選定結(jié)果的量,且此種量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員作為常規(guī)實驗事項加以確定。舉例而言,預(yù)防、治療和/或減輕感染的有效量可為在暴露于本發(fā)明的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSVF微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP時,造成免疫系統(tǒng)激活,導(dǎo)致抗原特異性免疫應(yīng)答的發(fā)生所必需的量。該術(shù)語亦為“足量”的同義詞。
如用于本文,術(shù)語“表達”指多聚核酸轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為肽、多肽或蛋白的過程。如果多聚核酸來源于基因組DNA,表達可包括mRNA的剪接(如果選取適當(dāng)?shù)恼婧怂拗骷毎蛏?。在本發(fā)明的上下文中,該術(shù)語亦涵蓋在其表達之后取得的RSV F基因mRNA 和RSV F蛋白的產(chǎn)出。如用于本文,術(shù)語“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”指具有RSV融合蛋白多肽全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白。類似地,術(shù)語“G蛋白”或 “G蛋白多肽”指具有RSV附接蛋白(attachment protein)多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白。已描述了多種RSV融合和附接蛋白,且其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。 W0/2008/114149,其通過全文提述并入本文,列舉了示例性F和G蛋白變體(例如,天然存在的變體)。如用于本文,術(shù)語“免疫原”或“抗原”指能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的物質(zhì)如蛋白、肽、肽、 核酸。兩個術(shù)語均涵蓋表位,并可互換使用。如用于本文,術(shù)語“免疫刺激劑”指通過機體自身的化學(xué)信使(細胞因子)增強免疫應(yīng)答的化合物。這些分子包括多種具有免疫刺激、免疫增強和促炎癥活性的細胞因子、 淋巴因子和趨化因子,如干擾素(IFN-Y)、白介素(例如IL-1、IL-2、IL_3、IL_4、IL-12、 IL-13);生長因子(例如,粒細胞-巨噬細胞(GM)集落刺激因子(CSF));和其他免疫刺激分子,如巨噬細胞炎癥因子、Flt3配體、B7. 1 ;B7. 2等。所述免疫刺激劑分子可與本發(fā)明的 VLP在相同配制物中施用,或可分別施用??墒┯迷摰鞍谆蚓幋a該蛋白的表達載體以產(chǎn)生免疫刺激作用。如用于本文,術(shù)語“免疫原性配制物”指當(dāng)施于脊椎動物例如哺乳動物時,會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的制備物。如用于本文,術(shù)語“傳染原”指在脊椎動物中造成感染的微生物。通常所述生物為病毒、細菌、寄生物、原生生物和/或真菌。如用于本文,術(shù)語“突變的”、“修飾的”、“突變”或修飾指任何導(dǎo)致核酸或多肽改變的對核酸和/或多肽的修飾。突變包括,例如在多核苷酸中的點突變、缺失或插入單一或多個殘基,其包括在基因的蛋白編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn)的改變以及在蛋白編碼序列之外的區(qū)(如調(diào)節(jié)或啟動子序列,但不限于此)中的改變。遺傳變化可以是任何類型的突變。舉例而言,所述突變可包括點突變、移碼突變、插入或缺失部分或整個基因。在一些實施方案中,所述突變?yōu)樘烊淮嬖诘?。在其他實施方案中,所述突變?yōu)槿斯ね蛔儔毫Φ慕Y(jié)果。仍在其他實施方案中,RSV F蛋白中的突變是遺傳工程的結(jié)果。如用于本文,術(shù)語“多價的”指具有一個或多個針對多種類型或株的傳染原或疾病的抗原性蛋白/肽或免疫原的組合物。如用于本文,術(shù)語“藥學(xué)上可接受的疫苗”指含有本發(fā)明的經(jīng)修飾或突變的RSV F 蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的 VLP的配制物,其為能夠施于脊椎動物并誘導(dǎo)足以誘導(dǎo)免疫以預(yù)防和/或減輕感染或疾病,和/或減少感染和/或疾病至少一種癥狀,和/或增強另一劑的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP 的效力的保護性免疫應(yīng)答的形式。通常而言,所述疫苗包含本發(fā)明組合物懸于或溶解于其中的常規(guī)的鹽水或經(jīng)緩沖的水溶液介質(zhì)。以此形式,本發(fā)明的組合物可方便地用于預(yù)防、減輕或以其他方式治療感染。當(dāng)導(dǎo)入宿主時,所述疫苗能夠激發(fā)包括但不限于產(chǎn)生抗體和/ 或細胞因子和/或激活細胞毒性T細胞、抗原呈遞細胞、輔助T細胞、樹突狀細胞和/或其他細胞應(yīng)答的免疫應(yīng)答。如用于本文,短語“保護性免疫應(yīng)答”或“保護性應(yīng)答”指由針對傳染原或疾病的抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,其由脊椎動物(例如人)所展示,預(yù)防或減輕感染,或減少其至少一種疾病癥狀。本發(fā)明的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP可刺激抗體的產(chǎn)生,所述抗體例如中和傳染原、阻斷傳染原進入細胞、阻斷傳染原的復(fù)制和/或保護宿主細胞免受感染和破壞。該術(shù)語亦指由T淋巴細胞和/或其他白細胞介導(dǎo)針對免疫原或疾病的免疫應(yīng)答,其由脊椎動物 (例如人)展示,預(yù)防或減輕感染或疾病,或減少其至少一種癥狀。如用于本文,術(shù)語“脊椎動物”或“受試者”或“患者”指任何脊索動物亞門 (subphylum cordata)的成員,包括但不限于人和其他靈長類,包括非人靈長類如黑猩猩和其他猿和猴物種。牲畜(farm animal)如牛、綿羊、豬、山羊和馬;家養(yǎng)哺乳動物如犬和貓; 實驗室動物包括嚙齒類如小鼠、大鼠(包括棉鼠)和豚鼠;禽類,包括家養(yǎng)、野生和獵禽如雞、火雞和其他雞類、鴨、鵝等亦為非限定性實例。術(shù)語“哺乳動物”和“動物”包括在該定義中。旨在涵蓋成體和新生個體兩者。具體而言,嬰幼兒為RSV疫苗的適當(dāng)受試者或患者。如用于本文,術(shù)語“病毒樣顆粒”(VLP)指至少一個屬性類似病毒但不表現(xiàn)為感染性的結(jié)構(gòu)。病毒樣顆粒依照本發(fā)明并不攜帶編碼病毒樣顆粒的蛋白的遺傳信息。一般而言, 病毒樣顆粒缺乏病毒基因組,并因此不具感染性。此外,病毒樣顆粒經(jīng)常通過異源表達大量產(chǎn)生,并可方便地純化。如用于本文,術(shù)語“嵌合VLP”指含有來自至少兩個傳染原的蛋白(異源蛋白)或其部分的VLP。通常而言,一種蛋白來源于能夠驅(qū)動從宿主細胞的VLP形成的病毒。就說明的目的的實例為BRSV M蛋白和/或HRSV G或F蛋白。術(shù)語RSV VLP和嵌合VLP在適當(dāng)時
可互換使用。如用于本文,術(shù)語“疫苗”指死的或減弱的病原體或衍生的抗原決定簇的制備物, 其用于誘導(dǎo)針對該病原體的抗體或免疫的形成。給予疫苗以提供對疾病例如流感(其由流感病毒引起)的免疫。此外,術(shù)語“疫苗”亦指施于脊椎動物以產(chǎn)生保護性免疫(即預(yù)防或減少與感染相關(guān)的疾病嚴(yán)重性的免疫)的免疫原(例如,經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP)的懸液或溶液。本發(fā)明提供了具免疫原性并可提供針對與感染相關(guān)的疾病的保護的疫苗組合物。RSV F 蛋白兩個結(jié)構(gòu)膜蛋白,F(xiàn)和G蛋白表達于RSV的表面,并顯示為中和抗體的靶標(biāo) (Sullender, W. ,2000, Clinical Microbiology Review 13,1-15) 這兩個蛋白亦主要負(fù)責(zé)病毒識別和進入靶細胞;G蛋白結(jié)合于特定細胞受體,而F蛋白促進病毒與細胞的融合。 F蛋白亦表達于感染細胞的表面,并負(fù)責(zé)其之后與其他細胞的融合,導(dǎo)致合胞體的形成。因此,針對F蛋白的抗體可中和病毒,或阻斷病毒進入細胞或防止合胞體形成。盡管對G和F 蛋白兩者,已描述了 A和B亞型之間的抗原性和結(jié)構(gòu)差異,更顯著的抗原性差異存在于G蛋白,其氨基酸序列僅為53%同源,而抗原相關(guān)性為5% (Walsh等(1987) J. Infect. Dis. 155, 1198-1204 ;and Johnson 等(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 5625-5629)。與之相對,針對F蛋白培育的抗體在亞型A和B病毒中顯示高度的交叉反應(yīng)性。RSV F蛋白指導(dǎo)RSV通過病毒粒體的包膜蛋白與宿主細胞質(zhì)膜之間的融合進行的穿透。之后在感染過程中,表達于細胞表面的F蛋白可介導(dǎo)與相鄰細胞的融合以形成合胞體。F蛋白是I型跨膜表面蛋白,其具有N端剪切的信號肽和靠近C端的膜錨著點(membrane anchor) 0 RSV F是作為無活性的Ftl前體合成的,其裝配為同三聚體,并通過在反面高爾基復(fù)合體(trans-Golgi complex)中由細胞內(nèi)肽酶剪切得到兩個二硫鍵連接的亞基,F(xiàn)1和F2 亞基而激活。由剪切產(chǎn)生的F1亞基的N端含有直接插入靶標(biāo)膜中以起始融合的疏水域(融合肽)。F1亞基亦含有在融合中結(jié)合從而驅(qū)動使病毒和細胞膜彼此緊密接近的構(gòu)象改變 (conformational shift)的七重復(fù),(Collins 禾口 Crowe,2007,F(xiàn)ields Virology, 5th ed., D. M Kipe 等,Lipincott, Williams and ffilkons, p. 1604)。SEQ IDNO :2 (GenBank 登錄號 AAB59858)描繪了代表性RSV F蛋白,其由SEQ IDNO :1 (GenBank登錄號Ml 1486)中所示的基因編碼。自然界中,RSV F蛋白作為命名為FO的長574個氨基酸的單一多肽前體表達。在體內(nèi),F(xiàn)O在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中寡聚化,并由弗林蛋白酶在兩個保守的弗林蛋白酶共同序列(弗林蛋白酶剪切位點)RARR(SEQ ID NO 23)(次要)和KKRKRR(SEQ ID NO 24)(主要)進行蛋白水解加工以生成由兩個二硫鍵連接的片段組成的寡聚物。這些片段中較小的命名為F2,其起源于FO前體的N端部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道,縮寫F0、Fl和F2在科學(xué)文獻中常常命名為Fc^F1和F2。較大的C端Fl片段通過疏水性氨基酸的序列將F蛋白錨定于膜,所述疏水性氨基酸鄰近M個氨基酸的細胞質(zhì)尾部。三個F2-F1 二聚體結(jié)合形成成熟F蛋白,其采用亞穩(wěn)的融合前的(融合前)構(gòu)象,在與靶細胞膜接觸時受觸發(fā)發(fā)生構(gòu)象改變。該構(gòu)象改變暴露稱作融合肽的疏水序列,該序列與宿主細胞膜結(jié)合并促進病毒或感染細胞的膜與靶細胞膜的融合。Fl片段含有至少兩個七重復(fù)域,稱為HRA和HRB,并分別處在靠近所述融合肽和跨膜錨定域的位置。在融合前構(gòu)象中,F(xiàn)2-F1 二聚體形成球狀的頭和柄(head and stalk) 結(jié)構(gòu),其中所述HRA域處于球狀頭部中的分段(延伸)的構(gòu)象。與之相對,HRB域形成從頭部區(qū)延伸的三鏈的卷曲螺旋柄。在從融合前至融合后構(gòu)象的轉(zhuǎn)變過程中,HRA域折疊 (collapse)并移至靠近HRB域處以形成反平行的六個螺旋束。在融合后狀態(tài),融合肽和跨膜域并排以促進膜融合。盡管上述對構(gòu)象的描述是基于結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)的分子建模,融合前和融合后構(gòu)象之間的結(jié)構(gòu)差異可無需訴諸結(jié)晶學(xué)即可進行監(jiān)視。舉例而言,可使用電子顯微術(shù)以區(qū)分融合前和融合后(或者稱為融合前的和融合的)構(gòu)象,如Calder等,Virology, 271 122-131 (2000)和Morton等,Virology, 311 :275-288所闡明(就其技術(shù)教導(dǎo)的目的通過提述并入本文)。融合前構(gòu)象也可以通過脂質(zhì)體相關(guān)測定法(liposome association assay)而區(qū)別于融合的(融合后)構(gòu)象,如 Connolly 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 17903-17908(2006)(就其技術(shù)教導(dǎo)的目的通過提述并入本文)。此外,融合前和融合的構(gòu)象可使用特異性識別RSV F蛋白的一種或另一種融合前或融合形式上存在,但不存在于其他形式的構(gòu)象表位的抗體(例如單克隆抗體)進行區(qū)分。此類構(gòu)象表位可為由于抗原決定簇在分子表面有偏好的暴露所致。或者,構(gòu)象表位可來自直鏈多肽上非連續(xù)的氨基酸的并置。 經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當(dāng)對RSV F蛋白的結(jié)構(gòu)進行特定修飾時,可取得令人驚訝地高水平的融合(F)蛋白的表達。此類修飾亦令人意想不到地減少了 RSV F蛋白在宿主細胞中的細胞毒性。此外,本發(fā)明的修飾的F蛋白表現(xiàn)了改善的展示融合后“棒棒糖”形態(tài)而非融合前“桿狀”形態(tài)的能力。因此,在一個方面,本發(fā)明經(jīng)修飾的F蛋白與野生型F蛋白(例如由SEQ ID NO :2所示例,其對應(yīng)于GenBank登錄號AAB59858)相比亦可顯示改善的(例如增強的)免疫原性。這些修飾顯然適用于使用所述疫苗用于治療和/或預(yù)防RSV的疫苗和方法的開發(fā)。依照本發(fā)明,可對天然或野生型RSV F蛋白進行任何數(shù)量的突變,且在一個優(yōu)選的方面,可進行多重突變以導(dǎo)致與天然或野生型RSV F蛋白相比改善的表達和/或免疫原性。 此類突變包括點突變、移碼突變、缺失和插入,優(yōu)選一個或多個(例如一個、兩個、三個或四個等)突變。所述天然F蛋白多肽可選自RSV A株、RSV B株、HRSV A株、HRSV B株、BRSV株或禽RSV株的任何的F蛋白,或其變體(如上所定義)。在某些示例性實施方案中,所述天然 F蛋白多肽是由SEQ ID NO: 2代表的F蛋白(GenBank登錄號AAB59858)。為了協(xié)助理解本公開,所有氨基酸殘基位置,無論是何種株,均針對(即所述氨基酸殘基的位置相對于)示例性F蛋白的氨基酸位置給出。來自其他RSV株的F蛋白的相應(yīng)氨基酸位置可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地通過將選定的RSV株的氨基酸序列與示例性序列使用方便可得且公知的比對算法(如BLAST,例如使用缺省參數(shù))進行比對來確定。來自不同RSV株的F蛋白多肽的多個其他實例公開于W0/2008/114149 (其通過全文提述并入本文)。其他變體可通過遺傳漂變發(fā)生,或可使用定點或隨機誘變或通過重組兩個或更多個已經(jīng)存在的變體而人工產(chǎn)生。此類其他的變體亦適于本文中公開的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的上下文??墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將突變導(dǎo)入本發(fā)明的RSV F蛋白。突變可通過例如在作為二價金屬離子輔因子的錳的存在下進行PCR反應(yīng)而隨機導(dǎo)入?;蛘撸押塑账釋?dǎo)向的誘變可用于構(gòu)建允許在沿編碼DNA分子上任何決定的位點進行所有可能類型的堿基對變化的突變的或修飾的RSV F蛋白。一般而言,該技術(shù)涉及將互補于(除了一個或多個錯配)編碼目標(biāo)RSV F蛋白的單鏈核苷酸序列的寡核苷酸退火。然后通過DNA聚合酶延伸錯配的寡核苷酸,生成在一條鏈的序列中含有所需變化的雙鏈DNA分子。該序列中的變化可例如導(dǎo)致氨基酸的缺失、取代或插入。然后可將雙鏈多核苷酸插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體,并由此產(chǎn)生突變的或修飾的多肽。上述寡核苷酸導(dǎo)向的誘變可例如通過PCR實施。其他RSV蛋白本發(fā)明還涵蓋包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV病毒樣顆粒(VLP),其可配制為疫苗或抗原性配制物以供保護脊椎動物(例如人)免受RSV感染或其至少一種疾病癥狀。在一些實施方案中,所述包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP進一步包含其他的RSV 蛋白,如M、N、G和SH。在其他實施方案中,所述包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP進一步包含來自異源的病毒株的蛋白,如流感病毒蛋白HA、NA和Ml。在一個實施方案中,流感病毒蛋白Ml來源于禽流感病毒株。RSV N蛋白緊密結(jié)合于基因組RNA和復(fù)制中間物反義基因組RNA以形成抗RNAse 的核殼。SEQ ID N0:16(野生型)和SEQ ID NO :18 (密碼子優(yōu)化的)描繪了 RSV N蛋白的代表性氨基酸序列,而SEQ ID NO :15(野生型)和SEQ IDNO 17 (密碼子優(yōu)化的)描繪了編碼所述RSV N蛋白的代表性核酸序列。本發(fā)明中涵蓋了與SEQ ID NO :18至少約20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%或者約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 96%、約 97%、約98%或約99%相同的RSV N蛋白,及其所有的片段和變體(包括嵌合蛋白)。RSV M蛋白是在質(zhì)膜中積累的非糖基化的內(nèi)部病毒粒體蛋白,其與RSVF蛋白和其他因子在病毒形態(tài)發(fā)生過程中相互作用。在某些優(yōu)選的實施方案中,RSV M蛋白是牛 RSV(BRSV)M蛋白。SEQ ID NO :12(野生型)和SEQ IDNO 14 (密碼子優(yōu)化的)描繪了 BRSV M蛋白的代表性氨基酸序列,而SEQ IDNO 11(野生型)和SEQ ID NO 13 (密碼子優(yōu)化的) 描繪了編碼所述BRSV M蛋白的代表性核酸序列。本發(fā)明中涵蓋了與SEQ ID N0:12和14至少約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%或約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、 約96 %、約97 %、約98 %或約99 %相同的RSV (包括但不限于BRSV) M蛋白,及其所有的片段和變體(包括嵌合蛋白)。RSV G蛋白是在接近N端具有單一疏水區(qū)的II型跨膜糖蛋白,其既充當(dāng)未剪切的信號肽,還充當(dāng)膜錨定點,留下分子C端的三分之二朝向外側(cè)。RSVG亦表達為分泌蛋白,其來自從ORF中第二個AUG (約在氨基酸48處)(其位于信號/錨定點之內(nèi))進行的翻譯起始。RSV G外功能區(qū)的大部分在RSV株之間是高度分歧的(同前,1607頁)。SEQ ID NO: 26描繪了代表性RSV G蛋白,其由SEQ ID NO :25中所示的基因序列所編碼。本發(fā)明中涵蓋了與SEQ IDNO 26至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%或約80%、約 85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%相同的RSV G蛋白,及其所有的片段和變體(包括嵌合蛋白)。 RSV的SH蛋白是含有64個(RSV亞組A)或65個氨基酸殘基(RSV亞組B)的II 型跨膜蛋白。一些研究表明RSV SH蛋白可在病毒融合或在改變膜滲透性中起作用。然而, 缺乏SH基因的RSV可以存活,導(dǎo)致合胞體形成并與野生型病毒一樣良好地生長,表明SH蛋白對于病毒進入宿主細胞或合胞體形成并不是必需的。RSV的SH蛋白顯示抑制TNF-α信號傳導(dǎo)的能力。SEQ IDNO :27描繪了 RSV SH蛋白的代表性氨基酸序列。本發(fā)明中涵蓋了與 SEQ IDNO 27 至少約 20%、約 30%、約 40%、約 50%、約 60%、約 70%或約 80%、約 85%、 約90 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %相同的RSV SH蛋白,及其所有的片段和變體(包括嵌合蛋白)。RSV 疫苗目前,唯一批準(zhǔn)用于預(yù)防RSV疾病的方法是被動免疫接種。表明IgG具有保護性作用的初始證據(jù)是從涉及雪貂(Prince, G. Α.,Ph. D. diss.,University of California, Los Angeles, 1975)中和人(Lambrecht 等,(1976) J. Infect. Dis. 134,211-217 ;和 Glezen 等(1981) J. Pediatr. 98, 708-715)中母體抗體的觀察獲得的。Hemming 等(Morel 1 等, eds. ,1986,Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins,Academic Press,London at pages 285-294)在涉及懷疑罹患新生兒敗血病的新生兒中的靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)的藥物代謝動力學(xué)的研究過程中認(rèn)識到RSV抗體可能可用于治療或預(yù)防RSV感染。他們注意到一個呼吸系統(tǒng)分泌物產(chǎn)生RSV的嬰兒在IVIG灌注之后迅速恢復(fù)。對于該IVIG批次的后續(xù)分析揭示了不尋常的高效價的RSV中和抗體。同一組的研究者隨后檢查了該富集了 RSV 中和抗體的超免疫的血清或免疫球蛋白保護棉鼠和靈長類免受RSV感染的能力O^ince等 (1985) Virus Res. 3,193-206 ;Prince 等(1990) J. Virol. 64,3091-3092)。這些研究的結(jié)果表明預(yù)防性給予的RSV中和抗體抑制RSV在棉鼠中的呼吸道復(fù)制。當(dāng)治療性給予時,RSV抗體既在棉鼠中還在非人靈長類模型中減少了肺部病毒復(fù)制。此外,免疫血清或免疫球蛋白的被動灌注并未在隨后用RSV攻擊的棉鼠中產(chǎn)生增強的肺部病理狀態(tài)。因為RSV感染可通過將中和抗體提供給脊椎動物來防止,包含經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白的疫苗當(dāng)施于脊椎動物時,可在體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體。偏好將經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白用于預(yù)防和/或治療RSV感染。因此,本公開的另一個方面涉及引發(fā)針對RSV的免疫應(yīng)答的方法。該方法涉及將免疫學(xué)上有效量的含有經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的組合物施于受試者(如人或動物受試者)。免疫學(xué)上有效量的所述組合物的給藥引發(fā)了對于所述經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白上存在的表位具有特異性的免疫應(yīng)答。此種免疫應(yīng)答可包括B細胞應(yīng)答(例如中和抗體的產(chǎn)生)和/或T細胞應(yīng)答(例如細胞因子的產(chǎn)生)。優(yōu)選地,由經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白引發(fā)的免疫應(yīng)答包含對于所述經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白上存在的至少一種構(gòu)象表位具有特異性的要素。在一個實施方案中,所述免疫應(yīng)答對于見于“棒棒糖”融合后活性狀態(tài)的RSV F蛋白上存在的表位具有特異性。可將RSV F蛋白和組合物施于受試者而使其與RSV接觸之后不增強病毒疾病。優(yōu)選地,本文中公開的經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白和適當(dāng)配制的免疫原性組合物引發(fā)偏好Thl的免疫應(yīng)答,其減少或預(yù)防RSV感染和/或減少或預(yù)防在RSV感染之后的病理應(yīng)答。在一個實施方案中,本發(fā)明的RSV F蛋白見于微團形式(例如,玫瑰花結(jié))。依照本發(fā)明可獲得的微團由具有玫瑰花結(jié)樣結(jié)構(gòu)的免疫學(xué)上有活性的F突起蛋白(spike protein)的聚集體組成。所述玫瑰花結(jié)在電子顯微鏡下是可見的(Calder等,2000, Virology 271 122-131)。優(yōu)選地,包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的本發(fā)明的微團展示表明融合后活性狀態(tài)的“棒棒糖”形態(tài)。在一個實施方案中,在于宿主細胞中表達之后純化微團。當(dāng)施于受試者時,本發(fā)明的微團優(yōu)選誘導(dǎo)中和抗體。在一些實施方案中,所述微團可與佐劑一同施用。在其他實施方案中,所述微團可無需佐劑施用。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV病毒樣顆粒(VLP),其可配制為疫苗或抗原性配制物以供保護脊椎動物(例如人)免受RSV感染或其至少一種疾病癥狀。本發(fā)明還涉及包含來源于不同株的RSV病毒的野生型和突變RSV 基因或其組合的RSV VLP和載體,當(dāng)將其轉(zhuǎn)染入宿主細胞時,會產(chǎn)生包含RSV蛋白的病毒樣顆粒(VLP)。在一些實施方案中,RSV病毒樣顆??蛇M一步包含至少一種病毒基質(zhì)蛋白(例如 RSV M蛋白)。在一個實施方案中,所述M蛋白來源于人RSV株。在另一個實施方案中,所述 M蛋白來源于牛RSV株。在其他實施方案中,所述基質(zhì)蛋白可為來自流感病毒株的Ml蛋白。 在一個實施方案中,所述流感病毒株是禽流感株。在一個優(yōu)選實施方案中,所述禽流感株是 H5W株AAndonesia/5/05。在其他實施方案中,所述基質(zhì)蛋白可來自新城疫病毒(NDV)。在一些實施方案中,所述VLP可進一步包含RSV G蛋白。在一個實施方案中,所述G蛋白可來自HRSV組A。在另一個實施方案中,所述G蛋白可來自HRSV組B。還在另一個實施方案中,所述RSV G可來源于HRSV組A和/或組B。在一些實施方案中,所述VLP可進一步包含RSV SH蛋白。在一個實施方案中,所述SH蛋白可來自HRSV組A。在另一個實施方案中,所述SH蛋白可來自HRSV組B。還在另一個實施方案中,所述RSV SH可來源于HRSV組A和/或組B。在一些實施方案中,所述VLP可進一步包含RSV N蛋白。在一個實施方案中,所述 N蛋白可來自HRSV組A。在另一個實施方案中,所述N蛋白可來自HRSV組B。還在另一個實施方案中,所述RSV N可來源于HRSV組A和/或組B。在進一步的實施方案中,本發(fā)明的VLP可包含一種或多種異源免疫原,如流感血凝素(HA)和/或神經(jīng)氨酸酶(NA)。在一些實施方案中,本發(fā)明在一個或多個VLP中還包含來自相同的和/或不同的株的不同的RSV M、F、N、SH和/或G蛋白的組合。此外,所述VLP可包含一種或多種其他分子以供增強免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的另一個實施方案中,所述RSV VLP可攜帶藥劑如核酸、SiRNA、微RNA、 化療劑、成像劑和/或其他需遞送至患者的藥劑。本發(fā)明的VLP可用于制備疫苗和免疫原性組合物。VLP的一個重要特征是表達目標(biāo)表面蛋白的能力,從而使得脊椎動物的免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)針對目標(biāo)蛋白的免疫應(yīng)答。然而,并非所有蛋白可表達于VLP表面。為何某些蛋白在VLP表面不表達或表達不良可能有許多原因。一個原因是所述蛋白未被引導(dǎo)至宿主細胞膜或者所述蛋白沒有跨膜域。作為一個實例, 靠近流感血凝素羧基端的序列對于HA摻入成熟流感包膜核殼的脂雙層和對于HA三聚體相互作用與流感基質(zhì)蛋白Ml裝配可為重要的(Ali,等,(2000) J.Virol. 74,8709-19).因此,本發(fā)明的一個實施方案包括包含來自RSV的經(jīng)修飾或突變的F蛋白和至少一種并不通常有效地表達于細胞表面或并非正常RSV蛋白的免疫原的VLP。在一個實施方案中,所述經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白可與目標(biāo)免疫原融合。在另一個實施方案中,所述經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白與所述免疫原通過跨膜域和異源病毒表面膜蛋白例如MMTV包膜蛋白的細胞質(zhì)尾部結(jié)合。本發(fā)明的其他嵌合VLP包括包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種來自異源傳染原的蛋白的VLP。異源傳染原的實例包括但不限于病毒、細菌、原生生物、真菌和/或寄生物。在一個實施方案中,來自另一個傳染原的免疫原是異源病毒蛋白。在另一個實施方案中,來自異源傳染原的蛋白是包膜相關(guān)蛋白。在另一個實施方案中,來自另一個異源傳染原的蛋白是在VLP表面表達的。在另一個實施方案中,來自傳染原的蛋白包含在脊椎動物中會生成保護性免疫應(yīng)答的表位。在一個實施方案中,來自另一個傳染原的蛋白與經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白共同表達。在另一個實施方案中,來自另一個傳染原的蛋白融合于經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。在另一個實施方案中,僅來自另一個傳染原的蛋白的一部分融合于經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。在另一個實施方案中,僅來自另一個傳染原的蛋白的一部分融合于經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的一部分。在另一個實施方案中,融合于經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的所述來自另一個傳染原的蛋白的部分在VLP表面表達。本發(fā)明還涵蓋在本發(fā)明的VLP之上或之中表達的蛋白的變體。所述變體可在其組成蛋白的氨基酸序列中含有改變。針對蛋白的術(shù)語“變體”指相對參照序列改變了一個或多個氨基酸的氨基酸序列。所述變體可具有“保守”變化,其中取代的氨基酸具有類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì),例如用異亮氨酸替代亮氨酸?;蛘?,變體可具有“非保守”的變化,例如用色氨酸替代甘氨酸。類似的次要變異還可包括氨基酸缺失或插入,或兩者皆是。確定可取代、 插入或缺失哪些氨基酸殘基而不會消除生物學(xué)或免疫性活性的指導(dǎo)可使用本領(lǐng)域公知的計算機程序例如DNASTAR軟件來發(fā)現(xiàn)。天然變體可由于蛋白中的突變而出現(xiàn)。這些突變可在每組傳染原例如流感中導(dǎo)致抗原性變異(variability)。因此,經(jīng)例如流感株感染的個體針對該病毒產(chǎn)生抗體,隨著新病毒株的出現(xiàn),針對舊株的抗體不再識別新病毒,而可出現(xiàn)重新感染。本發(fā)明涵蓋了來自傳染原的蛋白的所有抗原性和遺傳變異以供制備VLP。描述適用于本發(fā)明的分子生物學(xué)技術(shù)如克隆、突變、細胞培養(yǎng)等的通用文本包括 Berger 禾口 Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego, Calif. (Berger) ;Sambrook 等,Molecular Cloning—A Laboratory Manual(3rd Ed.), Vol. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,N. Y.,2000( "Sambrook,,)以及 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等,eds.,Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc. and John Wiley &Sons,Inc.,( "Ausubel,,)。這些文本描述了誘變、載體的使用、啟動子和許多其他相關(guān)的主題,涉及例如RSV的F和/或G分子的克隆和突變等。因此,本發(fā)明還涵蓋使用已知的蛋白質(zhì)工程方法和重組DNA技術(shù)以改善或改變在本發(fā)明的VLP之上或之中表達的蛋白的特征。多種類型的誘變可用于產(chǎn)生和/或分離編碼蛋白分子的變體核酸和/或進一步修飾/突變本發(fā)明VLP之中或之上的蛋白。其包括但不限于定位、隨機點誘變、同源重組(DNA改組)、使用含有尿嘧啶的模板的誘變、寡核苷酸導(dǎo)向的誘變、硫代磷酸酯修飾的DNA誘變、使用有間隔的雙鏈DNA的誘變等。其他合適的方法包括點錯配修復(fù)、使用修復(fù)缺陷型宿主株的誘變、限制-選擇和限制-純化、缺失誘變、通過全基因合成的誘變、雙鏈斷裂修復(fù)等。誘變例如涉及嵌合構(gòu)建體的誘變,亦包括在本發(fā)明中。在一個實施方案中,誘變可由天然存在的分子或經(jīng)改變或突變的天然存在的分子已知的信息例如序列、序列比較、物理性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等所指導(dǎo)。本發(fā)明進一步包括顯示實質(zhì)生物學(xué)活性例如當(dāng)表達于本發(fā)明的VLP之上或之中時,能夠引發(fā)有效的抗體應(yīng)答的蛋白變體。此類變體包括根據(jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則選定使其對活性幾乎無作用的缺失、插入、倒位、重復(fù)和取代??寺〉鞍椎姆椒ㄔ诒绢I(lǐng)域是已知的。舉例而言,編碼具體RSV蛋白的基因可通過 RT-PCR從來自經(jīng)RSV病毒感染的細胞提取的多聚腺苷酸化mRNA來分離。所得的產(chǎn)物基因可作為DNA插入克隆入載體。術(shù)語“載體”指通過其核酸可增殖和/或在生物、細胞或細胞組分之間轉(zhuǎn)移的物事。載體包括自主復(fù)制或可整合入宿主染色體的質(zhì)粒、病毒、細菌噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、人工染色體等。載體亦可為并不自主復(fù)制的裸RNA多核苷酸、 裸DNA多核苷酸、由在同一鏈中DNA和RNA兩者組成的多核苷酸、多賴氨酸綴合的DNA或 RNA、肽綴合的DNA或RNA、脂質(zhì)體綴合的DNA等。在許多但非所有的常見實施方案中,本發(fā)明的載體是質(zhì)粒或桿粒。因此,本發(fā)明包括編碼蛋白的核苷酸,包括嵌合分子,其克隆入可在細胞中表達誘導(dǎo)本發(fā)明VLP生成的表達載體?!氨磉_載體”是能夠促進表達以及摻入其中的核酸的復(fù)制載體如質(zhì)粒。通常,所述待表達的核酸“可操作地連接于”啟動子和/或增強子,并受該啟動子和/或增強子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)調(diào)控。在一個實施方案中,所述核苷酸編碼經(jīng)修飾或突變的RSV F 蛋白(如上所討論)。在另一個實施方案中,所述載體進一步包含編碼M和/或G RSV蛋白的核苷酸。在另一個實施方案中,所述載體進一步包含編碼M和/或N RSV蛋白的核苷酸。 在另一個實施方案中,所述載體進一步包含編碼M、G和/或N RSV蛋白的核苷酸。在另一個實施方案中,所述載體進一步包含編碼BRSV M蛋白和/或N RSV蛋白的核苷酸。在另一個實施方案中,所述載體進一步包含編碼BRSV M和/或G蛋白,或流感HA和/或NA蛋白的核苷酸。在另一個實施方案中,所述核苷酸編碼經(jīng)修飾的或突變的RSV F和/或RSV G 蛋白與流感HA和/或NA蛋白。在另一個實施方案中,所述表達載體是桿狀病毒。在本發(fā)明的一些實施方案中,蛋白可包含含有產(chǎn)生沉默取代、插入或缺失,但并不改變編碼蛋白的性質(zhì)或活性或該蛋白如何制備的突變??捎捎诙喾N原因產(chǎn)生核苷酸變體, 例如,為了對于特定宿主優(yōu)化密碼子表達(將人mRNA中的密碼子變?yōu)槔ハx細胞如Sf9細胞優(yōu)選的那些)。參見美國專利公開2005/0118191,就所有目的通過全文提述并入本文。此外,可對所述核苷酸進行測序以確??寺×苏_的編碼區(qū),且其不含有任何不希望的突變。該核苷酸可亞克隆入表達載體(例如桿狀病毒)以供在任何細胞中進行表達。 上述僅為如何可克隆RSV病毒蛋白的一個實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解其他方法是可獲得并為可能的。本發(fā)明還提供了包含編碼RSV結(jié)構(gòu)基因包括F、M、G、N、SH,或其一部分,和/或任何上述的嵌合分子的RSV核苷酸的構(gòu)建體和/或載體。所述載體可為,例如噬菌體、質(zhì)粒、 病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述包含RSV結(jié)構(gòu)基因,包括F、M、G、N、SH,或其一部分,和/或任何上述的嵌合分子的構(gòu)建體和/或載體,應(yīng)可操作地連接于適當(dāng)?shù)膯幼?,如AcMNPV多角體蛋白啟動子(或其他桿狀病毒)、噬菌體lambda PL啟動子,大腸桿菌laC、phoA和tac 啟動子,SV40早期和晚期啟動子,和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動子為非限定性實例。其他合適的啟動子根據(jù)宿主細胞和/或所需的表達速率對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。表達構(gòu)建體會進一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點,并在轉(zhuǎn)錄區(qū)中,含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。由構(gòu)建體表達的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選會在起始處含有翻譯起始密碼子而在待翻譯的多肽末端適當(dāng)位置含有終止密碼子。表達載體優(yōu)選會包含至少一個選擇性標(biāo)記。此類標(biāo)記包括二氫葉酸還原酶、G418 或新霉素抗性(對于真核細胞培養(yǎng));和四環(huán)素、卡那霉素或氨芐西林抗性基因(對于大腸桿菌和其他細菌的培養(yǎng))。優(yōu)選的載體包括病毒載體如桿狀病毒、痘病毒(例如牛痘病毒、 禽痘病毒、犬痘病毒、雞痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒等)、腺病毒(例如犬類腺病毒)、皰疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。其他可用于本發(fā)明的載體包括用于細菌的載體,其包括pQE70、pQE60 禾口 pQE-9,pBluescript 載體、Phagescript 載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、 PKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核載體包括 pFastBac lpffINEO, pSV2CAT、 pOG44、pXT 1和pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合適的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是容易想到的。在一個實施方案中,包含編碼RSV基因包括經(jīng)修改或突變的RSV F基因,以及M、G、N、SH的基因或其部分,和/或任何上述的嵌合分子的核苷酸的載體,是pFastBac。上述提及的重組構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化,并可表達RSV蛋白,包括經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種免疫原。在一個實施方案中,所述重組構(gòu)建體包含經(jīng)修飾或突變的RSV F、M、G、N、SH或其部分,和/或任何上述的分子進入真核細胞和/或原核細胞。因此,本發(fā)明提供了宿主細胞,其包含含有編碼RSV結(jié)構(gòu)基因包括經(jīng)修飾或突變的RSV F和至少一種免疫原例如但不限于RSVG、N或SH或其部分和/或任何上述的分子的核酸,并允許基因包括RSV F、G、N、M或SH或其部分和/或任何上述分子在宿主細胞中在允許VLP 形成的條件下表達的載體。真核宿主細胞包括酵母、昆蟲、禽類、植物、秀麗隱桿線蟲(C. elegans)(或線蟲) 和哺乳動物宿主細胞。昆蟲細胞的非限定性實例為草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf)細胞,例如Sf9、Sf21,粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞,例如High Five細胞,和果蠅屬(DrOSOphila)S2細胞。真菌(包括酵母)宿主細胞的實例為釀酒酵母(S. cerevisiae), 乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis) (K. Iactis),假絲酵母屬(Candida)菌種包括白色假絲酵母(C. albicans)和光滑假絲酵母(C. glabrata)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe (S. pombe))、巴斯德畢赤酵母 (Pichia pastoris)和解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)。哺乳動物細胞的實例為COS 細胞、幼倉鼠腎細胞、小鼠L細胞、LNCaP細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞,人胚腎(HEK)細胞和非洲綠猴細胞、CVl細胞、HeLa細胞、MDCK細胞、Vero和H印-2細胞。亦可使用非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母細胞或兩棲類來源的其他細胞。原核宿主細胞的實例包括細菌細胞例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)和分枝桿菌。載體,例如包含經(jīng)修飾的或突變的RSV F蛋白,和至少一種免疫原包括但不限于 RSV G、N或SH或其部分,和/或任何上述的嵌合分子的多核苷酸的載體,可依照本領(lǐng)域公知方法轉(zhuǎn)染入宿主細胞。舉例而言,將核酸導(dǎo)入真核細胞可通過磷酸鈣共沉淀、電穿孔、微注射、lipofection和采用多胺轉(zhuǎn)染劑的轉(zhuǎn)染。在一個實施方案中,上述載體是重組桿狀病毒。在另一個實施方案中,上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染入真核細胞。在一個優(yōu)選實施方案中,上述細胞是昆蟲細胞。在另一個實施方案中,上述昆蟲細胞是Sf9細胞。該發(fā)明還提供了增加VLP產(chǎn)生效率的構(gòu)建體和方法。舉例而言,將前導(dǎo)序列添加至RSV F、M、G、N、SH或其部分,和/或任何上述嵌合或異源分子,可改善蛋白在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的效率。舉例而言,可將異源信號序列融合于F、M、G、N、SH或其部分,和/或上述任何嵌合或異源分子。在一個實施方案中,所述信號序列可來源于昆蟲細胞的基因并融合于M、F、G、 N、SH或其部分和/或上述任何嵌合或異源分子。在另一個實施方案中,所述信號肽是殼多糖酶信號肽,其在桿狀病毒表達系統(tǒng)中有效運作。另一個增加VLP產(chǎn)生效率的方法是針對具體細胞類型密碼子優(yōu)化編碼RSV包括經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、M、G、N、SH或其部分和/或上述任何嵌合或異源分子的核苷酸。 對于密碼子優(yōu)化核酸以供在Sf9細胞中表達的實例,參見SEQ ID No :3、5、7、9、13、17、19和 25。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生VLP的方法,所述方法包括在允許VlP形成的條件下表達RSV 基因包括經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種其他蛋白包括但不限于RSV M、G、N、SH或其部分,和/或上述任何嵌合或異源分子。取決于選定的表達系統(tǒng)和宿主細胞,在重組蛋白表達和VLP形成的條件下通過培養(yǎng)由表達載體轉(zhuǎn)化的細胞來產(chǎn)生VLP。在一個實施方案中, 本發(fā)明包括產(chǎn)生VLP的方法,包括將編碼至少一種經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的載體轉(zhuǎn)染入合適的宿主細胞并在允許VLP形成的條件下表達經(jīng)修飾和突變的RSV F蛋白。在另一個實施方案中,真核細胞選自下組酵母、昆蟲、兩棲類、禽類或哺乳動物細胞。適當(dāng)生長條件的選擇在本領(lǐng)域的技術(shù)和本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。培養(yǎng)經(jīng)工程改造產(chǎn)生本發(fā)明VLP的細胞的方法包括但不限于分批、分批補料、連續(xù)和灌注細胞培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)意指細胞在細胞增殖并表達蛋白(例如重組蛋白)以供純化和分離的生物反應(yīng)器(發(fā)酵室)中的生長和增殖。通常而言,在滅菌、受控的溫度和大氣條件下在生物反應(yīng)器中進行細胞培養(yǎng)。生物反應(yīng)器是可監(jiān)視環(huán)境條件如溫度、大氣、 攪拌和/或PH的用于培養(yǎng)細胞的室。在一個實施方案中,所述生物反應(yīng)器是不銹鋼的室。 在另一個實施方案中,所述生物反應(yīng)器是預(yù)滅菌的塑料袋(例如Cellbag ,wave Biotech, Bridgewater, NJ)。在其他實施方案中,所述經(jīng)預(yù)滅菌的塑料袋為約50L至1000L的袋。然后使用保存VLP完整性的方法如梯度離心例如氯化銫、蔗糖和碘克沙醇,以及標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)包括例如離子交換和凝膠過濾層析來分離VLP。下述是如何制備、分離和純化的本發(fā)明的VLP的實例。通常而言VLP是從經(jīng)工程改造在細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)細胞時產(chǎn)生VLP的重組細胞系產(chǎn)生的(見上)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道有其他可用于制備和純化本發(fā)明VLP的方法,因此本發(fā)明并不限于所述方法。本發(fā)明VLP的產(chǎn)生可通過將Sf9細胞(非感染的)接種入搖瓶來起始,允許細胞隨著細胞生長和繁殖而擴展并規(guī)模放大(scale up)(例如從125ml燒瓶至50L Wave袋)。 將用于生長細胞的培養(yǎng)基對于適當(dāng)?shù)募毎颠M行配制(優(yōu)選無血清培養(yǎng)基,例如昆蟲培養(yǎng)基EXCell-420,JRH)。之后,以最有效的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection)用重組桿狀病毒感染細胞(例如每細胞約1至約3個空斑形成單位)。一旦發(fā)生感染,經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白,M、G、N、SH或其部分,和/或任何上述嵌合或異源分子從病毒基因組表達, 自主裝配入VLP,并在感染后大約M至72小時從細胞分泌。通常而言,當(dāng)細胞處于對數(shù)生長中期IO6個細胞/ml)并至少約90%存活時感染最為有效。本發(fā)明的VLP可在感染后大約48至96小時,當(dāng)細胞培養(yǎng)基中VLP的水平接近最大值,但在大量細胞裂解之前時進行收獲。收獲時點Sf9細胞密度和存活性可為約0.切IO6 個細胞/ml至約1. IO6個細胞/ml與至少20%存活性,如染色排阻測定顯示。之后,去除并澄清培養(yǎng)基。將NaCl添加至培養(yǎng)基至濃度為約0. 4至約1. 0M,優(yōu)選至約0. 5M,以避免 VLP聚集。從含有本發(fā)明VLP的細胞培養(yǎng)基去除細胞和細胞碎片可通過具有一次性使用的、 經(jīng)預(yù)滅菌的中空纖維0. 5或1. 00 μ m過濾筒的切向流過濾(TTF)或類似裝置來達成。之后,在澄清的培養(yǎng)基中的VLP可通過超濾使用一次性、經(jīng)預(yù)滅菌的500,000分子量截取值中空纖維筒來濃縮。濃縮的VLP可針對含有0. 5M NaCl的10體積的pH 7. 0至 8.0磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ透析過濾以去除殘余的培養(yǎng)基組分。濃縮的、透析過濾的VLP可進一步在20%至60% %不連續(xù)蔗糖梯度上在含0. 5M NaCl的pH 7. 2PBS緩沖液中通過以6500x g在約4°C至約10°C離心18小時來純化。通常而言,VLP會在約30%至約40%蔗糖之間或在界面(以20%和60%分步梯度)形成明顯可見的條帶,其可從該梯度收集并儲藏??上♂屧摦a(chǎn)物至包含200mM NaCl的制備物以供純化工藝的下一個步驟。該產(chǎn)物含有VLP并可含有完整的桿狀病毒顆粒。VLP的進一步純化可通過陰離子交換層析或44%等密度蔗糖墊(cushion)離心來達成。在陰離子交換層析中,將來自蔗糖梯度的樣品(見上)加載入含有具有陰離子(例如Matrix Fractogel EMD TMAE)的介質(zhì)的柱,并通過可將VLP從其他污染物(例如桿狀病毒和DNA/RNA)分離的鹽梯度(從約0.2M至約1.0M NaCl)來洗脫。在蔗糖墊方法中,將包含VLP的樣品添加至44%蔗糖墊,并以30000g離心約18小時。VLP在44%蔗糖頂部形成條帶,而桿狀病毒沉淀在底部,而其他的污染蛋白停留在頂部的0%蔗糖層。收集VLP峰或條帶。視需要,可將完整的桿狀病毒失活。失活可通過化學(xué)方法例如福爾馬林或β-丙內(nèi)酯(BPL)來達成。完整桿狀病毒的去除和/或失活亦大體上可通過使用上述例示的本領(lǐng)域已知的選擇性沉淀和層析方法來達成。失活方法包括將含有所述VLP的樣品在0. 2% BPL 中在約25°C至約27°C溫育3小時。桿狀病毒也可通過將含有所述VLP的樣品在0. 05% BPL 中在4°C溫育3日,然后在37°C溫育1小時來失活。在失活/去除步驟之后,可將包含VLP的產(chǎn)物經(jīng)過另一個透析過濾步驟運行以去除任何來自失活步驟的試劑和/或任何殘余的蔗糖,并將VLP置于所需的緩沖液(例如 PBS)中。包含VLP的溶液可通過本領(lǐng)域已知方法滅菌(例如無菌過濾)并儲藏于冷藏箱 (refrigerator)或冷凍箱(freezer)。上述技術(shù)可以多種規(guī)模進行實踐。舉例而言,T-燒瓶、搖瓶、旋轉(zhuǎn)瓶(spiner bottle),直至工業(yè)大小的生物反應(yīng)器。所述生物反應(yīng)器可包括不銹鋼罐或經(jīng)預(yù)滅菌的塑料袋(例如,由Wave Biotech, Bridgewater, NJ出售的系統(tǒng))。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道就其目的最需要的是什么。桿狀病毒表達載體的表達和產(chǎn)生和用重組桿狀病毒感染細胞以產(chǎn)生重組RSV VLP 如前所述可在昆蟲細胞例如Sf9昆蟲細胞中達成。在一個實施方案中,所述細胞為經(jīng)工程改造產(chǎn)生RSV VLP的重組桿狀病毒感染的SF9。藥物或疫苗配制物和給藥可用于本文的藥物組合物含有藥學(xué)上可接受的載體,包括任何合適的稀釋劑或賦形劑,其包括任何自身并不誘導(dǎo)有害于接受該組合物的脊椎動物的免疫應(yīng)答產(chǎn)生并可不帶來不必要的毒性地進行施用的醫(yī)藥試劑,以及本發(fā)明的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白,包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。如用于本文,術(shù)語“藥學(xué)上可接受”意指由聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)批準(zhǔn),或列于美國藥典、歐洲藥典或其他一般接受的藥典供用于哺乳動物特別是人。這些組合物可用作疫苗和/或抗原性組合物以供在哺乳動物中誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答。本發(fā)明涵蓋了包含VLP的藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,所述VLP包含至少一種經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白,以及至少一種其他蛋白,包括但不限于RSV M、G、N、SH或其部分, 和/或任何上述的嵌合或異源分子。在一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含至少一種經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種其他免疫原。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含至少一種經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種RSV M蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含至少一種經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種BRSV M蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含至少一種經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種流感Ml蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含至少一種經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種禽流感Ml蛋白。
在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP進一步包含RSV G蛋白,包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV G蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP進一步包含RSV N蛋白,包括但不限于HRSV、 BRSV或禽RSV N蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP進一步包含RSV SH蛋白,包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV SH蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含嵌合VLP的藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,如包含BRSV M和經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和/或來自RSV的G、H或SH蛋白和任選地來源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP,其中所述HA或NA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。本發(fā)明還涵蓋了如上所述包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白,包含經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP的藥學(xué)上可接受的疫苗組合物。在一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種其他蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP進一步包含RSV M蛋白,如BRSV M蛋白但不限于此。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP進一步包含RSV G蛋白,包括但不限于HRSV G蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP進一步包含RSV N蛋白,包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV N蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP進一步包含RSV SH蛋白,包括但不限于HRSV、BRSV或禽RSV SH蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含BRSV M蛋白和來自HRSV組A的F和/或G蛋白。在另一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含BRSV M蛋白和來自HRSV組B的F和/或G蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含嵌合VLP如包含來自BRSV的嵌合M蛋白和任選地來源于流感病毒的HA蛋白的VLP的藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,其中所述M蛋白融合于所述流感HA蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含嵌合VLP如包含BRSV M和來自RSV的嵌合F和/或G蛋白和任選地來源于流感病毒的HA蛋白的VLP的藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,其中所述嵌合流感HA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含嵌合VLP 如包含BRSV M和來自RSV的嵌合F和/或G蛋白和任選地來源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP的藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,其中所述HA或NA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。本發(fā)明還涵蓋了包含嵌合VLP的藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,所述VLP包含至少一種RSV蛋白。在一個實施方案中,所述藥學(xué)上可接受的疫苗組合物包含VLP,所述VLP包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白或至少一種來自異源傳染原或患病細胞的免疫原。在另一個實施方案中,所述來自異源傳染原的免疫原是病毒蛋白。在另一個實施方案中,所述來自異源傳染原的病毒蛋白是包膜相關(guān)蛋白。在另一個實施方案中,所述來自異源傳染原的病毒蛋白表達于VLP表面。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白包含在脊椎動物中產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的表位。本發(fā)明還涵蓋了用于免疫接種脊椎動物如人受試者的包含VLP的試劑盒,所述VLP包含至少一種RSV蛋白。在一個實施方案中,所述試劑盒包含的VLP包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。在一個實施方案中,所述試劑盒進一步包含RSV M蛋白如BRSV M蛋白。在另一個實施方案中,所述試劑盒進一步包含RSV G蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含VLP的試劑盒,其包含來自BRSV的嵌合M蛋白和任選地來源于流感病毒的HA蛋白, 其中所述M蛋白融合于BRSV M0在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含VLP的試劑盒,其包含來自BRSV的嵌合M蛋白、RSV F和/或G蛋白和來自異源傳染原的免疫原。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含VLP的試劑盒,其包含來自BRSV的M蛋白、嵌合RSV F和/ 或G蛋白和任選地來源于流感病毒的HA蛋白,其中所述HA蛋白融合于RSV F或G蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。在另一個實施方案中,本發(fā)明涵蓋了包含VLP的試劑盒,其包含來自 BRSV的M蛋白,嵌合RSV F和/或G蛋白和任選地來源于流感病毒的HA或NA蛋白,其中所述HA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。在一個實施方案中,本發(fā)明包含免疫原性配制物,其包含至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明包含免疫原性配制物,其包含至少一個有效劑量的包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團。還在另一個實施方案中, 本發(fā)明包含免疫原性配制物,其包含至少一個有效劑量的如上所述的包含經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白的VLP。本發(fā)明的免疫原性配制物包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的 RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP,和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、無菌等張水性緩沖液及其組合。對藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和其他賦形劑的詳盡討論呈現(xiàn)于 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N. J.目前版本)。配制物應(yīng)適合給藥模式。在一個優(yōu)選實施方案中,所述配制物適于對人給藥,優(yōu)選是無菌的,非顆粒的和 /或非致熱原性的。所述組合物,視需要,還可含有少量的潤濕劑或乳化劑,或pH緩沖劑。所述組合物可為固體形式,如適于重構(gòu)的凍干粉、液體溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、持續(xù)釋放配制物或散劑。經(jīng)口配制物可包括標(biāo)準(zhǔn)載體如醫(yī)藥級別甘露醇、乳糖、淀粉、硫酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。本發(fā)明還提供了包含一種或多種充以本發(fā)明疫苗組合物的一種或多種成分的容器的醫(yī)藥包或試劑盒。在一個優(yōu)選實施方案中,所述試劑盒包含兩個容器,一個含有經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP,而另一個含有佐劑。與此種(類)容器相配套的可為管理藥物或生物產(chǎn)品的制造、使用和銷售的政府機構(gòu)規(guī)定的通告,該通告反映了該機構(gòu)批準(zhǔn)用于人給藥的制造、使用和銷售。本發(fā)明還提供了將該配制物包裝于指示組合物量的密封的容器如安瓿瓶或小袋 (sachette)。在一個實施方案中,將組合物作為液體提供,在另一個實施方案中,作為置于密封容器中的干燥的經(jīng)滅菌的凍干粉或無水濃縮物提供,并可用例如水或鹽水重構(gòu)至適當(dāng)濃度以供施于受試者。在另一個實施方案中,將組合物以液體形式置于指示組合物量和濃度的密封容器中提供。優(yōu)選地,組合物的液體形式是在密封容器中以至少約50μ g/ml,更優(yōu)選至少約100 μ g/ml,至少約 200 μ g/ml,至少 500 μ g/ml,或至少 lmg/ml 提供的。作為一個實例,包含本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的嵌合RSV VLP以足以刺激免疫應(yīng)答的有效量或數(shù)量(如上所定義)施用,每個均為針對一個或多個RSV株的應(yīng)答。 本發(fā)明經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或VLP 的施用引發(fā)針對RSV的免疫。通常而言,可在該范圍之內(nèi)基于例如年齡、生理狀況、體重、性別、食譜、給藥時間和其他臨床因素來調(diào)整劑量。預(yù)防性疫苗配制物是通過例如皮下或肌肉內(nèi)注射使用針頭和注射器,或無針頭的注射裝置進行系統(tǒng)性施用?;蛘?,將所述疫苗配制物通過滴劑、大顆粒氣霧劑(大于約10微米)或噴霧而鼻內(nèi)施用進入上呼吸道。盡管所有上述遞送途徑導(dǎo)致免疫應(yīng)答,鼻內(nèi)給藥賦予了在許多病毒包括RSV和流感病毒進入位點引發(fā)粘膜免疫的附加益處。因此,本發(fā)明還包括配制對哺乳動物誘導(dǎo)針對感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的疫苗或抗原性組合物的方法,包括將有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP添加至所述配制物。在一個實施方案中,所述感染是RSV感染。盡管用單一劑量刺激免疫是可能的,可通過相同或不同的途徑施用額外的劑量以取得所需的效果。在新生兒和嬰兒中,例如,可能需要多次施用以引發(fā)充足水平的免疫。可在整個兒童期(childhood)視需要按間隔施用,以維持充足水平的針對感染例如RSV感染的保護。類似地,特別易感于重復(fù)或嚴(yán)重感染的成人,如例如健康護理工作者、日托工作者、 幼兒的家庭成員、老年人和具有缺損心肺功能的個體,可能需要多次免疫接種以確立和/ 或維持保護性免疫應(yīng)答。可監(jiān)視所誘導(dǎo)的免疫的水平,例如通過測量中和性分泌和血清抗體的量,并視需要調(diào)整劑量或重復(fù)接種以引發(fā)并維持所需水平的保護。施用包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F 微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP的組合物(例如疫苗和/或抗原性配制物) 的方法包括但不限于腸胃外給藥(例如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻內(nèi)和經(jīng)口或肺部途徑或通過栓劑)。在一個具體實施方案中,本發(fā)明的組合物是肌肉內(nèi)、 靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或皮內(nèi)施用的。所述組合物可通過任何方便的途徑施用,例如通過灌注或推注注射,通過經(jīng)由上皮或粘膜皮膚膜的吸收(例如,口粘膜、結(jié)腸、結(jié)膜、鼻咽、口咽、陰道、尿道、膀胱、和腸粘膜等),并可與其他生物活性劑一同施用。在一些實施方案中,本發(fā)明組合物的鼻內(nèi)或其他粘膜施用途徑可誘導(dǎo)實質(zhì)上高于其他給藥途徑的抗體或其他免疫應(yīng)答。在另一個實施方案中,本發(fā)明的鼻內(nèi)或其他粘膜給藥途徑可誘導(dǎo)會誘導(dǎo)針對其他RSV 株交叉保護的抗體或其他免疫應(yīng)答。給藥可為系統(tǒng)性的或局部的。還在另一個實施方案中,所述疫苗和/或免疫原性配制物以為了在免疫接種位點引發(fā)免疫應(yīng)答而靶向粘膜組織的方式施用。舉例而言,可靶向粘膜組織如腸相關(guān)淋巴組織 (GALT)以通過使用經(jīng)口施用含有具有特定粘膜靶向性質(zhì)的佐劑的組合物進行免疫接種。亦可靶向其他粘膜組織,如鼻咽淋巴組織(NALT)和支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)。本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性配制物亦可以劑量日程施用,例如,起始的疫苗組合物給藥與后續(xù)的增強給藥。在具體實施方案中,第二劑的組合物是在起始給藥之后從兩周至一年,優(yōu)選從約1、約2、約3、約4、約5至約6個月的任何時點施用的。此外,第三劑可在第二劑之后和起始給藥之后從約三個月至約兩年,或甚至更長,優(yōu)選約4、約5,或約6個月,或約7個月至約一年時施用。當(dāng)在第二劑之后在受試者的血清和/或尿或粘膜分泌物中檢測不出具體免疫球蛋白或檢測出低水平的具體免疫球蛋白時,可任選地施用第三劑。在一個優(yōu)選實施方案中,第二劑是在第一次給藥之后約一個月施用的,而第三劑是在第一次給藥之后約六個月施用的。在另一個實施方案中,第二劑是在第一次給藥之后約六個月施用的。在另一個實施方案中,本發(fā)明的組合物可作為聯(lián)合療法的一部分施用。舉例而言,本發(fā)明的組合物可與其他免疫原性組合物;抗病毒劑和/或抗生素一同配制。藥物組合物的劑量可方便地由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定,例如通過首先鑒定有效引發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的劑量,例如通過測量病毒特異性免疫球蛋白的血清效價或通過測量血清樣品或尿樣或粘膜分泌物中抗體的抑制比。所述劑量可從動物研究確定。用于研究疫苗效力的動物的非限定性列表包括豚鼠、倉鼠、雪貂、南美栗鼠、小鼠和棉鼠。大多數(shù)動物并非傳染原的天然宿主,但仍可用于疾病多種方面的研究。舉例而言,任何上述動物可按劑量給藥疫苗候選例如經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的 RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP,以部分表征誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答,和/或確定是否產(chǎn)生了任何中和抗體。舉例而言,許多研究是在小鼠模型中進行的,因為小鼠具有較小的大小,且其較低的成本允許研究者以較大規(guī)模進行研究。此外,本領(lǐng)域技術(shù)人員可進行人的臨床研究以確定對于人的優(yōu)選有效劑量。此類臨床研究在本領(lǐng)域是常規(guī)的和公知的。待采用的準(zhǔn)確劑量亦取決于給藥途徑。有效劑量可從來源于體外或動物測試系統(tǒng)的劑量-應(yīng)答外推。如本領(lǐng)域中亦公知的,具體組合物的免疫原性可通過使用稱作佐劑的免疫應(yīng)答的非特異性刺激劑來增強。佐劑實驗性用于促進針對未知抗原的免疫的一般性增長(例如,美國專利4,877,611號)。免疫接種實驗方案已使用佐劑刺激應(yīng)答多年,故此,佐劑對于本領(lǐng)域一般技術(shù)人員是公知的。一些佐劑影響抗原呈遞的方式。舉例而言,當(dāng)用明礬沉淀蛋白抗原時,免疫應(yīng)答增加??乖娜榛嘌娱L了抗原呈遞的持續(xù)時間。本發(fā)明的范圍涵蓋了包含任何描述于 Vogel 等,“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2ndEditi0n)”(就所有目的通過全文提述并入本文)中的佐劑。示例性的佐劑包括完全弗氏佐劑(含有被殺滅的結(jié)核分枝桿菌的非特異性免疫應(yīng)答刺激劑)、不完全弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。其他佐劑包括GMCSP、BCG、氫氧化鋁、MDP 化合物如thur-MDP或nor-MDP、CGP (MTP-PE)、脂質(zhì)A和單磷?;|(zhì)A (MPL)。涵蓋了 RIBI, 其含有三個提取自細菌的組分,即MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)在 2%鯊烯/Tween 80中的乳劑。亦可使用MF_59、Novasomes 、MHC抗原。在本發(fā)明的一個實施方案中,佐劑是具有約二至十個雙層以由水層分隔的實質(zhì)上為球形殼的形式排列,圍繞不含脂雙層的較大無定形中央空腔的少片層(paucilamellar) 脂質(zhì)小囊。少片層脂質(zhì)小囊可以以幾種方式起作用刺激免疫應(yīng)答,作為非特異性刺激劑,作為抗原載體,作為其他佐劑的載體及其組合。當(dāng)例如通過將抗原與完成的(performed)小囊相互混合從而使得抗原相對小囊保持在胞外時,少片層脂質(zhì)小囊作為非特異性免疫刺激劑起作用。通過將抗原包埋于小囊的中央空腔內(nèi),所述小囊作為免疫刺激劑和抗原載體起作用。在另一個實施方案中,所述小囊主要由非磷脂小囊構(gòu)成。在其他實施方案中,所述小囊為Novasomes 。Novasomes 為范圍為約IOOnm至約500nm的少片層非磷脂小囊。其包括Brij 72、膽固醇、油酸和鯊烯。已顯示Novasomes為對于流感抗原的有效佐劑(參見美國專利5,629,021,6, 387,373和4,911,928,就所有目的通過全文提述并入本文)。本發(fā)明的組合物亦可用“免疫刺激劑”配制。其為機體用于增加免疫系統(tǒng)應(yīng)答的自身化學(xué)信使(細胞因子)。免疫刺激劑包括但不限于多種具有免疫刺激、免疫增強和促炎活性的細胞因子、淋巴因子和趨化因子,如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、 IL-13);生長因子(例如粒細胞-巨噬細胞(GM)集落刺激因子(CSF));和其他免疫刺激分子,如巨噬細胞炎癥因子,F(xiàn)lt3配體,B7. 1 ;B7.2等。所述免疫刺激分子可在與本發(fā)明的組合物相同的配制物中施用,或可單獨施用??墒┯玫鞍谆蚓幋a蛋白的表達載體以產(chǎn)生免疫刺激作用。因此在一個實施方案中,本發(fā)明包括抗原性和疫苗配制物,所述配制物包含佐劑和/或免疫刺激劑。刺激免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或VLP可用于制備刺激免疫應(yīng)答的組合物,所述免疫應(yīng)答賦予針對傳染原的免疫或?qū)嵸|(zhì)免疫。粘膜和細胞免疫可促進對傳染原和疾病的免疫。在上呼吸道局部分泌的抗體為對天然感染抗性的主要因素。分泌型免疫球蛋白A(sIGA)涉及上呼吸道的保護,而血清IgG涉及下呼吸道的保護。由感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答保護免受相同病毒或抗原性類似的病毒株的再次感染。舉例而言,RSV發(fā)生頻繁和不可預(yù)測的變化;因此,在自然感染之后,由宿主的免疫提供的保護有效期針對在社區(qū)中傳播的新病毒株可能僅有效幾年。因此,本發(fā)明涵蓋了誘導(dǎo)受試者中對感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法, 包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。在一個實施方案中,所述方法包括施用包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種其他蛋白的VLP。在另一個實施方案中, 所述方法包括施用進一步包含RSV M蛋白例如BRSV M蛋白的VLP。在另一個實施方案中, 所述方法包括施用進一步包含RSV N蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法包括施用進一步包含RSV G蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法包括施用進一步包含RSV SH蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法包括施用進一步包含來自HRSV組A和/或組B的F和/或G蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法包括施用包含來自BRSV的 M蛋白和嵌合RSV F和/或G蛋白或MMTV包膜蛋白,例如來源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP,其中所述HA和/或NA蛋白融合于RSV F和/或RSV G蛋白或MMTV包膜蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。在另一個實施方案中,所述方法包括施用包含來自BRSV的M蛋白和嵌合RSV F和/或G蛋白和任選地包含來源于流感病毒的HA或NA蛋白的VLP,其中所述HA 或NA蛋白融合于RSVF和/或RSV G蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。在另一個實施方案中, 所述受試者是哺乳動物。在另一個實施方案中,所述哺乳動物是人。在另一個實施方案中, RSV VLP與佐劑或免疫刺激劑一同配制。在一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)針對受試者中RSV感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)針對受試者中RSV感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法, 包括施用至少一個有效劑量的包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團。還在另一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)針對受試者中RSV感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的RSV VLP,其中所述VLP包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白,M、G、SH和/或N蛋白。在另一個實施方案中,誘導(dǎo)針對受試者中RSV感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的RSV VLP,其中所述VLP基本上由 BRSV M(包括嵌合M)和RSV F、G和/或N蛋白組成。所述VLP可以以可忽略的濃度包含其他RSV蛋白和/或蛋白污染物。在另一個實施方案中,誘導(dǎo)針對受試者中RSV感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的RSV VLP,其中所述VLP由 BRSV M (包括嵌合M)、RSV G和/或F組成。在另一個實施方案中,誘導(dǎo)針對受試者中RSV 感染或其至少一種疾病癥狀的免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的包含RSV蛋白的 RSV VLP,其中所述RSV蛋白由BRSVM(包括嵌合M)、F、G和/或N蛋白組成,包括嵌合F、G 和/或N蛋白。這些VLP含有BRSV M(包括嵌合M)、RSV F、G和/或N蛋白,并可含有其他細胞成分如細胞蛋白、桿狀病毒蛋白、脂質(zhì)、糖類等,但并不含有其他RSV蛋白(除了 BRSV M 的片段(包括嵌合M),BRSV/RSV F、G和/或N蛋白之外)。在另一個實施方案中,所述受試者是脊椎動物。在一個實施方案中,所述脊椎動物是哺乳動物。在另一個實施方案中,所述哺乳動物是人。在另一個實施方案中,所述方法包括通過將所述配制物以一劑施用來誘導(dǎo)針對RSV感染或至少一種疾病癥狀的免疫。在另一個實施方案中,所述方法包括通過將所述配制物以多劑施用來誘導(dǎo)針對RSV感染或至少一種疾病癥狀的免疫。本發(fā)明亦涵蓋誘導(dǎo)針對受試者中由傳染原造成的感染或其至少一種癥狀的免疫, 包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。在一個實施方案中,所述方法包括施用包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種來自異源傳染原的VLP。在一個實施方案中,所述方法包括施用包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白和至少一種來自相同或異源傳染原的蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述來自異源傳染原的蛋白是病毒蛋白。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白是包膜相關(guān)蛋白。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白可為在VLP表面上表達的傳染原。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白包含在脊椎動物中產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白可與RSV M蛋白如BRSV M蛋白、RSV F、G和/或N蛋白相結(jié)合。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白融合于RSV蛋白如BRSV M蛋白、RSVF、G和/或N蛋白。在另一個實施方案中,僅僅來自所述傳染原的一部分融合于RSV蛋白如BRSV M蛋白、RSV F、G和/ 或N蛋白。在另一個實施方案中,僅僅來自所述傳染原的蛋白的一部分融合于RSV蛋白的一部分如BRSV M蛋白、RSV F、G和/或N蛋白。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白融合于所述RSV蛋白的部分表達于VLP的表面。在其他實施方案中,所述融合于來自傳染原的蛋白的RSV蛋白或其部分與RSV M蛋白結(jié)合。在其他實施方案中,所述RSV蛋白或其部分來源于RSV F、G、N和/或P。在另一個實施方案中,所述嵌合VLP進一步包含來自RSV的N和/或P蛋白。在另一個實施方案中,所述嵌合VLP包含多于一個來自相同和 /或異源傳染原的蛋白。在另一個實施方案中,所述嵌合VLP包含多于一個傳染原蛋白,從而構(gòu)建多價VLP。本發(fā)明的組合物當(dāng)施于脊椎動物(例如人)時,可在脊椎動物中誘導(dǎo)實質(zhì)免疫。該實質(zhì)免疫產(chǎn)生自針對本發(fā)明組合物的,在脊椎動物中保護或減輕感染或至少減輕感染的癥狀的免疫應(yīng)答。在一些實例中,如果所述脊椎動物受感染,該感染會是無癥狀的。該應(yīng)答可能不是完全保護性的應(yīng)答。在此情況下,如果所述脊椎動物受傳染原感染,所述脊椎動物與未經(jīng)免疫接種的脊椎動物相比會經(jīng)受減少的癥狀或較短期間的癥狀。在一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)受試者中針對RSV病毒感染或至少一種疾病癥狀的實質(zhì)免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括接種哺乳動物針對RSV的方法,包括將誘導(dǎo)保護量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP施于所述哺乳動物。在一個實施方案中,所述方法包括施用進一步包含RSV M蛋白如BRSV M蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法進一步包括施用包含 RSV G蛋白例如HRSV G蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法進一步包括施用包含來自HRSV組A的N蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法進一步包括施用包含來自 HRSV組B的N蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述方法包括施用包含來自BRSV的嵌合 M蛋白和來源于RSV的F和/或G蛋白的VLP,其中所述F和/或G蛋白融合于M蛋白的跨膜和細胞質(zhì)尾部。在另一個實施方案中,所述方法包括施用包含來自BRSV的M蛋白和嵌合 RSV F和/或G蛋白的VLP,其中所述F和/或G蛋白融合于流感HA和/或NA蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。在另一個實施方案中,所述方法包括施用包含來自BRSV的M蛋白和嵌合 RSV F和/或G蛋白和任選地包含流感HA和/或NA蛋白的VLP,其中所述F和/或G蛋白融合于HA蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。在另一個實施方案中,所述方法包括施用包含來自 BRSV的M蛋白和嵌合RSV F和/或G蛋白和任選地包含流感HA和/或NA蛋白的VLP,其中所述HA和/或NA蛋白融合于RSV F和/或G蛋白的跨膜域和細胞質(zhì)尾部。本發(fā)明還涵蓋了誘導(dǎo)受試者中針對由傳染原造成的感染或至少一種疾病癥狀的實質(zhì)免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSVF蛋白、包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。在一個實施方案中,所述方法包括施用進一步包含RSV M蛋白如BRSV M蛋白和至少一種來自另一種傳染原的蛋白的VLP。在一個實施方案中,所述方法包括施用進一步包含BRSV M蛋白和至少一種來自相同或異源傳染原的蛋白的VLP。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白是病毒蛋白。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白是包膜相關(guān)蛋白。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白表達于VLP表面。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白包含在脊椎動物中會產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的表位。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白可與RSV M蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白可與BRSV M 蛋白結(jié)合。在另一個實施方案中,所述來自傳染原的蛋白融合于RSV蛋白。在另一個實施方案中,僅來自所述傳染原的蛋白的一部分融合于RSV蛋白。在另一個實施方案中,僅來自所述傳染原的蛋白的一部分融合于RSV蛋白的一部分。在另一個實施方案中,融合于所述RSV 蛋白的來自所述傳染原的蛋白的部分表達于VLP表面。在其他實施方案中,所述融合于來自傳染原的蛋白的RSV蛋白或其部分與RSV M蛋白結(jié)合。在其他實施方案中,所述融合于來自傳染原的蛋白的RSV蛋白或其部分與BRSV M蛋白結(jié)合。在其他實施方案中,所述RSV 蛋白或其部分來源于RSV F、G、N和/或P蛋白。在另一個實施方案中,所述VLP進一步包含來自RSV的N和/或P蛋白。在另一個實施方案中,所述VLP包含來自傳染原的多于一種蛋白。在另一個實施方案中,所述VLP包含多于一種傳染原蛋白,從而構(gòu)建多價VLP。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)受試者中針對感染或其至少一種癥狀的保護性抗體免疫的方法,包括施用至少一個有效劑量的如上所述的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白,包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團或包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。如用于本文,“抗體”是包含由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段實質(zhì)或部分編碼的一種或多種多肽的蛋白。識別的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda, alpha、 gamma、delta、印silon和mu恒定區(qū)基因,以及繁多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈歸類為 kappa或lambda。重鏈歸類為gamma、mu、alpha、delta或印silon,其隨之分另lj限定免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。 每個四聚體由兩個相同對的多肽鏈組成,每對具有一個“輕”(約25kD)和一個“重”鏈(約 50-70kD)。每個鏈的N端限定約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū),其主要負(fù)責(zé)抗原識別。抗體作為完整的免疫球蛋白或通過用多種肽酶消化產(chǎn)生的多種充分表征的片段存在。在一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)受試者中針對RSV感染或至少一種疾病癥狀的保護性細胞應(yīng)答的方法,包括施用至少一個有效劑量的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)受試者中針對RSV感染或至少一種疾病癥狀的保護性細胞應(yīng)答的方法,包括施用至少一個有效劑量的包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的RSV F微團。在另一個實施方案中,本發(fā)明包括誘導(dǎo)受試者中針對RSV感染或至少一種疾病癥狀的保護性細胞應(yīng)答的方法,包括施用至少一個有效劑量的VLP,其中所述VLP包含如上所述的經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白。細胞介導(dǎo)的免疫還在從RSV感染恢復(fù)中起作用,并可預(yù)防RSV 相關(guān)的并發(fā)癥。RSV特異性細胞性淋巴細胞在受感染的受試者的血中和下呼吸道分泌物中檢測出。RSV感染細胞的細胞溶解是通過CTL與RSV特異性抗體和補體協(xié)同介導(dǎo)的。在受感染或經(jīng)接種的個體中主要的細胞毒性應(yīng)答在血中在6-14日之后可檢測出,并在第21日消失(Ermis等,1981)。細胞介導(dǎo)的免疫亦可在從RSV感染恢復(fù)中起作用,并可預(yù)防RSV相關(guān)的并發(fā)癥。RSV特異性細胞性淋巴細胞在受感染的受試者的血中和下呼吸道分泌物中檢測出。如上所提及,本發(fā)明免疫原性組合物預(yù)防或減少受試者中RSV感染的至少一種癥狀。RSV的癥狀在本領(lǐng)域是公知的。其包括鼻漏、咽喉痛、頭疼、聲嘶、咳嗽、痰、發(fā)熱、噦音、 喘鳴和呼吸困難。因此本發(fā)明的方法包括預(yù)防或減少至少一種與RSV感染相關(guān)的癥狀。癥狀的減少可主觀或客觀地確定,例如由受試者自我評價,通過醫(yī)師的評價或通過進行適當(dāng)?shù)臏y定法或測量(例如體溫),包括例如生活品質(zhì)評價,RSV感染或其他癥狀的進行減慢, RSV癥狀的嚴(yán)重程度減少,或合適的測定法(例如抗體效價和/或T細胞激活測定法)??陀^評價包括動物和人評價。本發(fā)明進一步通過下述實施例加以說明,其不應(yīng)認(rèn)為是限制性的。所有本申請中引用的參考文獻、專利和公開的專利申請的內(nèi)容以及附圖和序列表,就所有目的通過全文提述并入本文。實施例實施例1生成重組桿粒,轉(zhuǎn)染昆蟲細胞以制備重組病毒原種,空斑純化,和用初級病毒原種感染昆蟲細胞為了構(gòu)建重組病毒,將目標(biāo)病毒基因密碼子優(yōu)化以供Sf9昆蟲細胞表達,并克隆入 pFastBac 載體。
一旦確證并純化了所需的構(gòu)建體,對于每個構(gòu)建體,將一個小瓶的 MAX Efficiency DHlOBac 感受態(tài)細胞在冰上融化。將大約Ing (5 μ 1)所需的pFastBac 構(gòu)建體質(zhì)粒DNA添加至細胞并輕柔混合。將細胞在冰上溫育30分鐘。接著,將細胞在42°C不振蕩熱激45秒。之后,將試管轉(zhuǎn)移至冰上,并冰凍2分鐘。隨后將900 μ 1室溫S. 0. C.培養(yǎng)基添加至每個試管。將試管置于振蕩器上在37°C以225rpm振蕩4小時。對于每個pFastBac 轉(zhuǎn)化,使用S. 0. C.培養(yǎng)基制備10倍系列稀釋的細胞(lO—SlO—2和10_3)。之后,將ΙΟΟμΙ 的每個稀釋鋪板于含有50 μ g/ml卡那霉素、7 μ g/ml慶大霉素、10 μ g/ml四環(huán)素、100 μ g/ ml Bluo-gal和40 μ g/ml IPTG的LB瓊脂板上。將該板在37°C溫育48小時。挑取白色集落以供分析。對于每個構(gòu)建體制備來自上述的不同桿粒DNA,并將其分離。將這些DNA沉淀并添加至Sf9細胞5小時。之后,將30ml的Sf9昆蟲細胞Qx IO6個細胞/ml)用0. 3ml的空斑洗脫物用表達目標(biāo)病毒蛋白的桿粒感染,并溫育48-72小時。保存大約Iml的粗培養(yǎng)物(細胞+培養(yǎng)基)和澄清的培養(yǎng)收獲物以供表達分析,并將剩余物保存以供純化目的。實施例2經(jīng)修飾的HRSV F蛋白的表汰、純化和分析將編碼經(jīng)修飾的目標(biāo)HRSV F蛋白的基因作為重疊的寡核苷酸在體外合成,并在宿主細胞中克隆和表達。經(jīng)修飾的RSV F基因的克隆和表達是依照本領(lǐng)域已知方法達成的。挑取并確證含有目標(biāo)病毒蛋白的重組空斑。然后將重組病毒通過Sf9昆蟲細胞的感染進行擴增。在一些情況下,將Sf9昆蟲細胞由表達經(jīng)修飾的F蛋白的重組病毒和另一個表達其他病毒蛋白(例如BRSV M蛋白和/或HRSVN蛋白)的重組病毒共同感染。將昆蟲細胞的培養(yǎng)物用攜帶多種構(gòu)建體的桿狀病毒以 3M0I (感染復(fù)數(shù)=病毒ffu或pfu/細胞)感染。在感染后48-72小時收獲培養(yǎng)物和上清。將粗收獲物,大約30mL,通過以大約 800x g離心15分鐘來澄清。將所得的含有經(jīng)修飾的HRSV F蛋白的粗細胞收獲物如下所述進行純化。將經(jīng)修飾的目標(biāo)HRSV F蛋白從感染的Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)收獲物純化。將非離子型表面活性劑Tergitol NP_9(壬基苯酚乙氧化物,Nonylphenol Ethoxylate)用于膜蛋白提取實驗方案。將粗提取物通過經(jīng)由陰離子交換層析、小扁豆凝集素親和/HIC和陽離子交換層析來進一步純化。蛋白表達通過SDS-PAGE并用考馬斯染色對總蛋白進行染色來進行分析。以大約 15至20 μ 1 (約7. 5 μ 1至10 μ 1培養(yǎng)物)/泳道將等體積的來自粗收獲物的細胞樣品和含有β ME ( β -巰基乙醇)2χ樣品緩沖液加載至SDS Laemmli凝膠。在一些情況下,替代層析法,將粗細胞收獲物中的經(jīng)修飾的HRSV F蛋白通過30% 蔗糖梯度分離方法濃縮,然后通過用考馬斯染色的SDS-PAGE,或使用抗RSV F單克隆抗體的Western印跡進行分析。含有經(jīng)修飾的重組F蛋白的粗細胞收獲物,純化的重組F蛋白或通過蔗糖梯度濃縮的重組F蛋白可進一步通過使用抗RSV F單克隆抗體和/或抗RSVF多克隆抗體的 Western印跡進行分析。實施例3
編碼F蛋白BV#541的經(jīng)修飾的HRSV F基因表達全長HRSV F蛋白的最初嘗試證明無法成功地獲得高表達水平。用于該表達中的F基因序列為SEQ ID NO :1(野生型HRSV F基因,GenBank登錄號Ml 1486)。其編碼 574aa的無活性前體(Ftl)15該前體在成熟過程中由弗林蛋白酶樣蛋白酶剪切兩次以得到兩個二硫鍵連接的多肽,來自N端的亞基F2和來自C端的F1 (圖1)。該兩個剪切位點在殘基109和136,在其之前是由弗林蛋白酶識別基序(RARR,aa 106-109 (SEQ ID NO 23)和 KKRKRR,aal31-136(SEQ ID NO :24))。SEQ ID NO :1 的F基因序列對于在 Sf9 昆蟲細胞中表達含有欠佳的密碼子使用,并攜帶3個錯誤,產(chǎn)生展示非最優(yōu)的折疊(SEQID NO 2, GenBank 登錄號AAB59858)的蛋白。此外,在編碼F2亞基的區(qū)鑒定了可能的多聚(A)腺苷酸化位點 (ATAAAA)。而且,野生型F基因序列富含大約65%的AT,而Sf9昆蟲細胞表達系統(tǒng)中基因序列理想的GC-AT比為大約1 1。為了嘗試克服HRSV F蛋白的不良表達水平,設(shè)計了新的F基因序列,從而使得(a)修正了所述三個GenBank測序的錯誤;(b)修飾了編碼F2亞基的區(qū)的隱含多聚㈧位點;(c)優(yōu)化了 F基因密碼子;和(d)該F基因編碼具有失活的主要剪切位點的修飾的F蛋白。所述三個經(jīng)修正的氨基酸錯誤為P102A、I379V和M447V。修正了 HRSVF基因中的隱含多聚(A)位點而未改變其氨基酸序列。密碼子優(yōu)化方案是基于下述標(biāo)準(zhǔn)的(1)在鱗翅類物種的昆蟲細胞中對于如 Levin, D. B.等(Journal of General Virology, 2000, vol.81, pp. 2313-2325)所述的給定氨基酸,其特定密碼子的氨酰tRNA的豐度,⑵維持基因序列中的GC-AT比為大約 1 1,(3)最低限的回文或莖環(huán)DNA結(jié)構(gòu)的導(dǎo)入,和(4)最低限的轉(zhuǎn)錄和后轉(zhuǎn)錄阻遏子 (repressor)元件序列的導(dǎo)入。經(jīng)優(yōu)化的F基因的序列的實例示為SEQ ID NO :19(RSV-F BV#368)。為了失活HRSV F蛋白的主要剪切位點(1° CS,KKRKRR,aa 131-136),將弗林蛋白酶識別位點突變?yōu)镵KQKQQ(SEQ ID NO 28)或GRRQQR(SEQ IDNO : )。衡量了幾種具有此類剪切位點突變的修飾的F蛋白以確定防止剪切的效率。圖2顯示了經(jīng)衡量的幾種經(jīng)修飾的 F蛋白。結(jié)果表明HRSV F蛋白的主要剪切位點可由三個保守氨基酸變化R133Q、R135Q和 R136Q失活。這些從極性帶電荷分子的精氨酸(R)至極性中性分子的谷氨酰胺(Q)的保守氨基酸變化,改變了這些位點的電荷狀態(tài),并防止弗林蛋白酶樣蛋白酶的剪切(參見圖3), 而仍然保留F蛋白的3D結(jié)構(gòu)。防止1° CS處的剪切導(dǎo)致F蛋白的膜融合活性減少。非限定的示例性經(jīng)修飾以具有所有上述提及的修飾的HRSV F基因序列示于圖4。 該經(jīng)修飾的F基因(SEQ ID NO 5, RSV-F BV恥41)編碼SEQ IDNO :6的經(jīng)修飾的F蛋白。該基因序列在體外作為重疊的寡核苷酸合成,在宿主細胞中克隆和表達。從受感染的Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)收獲物純化經(jīng)修飾的HRSV F蛋白BV恥41,并將其通過由考馬斯染色的SDS-PAGE 進行分析。純化和SDS-PAGE分析的方法描述于實施例2。在Sf9昆蟲細胞中,F(xiàn)蛋白RSV-F BV#541 (例如F蛋白Ml)的表達水平與野生型Ftl蛋白相比得到改善。實施例4H^rF1 ^.m^mrn'Mk^mmmmHRSY FSS
為了進一步改善RSV F蛋白的表達,設(shè)計了包含下述修飾的額外修飾的HRSV F基因(a)修正了所述三個GenBank測序錯誤;(b)修飾了編碼F2亞基的區(qū)處的隱含多聚㈧位點;(c)優(yōu)化了 F基因密碼子;和(d)部分缺失了編碼F1亞基融合域的核苷酸序列。在一個實驗中,缺失了編碼F1 亞基融合域前10個氨基酸的核苷酸序列(對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸137-146)。包含所述修飾的非限制性示例性經(jīng)修飾的RSV F基因示于圖5,命名為SEQ ID NO 9 (RSV-F BV#622,例如F蛋白622),編碼SEQ ID NO 10的經(jīng)修飾的F蛋白。從受感染的Sf9 昆蟲細胞培養(yǎng)收獲物純化經(jīng)修飾的HRSV F蛋白BV#622,并通過考馬斯染色的SDS-PAGE進行分析。純化和SDS-PAGE分析的方法描述于實施例2。觀察到HRSV F蛋白BV#622的高表達水平,如示于圖6中的SDS-PAGE。實施例5具有失活的主要翦切位點和F1融合域部分缺失的經(jīng)修飾的HRSV F蛋白為了確定失活的主要剪切位點和F1融合域部分缺失的組合可否進一步促進RSV F 蛋白的表達,特別是在Sf9昆蟲細胞中的表達,設(shè)計了另一種包含下述修飾的經(jīng)修飾的RSV F基因(a)修正了所述三個GenBank測序錯誤;(b)修飾了編碼F2亞基的區(qū)處的隱含多聚㈧位點;(c)優(yōu)化了 F基因密碼子;(d)失活了主要剪切位點;和(e)部分缺失了編碼Fl亞基融合域的核苷酸序列。在一個實驗中,缺失了編碼所述F1亞基融合域的前10個氨基酸的核苷酸序列(對應(yīng)于SEQ IDNO 2的氨基酸137-146)。包含所述修飾的非限制性示例性經(jīng)修飾的RSV F基因示于圖7,命名為SEQ ID NO 7 (RSV-F BV#683,例如F蛋白683),編碼SEQ ID NO 8的經(jīng)修飾的F蛋白。從受感染的Sf9 昆蟲細胞培養(yǎng)收獲物純化經(jīng)修飾的RSV F蛋白BV#683 (例如F蛋白683),并通過考馬斯染色的SDS-PAGE進行分析。純化和SDS-PAGE分析的方法描述于實施例2。取得了表達水平的進一步增強,如示于圖8中的SDS-PAGE。實施例6經(jīng)修飾的HRSV F蛋白BV#683的表達和純化如實施例1中所述將經(jīng)修飾的HRSV F蛋白BV#683 (例如F蛋白683,SEQ ID NO 8)表達于桿狀病毒表達系統(tǒng),并挑取和確證表達HRSV F蛋白BV#683的重組空斑。然后通過感染Sf9昆蟲細胞擴增所述重組病毒。將昆蟲細胞的培養(yǎng)物以 3M0I (感染復(fù)數(shù)=病毒 ffu或pfu/細胞)用桿狀病毒感染。在感染后48-72小時收獲培養(yǎng)物和上清。將粗收獲物,大約30mL,通過以大約800x g離心15分鐘進行澄清。如下所述純化了所得的含有HRSV F蛋白BV#683的粗細胞收獲物。將HRSV F蛋白BV#683從受感染的Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)收獲物純化。將非離子型表面活性劑Tergitol NP-9(壬基苯酚乙氧化物)用于膜蛋白提取實驗方案。將粗提取物進一步通過經(jīng)由陰離子交換層析、小扁豆凝集素親和/HIC和陽離子交換層析純化。
將經(jīng)純化的HRSV F蛋白BV#683如實施例2中所述通過用考馬斯染色的SDS-PAGE 和使用抗RSV F單克隆抗體的Western印跡進行分析。結(jié)果示于圖9。取得了 HRSV F蛋白BV#683的優(yōu)異表達水平(例如F蛋白683,SEQID NO 8)。預(yù)計粗細胞培養(yǎng)中表達水平為高于10mg/L,而回收的F蛋白BV#683為約3. 5mg/L細胞培養(yǎng)。在一些情況下,取得了高于20mg/L的表達水平,并回收了約5mg/L的經(jīng)修飾的F蛋白BV#683 (參見圖10)。如通過掃描光密度法確定,經(jīng)回收的F蛋白BV#683的純度達到高于98% (參見圖10)。實施例7經(jīng)純化的HRSV F蛋白BV#683微團(玫瑰花結(jié))通過負(fù)染電子顯微術(shù)分析純化的HRSV F蛋白BV#683(參見圖11)。F蛋白以微團 (玫瑰花結(jié))的形式聚集,類似于對于野生型HRSV F蛋白觀察到的那些(Calder等,2000, Virology 271,pp. 122-131),和其他全長病毒膜糖蛋白(Wrigley 等,Academic Press, London, 1986,vol. 5,pp. 103-163)。在電子顯微鏡下,F(xiàn)突起展示棒棒糖形狀的桿狀形態(tài), 其較寬端從玫瑰花結(jié)的中心向外伸出。單個三聚體的長度為約20nm,而微團顆粒的直徑為約40nm(參見圖12)。這些結(jié)果表明HRSV F蛋白BV#683具有天然、活性蛋白的正確3D結(jié)構(gòu)??偠灾?,設(shè)計、表達并純化了經(jīng)修飾的重組HRSV F蛋白(例如BV#683)。該修飾的全長F經(jīng)糖基化。主要剪切位點和融合域的修飾一起極大地增強了 F蛋白的表達水平。 此外,該經(jīng)修飾的F蛋白可剪切二硫鍵連接的F1和F2亞基。Fl和F2亞基的三聚體形成棒棒糖形狀的19. 6nm的突起和40. 2nm的顆粒。而且,該經(jīng)修飾的F蛋白在Sf9昆蟲細胞中高度表達。在純化之后取得了>98%的微團純度。該修飾的蛋白的突起具有棒棒糖形態(tài) (其可進一步從40mm的微團顆粒形成)的事實,表明經(jīng)修飾的F蛋白BV#683具有天然蛋白的3D結(jié)構(gòu)。實施例8在VLP產(chǎn)生中經(jīng)修飾的HRSV F蛋白與BRSV M和/或HRSV N的共表達本發(fā)明還提供了包含經(jīng)修飾或突變的RSV F蛋白的VLP。此類VLP可用于誘導(dǎo)針對病毒蛋白抗原的中和抗體,并由此可施用以確立針對RSV的免疫。舉例而言,此類VLP可包含經(jīng)修飾的RSV F蛋白,和BRSV M和/或HRSVN蛋白。編碼BRSV M(SEQ ID N0:14)或 HRSV N(SEQ ID NO 18)蛋白的基因的密碼子可針對在昆蟲細胞中的表達進行優(yōu)化。舉例而言,經(jīng)優(yōu)化的BRSVM基因序列示于SEQ ID NO 13,而經(jīng)優(yōu)化的RSV N基因序列示于SEQ IDNO :17ο在一個實驗中,經(jīng)修飾的F蛋白BV#622和另一種經(jīng)修飾的F蛋白BV#623 (SEQ ID NO :21,經(jīng)修飾使得兩個剪切位點均失活)單獨表達或與HRSVN蛋白和BRSV M蛋白共同表達。含有VLP的粗細胞收獲物或從30%蔗糖梯度分離收集的VLP沉淀兩者均通過用考馬斯染色的SDS-PAGE,和使用抗RSV F單克隆抗體的Wfestern印跡進行分析。圖13顯示了經(jīng)修飾的F蛋白BV#622和BV#623的結(jié)構(gòu),以及SDS-PAGE和Western印跡分析的結(jié)果。BV#622 自身高度表達或與HRSV N蛋白和BRSV M蛋白共同表達,而BV#623具有非常不良的表達, 表明兩個剪切位點的失活均抑制F蛋白表達。在另一個實驗中,將修飾的F蛋白BV#622,雙重串聯(lián)基因BV#636 (BV恥41+BRSV M),BV#683,BV#684(具有 YIAL L-域?qū)?C 端的 BV#541)和 BV#685 (具有 YKKL L-域?qū)隒端的BV#541)單獨表達,或與HRSV N蛋白和BRSV M蛋白共同表達。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中,L域 (晚期域)是保守序列,并存在于Gag內(nèi)與細胞蛋白一同作用以有效地將病毒粒體從細胞表面釋放(Ott等,2005,Journal of Virology 79 :9038-9045)。每個經(jīng)修飾的F蛋白的結(jié)構(gòu)示于圖14。將含有VLP的粗細胞收獲物(胞內(nèi))和從30%蔗糖梯度分離收集的VLP沉淀通過用考馬斯染色的SDS-PAGE和使用抗RSV F單克隆抗體的Western印跡進行分析。圖14 顯示含有VLP的粗細胞收獲物(胞內(nèi))的SDS-PAGE和Western印跡分析的結(jié)果,而圖15顯示從30%蔗糖梯度分離收集的VLP沉淀的SDS-PAGE和Wfestern印跡分析的結(jié)果。BV#622 和BV#683自身高度表達,或與HRSV N蛋白和BRSV M蛋白共同表達,而BV#636、BV#684和 BV#685具有不良表達。實施例9f帝詵H有高表汰他嵌合HRSV F^a進行了篩選其他可以可溶形式在昆蟲細胞中高度表達并可形成具有更佳產(chǎn)率的 VLP的RSV F蛋白的努力。設(shè)計、表達和分析了多種F基因。Western印跡和SDS-PAGE均用于衡量所述表達。圖16a至圖16d總結(jié)了對于每個嵌合HRSV F克隆的結(jié)構(gòu)、克隆名、描述、Western 印跡/考馬斯分析結(jié)果和結(jié)論。如結(jié)果所示,野生型全長F蛋白表達不良。含有F1但非F2亞基的嵌合HRSV F蛋白可良好表達,但產(chǎn)物或者是不可溶的(可能是由于錯折疊),或者在共同感染之后無法與其他病毒蛋白裝配形成具有良好產(chǎn)率的VLP。主要剪切位點的失活本身并不導(dǎo)致表達的實質(zhì)增加,但當(dāng)主要剪切位點的失活與其他修飾如隱含多聚(A)位點的缺失和GenBank aa錯誤的修正組合(例如BV#541)時取得了更好的表達。YKKL L域?qū)隑V#541的C端在與BRSV M和HRSV N蛋白的共同表達中增強了含有經(jīng)修飾的F蛋白的VLP的分泌約2-3倍。結(jié)果進一步顯示由BV#541基因和BRSV M基因組成的雙重串聯(lián)的嵌合基因與BV#541和BRSV M蛋白的共同感染相比,顯示改善的胞內(nèi)和VLP產(chǎn)率,表明當(dāng)串聯(lián)表達時,BRSV M蛋白可促進含有經(jīng)修飾的HRSV F蛋白的VLP在昆蟲細胞中的產(chǎn)生。由BV#541、BRSV M和HRSV N組成的三重串聯(lián)嵌合基因與上述提及的雙重串聯(lián)的嵌合基因或BV#541、BRSV M和HRSV N蛋白的共同感染相比具有甚至更高的胞內(nèi)和遠為更佳的VLP產(chǎn)率。此外,結(jié)果表明嵌合HRSV F蛋白BV#683(例如F蛋白683,SEQ ID NO 8)具有最佳的胞內(nèi)表達。由BV#683和BRSV M基因組成的雙重串聯(lián)的嵌合基因或由BV#683、BRSV M和HRSV N基因組成的三重串聯(lián)的嵌合基因的表達亦為本文中的實施方案。這些雙重或三重串聯(lián)的嵌合基因與共同感染相比會進一步改善VLP產(chǎn)生。實施例10小鼠中的RSV中和測定法和RSV攻擊研究為了測試包含經(jīng)修飾的HRSV F蛋白BV#683的疫苗對于阻止RSV感染的效率,在小鼠中進行了中和測定法和RSV攻擊研究。實驗過程示于圖17。對各小鼠組(η= 10)在第0日和第21日肌肉內(nèi)注射(生活RSV除外)安慰劑 (PBS溶液)、生活RSV(鼻內(nèi)給藥)、福爾馬林失活的RSV疫苗(FI-RSV)、lug純化的F顆粒 (PFP,經(jīng)修飾的F蛋白BV#683)、lug經(jīng)純化的F顆粒與明礬(PFP+明礬)、IOug經(jīng)純化的F 顆粒、IOug經(jīng)純化的F顆粒與明礬(PFP+明礬)或30ug經(jīng)純化的F顆粒。在第42日(第二次免疫接種之后21日)用生活RSV攻擊每個經(jīng)免疫接種的組。將來自每個組的小鼠血清在第0日、第31日(第二次免疫接種之后10日)和第46日(用生活RSV攻擊之后的4 日)收獲。將來自每個處理組的小鼠血清就抗RSV中和抗體的存在進行測定。將來自經(jīng)免疫接種的小鼠的血清的稀釋與感染性RSV在96孔微滴定板中進行溫育。將血清從1 20稀釋至1 2560。將50ul經(jīng)稀釋的血清與50ul生活RSV病毒(400pfu)在每個孔中進行混合。病毒/血清混合物在室溫首先溫育60分鐘,然后與IOOul HEp-2細胞混合,并溫育4 日。然后在用結(jié)晶紫染色之后對感染性病毒空斑的數(shù)量進行計數(shù)。每個血清樣品的中和效價定義為產(chǎn)生100% RSV中和(例如,無空斑)的血清最大稀釋的倒數(shù),并對于每個動物進行確定。將第31日(增強接種之后10日)和第46日(用生活RSV攻擊之后4日)的血清中和抗體效價的幾何平均值對于每個疫苗組進行作圖。圖18顯示了中和測定法的結(jié)果。 該結(jié)果表明IOug或30ug經(jīng)純化的F蛋白產(chǎn)生遠高于生活RSV的中和效價。此外,與明礬佐劑共同施用增強了 PFP的中和效價。進行了 RSV攻擊研究以確定免疫接種是否可在經(jīng)免疫接種的動物的肺中預(yù)防和/ 或抑制RSV復(fù)制。在經(jīng)免疫接種的小鼠的肺中的RSV的量通過空斑測定使用HEp-2細胞進行確定。上述提及的經(jīng)免疫接種的小鼠組用Ix 106pfu的感染性長RSV株在第42日(第二次免疫接種之后11日)進行鼻內(nèi)感染。在第46日(RSV感染之后4日),將小鼠肺移除、 稱重并勻漿。澄清經(jīng)勻漿的肺組織。將經(jīng)澄清的溶液的上清稀釋并對其進行使用HEp-2細胞的空斑測定以確定肺組織中的RSV效價(計算為pfu/g肺組織)。結(jié)果示于圖19,表明所有用重組RSV F蛋白BV#683免疫接種的小鼠在肺中具有無法檢測到的RSV,而甚至Iug 不含佐劑的經(jīng)純化的重組HRSV F蛋白BV#683也展示優(yōu)異的抑制RSV復(fù)制的效力(與安慰劑相比減少超過1000倍)。為了確定上述使用的RSV PFP疫苗的穩(wěn)定性,將疫苗在2_8°C儲藏0、1、2、4和5 周,然后通過經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE進行分析(圖20)。結(jié)果顯示該RSV PVP疫苗在 2-8 °C非常穩(wěn)定,且并無可檢測的降解。實施例11在棉鼠中的重組RSV F微團活性在該實施例中,動物組包括在第0日和第21日用生活RSV(RSV)、福爾馬林失活的 RSV (FI-RSV),含和不含鋁的RSV-F蛋白BV#683 (PFP和PFP+鋁佐劑)和PBS對照進行的免疫接種。如圖21所示,用30ug的F微團疫苗(RSV-F蛋白BV#683,即F蛋白683,SEQ ID NO 8)的免疫接種,無論含不含鋁,均在暴露于RSVA和RSVB兩者之后產(chǎn)生了強烈的中和抗體應(yīng)答。此外,觀察到鋁顯著增強了抗體應(yīng)答。而且,分別在RSV A和RSV B中在第46或第49日進行的增強免疫之后,中和抗體增加。盡管在用福爾馬林失活的RSV(FI-RSV)免疫接種的大鼠中觀察到顯著的肺部病理狀況,用F微團疫苗未觀察到疾病的增強(圖22)。F微團疫苗和含佐劑的F微團疫苗的使用產(chǎn)生了比初次RSV感染(PBS+RSV攻擊)對照組(5. 8)低的炎癥評分(分別為4. 0 和2. 8)。如上所示,經(jīng)FI-RSV處理的組具有與初次RSV感染(PBS+RSV攻擊)對照組相比更高的炎癥評分(9.0對5. 8)。而且,經(jīng)FI-RSV處理的組與未經(jīng)攻擊的安慰劑對照、生活RSV+RSV攻擊、F微團+RSV攻擊、和F微團+鋁+RSV攻擊相比具有顯著較高的平均炎癥評分(9. 0)。前述詳細描述僅為清楚理解目的而給出,并不應(yīng)由其理解出不必要的限制,因為其改良對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。任何本文中提供的信息均非承認(rèn)其為現(xiàn)有技術(shù)或與現(xiàn)要求保護的發(fā)明相關(guān),亦非承認(rèn)任何特別或隱含引用的公開文獻為現(xiàn)有技術(shù)。除非另行定義,本文中使用的所有科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中一般技術(shù)人員通常理解的相同含意。盡管本申請劃分為章節(jié)以引導(dǎo)讀者對具體實施方案的注意,此類章節(jié)不應(yīng)視為對實施方案的分割。各個章節(jié)和其中描述的實施方案的教導(dǎo)均適用于其他章節(jié)。盡管本發(fā)明是與其特定實施方案相聯(lián)系進行描述,應(yīng)理解的是能夠?qū)ζ溥M行進一步改良,且該申請旨在涵蓋一般地遵循本發(fā)明的原理的任何本發(fā)明的變體、應(yīng)用或轉(zhuǎn)用,并包括下述與本公開有所不同的方案,其符合本發(fā)明所述領(lǐng)域內(nèi)的已知或慣用的實踐,并可適用于上文所示并如所附權(quán)利要求書的范圍的基本特征。
權(quán)利要求
1.一種呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白,其包含至少一種增加所述RSV F蛋白在宿主細胞中的表達的修飾或突變。
2.—種RSV F蛋白,其包含至少一種減少所述RSV F蛋白在宿主細胞中的細胞毒性的修飾或突變。
3.一種RSV F蛋白,其包含至少一種與未經(jīng)修飾的RSV F蛋白相比增強所述RSV F蛋白的免疫原性的修飾或突變。
4.權(quán)利要求1-3任一項的RSVF蛋白,其中所述F蛋白進一步在對應(yīng)于野生型RSV F 蛋白(SEQ ID NO 2)的脯氨酸102殘基的氨基酸位置包含氨基酸取代。
5.權(quán)利要求4的RSVF蛋白,其中所述脯氨酸102殘基由丙氨酸殘基取代。
6.權(quán)利要求4-5任一項的RSVF蛋白,進一步在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)的異亮氨酸379殘基的氨基酸位置包含氨基酸取代。
7.權(quán)利要求6的RSVF蛋白,其中所述異亮氨酸379殘基由纈氨酸殘基取代。
8.權(quán)利要求4-7任一項的RSVF蛋白,進一步包含在對應(yīng)于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO 2)的甲硫氨酸447殘基的氨基酸位置包含氨基酸取代。
9.權(quán)利要求8的RSVF蛋白,其中所述甲硫氨酸447殘基由纈氨酸殘基取代。
10.權(quán)利要求1-9任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白呈棒棒糖狀的形態(tài)。
11.權(quán)利要求4-10任一項的RSVF蛋白,其包含失活至少一個弗林蛋白酶剪切位點的突變。
12.權(quán)利要求11的RSVF蛋白,其中所述弗林蛋白酶剪切位點是主要剪切位點。
13.權(quán)利要求11-12任一項的RSVF蛋白,其中所述至少一個弗林蛋白酶剪切位點的失活是通過在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)的精氨酸133、精氨酸135和精氨酸 136的位置導(dǎo)入至少一個氨基酸取代而實現(xiàn)的。
14.權(quán)利要求13的RSVF蛋白,其中在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ IDNO 2)的精氨酸133、精氨酸135和精氨酸136的位置導(dǎo)入至少兩個氨基酸取代。
15.權(quán)利要求14任一項的RSVF蛋白,其中在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO: 2)的精氨酸133、精氨酸135和精氨酸136的位置導(dǎo)入三個氨基酸取代。
16.權(quán)利要求13-15任一項的RSVF蛋白,其中所述精氨酸133殘基由谷氨酰胺取代。
17.權(quán)利要求13-16任一項的RSVF蛋白,其中所述精氨酸135殘基由谷氨酰胺取代。
18.權(quán)利要求13-17任一項的RSVF蛋白,其中所述精氨酸136殘基由谷氨酰胺取代。
19.權(quán)利要求4-18任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白進一步包含至少一個對 F2的隱含多聚(A)位點的修飾。
20.權(quán)利要求4-19任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白進一步包含在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)的約氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
21.權(quán)利要求1-3任一項的RSVF蛋白,其中所述修飾或突變選自下組(i)至少一個弗林蛋白酶剪切位點的失活;(ii)F2的隱含多聚(A)位點的修飾;和(iii)在對應(yīng)于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO 2)的約氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
22.權(quán)利要求1-3任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白攜帶至少兩個選自下組的突變(i)至少一個在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)的脯氨酸102、異亮氨酸379 和甲硫氨酸447的位置的氨基酸取代;( )至少一個弗林蛋白酶剪切位點的失活;(iii)F2的隱含多聚(A)位點的修飾;和(iv)在對應(yīng)于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO 2)的約氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
23.權(quán)利要求1-3任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白攜帶至少三個選自下組的突變(i)至少一個在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)的脯氨酸102、異亮氨酸379 和甲硫氨酸447的位置的氨基酸取代;( )至少一個弗林蛋白酶剪切位點的失活;(iii)F2的隱含多聚(A)位點的修飾;和(iv)在對應(yīng)于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO 2)的約氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
24.權(quán)利要求1-3任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白攜帶四個選自下組的突變(i)至少一個在對應(yīng)于野生型RSV F蛋白(SEQ ID NO 2)的脯氨酸102、異亮氨酸379 和甲硫氨酸447位置的氨基酸取代;( )至少一個弗林蛋白酶剪切位點的失活;(iii)F2的隱含多聚(A)位點的修飾;和(iv)在對應(yīng)于野生型RSVF蛋白(SEQ ID NO 2)的約氨基酸137-146的融合域N端一半中的缺失。
25.權(quán)利要求21- 任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白在對應(yīng)于野生型RSV F 蛋白(SEQ ID NO 2)的脯氨酸102、異亮氨酸379和甲硫氨酸447的位置攜帶至少兩個氨基酸取代。
26.權(quán)利要求21-25任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白在對應(yīng)于野生型RSV F 蛋白(SEQ ID NO 2)的脯氨酸102、異亮氨酸379和甲硫氨酸447的位置攜帶三個氨基酸取代。
27.一種RSV F蛋白,由選自下組的核酸序列編碼SEQ ID NO 3,SEQID NO :5、SEQ ID NO 7 禾口 SEQ ID NO :9。
28.—種RSV F蛋白,其包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :4、SEQID NO :6、SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO :10。
29.權(quán)利要求1- 任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白在宿主細胞中與野生型 RSV F蛋白相比展現(xiàn)表達增加。
30.權(quán)利要求1- 任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白與野生型RSV F蛋白相比展現(xiàn)增強的免疫原性。
31.權(quán)利要求1-30任一項的RSVF蛋白,其中所述宿主細胞是真核細胞。
32.權(quán)利要求31的RSVF蛋白,其中所述真核細胞是昆蟲細胞。
33.權(quán)利要求32的RSVF蛋白,其中所述昆蟲細胞是Sf9細胞。
34.權(quán)利要求1-33任一項的RSVF蛋白,其中所述RSV F蛋白來源于選自下組的RSV 株人RSV A株、人RSV B株、牛RSV株和禽RSV株。
35.一種純化的微團,其包含一種或多種權(quán)利要求1-34任一項的RSV F蛋白。
36.一種病毒樣顆粒(VLP),其包含權(quán)利要求1-34任一項的RSV F蛋白。
37.權(quán)利要求36的VLP,進一步包含基質(zhì)(M)蛋白。
38.權(quán)利要求37的VLP,其中所述M蛋白來源于人RSV株。
39.權(quán)利要求37的VLP,其中所述M蛋白來源于牛RSV株。
40.權(quán)利要求37的VLP,其中是M蛋白是來自流感病毒株的Ml。
41.權(quán)利要求40的VLP,其中所述流感病毒株是禽流感病毒株。
42.權(quán)利要求41的VLP,其中所述禽流感病毒株是H5W株。
43.權(quán)利要求42的VLP,其中所述H5m株是A/lndonesia/5/05。
44.權(quán)利要求37的VLP,其中所述M蛋白來源于新城疫病毒(NDV)株。
45.權(quán)利要求36-44任一項的VLP,進一步包含RSV糖蛋白(G)。
46.權(quán)利要求36-45任一項的VLP,進一步包含RSV糖蛋白(SH)。
47.權(quán)利要求36-46任一項的VLP,進一步包含RSV核殼蛋白(N)。
48.權(quán)利要求36-47任一項的VLP,其中所述VLP在真核細胞中在允許VLP形成的條件下表達。
49.權(quán)利要求49的VLP,其中所述真核細胞選自下組酵母、昆蟲、兩棲類、禽類、哺乳動物或植物細胞。
50.一種免疫原性組合物,其包含權(quán)利要求1-34任一項的RSV F蛋白。
51.一種免疫原性組合物,其包含權(quán)利要求35的純化的微團。
52.一種免疫原性組合物,其包含權(quán)利要求36-49任一項的VLP。
53.一種藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,其包含權(quán)利要求1-34任一項的RSV F蛋白,其中所述RSV F蛋白能夠在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答。
54.一種藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,其包含權(quán)利要求35的純化的微團,其中所述微團能夠在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答。
55.一種藥學(xué)上可接受的疫苗組合物,其包含權(quán)利要求36-49任一項的VLP,其中所述 VLP能夠在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答。
56.一種針對病毒感染對人受試者進行免疫接種的試劑盒,其包含權(quán)利要求1-34任一項的RSV F蛋白。
57.一種針對病毒感染對人受試者進行免疫接種的試劑盒,其包含權(quán)利要求35的純化的微團。
58.一種針對病毒感染對人受試者進行免疫接種的試劑盒,其包含權(quán)利要求36-49任一項的VLP。
59.權(quán)利要求M-56任一項的試劑盒,其中所述病毒感染是RSV感染。
60.一種針對病毒感染對哺乳動物進行疫苗接種的方法,其包括將權(quán)利要求1-34任一項的RSV F蛋白在藥學(xué)上可接受的配制物中施于人受試者。
61.一種針對病毒感染對哺乳動物進行疫苗接種的方法,其包括將權(quán)利要求35的純化的微團在藥學(xué)上可接受的配制物中施于人受試者。
62.一種針對病毒感染對哺乳動物進行疫苗接種的方法,其包括將權(quán)利要求36-49任一項的VLP在藥學(xué)上可接受的配制物中施于人受試者。
63.權(quán)利要求60-62任一項的方法,其中所述藥學(xué)上可接受的配制物包含佐劑。
64.權(quán)利要求63的方法,其中所述佐劑是非磷脂脂質(zhì)體。
65.一種針對病毒感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法,其包括將權(quán)利要求1-34任一項的RSV F 蛋白在藥學(xué)上可接受的配制物中施于人受試者。
66.一種針對病毒感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法,其包括將權(quán)利要求35的純化的微團在藥學(xué)上可接受的配制物中施于人受試者。
67.一種針對病毒感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法,其包括將權(quán)利要求36-49任一項的VLP在藥學(xué)上可接受的配制物中施于人受試者。
68.一種分離的核酸,其編碼權(quán)利要求1-30任一項的RSV F蛋白。
69.一種分離的細胞,其包含權(quán)利要求68的核酸。
70.一種載體,其包含權(quán)利要求68的核酸。
71.一種制備RSV F蛋白的方法,其包括(a)轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達權(quán)利要求68的核酸;和(b)在有助于所述RSVF蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
72.—種制備RSV F蛋白微團的方法,其包括(a)轉(zhuǎn)化宿主細胞以表達權(quán)利要求68的核酸;和(b)在有助于所述RSVF蛋白微團產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
73.權(quán)利要求71-72任一項的方法,其中所述宿主細胞是昆蟲細胞。
74.權(quán)利要求73的方法,其中所述昆蟲細胞是用包含權(quán)利要求68的核酸的桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染的昆蟲細胞。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及經(jīng)修飾或突變的呼吸道合胞病毒融合(F)蛋白及其制備和使用方法,包括免疫原性組合物如用于治療和/或預(yù)防RSV感染的疫苗。
文檔編號A61K39/155GK102307591SQ200980156344
公開日2012年1月4日 申請日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者B.周, G.史密斯, M.馬薩雷, P.普什科, Y.劉, Y.吳 申請人:諾瓦瓦克斯股份有限公司
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