專利名稱：：用于將蛋白插入到慢病毒載體中的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于將外源蛋白和整合酶融合蛋白插入到第三代基于HIV-1的慢病毒載體。
背景技術：
：將病毒cDNA整合到細胞染色質中在簡單和復雜反轉錄病毒的生命周期中是至關重要的一步。當需要長期基因轉移時，該步驟使得這些病毒成為有吸引力的候選基因治療載體。但是反轉錄病毒DNA整合是一個可能會導致插入突變及使得細胞基因表達發(fā)生變化的非特異性事件。最近，已經發(fā)現白血病病例與在基因治療試驗中使用反轉錄病毒載體有關。一種減輕由非特異性反轉錄病毒整合引起的問題的方式是利用整合酶(IN)融合蛋白進行靶向整合?？梢詫⒇撠焎DNA整合的反轉錄病毒整合酶與序列特異性DNA結合蛋白融合，所述序列特異性DNA結合蛋白融合物能夠乾向預定的染色體位點(Bushman，1994;Bushman,1995;Goulaouic&Chow，1996)。已經利用體外研究及細胞培養(yǎng)測定證明了這些IN融合蛋白能夠將IN介導的整合靶向到被所述DNA結合蛋白識別的預定位點中或其附近。然而，此前尚未證明可將IN融合蛋白有效插入到基因治療級載體中。此前，已經使用"反式包裝"策略將IN融合蛋白插入到慢病毒病毒體中(Wuetal.，1995;Fletcheretal.，1997)。該方法包括HIV-1輔助蛋白Vpr，通過與Gag的p6蛋白相互作用將Vpr包裝到病毒中(Kondoetal，1995)。利用生產細胞系共表達Vpr融合蛋白與HIV-1分子克隆，可使得將該融合蛋白插入到新形成的病毒中(參見圖2)。包裝之后，利用HIV-1蛋白酶(PR)將Vpr從IN融合蛋白中移除(Fletcheretal.，1997)。Vpr介導的反式包裝方法已經用于將IN融合蛋白包裝到感染性HIV-1病毒體中，并且還用于將治療蛋白靶向到基于慢病毒載體的核酸——游離蛋白轉導納米顆粒(PTN)(Tanetal"2006;Holmes-Son&Chow.，2002)中。但是所述反式包裝方法具有許多缺點，如反式包裝的蛋白從Vpr上不完全釋放以及所插入的融合蛋白的非特異性切割。此外，無法使用反式包裝方法將促凋亡蛋白插入到PTN顆粒中。一種所述Vpr依賴性反式包裝方法的替代方法是通過提供直接來源自病毒基因組的融合基因將IN融合蛋白插入到病毒體中。此前將HIV-1IN或鳥類肉瘤病毒(ASV)IN融合蛋白插入到病毒基因中的嘗試均會導致病毒感染性的損失(Bushman&Miller,1997)或者病毒復制過程中融合蛋白表達的損失(Katzetal.，1996)。第三代HIV來源的載體是有前途的基因治療工具，因為它們能夠同時感染分裂細胞和未分裂細胞，能夠進行長期的基因轉移，可以攜帶相當大的轉基因負荷，以及相對容易產生較高滴度。第三代HIV-l來源的載體僅在病毒生命周期的早期步驟中組裝它們的野生型副本，在轉基因構建體整合到靶細胞染色質中結束。第三代基于HIV-1的慢病毒(LV)栽體是通過以下方法生產的，即共轉染四種編碼結構和調節(jié)產物的不同質粒，所述產物是生產復制缺陷型載體顆粒所必需的。已經證明HIV-1輔助基因viy、v/r、v/7ii和we/對于載體生產來說是非必須的，并且已經將其從包裝構建體中刪除。這些基因對于病毒的體內復制和致病來說是至為重要的，但是對于病毒的體外生長或轉導來說不是至關重要的。未將載體設計為可在靶細胞中復制，而是將其設計為僅至多(包括)可實施到轉基因整合步驟。
發(fā)明內容本發(fā)明是一種用于將IN融合蛋白插入到自滅活的第三代基于HIV-1的慢病毒載體中的新方法。這是通過用病毒包裝質粒表達與/w/基因融合的融合基因來實現的。因此，與傳統的反式包裝方法不同，它不依賴于PR介導的功能性IN融合蛋白從Vpr上的釋放。本發(fā)明的一種用于將整合酶融合蛋白插入到第三代慢病毒載體中的方法，包括(i)將一種載體包裝質粒轉染到慢病毒生產細胞中，一種編碼所述整合酶融合蛋白的基因，所述基因與戶/-多聚蛋白基因融合；(ii)利用慢病毒生產細胞轉錄并翻譯所述基因以生產慢病毒載體顆粒；和(iii)在所述載體顆粒中，從/70/-多聚蛋白上釋放出整合酶融合蛋白。下述附圖舉例說明了本發(fā)明的實施方案。圖1示出了包裝質粒pMDLg/pRRE(左圖)和含有IN融合基因的包裝質粒pMDLg/pRRE(右圖)。所述包裝質粒包含任一IN融合蛋白cDNA。示出了用于克隆所述含有IN融合基因的包裝質粒的酶切位點。IN:整合酶；PC:蛋白酶切割位點；POL:HIV-1多聚蛋白。圖2示出了使用Vpr介導的反式包裝(A)和經改良的第三代LVV生產系統(B)將IN融合蛋白包裝到病毒體中的栽體生產的示意圖。編號表示病毒生產的下述階段1)將病毒生產質粒轉染到生產細胞中；2)在生產細胞中轉錄并翻譯所述結構基因。還轉錄了側接有LTR的載體RNA(轉移構建體)；3)結構蛋白和栽體RNA在質膜上裝配。Vpr-IN融合蛋白連接到Gag蛋白的p6區(qū)域上(A);4)通過出芽釋放病毒體，并且發(fā)生PR介導的蛋白水解成熟。在成熟過程中，將多聚蛋白切割為它們的單個片段以釋放功能性蛋白；5)部分成熟后的病毒體組成的示意圖。一部分Vpr-IN融合蛋白仍未被加工，同時一部分功能性IN融合蛋白被釋放(A)。在(B)中，IN融合蛋白被有效地從/^/-多聚蛋白上釋放出來(a)所述包裝構建體(b)Vpr-PC-IN融合蛋白構建體(c)Env構建體(假型化)(d)第三代LVV轉移構建體(e)RRE表達構建體。在該圖中，編號代表下述構建體IN蛋白(i);Vpr-PC-IN融合蛋白(ii);與IN融合的蛋白(iii);病毒RNA基因組(轉移構建體)(iv)。具體實施例方式本文中所用的術語整合酶融合蛋白是指與病毒整合酶融合的蛋白。所述蛋白可能會是，例如內切核酸酶如I-PpoI。術語"慢病毒生產細胞"是本領域技術人員已知的。慢病毒生產細胞為一種能夠生產慢病毒的生產細胞。在本發(fā)明的方法中，將包含編碼整合酶融合蛋白的基因的載體包裝質粒轉染到慢病毒生產細胞中，所述基因與/10/-多聚蛋白融合。利用所述生產細胞轉錄并翻譯所述基因以生產慢病毒載體顆粒，所述顆粒包含與"/-多聚蛋白融合的整合酶融合蛋白。然后在成熟的載體顆粒中，使整合酶融合蛋白從/^/-多聚蛋白上釋放出來。在本發(fā)明的方法中，用所述載體包裝質粒表達作為所述病毒基因框內融合物的外源蛋白。將所需的蛋白融合到病毒整合酶的C-末端，所述蛋白在成熟病毒體中被從Pol多聚蛋白釋放出來。可以利用病毒蛋白酶將所述整合酶融合蛋白從前體pol多聚蛋白上切割下來。可將正確大小的整合酶融合蛋白包裝到載體顆粒中而不發(fā)生顯著的非特異性降解。當整合酶融合蛋白插入到新的病毒體中作為大的Gag-Pol多聚蛋白的一部分時，還可能將治療蛋白如細胞毒性蛋白包裝到病毒體中。該方法的另一個優(yōu)勢是將病毒體來源的IN融合蛋白轉運到細胞核中，此時它們形成病毒前整合復合體(PIC)的一部分。然而，如果將額外的蛋白酶切割位點引入到整合酶基因的3，端和外源蛋白編碼基因的5，端之間，則載體脫殼后，所包裝的蛋白可能會被釋放到靶細胞的胞質溶膠中本發(fā)明方法的一個重要應用是它使得用戶能夠在使用基因治療級第三代慢病毒載體的情況下，研究不同IN融合蛋白在體外和體內指導轉基因整合的能力。本發(fā)明還可用于將外源蛋白快速遞送到各種哺乳動物細胞中，以及將IN融合蛋白直接靶向到細胞核中。對于對體內大范圍核酸酶輔助的同源重組或促凋亡蛋白功能的研究來說，這可能是一項重要的應用。制備攜帶IN融合蛋白的LV載體，所述LV載體攜帶所需的IN融合蛋白而非病毒整合酶。將所述蛋白包裝到LVX載體中，所述蛋白含有l(wèi)型野生型人免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶。HIV-1整合酶的C末端與歸巢內切核酸酶I-Ppol、N119A或H78A突變形式的I-Ppol、紅色熒光蛋白mCherry或促凋亡細胞信號蛋白p53融合。所述整合酶還可能與其他突變形式的I-Ppol如R61A融合。此外，IN可能與其他歸巢內切核酸酶或大范圍核酸酶蛋白融合，或者與其他具有治療或細胞毒性性質的蛋白融合。I-Ppol在人基因組中有天然靶標，并且能夠識別并切割這種在28SrRNA基因中非常保守的序列。已有報導稱人細胞對I-Ppol的組成型表達會導致細胞存活率下降或直接的細胞毒性。已有報道稱I-Ppol中的N119A突變會導致酶催化活性急劇降低，但是并不位于對于DNA結合和特異性來說重要的區(qū)域內。與野生型I-Ppol蛋白活性相比，H78A突變導致I-Ppol的活性降低約50%。下述實施例舉例說明了本發(fā)明。將IN融合蛋白插入到第三代LV載體中為評估功能性IN融合蛋白是否可以被包裝到第三代慢病毒載體中而不需要首先將該蛋白融合到HIV-1Vpr內，構建了在pol-多聚蛋白基因中框內融合了不同IN融合蛋白cDNA的HIV-1載體包裝質粒pMDLg/pRRE(圖1)。保留了反轉錄酶和整合酶基因之間的天然蛋白酶切割位點(PC),因為在該克隆策略中未改變IN的N末端片段。通過共轉染4種質粒來制備病毒(Follenzi&Naldini，2002)，其中之一用不同IN融合蛋白cDNA替換了/wZ-多聚蛋白基因中的野生型IN(圖1)。還通過使用包裝質粒制備了包含缺陷型IN的LV(慢病毒)載體，其中已經在IN編碼區(qū)中引入了滅活的D64V點突變。在評估IN融合蛋白的酶活性時，制備上述載體作為對照。通過蛋白質印跡來證實IN融合蛋白被正確包裝到載體內。所有被包裝到LV(慢病毒)載體中的融合蛋白均具有正確大小且大多數未退化。所生產的病毒具有良好的滴度，且未對標準的栽體制備方案進行改變(Follenzi&Naldini，2002)。除制備了攜帶單獨一種類型IN分子的載體外，還制備了使用IN融合蛋白的載體以及含缺陷型或野生型IN的包裝質粒。與單獨的IN融合蛋白相比，滅活(D64V突變)的IN突變體和IN融合蛋白的混合多聚體在結構上可能更加穩(wěn)定，并且可能在催化轉基因整合方面更有效。表2中列出了所制備的不同的IN改良的第三代LV載體。7體外研究為評估不同含IN融合蛋白的載體的可能細胞毒性作用，用載體LV-INIPpoI、LV-INN119A、LV-GFP和LV-D64V以等于1的感染復數轉導人胚腎細胞293和HeLa細胞。監(jiān)測細胞形態(tài)2-5天。以MOI=l轉染細胞會導致約55-95%的HeLa細胞在感染后第2天即表達GFP。在第2天，用LV-GFP、LV-D64V和LV-INN119A感染的細胞看上去正常，而用LV-INIPpoI感染的細胞已經開始死亡。在第3天，大多數LV-INIPpoI感染的細胞已經從培養(yǎng)板上脫附并且死亡，證實了核內遞送的活性內切核酸酶I-Ppol的細胞毒性作用。LV-INIPpoI板上殘余的細胞為GFP陰性的，并且因此未被所述載體轉導。攜帶無細胞毒性IN融合蛋白的LV載體的功能是利用它們催化轉基因整合的能力來加以評估的。載體LVINmCherry的特征也在于由IN-mCherry融合蛋白發(fā)射出的紅色熒光。在體外研究中，所生產的含融合蛋白IN的載體全部能夠催化所述載體轉基因的整合。DNA構建體首先將IN融合cDNA克隆到pBluescriptII中。使用引物5'IN和3'IN通過PCR擴增所述INcDNA。引物3，IN被i殳計為可缺失IN的終止密碼子并且將框內Xbal位點引入到PCR片段中。使用引物5，Pro和3，Pro擴增I-Ppol。引物5'Pro被設計為可缺失NLS序列N末端的起始密碼子至I-Ppol，并將其轉換為Spel位點。引物3，Pro被設計為含有以終止密碼子結尾的I-PpolcDNA的一部分，以及以pMDLg/pRRE的BspEI位點結尾的質粒序列。使用引物pRSET正向和3，mCherryBspEI由pRSET-B-mCherry擴增mCherry，它們含有與I-Ppol引物相同的限制性內切酶位點。4吏用引物p53(SpeI;NLS)正向和p53(NotI;BspeI，STOP)由質粒擴增p53pBacCaplRed(Ha隱畫RiikkaKarkkainen)擴增p53的cDNA。除含有與上文中的I-Ppol和mCherry所用的限制性位點相同的限制性位點外，引物p53(Spel;NLS)還將NLS序列引入到p53PCR產物中。PCR中所用的寡核苷酸購自OligomerOy，Helsinki,序列在表1中示出。利用ChargeSwitchPCRCleanUp試劑盒(Invitrogen)純化PCR片段，將其平端連接/亞克隆到pBluescriptII的EcoRV位點中以產生含融合包含融合伴侶I-Ppol(pBS-IPpoI)、mCherry(pBS-mCherry)和HIV-1整合酶(pBS-IN)。用Spel消化pBS-IPpol,并且將所得的片段用用PureLinkQuick凝膠提取試劑盒(Invitrogen)進行凝膠提取。將pBS-IN用Xbal線性化并且純化。將I-Ppol片段連接到pBS-IN的Xbal位點中以產生質粒pBS-INIPpoI。按照所述的用于I-Ppol相同的方法制備IN-mCherry融合物。將所純化的p53PCR片段用Spel和Notl消化，并且連接到用同樣酶消化的pBS-IN中。為構建所述帶有IN-I-Ppol融合基因的第三代慢病毒包裝質粒pMDLg/pRRE，首先將pBS-INIPpol用AflII和BspEI消化、凝膠提取并且純化。將pMDLg/pRRE用AflII和BspEI線性化，并且將所得的缺少大部分野生型IN序列的質粒片段凝膠提取并且純化。將IN-I-PpoI基因片段連接到用AflII和BspEI切割的pMDLg/pRRE中以制備質粒pMDLg/pRRE-Ppo圖1)。按照上文所述的用于IN-I-Ppol的方法，將含有IN-mCherry和IN-p53融合基因的包裝質粒從其親代pBluescript質粒上克隆到pMDIg/pRRE中。通過使用QuikChangeRIIXL定點誘變試劑盒(StratageneLaJolla,CA)以及寡核苷酸引物N119A正向和N119A反向通過定點誘變制備在I-Ppol基因中含有N119A突變的質粒pMDLg/pRRE-N119A。4吏用引物H78A正向和反向通過類似的方法制備在I-Ppol基因中含有H78A突變的質粒pMDLg/pRRE-H78A。制備另一種pMDLg/pRRE包裝質粒，其中對IN基因進行突變以消除其活性。類似地使用寡核苷酸引物D64V正向和D64V反向通過定點誘變制備該D64V突變。通過測序驗證上述克隆。制備IN改良的基于HIV-1的慢病毒載體通過以使用質粒pMDLg/pRRE的變體對293T細胞進行標準磷酸鈞介導的轉染來制備水泡性口膜炎病毒包膜(VSV-G)假型化的第三代基于HIV-1的LV載體(Follenzi&Naldini，2002)。對于每個產生的病毒，四種第三代LV包裝質粒中有三種總是相同的pRSV-Rev、pMD2G和pLV-l，包含GFPcDNA作為轉基因。所用的第4個3rd代核心包裝質粒為包含突變IN融合體的pMDLg/pRRE質粒、包含野生型IN的pMDLg/pRRE質粒或者帶有滅活IN的pMDLg/pRRE-D64V。依次使用上述三種經改良的pMDLg/pRRE質粒中的一種，或者按1:1的比例混合含有IN融合物的pMDLg/pRRE質粒與野生型pMDLg/pRRE質粒或pMDLg/pRRE質粒-064￥來制備質粒。這樣將融合蛋白整合酶與野生型IN或滅活的整合酶突變體都包裝到帶有IN融合蛋白的相同病毒中(關于所制備的不同LV載體，請參見表5)。通過用HIV-1衣殼(CA;p24)抗原進行酶聯免疫吸附測定或者通過確定在HeLa細胞中的功能性滴度(表現為GFP表達)來評估病毒滴度。蛋白質印跡通過蛋白質印跡驗證不同的IN蛋白是否被正確的插入到LV栽體中。4吏用通過NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgram獲得的抗HIV-1整合H-第23-34位氨基酸(catalogue#757)抗血清來檢測IN蛋白。所使用的二抗為山羊抗兔IgG(H+L)-AP綴合物(BIORAD)。細胞培養(yǎng)將人胚腎293T細胞(HEK293T/17ATCCNumberCRL-11268TM)和HeLa細胞(ATCCNumber:CCL-2TM)于補加有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中，在37。C下、5%含C02的潮濕氣氛中培養(yǎng)?？傊?，本發(fā)明使得可以研究IN融合蛋白的活性，特別是在使用第三代LV栽體的情況下，所述栽體缺乏非必需的HIV-1來源的輔助蛋白如Vif和Vpr。本發(fā)明的一個優(yōu)勢是可以生產等摩爾量的IN融合蛋白，并且將其與其他g^-;^/基因產物一起包裝到所述載體顆粒中，而使用Vpr介導的反式包裝策略可能只會插入較少的異源蛋白。使用這種方法，可利用病毒的蛋白酶可在天然RT-IN界面處將IN融合蛋白從前體Pol多聚蛋白上切割下來，這可能有助于正確的將包裝的蛋白從前體蛋白上釋放出來。Vpr介導的反式包裝可能不適合用于將毒性蛋白包裝到病毒體中，而本發(fā)明已經證明了活性內切核酸酶蛋白作為Pol融合體的表達對所述載體生產細胞無害，反而可以有效地殺死栽體轉導細胞。本發(fā)明還可用于將外源蛋白(細胞毒性蛋白或促凋亡蛋白)包裝到HIV-1載體顆粒中。例如，可同時使用活性大范圍核酸酶蛋白和包含線性轉基因盒的所需同源區(qū)域的可能性有助于對大范圍核酸酶輔助的同源重組(HR)進行體內研究。使用本發(fā)明研究大范圍核酸酶輔助的HR的一個優(yōu)勢為所述蛋白和DNA底物二者核定位為病毒PIC的一部分。表4中總結了不同IN融合蛋白插入策略的主要特征。使用本發(fā)明的方法成功的插入載體可能會依賴于待包裝的外源蛋白的氨基酸序列。使用本發(fā)明的方法時，所述Pol-多聚蛋白中的較大融合蛋白可被載體顆粒所容納，而不會減少顆粒的形成或降低栽體滴度。使用Vpr相關方法，可將最大達75kDa的外源蛋白反式包裝到PTN中(Linketal，2006)。這可能反映了慢病毒來源顆粒容納外源蛋白的能力的靈活性。使用本發(fā)明的方法，可能將大小為87kDa的IN-P53蛋白插入到LV載體顆粒中。本發(fā)明證明了將全長IN融合蛋白包裝到第三代慢病毒栽體中的可行性。本發(fā)明的蛋白包裝方法使得可以研究在使用第三代慢病毒載體的情況下，IN融合蛋白將轉基因整合靶向到安全的染色體位點中的能力。表1(下文)示出了用于融合蛋白構建和定點誘變的PCR引物的DNA序列。在表1中，a:在限制性位點下劃線，右側列出了限制性內切酶的名稱；b:粗體字母表示引入到I-Ppol和INcDNA中的核苷酸取代序列；并且c:斜體字母表示添加到I-Ppol和p53的5，引物上的核定位信號。ii<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>用或者以任一組合混合。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3是用于將IN融合蛋白插入到HIV來源的栽體或病毒中的不同方法的比較。Env,病毒包膜蛋白；VSV-G,水泡性口膜炎病毒G蛋白；PR,慢病毒蛋白酶；PC，蛋白酶切割位點；LVV，慢病毒栽體。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>參考文獻BushmanandMiller,1997.丄Virol.71:458464.Bushman(1994).Prac.A/a汰/4cad.Sc人USy491:9233-9237.Bushman(1995).Sc/ence:267:1443-1444.Bushman(2003).Cell115:135-138.Fletcherefa/，EMBO丄16:5123-5138.FollenziandNaldini(2002).MethodsEnzymol.346:454-65.GoulaouicandChow(1996).</旨o/.70:37-46Holmes-SonandChow.2002.Mol.Ther,5:360~370.Katz射al,(1996).Virology.217(1):178-90.Kondoa/,1995.丄Virol.69:2759~2764.Linkefal，(2006)NucleicAcidsRes.34(2):e16.Tana/,2006.JVirol.80:1939-48.Wuefa/,1995.丄Virol.69:3389-3398.權利要求1.一種用于將整合酶融合蛋白插入到第三代慢病毒載體中的方法，包括(i)將一種載體包裝質粒轉染到慢病毒生產細胞中，其中所述載體包裝質粒包含編碼所述整合酶融合蛋白的基因，所述基因與pol-多聚蛋白基因融合；(ii)利用慢病毒生產細胞轉錄并翻譯所述基因以生產慢病毒載體顆粒；和(iii)在所述載體顆粒中，從pol-多聚蛋白上釋放出整合酶融合蛋白。2.權利要求1的方法，其中所述整合酶融合蛋白包括大范圍核酸酶蛋白或歸巢內切核酸酶蛋白。3.權利要求1或2的方法，其中所述整合酶融合蛋白包括標記蛋白。4.權利要求3的方法，其中所述標記蛋白包括mCherry、l-Ppol、N119A、R61A或H78A。5.前述權利要求任一項的方法，其中所述整合酶融合蛋白包括治療蛋白或促凋亡蛋白。6.權利要求5的方法，其中所述治療蛋白或促凋亡蛋白為p53。7.權利要求5的方法，其中所述治療蛋白或促凋亡蛋白為細胞毒性蛋白。8.前述權利要求任一項的方法，其中所述整合酶融合蛋白包括D64V。全文摘要本發(fā)明是一種用于將整合酶融合蛋白插入到第三代慢病毒載體中的方法，包括(i)將一種載體包裝質粒轉染到慢病毒生產細胞中，其中所述載體包裝質粒包含慢病毒轉移構建體和編碼所述整合酶融合蛋白的基因，所述基因與pol-多聚蛋白基因融合；(ii)轉錄并翻譯所述基因；和(iii)從pol-多聚蛋白上釋放出整合酶融合蛋白。文檔編號C12N15/867GK101680003SQ200880004693公開日2010年3月24日申請日期2008年2月11日優(yōu)先權日2007年2月12日發(fā)明者D·申肯奎恩,S·伊阿-赫特圖阿拉申請人:Ark治療學有限公司