專利名稱：abl基因突變的檢測(cè)用探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)與白血病相關(guān)的abl基因的突變的探 針及其用途。
背景技術(shù)：
點(diǎn)突變的檢測(cè)，即單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)有著廣 泛的應(yīng)用，該方法可從基因水平上分析所有疾病的原因，以及 個(gè)體間疾病易感性(感染某種疾病的難異程度)、個(gè)體間藥效的 差異等。
點(diǎn)突變的通常4企測(cè)方法為(1 )擴(kuò)增樣品的目標(biāo)DNA相應(yīng) 于檢測(cè)對(duì)象序列的區(qū)域，對(duì)全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行解析的直接測(cè)序 (Direct Sequencing )法,(2 )焦石奔酉臾觀寸序(Pyrosequencing ) 法，(3)擴(kuò)增檢測(cè)對(duì)象序列所在的區(qū)域，在溫度梯度柱中進(jìn)行 HPLC，根據(jù)洗脫時(shí)間檢測(cè)突變的有無(wú)的變性高效液相色譜 (Denaturing HPLC )法，(4 )利用熒光探針與含有靶突變的區(qū) 域結(jié)合時(shí)可發(fā)出熒光的現(xiàn)象，根據(jù)所述熒光的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)突變 的Invadar法，(5 )使用3，末端含有靶突變的引物進(jìn)行PCR,才艮 據(jù)是否能擴(kuò)增來(lái)判斷突變存在性的ASP- PCR法等。
但是，上述(1 )、(2)和(4)方法的敏感度分別低達(dá)約20%、 約5%、約5%左右，操作需要很多功夫和時(shí)間。上述(3)方法 的敏感度低達(dá)約10%,另外，僅能確認(rèn)有無(wú)突變，無(wú)法解析在 何部位產(chǎn)生了何種突變，具有缺乏特異性的問(wèn)題。另外，上述 (5)的方法雖然敏感度高、但特異性低，具有易于產(chǎn)生假陽(yáng)性 的問(wèn)題。予以說(shuō)明，數(shù)值(％)越小則敏感度為越高。目標(biāo)核酸與探針形成的雙鏈核酸的熔解溫度(melting temperature, Tm )的方法。這才羊的方法通過(guò)例^口 Tm分沖斤或前 述雙鏈的熔解曲線的分析來(lái)進(jìn)行，因此被稱為熔解曲線分析。 該方法例如可以如下進(jìn)行。首先，使用與含有4企測(cè)目標(biāo)的點(diǎn)突 變的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針，形成檢測(cè)樣品中的目標(biāo)單鏈 DNA和上述探針的雜交體(雙鏈DNA)。接著，對(duì)該雜交產(chǎn)物 實(shí)施加熱處理，利用吸光度等信號(hào)測(cè)定來(lái)檢測(cè)隨著溫度上升的 雜交體的解離(融解)。然后，根據(jù)該檢測(cè)結(jié)果決定Tm值，從 而判斷有無(wú)點(diǎn)突變。Tm值在雜交產(chǎn)物的同源性越高時(shí)越高，在 同源性越低時(shí)越低。因此，對(duì)于由含有點(diǎn)突變的^r測(cè)對(duì)象序列 和與其互補(bǔ)的探針的雜交產(chǎn)物，預(yù)先求出其Tm值(評(píng)價(jià)基準(zhǔn)
值)，測(cè)定檢測(cè)樣品的目標(biāo)單鏈DNA和上述探針的Tm值(測(cè)定 值)，則可以進(jìn)行以下的判斷。當(dāng)上述測(cè)定值與上述評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值 相同時(shí)，則可以判斷為匹配、即在目標(biāo)DNA上存在點(diǎn)突變。另 一方面，上述測(cè)定值低于上述評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值時(shí)，則可以判定為錯(cuò) 配、即在目標(biāo)DNA上不存在點(diǎn)突變。
但是，使用這種Tm分析的檢測(cè)方法具有敏感度低的問(wèn)題。 作為具體例子，對(duì)于白血病患者的血細(xì)胞來(lái)源的DNA斥全測(cè)點(diǎn)突 變時(shí)存在問(wèn)題(專利文獻(xiàn)l)。白血病是骨髓中的造血干細(xì)胞癌 變所引起的疾病。其中，已知慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML )的發(fā)病原因在于由第9個(gè)染色體和第 22個(gè)染色體易位所形成的bcr- abl融合基因，在其治療中廣泛 使用作為ABL酶抑制劑的伊馬替尼等。但是，存在如下的問(wèn)題 該abl基因(包括上述融合基因中的abl基因)上存在點(diǎn)突變時(shí)， 對(duì)伊馬替尼表現(xiàn)出耐受性。此時(shí)，治療中例如有必要進(jìn)行伊馬 替尼給藥量的增加、換成其它治療藥、改為骨髓移植等。因此， 在白血病、特別是CML的治療中，檢測(cè)abl基因上有無(wú)點(diǎn)突變非常重要。但是，即便是同 一個(gè)CML患者的血液，在其血細(xì)胞中 也包括abl基因中產(chǎn)生了點(diǎn)突變的序列(檢測(cè)對(duì)象序列)和未產(chǎn) 生點(diǎn)突變的序列(非檢測(cè)對(duì)象序列)，兩者的不同僅為點(diǎn)突變、 即一個(gè)堿基的序列。這樣，發(fā)生如下現(xiàn)象用于檢測(cè)點(diǎn)突變的 探針與含有點(diǎn)突變的檢測(cè)對(duì)象序列雜交(匹配)，進(jìn)而還與不含 點(diǎn)突變的非檢測(cè)對(duì)象序列雜交(錯(cuò)配)。這種情況下，當(dāng)通過(guò) T m分析制作表示信號(hào)強(qiáng)度和溫度間的關(guān)系的融解曲線時(shí)，相應(yīng) 于匹配的突變序列的高溫側(cè)峰由于相應(yīng)于錯(cuò)配的正常序列的低 溫側(cè)峰的存在而難以纟企測(cè)到，進(jìn)而發(fā)生#全測(cè)敏感度降低。 專利文獻(xiàn)l:曰本凈爭(zhēng)7>表2004 — 537992號(hào)

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)用探針以及其用途， 所述探針即使在僅一 個(gè)堿基不同的、包含突變的檢測(cè)對(duì)象序列 和不含突變的非檢測(cè)對(duì)象序列共存的情況下，也能夠檢測(cè)所述 包含突變的檢測(cè)對(duì)象序列。
為了達(dá)到所述的目的，本發(fā)明的探針為用于檢測(cè)abl基因的 突變的探針，其特征在于，包含選自由下述(A1) ~ (II)所 組成的組中的至少一種寡核苷酸。
(Al)包含序列號(hào)2的堿基序列的寡核苷酸 (A2)包含序列號(hào)3的堿基序列的寡核苷酸 (Bl)包含序列號(hào)4的堿基序列的寡核苷酸 (B2)包含序列號(hào)5的堿基序列的寡核苷酸 (Cl)包含序列號(hào)6的堿基序列的寡核苷酸 (C2)包含序列號(hào)7的堿基序列的寡核苷酸 (Dl)包含序列號(hào)8的堿基序列的寡核香酸 (D2)包含序列號(hào)9的堿基序列的寡核普酸(El)包含序列號(hào)10的堿基序列的寡核苷酸 (Fl)包含序列號(hào)ll的堿基序列的寡核苷酸 (Gl)包含序列號(hào)12的堿基序列的寡核苷酸 (G2)包含序列號(hào)13的堿基序列的寡核苷酸 (Hl)包含序列號(hào)14的堿基序列的寡核苷酸 (H2)包含序列號(hào)15的堿基序列的寡核苷酸 (II)包含序列號(hào)16的堿基序列的寡核苷酸 本發(fā)明的突變檢測(cè)方法，其特征在于，其為檢測(cè)abl基因中 的突變的方法，含有下述(1 ) ~ ( 3 )工序。
(1) 配制反應(yīng)液的工序，所述反應(yīng)液包含含有DNA的樣 品與本發(fā)明的探針，
(2) 改變所述反應(yīng)液的溫度，測(cè)定所述DNA與所述探針 的雜交產(chǎn)物顯示熔解狀態(tài)的信號(hào)值的工序，
(3) 由伴隨溫度變化的所述信號(hào)值的變化，決定突變的 有無(wú)的工序。
使用本發(fā)明的探針，即使在發(fā)生了檢測(cè)目標(biāo)突變的abl基因 (突變基因)和未發(fā)生突變的abl基因(正?；?共存的情況 下，也能檢測(cè)所述發(fā)生目標(biāo)突變的檢測(cè)對(duì)象序列。例如，前述 Tm分析中，若采用以往的探針，所述探針會(huì)與僅有一個(gè)堿基不 同的突變基因以及正?；蚨叨茧s交，導(dǎo)致所述的熔解曲線 中，二者的信號(hào)行為(如信號(hào)峰)重疊，檢測(cè)突變基因的存在 非常困難。與此相反，若采用本發(fā)明的探針，即使探針與突變 基因和正常基因二者都雜交，在熔解曲線中，也可以充分分離 二者的信號(hào)峰。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以以比以往更高的靈敏 度檢測(cè)突變基因。另外，在本發(fā)明中，abl基因還包括bcr - abl 融合基因中的abl基因(下同)。


圖l為示意本發(fā)明實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖2為示意本發(fā)明另 一實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖3為示意本發(fā)明又一實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖4為示意本發(fā)明又一實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖5為示意本發(fā)明又一實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖6為示意本發(fā)明又一實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖7為示意本發(fā)明又一 實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖8為示意本發(fā)明又一實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。 圖9為示意本發(fā)明又 一 實(shí)施例中Tm分析結(jié)果的圖表。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，下面將發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)突變的abl基因稱為"突 變基因或檢測(cè)對(duì)象基因"；將發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)突變的序列、利用探 針進(jìn)行檢測(cè)的對(duì)象序列稱為"突變序列或檢測(cè)對(duì)象序列"；將未 發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)突變的abl基因稱為"正?；蚧蚍菣z測(cè)對(duì)象基 因"；將未發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)突變的序列稱為"正常序列或非檢測(cè)對(duì) 象序列"，將待檢測(cè)是否有突變的樣品中的DNA稱為"目標(biāo) DNA"。在本發(fā)明中，所檢測(cè)的突變可以列舉出單核苦酸多態(tài) 性(SNP)等。
<探針>
如前所述，本發(fā)明的探針為用于檢測(cè)abl基因的突變的探 針，其特征在于，包含選自前述(A1) ~ (Il)所組成的組中 的至少 一種寡核苷酸。在序列號(hào)1中示意出abl基因的cDNA序列 (mRNA序列)。另夕卜，該序列的NCBI登錄號(hào)為No.NM—005157。 下面對(duì)這些探針進(jìn)行說(shuō)明。
包含下述(Al )及(A2)的寡核苷酸的探針，分別為用于檢測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第730位的堿基A的突變(A—G)的 探針。通過(guò)下述序列號(hào)2或序列號(hào)3的寡核苷酸可以確認(rèn)正鏈上 的突變，通過(guò)與之互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)負(fù)鏈上的突變。 (Al )包含序列號(hào)2的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
(A2 )包含序列號(hào)3的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
5'-tgtgcttcaCggtgatgtcc-3'(序歹'J號(hào)2 ) 5'-gtgcttcaCggtgatgtccgtgcgttcc—3，(序歹ij號(hào)3 )
包含下述(Bl)及(B2)的寡核苷酸的探針，分別為用于
檢測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第749位堿基G的突變(G—A)的探 針。通過(guò)下述序列號(hào)4或序列號(hào)5的寡核苷酸可以確認(rèn)負(fù)鏈上的 突變，通過(guò)與之互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)正鏈上的突變。
(Bl )包含序列號(hào)4的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
(B2 )包含序列號(hào)5的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
5，-caagctgggcgAgggcc-3，(序歹ij號(hào)4 ) 5， -cacaagctgggcgAggg-3，(序歹ij號(hào)5 )
包含下述(Cl )及(C2)的寡核苷酸的探針，分別為用于 檢測(cè)序列號(hào)1中的第943位堿基A的突變(A—G)的探針。通過(guò) 下述序列號(hào)6或序列號(hào)7的寡核苷酸可以確認(rèn)正鏈上的突變，通 過(guò)與之互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)負(fù)鏈上的突變。
(Cl )包含序列號(hào)6的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
(C2 )包含序列號(hào)7的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸5，-ctcagCgatgatatagaacgg-3，(序歹ij號(hào)6 ) 5，-cagCgatgatat卿acggg-3，(序歹ij號(hào)7 )
包含下述(Dl )及(D2)的寡核苷酸序列的探針，分別為 用于檢測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第944位的堿基C的突變(C—T) 的探針。通過(guò)下述序列號(hào)8或序列號(hào)9的寡核苷酸可以確認(rèn)正鏈 上的突變，通過(guò)與之互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)負(fù)鏈上的突變。 (Dl )包含序列號(hào)8的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
苷酸
(D2 )包含序列號(hào)9的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
5'—ctcaAtgatgatatagaacg—3，(序歹寸號(hào)8 ) 5'-actcaAtgatgatatagaac-3，(序列號(hào)9 )
包含下述(E1)的寡核苷酸序列的探針，分別為用于檢測(cè) 序列號(hào)l的堿基序列中第951位的堿基C的突變(C—G)的探針。 通過(guò)下述序列號(hào)10的寡核苷酸可以確認(rèn)DNA正鏈上的突變，通 過(guò)與其互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)負(fù)鏈上的突變。
(El )包含序列號(hào)10的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
5，—ttcccgtaggtcatCaac—3' (序歹ij號(hào)10 )
包含下述(Fl)的寡核苷酸序列的探針，分別為用于檢測(cè) 序列號(hào)1的堿基序列中第1052位的堿基T的突變(T—C )的探針。 通過(guò)下述序列號(hào)11的寡核苷酸可以確認(rèn)負(fù)鏈上的突變，通過(guò)與 之互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)正鏈上的突變。
(Fl )包含序列號(hào)ll的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
5'-gtcagccaCggagtacc-3，(序歹ij號(hào)11 )包含下述(Gl )及(G2)的寡核苷酸序列的探針，分別為 用于檢測(cè)序列號(hào)1的堿基序列中第1064位的堿基A的突變 (A—G)的探針。通過(guò)下述序列號(hào)12或序列號(hào)13的寡核苷酸可 以確認(rèn)正鏈上的突變，通過(guò)與之互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)負(fù) 鏈上的突變。
(Gl )包含序列號(hào)12的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
(G2)包含序列號(hào)13的堿基序列的寡核普酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
5，-gtttttcttcCccaggtactc-3， (序歹寸號(hào)12 ) 5，-gtttttcttcCccaggtactcc-3，(序歹'J號(hào)1 3 )
包含下述(Hl)及(H2)的寡核苷酸序列的探針，分別為 用于檢測(cè)序列號(hào)1的堿基序列中第1075位堿基T的突變(T—G ) 的探針。通過(guò)下述序列號(hào)14或序列號(hào)15的寡核苷酸可以確認(rèn)正 鏈上的突變，通過(guò)與之互補(bǔ)的寡核苷酸則可以確認(rèn)負(fù)鏈上的突變。
(Hl )包含序列號(hào)14的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
(H2 )包含序列號(hào)15的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
5，—gatgaCgtttttcttctcc-3，(序歹ij號(hào)14 ) 5'-tgtggatgaCgtttttcttc-3，(序歹寸號(hào)1 5 )
包含下述(II)的寡核苷酸序列的探針，分別為用于檢測(cè) 序列號(hào)l的堿基序列中第1187位的堿基A的突變(A—G)的探針。 通過(guò)下述序列號(hào)16的寡核苷酸可以確認(rèn)正鏈上的突變，使用與
之互補(bǔ)的寡核普酸則可以確認(rèn)負(fù)鏈上的突變。(II )包含序列號(hào)16的堿基序列的寡核苷酸或其互補(bǔ)寡核
苷酸
5'-ccagcaCgggctgtgtaggtgtcc-3，(序歹ij號(hào)1 6 )
本發(fā)明的纟笨4十，優(yōu)選為用標(biāo)記物標(biāo)記的纟罙針。前述標(biāo)記物 并無(wú)限制，可列舉出熒光染料(熒光團(tuán))。所述標(biāo)記探針的具體 例子，優(yōu)選例如如下的探針用所述熒光染料標(biāo)記的、單獨(dú)時(shí) 顯示熒光且形成雜交體后熒光減弱(例如猝滅)的探針。利用
這種焚光摔滅王見(jiàn)象(Quenching phenomenon)的4果4十稱、為焚光 猝滅探針。其中，所述探針優(yōu)選寡核苷酸的3，末端或者5，末端 用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，被標(biāo)記的所述的末端的堿基優(yōu)選為C。 此時(shí)，優(yōu)選所述標(biāo)記探針的堿基序列如下地進(jìn)行設(shè)計(jì)使得在 前述標(biāo)記探針?biāo)s交的檢測(cè)對(duì)象序列中，與所述標(biāo)記探針的末 端堿基C配對(duì)的堿基或距離所述配對(duì)的堿基l ~ 3個(gè)堿基處的堿 基為G。這種探針一般稱為鳥(niǎo)噤呤猝滅探針，已知有所謂的 QProbe (注冊(cè)商標(biāo))探針。這種鳥(niǎo)噤呤猝滅探針與檢測(cè)對(duì)象序 列雜交后，被熒光染料標(biāo)記的末端的C由于接近所述檢測(cè)對(duì)象 DNA上的G,因而產(chǎn)生所述熒光染料發(fā)光減弱(熒光強(qiáng)度降低) 的現(xiàn)象。使用這樣的探針的話，根據(jù)信號(hào)的變化可以容易地確 認(rèn)雜交、解離。
所述的熒光染料并無(wú)限制，可列舉出例如熒光素、磷光體、 羅丹明、聚曱川染料衍生物等。市售的熒光染料可列舉出例如 BODIPYFL (商標(biāo)名，乇^年二，一'7?？谝?公司生產(chǎn))、 FluorePrime (商品名，7 7 7卞厶7 7》7 、> 7公司生產(chǎn))、 Fluoredite(商品名，$ ]J求了公司生產(chǎn))、FAM( ABI公司生產(chǎn))、 Cy3和Cy5 ( 了 7 、>亇厶7 7/P7、乂7公司生產(chǎn))、TAMRA (乇 k年二 ，一y口 一:/公司生產(chǎn))等。探針的檢測(cè)條件并無(wú)特別限制，可根據(jù)使用的熒光染料適當(dāng)決定，例如Pacific Blue檢測(cè) ;皮長(zhǎng)為450 ~ 480nm, TAMRA沖全觀'H皮長(zhǎng)為585 ~ 700nm, BODIPY F L檢測(cè)波長(zhǎng)為515 ~ 5 5 5 n m 。若使用此類探針，根據(jù)信號(hào)的變化， 可以容易地確定雜交或解離。另外，若在同一反應(yīng)液中檢測(cè)二 種突變時(shí)，可同時(shí)使用兩種以上與各突變相應(yīng)的探針。此時(shí)， 通過(guò)用檢測(cè)波長(zhǎng)不同的熒光染料將各探針進(jìn)行標(biāo)記，可使用同 一反應(yīng)液4全測(cè)二種以上的突變。
此外，本發(fā)明的探針，例如3，末端可以帶有磷酸基團(tuán)。如 后文所述，可以通過(guò)PCR等基因擴(kuò)增方法制備用來(lái)檢測(cè)有無(wú)突 變的DNA(靶DNA),此時(shí)，可使本發(fā)明的探針在基因擴(kuò)增反 應(yīng)的反應(yīng)液中共存。這時(shí)若探針的3，末端預(yù)先帶有磷酸基團(tuán)， 可以很好地防止探針自身通過(guò)基因擴(kuò)增反應(yīng)而延伸。此外，也 可以在3，末端加上前面所述的標(biāo)記物來(lái)獲得同樣的效果。
本發(fā)明的探針如前所述，可用于檢測(cè)abl基因的突變。檢測(cè) 方法無(wú)任何限制，只要是利用檢測(cè)對(duì)象序列與探針的雜交的方 法即可。作為應(yīng)用本發(fā)明的探針的方法的一個(gè)例子，下文對(duì)利 用Tm分析的突變檢測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明。
<突變4全測(cè)方法>
如前所述，本發(fā)明的突變檢測(cè)方法，其特征在于，其為檢 測(cè)abl基因中的突變的方法，含有下述(1 ) ~ ( 3 )工序。此外， 本發(fā)明的突變檢測(cè)方法的特征在于采用本發(fā)明的探針，對(duì)于其 他的組成以及條件并不限于下述記載。
(1) 配制反應(yīng)液的工序，所述反應(yīng)液包含含有DNA的樣 品與本發(fā)明的探針
(2) 改變所述反應(yīng)液的溫度，測(cè)定所述DNA與所述探針 的雜交產(chǎn)物顯示熔解狀態(tài)的信號(hào)值的工序
(3) 由伴隨溫度變化的所述信號(hào)值的變化，決定突變的有無(wú)的工序
在本發(fā)明中，樣品中的DNA可為單鏈DNA,亦可為雙鏈 DNA。所述DNA為雙鏈DNA時(shí)，優(yōu)選例如包含在所述工序(2 ) 之前通過(guò)加熱使前述雙鏈DNA解離的工序。通過(guò)將雙鏈DNA解 離成單鏈DNA，使得與本發(fā)明的探針進(jìn)行雜交成為可能。
在本發(fā)明中，樣品中所含的DNA例如可以為生物樣品中原 本含有的DNA,但為了提高檢測(cè)精度，優(yōu)選以生物樣品中原本 含有的DNA為模板，通過(guò)PCR等擴(kuò)增后的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物 的長(zhǎng)度并無(wú)特別限制，例如為50~ 1000mer,優(yōu)選80 200mer。 此外，前述核酸例如可以為DNA、 RNA(總RNA, mRNA等) 等，亦可為由前述RNA通過(guò)RT - PCR ( Reverse Transcription PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR)合成的cDNA等。
使用本發(fā)明的突變檢測(cè)方法的樣品，并無(wú)特別限制，可列 舉出存在abl基因的樣品。具體例子可列舉出白細(xì)胞等血細(xì)胞樣 品，全血樣品等。此外，本發(fā)明中對(duì)于樣品的采集手段、DNA 的制備方法等亦無(wú)限制，可采用目前已知的方法。
本發(fā)明中，本發(fā)明的探針相對(duì)于所述樣品中的DNA的添加 比例(摩爾比)并無(wú)限制，但為了能夠充分確保檢測(cè)信號(hào)而優(yōu) 選為l倍以下，更優(yōu)選為0.1倍以下。此時(shí)，樣品中的DNA既可 以指例如發(fā)生纟企測(cè)目標(biāo)突變的檢測(cè)對(duì)象DNA與所述未發(fā)生突 變的非檢測(cè)對(duì)象DNA的總計(jì)，亦可以指包含發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)突變 的檢測(cè)對(duì)象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物與包含所述未發(fā)生突變的非檢測(cè)對(duì) 象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的總計(jì)。此外，在樣品中的DNA中，所述檢 測(cè)對(duì)象DNA的比例通常未知，但從結(jié)果上看，優(yōu)選所述探針的 添加比例(摩爾比)相對(duì)于檢測(cè)對(duì)象DNA (含有檢測(cè)對(duì)象序列 的擴(kuò)增產(chǎn)物)為10倍以下，更優(yōu)選為5倍以下，進(jìn)一步優(yōu)選為3 倍以下。另外，對(duì)其下限并無(wú)特別限制，例如為0.001倍以上，優(yōu)選0.01倍以上，更優(yōu)選0.1倍以上。
本發(fā)明的探針相對(duì)于所述DNA的添加比例，例如可為相對(duì) 于雙鏈DNA的摩爾比，也可為相對(duì)于單鏈DNA的摩爾比。
下面對(duì)Tm值進(jìn)行說(shuō)明。持續(xù)加熱含雙4連DNA的溶液的話， 260nm處的吸光度會(huì)上升。這是由于雙鏈DNA中雙鏈間的氫鍵 由于加熱而解開(kāi)，成為單鏈DNA ( DNA熔解)。并且所有的雙 鏈DNA解離成單《連DNA的話，吸光度顯示為開(kāi)始加熱時(shí)的吸光 度(僅雙《連DNA時(shí)的吸光度)的約1.5倍，可以由此判定已完成 熔解。根據(jù)這種現(xiàn)象，熔解溫度Tm通常指吸光度值達(dá)到吸光度 總上升部分的5 0 %時(shí)的溫度。
本發(fā)明的所述工序(2)中，測(cè)定所述DNA與所述纟笨針的 雜交產(chǎn)物顯示熔解狀態(tài)的信號(hào)值時(shí)，由上述的原理出發(fā)，可以 測(cè)定260nm處的吸光度，但優(yōu)選測(cè)定本發(fā)明的探針上帶有的標(biāo) 記物的信號(hào)。因此，本發(fā)明的探針優(yōu)選使用前述的標(biāo)記探針。 所述標(biāo)記探針可以列舉例如單獨(dú)時(shí)顯示信號(hào)且通過(guò)形成雜交體 不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針，或單獨(dú)時(shí)不顯示信號(hào)而通過(guò)形成雜交 體顯示信號(hào)的標(biāo)記探針。若為前者這樣的探針，在與檢測(cè)對(duì)象 序列形成雜交體(雙鏈DNA)時(shí)不顯示信號(hào)，通過(guò)加熱探針游 離而顯示信號(hào)。若為后一種探針則通過(guò)與檢測(cè)對(duì)象序列形成雜 交體(雙鏈DNA)時(shí)顯示信號(hào)，通過(guò)加熱探針游離時(shí)信號(hào)減弱 (消失)。因此，通過(guò)在信號(hào)特有的條件(吸光度等)下檢測(cè)該 標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)，可以與所述260nm下的吸光度測(cè)定同樣地進(jìn) 行熔解進(jìn)行情況和Tm值的決定。標(biāo)記探針上的標(biāo)記物例如如前 所述。
下面，列舉使用熒光染料標(biāo)記的標(biāo)記探針作為本發(fā)明探針 的例子，對(duì)本發(fā)明的突變檢測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明。此外，本發(fā)明的 突變檢測(cè)方法的特征在于使用本發(fā)明的探針，對(duì)其他的工序、條件并無(wú)任何限制。
首先從全血中提取基因組DNA?？墒褂媚壳耙阎姆椒◤?br> 全血提取基因組DNA,例如，可使用市售的基因組DNA提取試 劑盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE、 ^^少7"、4才廿4工7義公司生產(chǎn))。
接著，將本發(fā)明的標(biāo)記探針加入到包含所提取的基因組 DNA的樣品中。所述標(biāo)記探針例如優(yōu)選前述那樣的QProbe。該 QProbe通常是指探針末端的胞嘧啶堿基被熒光染料標(biāo)記了的 探針，通過(guò)其與檢測(cè)對(duì)象序列雜交，所述熒光染料與檢測(cè)對(duì)象 序列中鳥(niǎo)嘌呤堿基相互作用，結(jié)果使得熒光減弱(或猝滅)。標(biāo) 記探針的序列如前所述，可根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)突變適當(dāng)進(jìn)行選擇。
所述;f全測(cè)用纟罙^"的添加時(shí)才;i無(wú)特別限制，例如可以在后述 的基因擴(kuò)增處理后，向擴(kuò)增產(chǎn)物中添加，亦可在基因擴(kuò)增處理 前添加。像這樣，在通過(guò)PCR等進(jìn)行擴(kuò)增處理前添加所述檢測(cè) 用探針的情況下，例如，優(yōu)選如前所述地在其3，末端附加熒光 染料或者附加磷酸基團(tuán)。
所述檢測(cè)用探針，可以添加在包含所提取的基因組DNA的 液體樣品中，亦可在溶劑中與基因組DNA混合。所述溶劑無(wú)特 別限制，可列舉例如Tris - HC1等緩沖液，含KC1 、 MgCl2、 MgS04、 甘油等的溶劑，基因擴(kuò)增反應(yīng)液等公知常用的溶劑。
接著，以所提取的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR等基因擴(kuò) 增方法擴(kuò)增包含發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)點(diǎn)突變的位點(diǎn)的序列(檢測(cè)對(duì)象 序列及非檢測(cè)對(duì)象序列)。所述基因擴(kuò)增方法并無(wú)限制，例如， PCR ( Polymerase Chain Reaction,聚合酶4連反應(yīng))法，NASBA (Nucleic acid sequence based amplification,依賴核酸序歹'J的擴(kuò) 增)法，SDA( Strand Displacement Amplification,鏈置換擴(kuò)增) 法等。其中優(yōu)選PCR法。此外，雖然下文以PCR法為例來(lái)闡述本發(fā)明，但并不限定于此。另外，PCR條件也無(wú)特別限制，可 通過(guò)目前已知的方法來(lái)進(jìn)4亍。
PCR的引物序列只要能擴(kuò)增目標(biāo)檢測(cè)對(duì)象序列即可，此外 無(wú)特別限制，可根據(jù)目標(biāo)序列使用目前已知的方法適當(dāng)進(jìn)行設(shè) 計(jì)。引物長(zhǎng)度無(wú)特別限制，通常，長(zhǎng)度可設(shè)定為例如10 30mer。 以下示意出使用所述(Al ) ~ (Il)的探針時(shí)，可用于擴(kuò)增檢 測(cè)對(duì)象序列的引物對(duì)的一些例子。另外，這些為例示，并不限 定本發(fā)明。
A1探針及A2探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)17
5 ，-gacaagtgggagatggaacgc-3 ，
反義引物 序列號(hào)18
5 ， -cacggccaccgtcagg-3 ，
B1探針及B2探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)19
5，-gacaagtgggagatggaacgc-3 ，
反義引物 序列號(hào)20
5' -cacggccaccgtcagg-3'
C1探針及C2探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)21
5' -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3'
反義引物 序列號(hào)22
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
D1探針及D2探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)23
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反義引物 序列號(hào)245 -ggacggacggaxxgcactccctcaggtagtccag-3 ，
El探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)25
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反義引物 序列號(hào)26
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
Fl探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)27
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3 ，
反義引物 序列號(hào)28
5 ， -cacgccctgtgactccatg-3 ，
G1探針及G2探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)29
5' -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3'
反義引物 序列號(hào)30
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
H1探針及H2探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)31
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3'
反義引物 序列號(hào)32
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
ii探針用引物對(duì)
正義引物 序列號(hào)33
5' -acctacctacctagatcttgctgcccgaaactg-3'
反義引物 序列號(hào)34
5' -acctacctacctcttgttgtaggccaggctctc-3'
接著，進(jìn)行所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解離、以及通過(guò)解離獲得的單鏈DNA與所述標(biāo)記探針的雜交。這些操作例如可以通
過(guò)改變反應(yīng)液的溫度來(lái)進(jìn)行。
所述解離工序中的加熱溫度，只要是所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以解
離的溫度即可，此外無(wú)特別限制，例如，為85 95。C。加熱時(shí) 間亦無(wú)特別限制，通常為1秒~10分鐘，優(yōu)選1秒 5分鐘。
解離后的單鏈DNA與所述標(biāo)記探針的雜交可通過(guò)例如在 所述解離工序后，降低所述解離工序中的加熱溫度來(lái)進(jìn)行。溫 度條件例如為40 ~ 50°C。
所述反應(yīng)液中各成分的體積、濃度無(wú)特別限制。所述反應(yīng) 液中DNA濃度的具體例子例如為O.Ol ~ l(iM,優(yōu)選O.l ~ 0.5fiM, 所述標(biāo)記探針的濃度例如優(yōu)選滿足對(duì)所述DNA的添加比例的 范圍，例如為O.OOl ~ lO(iM,優(yōu)選為O.OOl ~ l(iM。
隨后，再改變所述反應(yīng)液的溫度，測(cè)定所述擴(kuò)增產(chǎn)物與所 述標(biāo)記探針的雜交產(chǎn)物顯示熔解狀態(tài)的信號(hào)值。具體來(lái)說(shuō)，例 如，力口熱含有所述單鏈DNA與所述標(biāo)記^笨針的雜交產(chǎn)物的前述 反應(yīng)液，測(cè)定隨著溫度上升的信號(hào)值的變化。如前所述，例如， 在使用末端的C堿基被標(biāo)記的探針(鳥(niǎo)噤呤猝滅探針)時(shí)，在 其與單鏈DNA雜交的狀態(tài)下，熒光強(qiáng)度減弱(或猝滅)，在解 離的狀態(tài)下發(fā)出熒光。因此，緩慢加熱熒光強(qiáng)度減弱(或猝滅) 了的雜交產(chǎn)物，測(cè)定隨溫度上升的熒光強(qiáng)度的增加即可。
測(cè)定熒光強(qiáng)度變化時(shí)的溫度范圍無(wú)特別限制，例如，起始 溫度可為室溫~ 85°C ,優(yōu)選為25 ~ 70°C。終止溫度例如可為40 ~ 105°C。此外，溫度的上升速度無(wú)特別限制，例如為0.1 20。C/ 秒，優(yōu)選0.3 ~ 5。C/秒。
在本發(fā)明中，例如，可使用同一反應(yīng)液4全測(cè)2個(gè)以上不同位 點(diǎn)的突變。此時(shí)，如前所述，各突變相應(yīng)的探針優(yōu)選使用附加 不同的標(biāo)記物的標(biāo)記4笨針。并且，在該測(cè)定工序中，優(yōu)選在各標(biāo)記物相應(yīng)的4全測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定各標(biāo)記物的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
此后，分析所述信號(hào)的變動(dòng)來(lái)決定Tm值。具體來(lái)說(shuō)，由得 到的熒光強(qiáng)度計(jì)算出各溫度下的每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量 (- d熒光強(qiáng)度增加量/dt),將顯示最低值的溫度作為Tm值。另 外，也可將每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量 /dt)最高的點(diǎn)作為Tm值。此外，不使用猝滅探針，而是使用單 獨(dú)時(shí)不顯示信號(hào)且通過(guò)形成雜交體顯示信號(hào)的標(biāo)記作為標(biāo)記探 針的情況下，相反地測(cè)定熒光強(qiáng)度的減少量即可。
隨后，可由Tm值決定^r測(cè)對(duì)象序列的基因型。Tm分析中， 可以獲得完全互補(bǔ)的雜交體(完全匹配)比一個(gè)堿基不同的雜 交體(錯(cuò)配)顯示解離的Tm值變高的結(jié)果。所以，通過(guò)預(yù)先對(duì) 所述探針，確定完全互補(bǔ)雜交體的Tm值、 一個(gè)堿基不同的雜交 體的Tm值，可以決定各檢測(cè)對(duì)象部位的基因型。例如，假設(shè)檢 測(cè)對(duì)象部位的堿基為突變型(例如，序列號(hào)1中第730位堿基為 G),使用與含該部位的檢測(cè)對(duì)象序列互補(bǔ)的探針(序列號(hào)2或3 ) 時(shí)，所形成的雜交體的Tm值若與完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值相 同時(shí)，則所述擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)可判斷為突變型。若所形成的雜 交體的Tm值與 一 個(gè)堿基不同的錯(cuò)配雜交體的Tm值相同時(shí)(較 完全互補(bǔ)雜交體的Tm值低)，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)則可判定為 野生型(例如，序列號(hào)1中第730位的堿基為A)。另外，僅檢測(cè) 到完全互補(bǔ)的雜交體的Tm值時(shí)，可判斷為突變型純合子；僅檢 測(cè)到錯(cuò)配的雜交體的Tm值時(shí)，可判斷為野生型純合子。另一方 面，若同時(shí)檢測(cè)到雙方的Tm值時(shí)，則可判斷為雜合體。這樣即 可根據(jù)各標(biāo)記探針的2個(gè)Tm值來(lái)判定基因型。
本發(fā)明中，優(yōu)選事先對(duì)各探針決定完全匹配的雜交產(chǎn)物的 Tm值和錯(cuò)配的雜交產(chǎn)物的Tm值。這樣通過(guò)將實(shí)際與檢測(cè)對(duì)象 序列形成雜交體時(shí)的Tm值與事先決定的作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的Tm值進(jìn)行比較，可容易地確定有無(wú)突變和合子類型。所述作為評(píng)價(jià)
標(biāo)準(zhǔn)的Tm值可通過(guò)例如目前已知的MELTCALC4欠件(http: 〃www.meltcalc.com )或鄰接法(Nearest Neighbor Method )確
形成雜交體并進(jìn)行Tm分析來(lái)確定。
另外，本發(fā)明中，例如也可測(cè)定雜交體形成時(shí)的信號(hào)變化 來(lái)替代如前所述的使含雜交產(chǎn)物的反應(yīng)液溫度上升(加熱)并 測(cè)定隨溫度上升的信號(hào)變化的方法。即亦可在使所述含探針的 反應(yīng)液的溫度降低而形成雜交產(chǎn)物時(shí)，測(cè)定隨所述溫度下降的 信號(hào)變化。
作為具體例子，使用單獨(dú)時(shí)顯示信號(hào)且通過(guò)形成雜交體后 不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針(例如鳥(niǎo)噤呤猝滅探針)時(shí)，在單鏈DNA 與探針解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光，通過(guò)降低溫度形成雜交體的話， 所述熒光減弱(或猝滅)。因此，例如可以緩慢降低所述反應(yīng)液 的溫度，測(cè)定伴隨溫度下降的熒光強(qiáng)度的降低。另一方面，使 用單獨(dú)時(shí)不顯示信號(hào)且通過(guò)形成雜交體顯示信號(hào)的標(biāo)記探針 時(shí)，在單鏈DNA與探針解離的狀態(tài)下不發(fā)熒光，通過(guò)降低溫度 形成雜交體后能發(fā)出熒光。因此，例如可以緩慢降低所述反應(yīng) 液的溫度，測(cè)定伴隨溫度下降的熒光強(qiáng)度的增加。
<探針試劑盒>
本發(fā)明的探針試劑盒，其特征在于，其為用于檢測(cè)abl基因 突變的試劑盒，含有本發(fā)明的探針。本發(fā)明的探針試劑盒中， 本發(fā)明的探針既可以是一種亦可是兩種以上。為后者的情況下， 所包含的二種以上探針可為混合狀態(tài)，也可分別為單個(gè)試劑。 另外，二種以上的本發(fā)明的探針以混合狀態(tài)包含在本發(fā)明的試 劑盒中的情況；以及以單個(gè)試劑被包含、例如使用時(shí)在同一反 應(yīng)體系中進(jìn)行各探針與各檢測(cè)對(duì)象序列的Tm分析的情況中，優(yōu)選各纟采針4吏用不同的標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。這樣通過(guò)改變標(biāo)記物的 種類，即使在同一反應(yīng)體系中，也可以分別檢測(cè)不同的探針。 所述標(biāo)記物優(yōu)選例如才企測(cè)波長(zhǎng)不同的物質(zhì)。
如前所述，已知abl基因上有多個(gè)突變與白血病相關(guān)，使用 本發(fā)明的探針，可檢測(cè)所述的各種突變(9種)。另一方面，與 白血病相關(guān)的abl基因，例如，存在僅檢測(cè)其中任一個(gè)位點(diǎn)的突 變的情況，亦存在檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)的突變的情況。本發(fā)明中作為 檢測(cè)目標(biāo)多個(gè)突變雖然都是顯示與白血病及所用藥品(例如伊 馬替尼)相關(guān)的突變，但也顯示出每個(gè)突變所特有的特征。因 此，例如，檢測(cè)出多個(gè)突變時(shí)，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行綜合分析，由 此可能作出更佳的診斷、治療。因此，本發(fā)明的探針試劑盒中 通過(guò)包含2種以上本發(fā)明的探針時(shí)，用于診斷、治療等目的的突 變檢測(cè)將更加簡(jiǎn)便易行。
<it斷方法>
本發(fā)明的診斷方法，其特征在于，其為白血病診斷方法， 包含通過(guò)本發(fā)明的突變檢測(cè)方法檢測(cè)abl基因的突變的工序。本 發(fā)明的特征在于，使用所述本發(fā)明的探針對(duì)abl基因的突變進(jìn)行 檢測(cè)，對(duì)其他的工序、條件無(wú)任何限制。
根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)abl基因特定部位上有無(wú)突變，來(lái)判 斷對(duì)白血病治療藥物的耐性。所述白血病治療藥物例如可舉出
伊馬替尼、曱磺酸伊馬替尼。
下面舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述，但本發(fā)明并不受下述實(shí) 施例限制。
實(shí)施例1
abl基因第730位堿基的點(diǎn)突變(A—G) 使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第730位堿基的點(diǎn)突變 (A—G)進(jìn)行Tm分析。制備插入有序列號(hào)1所表示的第730位的堿基A未突變的正 常abl基因序列的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA，，)、插入有所述第730位 的堿基A突變?yōu)镚的突變abl基因(abl酪氨酸激酶A730G,氨基 酸信息M244V)的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。并將兩者配制成 關(guān)見(jiàn)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97), ^l尋104copy/test ( 1 |iL )力口 入到49iiL下述PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)液 中檢測(cè)探針的終濃度為50nM。所述PCR反應(yīng)如下進(jìn)行使用熱 循環(huán)4義，95。C處理60秒后，以95。C處理1秒、58。C處理30秒為一 循環(huán)，重復(fù)50個(gè)循環(huán)，隨后95。C處理1秒，40。C處理60秒。此后 使溫度上升速度為TC/3秒，將所述PCR反應(yīng)液從4(TC加熱至 95°C,測(cè)定熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化(波長(zhǎng)585 ~ 700nm)。
(PCR反應(yīng)液?jiǎn)挝籟il)
蒸餾水 25.25
10xgene Taq buffer* 5
40%甘油 12.5
2.5mM dNTPs 4
100pM正義引物 1 (實(shí)施例) 0.5 (比較例)
100pM反義引物 0.5 (實(shí)施例) 1 (比較例)
5pM檢測(cè)用探針 0.5
5U/|aL Gene Taq FP*_^_
總計(jì) 49pL
*商品名Gene Taq Fp: 二 y求乂 ^ 一 乂乂>司生產(chǎn)(以下同) 正義引物 序列號(hào)17
5 ， -gacaagtgggagatggaacgc-3,
反義引物 序列號(hào)18
5' -cacggccaccgtcagg-3'
(實(shí)施例i -1)
檢測(cè)用探針A1 序列號(hào)2
5' —tgtgcttcaCggtgatgtcc— (TAMRA) -3'(實(shí)施例1 - 2 )
檢測(cè)用探針A2 序列號(hào)3
5' -gtgcttcaCggtgatgtccgtgcgttcc- (TAMRA) -3 ，
(比較例1 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)35
5 ， -(TAMRA)-caccGtgaagcacaag-P-3 ，
這些的結(jié)果如圖i所示。圖i為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度
變化(微分值=(-d熒光強(qiáng)度增加量/dt),以下同)的Tm分析 的圖表(熔解曲線)。圖1中(A )為實(shí)施例1 - 1的結(jié)果，(B ) 為實(shí)施例l-2的結(jié)果，(C)為比較例l的結(jié)果。此外，在相同 條件下各探針與wtDNA ( 100%)形成雜交體的情況、以及各探 針與mtDNA ( 100%)形成雜交體的情況下，各峰值如下所示， 并以此作為評(píng)^介標(biāo)準(zhǔn)。
峰值溫度(。C )
探針_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
實(shí)施例1 - 1 ^ ^75
實(shí)施例1 - 2 69.0 74.0
比較例l 50.0 57.0
如該圖中的(A)與(B)所示，使用實(shí)施例l - l及實(shí)施例 1 - 2的探針，結(jié)果檢測(cè)到與所述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA峰(°C ) 與mtDNA峰(。C)。與此相反，如該圖的(C)所示，使用比較 例l的探針時(shí)，未能觀察到mtDNA峰。由此結(jié)果可知，使用本 發(fā)明的探針，即使在mtDNA與wtDNA共存的情況下，也可以提 高mtDNA的檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例2
abl基因第749位堿基的點(diǎn)突變(G—A)
使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第749位堿基的點(diǎn)突變(G—A)進(jìn)行Tm分析。
制備插入有序列號(hào)1所表示的第749位堿基G未突變的正常 abl基因序列的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA，，)，制備插入有所述第749 位堿基G突變?yōu)锳的突變abl基因(abl酪氨酸激酶G749A,(氨基 酸信息G250E))的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。隨后將兩者配制 成規(guī)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),將104copy/test ( lpL) 加入到49^L的下述PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)及 熒光強(qiáng)度的檢測(cè)與前述實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
(PCR反應(yīng)液?jiǎn)挝籭al)
蒸餾水 31.5 10xgene Taq buffer* 5 40%甘油 6.25 2.5mM dNTPs 4
100pM正義引物 1 (實(shí)施例) 0.5 (比較例)
100pM反義引物 0.5 (實(shí)施例) 1 (比較例)
5pM檢測(cè)用探針 0.5
5U/^L Gene Taq FP*__
49pL
正義引物 序列號(hào)21
5, -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反義引物 序列號(hào)22
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3 ，
(實(shí)施例3 - 1 ) 檢測(cè)用探針C1 序列號(hào)6
5'-(Pacific Blue)-ctcagCgatgatatagaacgg-P-3
(實(shí)施例3 - 2 ) 檢測(cè)用探針C2 序列號(hào)7
5 ， -(TAMRA)-cagCgatgatatagaacggg-P-3 ，
(比較例3 - 1 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)37
5' -(TAMRA)-catgaactcaGcgatgatatag-P-3'
(比專交例3 — 2 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)38 5 ， —(TAMRA)-cccgttctatatcatcgCtg-P-3 ，這些結(jié)果如圖3所示。圖3為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變 化的Tm分析的圖表。圖3中，(A)為實(shí)施例3- l的結(jié)果，(B) 為實(shí)施例3 - 2的結(jié)果，(C)為比較例3 - l的結(jié)果，(D)為比較 例3-2的結(jié)果。此外，在相同條件下，各探針與wtDNA( 100%) 形成雜交體的情況、以及各探針與mtDNA ( 100%)形成雜交體 的情況下，各峰值如下所示，并以此作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
峰值溫度(。c )
探針_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )
實(shí)施例3 - 1 ^T5 ^
實(shí)施例3 - 2 50.0 60.0
比豐i例3 - 1 52.0 N.D
比較例3 - 2 55.0 N.D
如該圖的(A)與(B)所示，使用實(shí)施例3- l及實(shí)施例3 - 2的探針，結(jié)果可檢測(cè)到與所述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA的峰 (。C )與mtDNA的峰(。C )。與此相反，如該圖中的(C)和圖 (D)所示，使用比較例3 - l及比較例3 - 2的探針時(shí)，未能觀 察到mtDNA的峰。由此結(jié)果可知，使用本發(fā)明的探針，即使在 mtDNA與wtDNA共存的情況下，也可以提高mtDNA的檢測(cè)靈敏 度。
實(shí)施例4
abl基因第944位堿基的點(diǎn)突變(C—T)
使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第944位堿基的點(diǎn)突變 (C—T)進(jìn)行Tm分析。
制備插入有序列號(hào)1所表示的第944位堿基C未突變的正常 abl基因序列的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA，，)，制備插入有所述第944 位堿基C突變?yōu)門的突變abl基因(abl酪氨酸激酶C944T,(氨基 酸信息T3151))的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。隨后將兩者配制成 頭見(jiàn)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97), 4奪104copy/test ( l^iL )力口入到49jaL前述表3所示的PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反 應(yīng)及熒光強(qiáng)度的才企測(cè)與所述實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。 正義引物 序列號(hào)23
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3,
反義引物 序列號(hào)24
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
(實(shí)施例4 - 1 ) 檢測(cè)用探針D1 序列號(hào)8
5' -(BODIPY FL)-ctcaAtgatgatatagaacg-P-3'
(實(shí)施例4 - 2 ) 檢測(cè)用探針D2 序列號(hào)9
5, -actc aAtgatgatat卿ac-(TAMRA)-3,
(比較例4- 1 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)39
5' -(TAMRA)-cccgttctatatcatcaTtgag—P—3'
(比較例4 - 2) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)40 5 ， —(TAMRA)—ccgttctatatcatcaTtg—P-3'
這些結(jié)果如圖4所示。圖4為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變 化的Tm分析的圖表。圖4中，(A)為實(shí)施例4 - l的結(jié)果，(B ) 為實(shí)施例4-2的結(jié)果，(C)為比較例4- l的結(jié)果，(D)為比較 例4-2的結(jié)果。此外，在相同條件下，各探針與wtDNA( 100% ) 形成雜交體的情況、以及各探針與mtDNA ( 100%)形成雜交體 的情況下，各峰值如下所示，并以此作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
峰值溫度(。c )探針_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
實(shí)施例4 _ 1
實(shí)施例4 - 2 46.0 55.0
比4交例4 - 1 54.0 59.0
比4交例4 - 2 49.0 54.0
如該圖的(A)與(B)所示，使用實(shí)施例4_ l及實(shí)施例4 -2的探針，結(jié)果可才企測(cè)到與所述評(píng)1介標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA的峰 (。C )與mtDNA的峰(。C )。與此相反，如該圖中的(C)和圖 (D)所示，使用比較例4- l及比較例4-2的探針時(shí)，未能觀 察到mtDNA的峰。由此結(jié)果可知，使用本發(fā)明的探針，即使在 mtDNA與wtDNA共存的情況下，也可以提高mtDNA的檢測(cè)靈敏 度。
實(shí)施例5
abl基因第951位石威基的點(diǎn)突變(C—G)
使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第951位堿基的點(diǎn)突變 (C—G)進(jìn)行Tm分析。
制備插入有序列號(hào)1所表示的第9 51位堿基C未突變的正常 abl基因序列的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA")，制備插入有所述第951 位堿基C突變?yōu)镚的突變abl基因(abl酪氨酸激酶C951G，(氨基 酸信息F317L))的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。隨后將兩者配制 成頭見(jiàn)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),將104copy/test ( 1 pL ) 加入到49pL前述表3所示的PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)及熒光強(qiáng)度的檢測(cè)與所述實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
正義引物 序列號(hào)25
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反義引物 序列號(hào)26
5' _ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
(實(shí)施例5 )檢測(cè)用探針E1 序列號(hào)IO 5, -ttcccgtaggtcatCaac-(TAMKA)-3 ，
(比較例5- 1 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)41 5' -ttGatgacctacgggaacc-(TAlVlRA)-3'
(比較例5 - 2) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)42 5 ， -ttGatgaccUcgggaac-(TAVIRA)-3 ，
(比較例5 - 3 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)43 5 ， -(TAMRA)—cccgtaggtcatCaactc-P-3 ，
這些結(jié)果如圖5所示。圖5為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變 化的Tm分析的圖表。圖5中，(A)為實(shí)施例5的結(jié)果，(B)為 比較例5 - 1的結(jié)果，(C )為比較例5 - 1的結(jié)果，(D )為比較例 5-3的結(jié)果。此外，在相同條件下，各探針與wtDNA ( 100%) 形成雜交體的情況、以及各探針與mtDNA( 100%)形成雜交體 的情況下，各峰值如下所示，并以此作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
峰值溫度(°c )
探針_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
實(shí)施例5
比較例5 - 1 58.0 62.0
比較例5 - 2 56.0 60.0
比較例5 —3 N.D. N.D.
如該圖的(A)所示，使用實(shí)施例5的探針，結(jié)果可檢測(cè)到
與所述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA的峰(°C )與mtDNA的峰(°C )。
與此相反，如該圖中的(B)和(C )所示，使用比較例5 - 1
及比較例5-2的探針時(shí)，未能觀察到mtDNA的峰。另外，如該圖中的(D)所示，使用比較例5 - 3的探針時(shí)存在多個(gè)峰，無(wú) 法進(jìn)行判斷。由此結(jié)果可知，使用本發(fā)明的探針，即使在mtDNA 與wtDNA共存的情況下，也可以提高mtDNA的檢測(cè)靈敏度。 實(shí)施例6
abl基因第1052位堿基的點(diǎn)突變(T—C) 使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第1052位堿基的點(diǎn)突變 (T—C)進(jìn)行Tm分析。
制備插入有序列號(hào)l所表示的第1052位堿基T未突變的正 常abl基因序列的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA，，)，制備插入有所述第 1052位堿基T突變?yōu)镃的突變abl基因(abl酪氨酸激酶T1052C， (氨基酸信息M351T))的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。隨后將兩 者配制成規(guī)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),將104copy/test (ljiL)加入到49fiL前述表l所示的PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反 應(yīng)。PCR反應(yīng)及熒光強(qiáng)度的檢測(cè)與所述實(shí)施例l同樣地進(jìn)行。
正義引物 序列號(hào)27
5' -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3 ，
反義引物 序列號(hào)28
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
(實(shí)施例6 ) 檢測(cè)用探針F1 序列號(hào)ll
5' -gtcagccaCggagtacc-(BODIPY FL)-3'
(比較例6 - 1 ) 檢測(cè)用纟笨針 序列號(hào)44
5' -ccactcagatctcgtcagccaCggagtacc-(TAMRA)-3'
(比較例6 - 2) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)455 ，《TAMRA)-ccaTggagtEicctEigCgeieig-P-3,
這些結(jié)果如圖6所示。圖6為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變 化的Tm分析的圖表。圖6中，(A)為實(shí)施例6的結(jié)果，(B)為 比較例6-l的結(jié)果，(C)為比較例6-2的結(jié)果。此外，在相同 條件下，各探針與wtDNA ( 100%)形成雜交體的情況、以及各 探針與mtDNA( 100%)形成雜交體的情況下，各峰值如下所示， 并以此作為評(píng)i"介標(biāo)準(zhǔn)。
峰值溫度(。c )
探針_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
實(shí)施例6 ^
比較例6 - 1 68.0 73.0
比砵交例6 —2 N.D. N.D.
如該圖的(A)所示，使用實(shí)施例6的探針，結(jié)果可檢測(cè)到 與所述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA的峰(。C )與mtDNA的峰(°C )。 與此相反，如該圖中的(B )和(C )所示，使用比較例6 - 1 及比較例6-2的探針時(shí)，未能觀察到mtDNA的峰。由此結(jié)果可 知，使用本發(fā)明的探針，即使在mtDNA與wtDNA共存的情況下， 也可以提高mtDNA的檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例7
abl基因第1064位堿基的點(diǎn)突變(A—G) 使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第1064位堿基的點(diǎn)突變 (A—G)進(jìn)行Tm分析。
制備插入有序列號(hào)l所表示的第1064位堿基A未突變的正 常abl基因序列的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA"),制備插入有所述第 1064位堿基A突變?yōu)镚的突變abl基因(abl酪氨酸激酶A1064G, (氨基酸信息E355G))的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。隨后將兩 者配制成規(guī)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97)，將104copy/test(l[iL)力口入到49pL下述PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反 應(yīng)及熒光強(qiáng)度的4全測(cè)與所述實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。 [表IO]
(PCR反應(yīng)液?jiǎn)挝籟il)
蒸餾7jc 28.375
10xgene Taq buffer* 5
40%甘油 9.375
2.5mM dNTPs 4
100^M正義引物 1
100pM反義引物 0.5
5[iM檢測(cè)用探針 0.5
5U/^L Gene Taq FP*_0.25
總計(jì) 49nE
正義引物 序列號(hào)29
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgt織tg-3 ，
反義引物 序列號(hào)30
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
(實(shí)施例7 - 1 ) 檢測(cè)用纟笨針G1 序列號(hào)12
5' -gtttttcttcCccaggtactc-(TAMRA)-3'
(實(shí)施例7 _ 2 ) 檢測(cè)用探針G2 序列號(hào)13
5' -gtttttcttcCccaggtactcc-(TAMRA)-3'
(比較例7) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)46
5' -(TAMRA)-cttcCccaggtactcc-P-3'
這些結(jié)果如圖7所示。圖7為表示隨溫度上升的焚光強(qiáng)度變 化的Tm分析的圖表。圖7中，(A)為實(shí)施例7- l的結(jié)果，(B) 為實(shí)施例7-2的結(jié)果，(C)為比較例7的結(jié)果。此外，在相同條件下，各探針與wtDNA ( 100%)形成雜交體、以及各探針與 mtDNA ( 100%)形成雜交體的情況下，各峰值如下所示，并以 此作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 [表ll]
峰值溫度(。C )
探針_wtDNA ( 100% )mtDNA ( 100% )
實(shí)施例7 - 1 53.0 62.0
實(shí)施例7 - 2 55.0 63.0
如該圖的(A)和(B)所示，使用實(shí)施例7- l及實(shí)施例7 -2中的探針，結(jié)果可檢測(cè)到與所述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA的 峰(。C )與mtDNA的峰(。C )。與此相反，如該圖中的(C )所 示，使用比較例7的探針時(shí)，未能觀察到mtDNA的峰。由此結(jié) 果可知，使用本發(fā)明的探針，即使在mtDNA與wtDNA共存的情 況下，也可以提高mtDNA的檢測(cè)靈敏度。
實(shí)施例8
abl基因第1075位堿基的點(diǎn)突變(T—G)
使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第1075位堿基的點(diǎn)突變 (T—G)進(jìn)行Tm分析。
制備插入有序列號(hào)l所表示的第1075位堿基T未突變的正 常abl基因的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA"),制備插入有所述第1075 位堿基T突變?yōu)镚的突變abl基因(abl酪氨酸激酶T1075G,(氨 基酸信息F359V))的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。隨后將兩者配 制成規(guī)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),以104copy/test ( lpL ) 加入到49nL前述表4所示的PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)及熒光強(qiáng)度的檢測(cè)與所述實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
正義引物 序列號(hào)31
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3 ，反義引物 序列號(hào)32
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
(實(shí)施例8 - 1 ) 檢測(cè)用探針H1 序列號(hào)14
5' —gatgaCgtttttcttctcc—(TAMRA)—3'
(實(shí)施例8 _ 2 ) 檢測(cè)用探針H2 序列號(hào)15
5 ， -tgtggatgaCgtttttcttc-(TAMRA)-3'
(比較例8 - 1 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)47
5' -(TAMRA)-ctgtggatgaCgtttttc-P-3'
(比較例8 _ 2 )
檢測(cè)用探針 序列號(hào)48
5' -(TAMRA)-cctgtggatgaCgtttttc-P-3'
這些結(jié)果如圖8所示。圖8為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變
化的Tm分析的圖表。圖8中，(A)為實(shí)施例8-l的結(jié)果，(B) 為實(shí)施例8 - 2的結(jié)果，(C )為比較例8 - 1的結(jié)果，(D )為比較 例8-2的結(jié)果。此外，在相同條件下，各探針與wtDNA( 100%) 形成雜交體、以及各探針與mtDNA( 100%)形成雜交體的情況 下，各峰值如下所示，并以此作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 [表12]
峰值溫度(。c )
探針_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
實(shí)施例8 - 1
實(shí)施例8 - 2 50.0 60.0
比較例8 - 1 48.0 58.0.
比較例8 - 2 50.0 59.0
如該圖的(A)和(B)所示，使用實(shí)施例8- l及實(shí)施例8-2中的探針，結(jié)果可檢測(cè)到與所述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA的 峰(°C )與mtDNA的峰(°C )。與此相反，如該圖中的(C)和
(D)所示，使用比較例8- l和比較例8-2的探針時(shí)，出現(xiàn)多 個(gè)峰，無(wú)法辨別mtDNA的峰。由此結(jié)果可知，使用本發(fā)明的探 針，即使在mtDNA與wtDNA共存的情況下，也可以提高mtDNA 的檢測(cè)靈敏度。 實(shí)施例9
abl基因第1187位堿基的點(diǎn)突變(A—G)
使用本發(fā)明的探針，對(duì)abl基因第1187位堿基的點(diǎn)突變 (A—G)進(jìn)行Tm分析。
制備插入有序列號(hào)1所表示的第1187位堿基A未突變的正 常abl基因的質(zhì)粒(以下稱"wtDNA"),制備插入有所述第1187 位堿基A突變?yōu)镚的突變abl基因(abl酪氨酸激酶A1187G，(氨 基酸信息H396R))的質(zhì)粒(以下稱"mtDNA")。隨后將兩者配 制成規(guī)定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),以104copy/test ( lpL ) 加入到49(iL下述PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)及熒 光強(qiáng)度的4企測(cè)與所述實(shí)施例1同樣地進(jìn)行。
(PCR反應(yīng)液?jiǎn)挝籶l)
蒸餾水 31.5
10xgene Taq buffer* 5
40%甘油 6.25
2.5mM dNTPs 4
100^M正義引物 0.5
100pM反義引物 0.5
5nM檢測(cè)用探針 0.5
5U/nL Gene Taq FP*_0.25
總計(jì) 49nL
正義引物 序列號(hào)33
5' -acctacctacctagatcttgctgcccgaaactg-3反義引物 序列號(hào)34
5' -acctacctacctcttgttgtaggccaggctctc-3'
(實(shí)施例9 ) 檢測(cè)用探針I(yè)l 序列號(hào)16
5 ， —ccagcaCgggctgtgtaggtgtcc—(TAMRA)-3'
(比較例9- 1 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)49 5 ， -gctccagcaCgggctgtgtaggtgtcc-(TAMRA)-3'
(比舉交例9 _ 2 ) 檢測(cè)用探針 序列號(hào)50
5 ， -(TAMRA)-ccagcaCgggctgtgtag-P-3 ，
這些結(jié)果如圖9所示。圖9為表示隨溫度上升的熒光強(qiáng)度變 化的Tm分析的圖表。圖9中，(A)為實(shí)施例9的結(jié)果，(B)為 比較例9-l的結(jié)果，(C)為比較例9-2的結(jié)果。此外，在相同 條件下，各探針與wtDNA ( 100%)形成雜交體、以及各探針與 mtDNA ( 100%)形成雜交體的情況下，各峰值如下所示，并以 此作為評(píng)1^介標(biāo)準(zhǔn)。
峰值溫度(。c )
探針_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
實(shí)施例9 ^
比較例9 - 1 69.0 75.0
比較例9 - 2 55.0 65.0
如該圖的(A)，使用實(shí)施例9的探針，結(jié)果可檢測(cè)到與所 述評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)相同的wtDNA的峰(°C )與mtDNA的峰(°C )。與 此相反，如該圖中的(B )和(C )所示，使用比較例9 - l和比 較例9-2的探針時(shí)，出現(xiàn)多個(gè)峰，無(wú)法辨別mtDNA的峰。由此 結(jié)果可知，使用本發(fā)明的探針，即使在mtDNA與wtDNA共存的情況下，也可以提高mtDNA的檢測(cè)靈敏度。 工業(yè)上利用的可能性
如上所述，利用本發(fā)明的探針，即使在發(fā)生檢測(cè)目標(biāo)的突 變的abl基因(突變基因)與未發(fā)生突變的abl基因(正?；? 共存的情況下，也可檢測(cè)出所述作為檢測(cè)對(duì)象的突變基因。例 如，進(jìn)行所述的Tm分析時(shí)，使用以往的探針的話，如前所述探 針會(huì)與僅一個(gè)堿基不同的突變基因以及正?；螂p方發(fā)生雜 交，因而所述的熔解曲線中，兩者的信號(hào)重疊，很難檢測(cè)突變 基因的存在。與此相反，若采用本發(fā)明的探針，雖然探針也會(huì) 與突變基因與正常基因雙方雜交，但在熔解曲線中，能夠使二 者的信號(hào)分離。因此，采用本發(fā)明，例如可通過(guò)Tm分析來(lái)檢測(cè) 突變基因的存在。
權(quán)利要求
1. 一種探針，其為用于檢測(cè)abl基因的突變的探針，其包含選自由下述(A1)～(I1)組成的組中的至少一種寡核苷酸，(A1)包含序列號(hào)2的堿基序列的寡核苷酸、(A2)包含序列號(hào)3的堿基序列的寡核苷酸、(B1)包含序列號(hào)4的堿基序列的寡核苷酸、(B2)包含序列號(hào)5的堿基序列的寡核苷酸、(C1)包含序列號(hào)6的堿基序列的寡核苷酸、(C2)包含序列號(hào)7的堿基序列的寡核苷酸、(D1)包含序列號(hào)8的堿基序列的寡核苷酸、(D2)包含序列號(hào)9的堿基序列的寡核苷酸、(E1)包含序列號(hào)10的堿基序列的寡核苷酸、(F1)包含序列號(hào)11的堿基序列的寡核苷酸、(G1)包含序列號(hào)12的堿基序列的寡核苷酸、(G2)包含序列號(hào)13的堿基序列的寡核苷酸、(H1)包含序列號(hào)14的堿基序列的寡核苷酸、(H2)包含序列號(hào)15的堿基序列的寡核苷酸、(I1)包含序列號(hào)16的堿基序列的寡核苷酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(Al)及(A2 )的寡核苷酸的探針為用于檢測(cè)序列號(hào)1的堿基序列中第730位堿基A的突變(A—G)的探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(Bl)及(B2)的寡核苷酸的探針為用于檢測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第749位堿基G的突變(G—A)的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(Cl)及(C2)的寡核苷酸的探針為用于檢測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第943位堿基A的突變(A—G)的探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(Dl)及944位堿基C的突變(C—T)的探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(El)的C的突變(C—G)的探針。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(Fl)的寡核苷酸的探針為用于檢測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第1052位堿基T的突變(T—C)的探針。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(G1)及1064位堿基A的突變(A—G)的探針。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(H1)及(H2 )的寡核香酸的探針為用于檢測(cè)序列號(hào)l的堿基序列中第1075位堿基T的突變(T—G)的探針。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述包含(Il)的寡核苷酸的探針為用于檢測(cè)序列號(hào)l的堿基中第1187位堿基A的突變(A—G)的探針。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述探針為標(biāo)記探針。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的探針，其中，所述標(biāo)記探針為單獨(dú)時(shí)顯示信號(hào)、通過(guò)形成雜交體不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針，或?yàn)閱为?dú)時(shí)不顯示信號(hào)、通過(guò)形成雜交體顯示信號(hào)的標(biāo)記探針。
13. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的探針，其中，所述標(biāo)記探針為用熒光染料標(biāo)記的探針，單獨(dú)時(shí)顯示熒光，通過(guò)形成雜交體而熒光減弱。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的探針，其中，所述探針中，5，末端或3，末端的i咸基為C,所述末端石威基C^皮標(biāo)記。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的探針，其中，所述探針為Tm分析用探針。
16. —種突變的檢測(cè)方法，其特征在于，其為檢測(cè)abl基因中的突變的方法，該方法包括下述(1 ) ~ ( 3 )工序，(1) 配制反應(yīng)液的工序，所述反應(yīng)液包含含有DNA的樣品與權(quán)利要求1中所述的探針；(2) 改變所述反應(yīng)液的溫度，測(cè)定所述DNA與所述探針的雜交產(chǎn)物顯示熔解狀態(tài)的信號(hào)值的工序；(3 )由伴隨溫度變化的所述信號(hào)值的變化，決定突變的有無(wú)的工序。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的突變檢測(cè)方法，其中，所述樣品 為血液樣 品。
18. —種白血病診斷方法，其為白血病的i貪斷方法，其特征在于，包含通過(guò)權(quán)利要求16所述的突變的檢測(cè)方法，檢測(cè)abl基因中的突變的工序。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的白血病診斷方法，其通過(guò)abl基因的突變來(lái)判斷對(duì)白血病治療藥物的耐性。
20. 根據(jù)^又利要求19所述的白血病"i貪斷方法，其中，所述白血病治療藥物為伊馬替尼。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)用探針，其即使在僅一個(gè)堿基不同的、包含突變的檢測(cè)對(duì)象序列與不含突變的非檢測(cè)對(duì)象序列共存的情況下，也能檢測(cè)所述包含突變的檢測(cè)對(duì)象序列。使用選自由序列號(hào)2～16所組成的組中的至少一種寡核苷酸作為探針。例如通過(guò)在Tm分析中使用這些探針，即便是包含發(fā)生突變的abl基因與未發(fā)生突變的abl基因的樣品，也能檢測(cè)出前者的突變。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101548022SQ20088000083
公開(kāi)日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2008年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月20日
發(fā)明者前川平, 平井光春, 木村晉也, 間島智史 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社