專利名稱：人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工皮膚黑色素瘤組織制作方法，特別是涉及以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、 黑色素瘤細(xì)胞及基質(zhì)材料制作皮膚黑色素瘤組織的方法。
技術(shù)背景惡性黑素瘤(malignantmelanoma， MM)是由皮膚和其它器官的黑素細(xì)胞系統(tǒng)所發(fā)生的 一種惡性程度相當(dāng)高的腫瘤，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移， 一般黑色素瘤患者預(yù)后較差，進(jìn)展期患者平均生 存期僅有6 9個月，是一種嚴(yán)重威脅人們健康和生命的疾病。近年來，在全球范圍內(nèi)該病的 發(fā)病率呈逐年上升趨勢， 一般認(rèn)為可能是由于對紫外線暴露增加的原因，也可能是多種因素 綜合作用導(dǎo)致的結(jié)果。目前，人們對惡性黑素瘤的發(fā)病原因和機(jī)制仍然不甚清楚，從而帶來 了診斷和治療的困難。為此，引起了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高度關(guān)注，國內(nèi)外科學(xué)家對其發(fā)病機(jī)制、診斷 、治療方法的篩選，療效的驗(yàn)證及腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制及其防治等諸多黑素瘤所涉及的相關(guān)因素 進(jìn)行了大量研究和探索。圍繞這些問題的研究和實(shí)驗(yàn)以往大多是在動物體內(nèi)進(jìn)行的(Habib FA，Lobocki C， Ezhuthachan R， et al. Interferon (alpha)2b inhibits the murine melanoma cell line Cloudman S91 in vivo but not in vitro: a model for studying tumor cell-cytokine interactions/discussion. Am Surg 2001 ;67(3) :257-260; 牟霞， 陸洪光，等.B16小鼠惡性黑色素瘤模型的建立中華皮膚科雜志2004;37(10) :613 )。動物試驗(yàn) 會造成大量動物死亡，并且實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較高，實(shí)驗(yàn)周期較長，消耗較大。近年來隨著人們普遍增 長的對動物的保護(hù)意識，用替代性人工腫瘤組織和器官等生物活組織材料進(jìn)行黑素瘤的研究 成為必然。顯然，組織工程腫瘤器官的研究對于最終了解腫瘤的形成機(jī)制、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn) 移，以及探索抗腫瘤方法或藥物都有可預(yù)期的廣闊前景及潛在的理論和實(shí)際應(yīng)用價值。最近該領(lǐng)域的相關(guān)進(jìn)展包括MaaserK(MolBiolcell， 1999; 10: 3067 — 3079)等報道用 異種來源的牛皮膚膠原構(gòu)建三維膠原基質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上種植惡性黑色素瘤細(xì)胞取得成功。 EvesP (BritishJDermatol 2000; 140;210-22)等用人的去細(xì)胞的真皮組織(de-印idermized acellularhumandermis ，簡稱DED)作為基質(zhì)材料，體外培養(yǎng)黑色素瘤組織取得成功。我們用 人的去表皮的真皮組織(humande-印idermizedhumandermis ，簡稱HDED)接種MV3黑色素瘤種 子細(xì)胞體外構(gòu)建黑色素瘤體外模型取得成功(陸洪光;彭琳琳:一種黑色素瘤體外模型的制作 方法，申請?zhí)?00710201275. 1)。以往技術(shù)報告和發(fā)明在一定程度上提供了體外研究皮膚黑
色素瘤的組織器官模型，然而均在不同程度上存在一些不足，尚待進(jìn)一步改進(jìn)和完善1、 Maaser K所構(gòu)建的黑色素瘤組織選用的基質(zhì)材料是用異種牛皮提取的膠原，與人體組 織存在差異。2、 盡管EvesP用人的去細(xì)胞的真皮組織(DED)作為基質(zhì)材料，然而也有一些技術(shù)問題值得 商榷，比如(1)DED制作比較復(fù)雜，用lmol/L氯化鈉處理6 8小時后的真皮表面基底膜成分未有 檢測說明；(2)黑色素瘤種子細(xì)胞專屬于Ghanem's實(shí)驗(yàn)室，來源受限；(3)在黑色素瘤種子細(xì) 胞種植過程中，為防止種子細(xì)胞脫離，需用特定金屬環(huán)固定，給實(shí)際操作帶來了不便，并且不 能確保種子細(xì)胞粘付于DED。3、 2007年我們提出的發(fā)明申請"一種黑色素瘤體外模型的制作方法"(申請?zhí)?200710201275. 1)，克服了以往技術(shù)的不足，制作出一種以人工皮膚為基質(zhì)材料的惡性黑色素 瘤體外模型，并實(shí)施用于腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移的研究，顯示了制作方法簡便、易操作、可重復(fù)性強(qiáng)、便于觀察、干預(yù)和調(diào)控性強(qiáng)等特點(diǎn)。但該模型存在種子細(xì)胞單一(僅有黑色素瘤細(xì)胞 ，缺乏表皮種子細(xì)胞)的情況，在憑估黑素瘤與表皮相互作用過程等有關(guān)的腫瘤形成機(jī)制時，缺 乏一定的表皮組織學(xué)支撐。這是因?yàn)槠つw由表皮，真皮及皮下組織組成。表皮在皮膚的最外層，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞 (keratinocyte)及產(chǎn)生的角蛋白構(gòu)成。角質(zhì)形成細(xì)胞與表皮其它細(xì)胞(如黑素細(xì)胞，朗格漢斯 細(xì)胞)形成皮膚天然保護(hù)屏障，使人體免受各種有害物入侵，維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起 重要作用。而原發(fā)性皮膚黑素瘤大多發(fā)生于表皮和真皮交界處， 一般來說瘤細(xì)胞在此處增生 ，形成微小瘤灶，穿過基底膜侵入真皮。因此，需要一種體外構(gòu)建的理想的皮膚黑色素瘤組織，該組織應(yīng)當(dāng)反映并呈現(xiàn)在體皮膚 黑色素瘤在表皮、基底膜及真皮的組織學(xué)特性。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，以制作一 種以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞及基質(zhì)材料的人工皮膚生長環(huán)境，其上接種惡性黑色素瘤細(xì)胞，構(gòu)建 人工皮膚黑色素瘤組織，為今后的抗腫瘤研究提供可以摸擬在體環(huán)境的人工皮膚黑色素瘤活 組織，以克服現(xiàn)有技術(shù)的存在的不足。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的基本方案是首先建立含有基底膜成分的三維基質(zhì)材料，即 人的去表皮的真皮組織(humande-印idermizedhumandermis ，簡稱HDED)，按照3: l的細(xì)胞比 例先后將角質(zhì)形成細(xì)胞、MV3惡性黑色素瘤細(xì)胞種植于HDED表面，通過液下培養(yǎng)和空氣一液 面培養(yǎng)相聯(lián)合的方式，使角質(zhì)形成細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞在HDED生長，進(jìn)一步構(gòu)建出含有人皮膚
角質(zhì)形成細(xì)胞的皮膚惡性黑色素瘤組織，最后用組織學(xué)及免疫組化技術(shù)方法觀察皮膚惡性黑 色素瘤組織生長情況。人的去表皮的真皮組織制備取健康成人皮膚標(biāo)本，用PBS清洗標(biāo)本表面附著物，常規(guī) 消毒，去除標(biāo)本皮下脂肪組織層，制成lXlcm2的皮片，浸于56。CPBS中30分鐘，然后去除標(biāo) 本表皮，將去除表皮的標(biāo)本置于聚乙烯塑料瓶中，將塑料瓶密封后迅速置入液氮中5分鐘， 取出后室溫放置30分鐘，依此連續(xù)10個循環(huán)后，即得HDED基質(zhì)材料。人角質(zhì)形成細(xì)胞制備健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮。將新鮮標(biāo)本浸入D-Hanks緩沖液 中，4"C保存?zhèn)溆茫?小時內(nèi)使用。將包皮在無菌條件下用PBS (含100u/ml青霉素和100u/ml 鏈霉素)沖洗5遍，眼科剪去除皮下脂肪組織，將包皮剪成約2mmX5mm皮條，浸入2. 5mg/ml Dispase酶中，4"C過夜，共消化16-17個小時。次日取出，PBS沖洗，分離表皮，用O. 25%胰 蛋白酶-O. 0P/。EDTA室溫下消化2 3min，含10。/。FBS的DMEM-F12 (3: 1)終止消化。離心 (1000r/min， 5min)，棄上清，PBS重混懸細(xì)胞，再離心，棄上清。K-SFM混懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì) 數(shù)，KC細(xì)胞密度為(5-6) X105/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育(5%C02， 37°C )，24小時后首次換液。后2 3天換液一次。培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70%-80%融合狀態(tài)時用0. 25%胰蛋 白酶-0. OP/。EDTA消化傳代，按(1-2) X 105/1111接種。人工皮膚黑色素瘤組織制備將HDED置于經(jīng)滅菌處理過的六孔板上，將濃度為2X 10Vml角質(zhì)形成細(xì)胞懸液接種于HDED表面，置于37。C、 5%(]02環(huán)境中孵育2小時，后加6. 7X 10"ml黑色素瘤細(xì)胞懸液于HDED面(角質(zhì)形成細(xì)胞/黑色素瘤細(xì)胞為3: 1)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜 置3小時后，每孔加入5ml的完全培養(yǎng)基，進(jìn)行液下培養(yǎng)，3天后改為氣液界面培養(yǎng)，37°C、 5%(]02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)12-15天，取出，進(jìn)行黑素瘤組織學(xué)檢査上述所用的HDED基質(zhì)材料制備后放于-7(TC冰柜中無菌儲藏備用，應(yīng)用前-7(TC， -20°C ，-4°C，室溫，依次解凍。在接種前浸于完全培養(yǎng)基中，在37'C、 57。C02環(huán)境中浸泡24小時 ，以便種子細(xì)胞接種后生長。上述角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基是角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(KC-SFM)，購于Gibco公司。由于角質(zhì)形成細(xì)胞要求量較大，為使角質(zhì)形成細(xì)胞增量生長，在角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng) 基中加添加重組表皮生長因子和牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extract, BPE)。上述過程中，取2-3代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，用胰酶常規(guī)消化下來后，用完全培養(yǎng)基制 成單細(xì)胞懸液，接種時角質(zhì)形成細(xì)胞懸液濃度為2Xl()5/ml，根據(jù)應(yīng)用時實(shí)際情況進(jìn)行細(xì)胞 濃度調(diào)整。
上述所用的黑色素瘤細(xì)胞是MV3黑色素瘤細(xì)胞。MV3黑素瘤細(xì)胞來源人的黑色素瘤的淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞，是一個具有高度侵襲性的細(xì)胞株。黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)基是RPMI-1640培養(yǎng)基 ，購于Gibco公司。由于黑色素瘤細(xì)胞要求量較大，在進(jìn)行黑色素瘤細(xì)胞接種前，先進(jìn)行黑色素瘤細(xì)胞的增量 生長培養(yǎng)，培養(yǎng)方法是將黑色素瘤細(xì)胞接種于加10。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基/F12營養(yǎng)液( 3: 1)的完全培養(yǎng)基中，于37。C、 5%(]02環(huán)境中培養(yǎng)，每2天換液一次，待細(xì)胞長至80%融 合狀態(tài)時吸去完全培養(yǎng)基，以PBS液清洗兩遍，加入0.25%胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼 壁細(xì)胞l分鐘后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，將含有細(xì)胞的混合液以800 轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘收集黑色素瘤細(xì)胞，重懸于完全培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，分成3 4份 接種于無菌培養(yǎng)瓶中，于37。C、 5%(]02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞的貼壁率為85%以上。人工皮膚黑色素瘤的完全培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基與F12營養(yǎng)液以3: l比例混合，加新鮮 10%胎牛血清制成。所述培養(yǎng)的黑色素瘤細(xì)胞，用胰酶常規(guī)消化下來后，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，接 種時濃度為6. 7X104/ml，根據(jù)應(yīng)用時實(shí)際情況進(jìn)行細(xì)胞濃度調(diào)整。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在黑色素瘤制作過程中加入人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，從而構(gòu)建了 更為貼近人皮膚微環(huán)境的黑色素瘤組織，經(jīng)組織學(xué)方法觀察顯示黑色素瘤細(xì)胞侵襲性生長更 加顯著，在HDED表面及真皮附屬器管腔內(nèi)中形成明顯瘤灶或瘤團(tuán)，符合惡性黑色素瘤細(xì)胞在 人體皮膚真皮內(nèi)浸潤分布特點(diǎn)，并且反映黑素瘤組織細(xì)胞的標(biāo)記物呈陽性反應(yīng)，說明本發(fā)明 構(gòu)建的人工皮膚黑色素瘤組織能夠呈現(xiàn)在體皮膚黑色素瘤在表皮、基底膜及真皮的某些組織 學(xué)特性。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞及去表皮的真皮組織，其上接種惡性黑 色素瘤細(xì)胞，構(gòu)建人工皮膚黑色素瘤組織，其制作方法如下取健康成人皮膚標(biāo)本，常規(guī)消毒，用眼科剪小心去除皮下脂肪組織層。將剩余組織制成 lXlcm2的皮片后浸于56。CPBS液中30分鐘。取出后用鑷子小心的撕去表皮。將去表皮的真皮 組織置于聚乙烯塑料瓶中，將其迅速置入液氮中5分鐘，取出后室溫放置30分鐘，再置入液 氮中5分鐘，依此方式連續(xù)10個循環(huán)后，即得HDED基質(zhì)材料。經(jīng)此處理后的HDED中細(xì)胞成分 被殺死，含有基底膜成分。接種前首先將HDED進(jìn)行預(yù)處理，方法是浸于DMEM中，在37。C、 5%(]02環(huán)境中浸泡2處 待用；角質(zhì)形成細(xì)胞為取自健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮，通過Dispase酶分離表皮，胰蛋白 酶消化等步驟，得到表皮細(xì)胞懸液，用K-SFM角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 (5%C02， 37°C)角質(zhì)形成細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70%-80%融合狀態(tài)時用0.25%胰蛋白酶 -0. 0P/。EDTA消化傳代。選2-3代角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行接種，接種時將HDED置于經(jīng)滅菌處理過的 六孔板上，將濃度為2X10Vml角質(zhì)形成細(xì)胞懸液接種于HDED表面，置于37。C、 5%(]02環(huán)境中 孵育2小時，后加6. 7X 1()4/ml黑色素瘤細(xì)胞懸液于HDED面(使角質(zhì)形成細(xì)胞/黑色素瘤細(xì)胞為 3: 1)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3小時后，每孔加入5ml的完全培養(yǎng)基，進(jìn)行液下培養(yǎng)，3天后改為 氣液界面培養(yǎng)，37°C、 5%(]02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)12-15天后取出， 進(jìn)行黑素瘤組織學(xué)及免疫組化學(xué)檢査。本發(fā)明對經(jīng)過如上方法制得的人工皮膚黑色素瘤組織學(xué)及免疫組化檢測1. 常規(guī)石蠟切片10%甲醛溶液固定標(biāo)本，4'C過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟 ，包埋，石蠟連續(xù)切片，4ym，烘干。2. 蘇木素-伊紅染色組織切片浸于二甲苯、95%酒精中脫蠟，各兩次，5分鐘/次。蘇 木素浸染15min，流水沖洗，鹽酸酒精分化片刻，流水沖洗，氨水返藍(lán)片刻，流水沖洗，伊 紅酒精染色片刻，流水沖洗，選片，95%酒精分化兩次，5分鐘/次。烘干后封片。3. 免疫組化染色采用EnVision二步法測定S-100蛋白和HMB45的表達(dá)。脫蠟，熱修復(fù) 。蒸餾水漂洗，置于PBS中。滴加3%的11202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵育10min。蒸餾水漂洗 ，置于TBS漂洗10min， 一抗(分別為兔抗人S-100和鼠抗人HMB45)孵育60min， TBS漂洗 10min。 二抗(分別為羊抗兔和羊抗鼠)孵育30min， TBS漂洗10min。 DAB顯色，蒸餾水漂洗 ，蘇木素復(fù)染，封片。人工皮膚黑色素瘤組織學(xué)及免疫組化檢測結(jié)果如下1. 蘇木素-伊紅染色結(jié)果在光學(xué)顯微鏡下觀察到MV3黑色素瘤細(xì)胞在HDED表面形成大小 不等的瘤灶，其間間雜少許角質(zhì)形成細(xì)胞。黑素瘤細(xì)胞穿過基底膜侵入真皮組織，在HDED底 面及側(cè)面，瘤細(xì)胞呈單個細(xì)胞的彌散狀浸潤。細(xì)胞核深染，瘤細(xì)胞核分裂多見，增殖明顯。在 皮膚附屬器管腔內(nèi)，瘤細(xì)胞呈帶狀、環(huán)形附著于管壁上，部分區(qū)域穿過管壁進(jìn)入附屬器周邊 真皮組織。2. S-100蛋白免疫組化染色人工皮膚黑色素瘤組織中黑色素瘤細(xì)胞漿和胞膜均染成棕 黃色，顯示黑色素瘤S-100蛋白陽性表達(dá)。3. HMB45免疫組化染色人工皮膚黑色素瘤組織中黑色素瘤細(xì)胞漿和胞膜呈淺棕黃色， 顯示黑色素瘤HMB45弱陽性表達(dá)。結(jié)論蘇木素-伊紅染色顯示在HDED表面，附屬器管腔內(nèi)有大量黑素瘤細(xì)胞形成的瘤團(tuán)
、瘤灶。并且黑素瘤細(xì)胞穿過基底膜侵入真皮組織內(nèi)，細(xì)胞核深染，瘤細(xì)胞核分裂多見，增殖 明顯。形態(tài)學(xué)的結(jié)果表明人工皮膚黑色素瘤組織構(gòu)建成功。S-100和HMB-45在醫(yī)學(xué)臨床上是用于診斷黑色素瘤的組織標(biāo)記物。本發(fā)明顯示體外構(gòu)建的人工皮膚黑色素瘤組織表達(dá)s-ioo蛋白與HMB45，說明該發(fā)明構(gòu)建的黑色素瘤組織能夠反映在體黑素瘤的組織學(xué)標(biāo)記特征。
權(quán)利要求
權(quán)利要求1一種人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征在于首先在去表皮真皮組織上接種人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞；然后采用液下培養(yǎng)和空氣—液面培養(yǎng)相聯(lián)合的方式，使角質(zhì)形成細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞在HDED生長，構(gòu)建出含有人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的皮膚惡性黑色素瘤組織；最后用組織學(xué)及免疫組化技術(shù)方法觀察皮膚惡性黑色素瘤組織生長情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于在去表皮真皮組織上接種人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞與黑色素瘤細(xì)胞的比例為3: 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于液下培養(yǎng)和空氣一液面培養(yǎng)相聯(lián)合的方式是在5。/。C02、 37。C無菌條件下進(jìn)行的，其操 作過程如下將HDED置于經(jīng)滅菌處理過的六孔板上，將濃度為2X105/ml角質(zhì)形成細(xì)胞懸液 接種于HDED表面，置于37。C、 5呢C02環(huán)境中孵育2小時，后加6. 7X 104/ml黑色素瘤細(xì)胞懸液于 HDED面，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3小時后，每孔加入5ml的完全培養(yǎng)基進(jìn)行液下培養(yǎng)，3天后改為氣 液界面培養(yǎng)，37°C、 5 7。C02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)12-15天，取出后即 進(jìn)行黑素瘤組織學(xué)檢査。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其 特征在于所述的黑色素瘤細(xì)胞是MV3黑色素瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于去表皮真皮組織制備方法如下取健康成人皮膚標(biāo)本，用PBS清洗標(biāo)本表面附著物， 常規(guī)消毒，去除標(biāo)本皮下脂肪組織層，制成lXlcm2的皮片，浸于56。CPBS中30分鐘，然后去 除標(biāo)本表皮，將去除表皮的標(biāo)本置于聚乙烯塑料瓶中，將塑料瓶密封后迅速置入液氮中5分 鐘，取出后室溫放置30分鐘，依此連續(xù)10個循環(huán)后，即得HDED基質(zhì)材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞制備方法如下首先取健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮，將新鮮標(biāo) 本浸入D-Hanks緩沖液中，4"C保存?zhèn)溆茫?小時內(nèi)使用；其次將包皮在無菌條件下用PBS沖洗 5遍，剪除皮下脂肪組織，并剪成約2mmX5mm皮條，浸入O. 25% Dispase酶中，4'C共消化16 -17個小時，次日取出后PBS沖洗，分離表皮，用0.25%胰蛋白酶-0.0P/。EDTA室溫下消化2 3min，含10。/。FBS的DMEM-F12 (3: 1)終止消化；然后進(jìn)行離心(1000r/min， 5min)及棄上清 操作，PBS重混懸細(xì)胞，再離心、棄上清，使K-SFM混懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，KC細(xì)胞密度為 (5-6) X105/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，24小時后首次換液，后2 3天換液一次，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70%-80%融合狀態(tài)時用0. 25%胰蛋白酶-0. OP/。EDTA消化傳代，按 (1-2) X105/ml接種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其 特征在于所述接種的角質(zhì)形成細(xì)胞濃度為2X 105/ml，黑素瘤細(xì)胞濃度為6. 7X 104/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于所述的完全培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基與F12營養(yǎng)液以3: l比例混合，加新鮮10%胎牛血清配 制。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于所述的HDED基質(zhì)材料制備后放于-7(TC冰柜中無菌儲藏備用，應(yīng)用前-7(TC， -20°C， -4°C，室溫，依次解凍；在接種前浸于完全培養(yǎng)基中，在37'C、 5 7。C02環(huán)境中浸泡24小時。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人工皮膚黑色素瘤組織制作方法，包括人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)，生物基質(zhì)材料制備(HDED)，分別先后在生物基質(zhì)材料上接種人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞，通過液下培養(yǎng)、空氣-液面孵育相聯(lián)合的方式，用一定的培養(yǎng)基在5％CO₂、37℃無菌條件下，培育和構(gòu)建皮膚黑色素瘤組織，用組織學(xué)及免疫組化技術(shù)方法觀察皮膚惡性黑色素瘤組織生長情況。本發(fā)明構(gòu)建了更為貼近人皮膚微環(huán)境的黑色素瘤組織，經(jīng)組織學(xué)方法觀察顯示黑色素瘤細(xì)胞侵襲性生長顯著，在HDED表面及真皮附屬器管腔內(nèi)中形成明顯瘤灶或瘤團(tuán)，符合惡性黑色素瘤細(xì)胞在人體皮膚真皮內(nèi)浸潤分布特點(diǎn)，并反映黑素瘤組織細(xì)胞的標(biāo)記物呈陽性反應(yīng)。
文檔編號C12N5/08GK101392238SQ20081030550
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者卜曉琳, 陸洪光 申請人:陸洪光