一種黑色素瘤細(xì)胞粘附分子拮抗劑多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚及其應(yīng)用，具體設(shè)及特異性抑制腫 瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多膚。
【背景技術(shù)】
[0002] 1971年化化man提出腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴新生血管生成。并認(rèn)為實(shí)體瘤形成后， 其發(fā)展可分為無(wú)血管期和血管期兩個(gè)階段。無(wú)血管期，微小腫瘤的存在依靠周?chē)g質(zhì)彌散 供血，生長(zhǎng)速度呈線性，腫瘤限制在1mm~2mm之內(nèi)，瘤細(xì)胞數(shù)少于10 5~10 6個(gè)，迫使腫瘤 處于"休眠狀態(tài)";進(jìn)入血管期后，腫瘤組織為灌注性供血，瘤體呈指數(shù)性生長(zhǎng)，2周后可增大 1. 6萬(wàn)倍。新生血管不僅提供腫瘤所需要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，排除代謝產(chǎn)物，而且是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的 途徑。因此，阻斷腫瘤新生血管形成就可能阻止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，抗新生血管療法也成為腫 瘤治療的手段之一。
[0003] 血管內(nèi)皮與基質(zhì)細(xì)胞黏附分子對(duì)腫瘤血管生成的作用越來(lái)越受到關(guān)注。黑色素瘤 細(xì)胞粘附分子（melanoma cell a化esion molecule，MCAM)是重要的細(xì)胞黏附蛋白，研究報(bào) 道黑色素瘤細(xì)胞粘附分子是一個(gè)新的腫瘤血管標(biāo)志分子，特異表達(dá)在腫瘤新生血管并參與 腫瘤血管生成。黑色素瘤細(xì)胞粘附分子具有膜受體的功能，參與VEGF調(diào)節(jié)血管生成過(guò)程。 研究發(fā)現(xiàn)腫瘤分泌物中的某種因子能夠誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞粘附分子二聚化，通過(guò)P38MAPK 信號(hào)通路活化NF- K B，上調(diào)多種促血管生成基因（VEGF、比-8、ICAM-1、MMP9)的表達(dá)，從而 促進(jìn)腫瘤血管的生成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CD146中和抗體AA98或CD146siRNA都能夠顯著抑 制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，W及多種腫瘤（肝癌、黑色素瘤、肉瘤）的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因 此，抑制黑色素瘤細(xì)胞粘附分子可W有效抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，使腫瘤處 于"休眠狀態(tài)"。
[0004] 目前，沒(méi)有成熟開(kāi)發(fā)的黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚問(wèn)世，用于治療惡性腫 瘤。
[0005] 本專利中的黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚已證明在治療黑色素瘤中有效，具 有在其他腫瘤模型中開(kāi)發(fā)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚，特異性抑 制腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，對(duì)惡性腫瘤具有很好的療效。
[000引技術(shù)方案
[0009] 黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚，其特征在于其序列為HFSISGVECTVLVTPKLPE。
[0010] 所述的黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
[0011] 一種檢測(cè)黑色素瘤的試劑盒，其含有所述的黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚。
[0012] 所述的試劑盒，其特征在于還有
[0013] (1)包被液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0014] (2) PBS緩沖液；pH7. 4的0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液；
[0015] (3)抗體稀釋液；pH7. 4 的 0. 02mol/LPBS 和 0. 2% BSA ;
[0016] (4)封閉液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA
[0017] (5)洗漆液；0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0. 05% Tween-20 ;
[0018] (6)底物液；可溶性單組份TMB底物溶液；
[0019] (7)終止液；2mol/L硫酸溶液；
[0020] (8)黑色素瘤細(xì)胞粘附分子抗體；
[0021] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0022] 有益效果
[0023] 利用固相合成法化學(xué)合成黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚，該多膚具有全新的 序列，該多膚可祀向識(shí)別腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，并在體外抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，治療惡性腫 瘤，如黑色素瘤。我們發(fā)現(xiàn)的黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚可W同時(shí)抑制血管內(nèi)皮細(xì) 胞遷移活力，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】[0024] 實(shí)施例1
[0025] 黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚人血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。
[0026] 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。先用marker筆在24孔板背后，用直尺比著，均勻得劃?rùn)M線，大約每 隔0. 5~1cm -道，橫穿過(guò)孔。每孔穿過(guò)3條線；將成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HUVEC細(xì)胞，W 1. 0X 1〇5 加入24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2化。第二天用10 y 1槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，W 劃痕和背后橫線的交叉點(diǎn)為固定觀察位點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的 實(shí)驗(yàn)藥物黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚（上海生工合成）和陽(yáng)性對(duì)照藥物長(zhǎng)春新堿； 空白組加入相同體積的溶劑，每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔；放入37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0，6，12， 24，36小時(shí)，拍照；測(cè)量0，6，12，24，3化劃痕寬度。W不同的時(shí)間點(diǎn)，記錄每孔S個(gè)固定位置 處劃痕寬度的變化，即為細(xì)胞遷移距離。按照公式計(jì)算遷移率（migration rate,MR);遷移 率（MR)=(實(shí)驗(yàn)第n小時(shí)的劃痕寬度一實(shí)驗(yàn)第0小時(shí)的劃痕寬度）X 100% /實(shí)驗(yàn)第0小時(shí) 的劃痕寬度。結(jié)果，隨黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚濃度增加，遷移抑制率逐漸下降， 說(shuō)明黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚能夠抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，抑制率為57. 4%。
[0027] 實(shí)施例2
[002引黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚對(duì)體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活 IC50。
[0029] 采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，W 1. 0X 105加入96孔培 養(yǎng)板中，培養(yǎng)2化，實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物黑色素瘤細(xì)胞粘 附分子括抗劑多膚（上海生工合成）和陽(yáng)性對(duì)照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。 每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)4她，分別在化、2h、她、1化、2化、2化、3化、，4她每孔加入MTT，作用化 后，加入DMS0,解育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測(cè)定吸光度A值，按公式HUVEC生長(zhǎng)抑制率= (1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值）X 100%。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為35. 09 y M。
[0030] 實(shí)施例3
[0031] 用腫瘤模型檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚的體內(nèi)活力。
[0032] 建立黑色素瘤腫瘤模型，陽(yáng)性對(duì)照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn) 組多膚（上海生工合成）設(shè)3個(gè)劑量；0.75、1.5、3111肖/蛇。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì) 算存活率。結(jié)果顯示，黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤小 鼠的生存率，生存率達(dá)到62. 87 %。
[0033] 實(shí)施例4含有黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚的化ISA試劑盒檢測(cè)；
[0034] 酶連免疫吸附實(shí)驗(yàn)巧LISA)試劑盒包括如下試劑：
[003引 （1)包被液；0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（P冊(cè).6)。稱取0. 75g碳酸鋼，1. 46g碳酸氨 鋼，加去離子水定容至500ml ;
[0036] (2)PBS緩沖液；0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0. 2g磯酸二氨鐘，2. 90g 磯酸氨二鋼，8g氯化鋼，加去離子水定容到1000ml ;
[0037] (3)抗體稀釋液；0. 02mol/LPBS (pH7. 4)和0. 2% BSA。稱取0. 2濁SA加入配好的 0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[003引 （4)封閉液；0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2. 0% BSA。2. 0濁SA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0039] (5)洗漆液；0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0. 05 % Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 lOOml0.0 2mol/L磯酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0040] (6)底物液；可溶性單組份TMB底物溶液；
[0041] (7)終止液；2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0042] (8)黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚
[0043] (9)黑色素瘤細(xì)胞粘附分子抗體購(gòu)自上海一研生物科技有限公司
[0044] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購(gòu)自艾美捷科技有限公司
[0045] 使用方法；1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進(jìn)行眼眶取血，每只200化，迅速 離屯、12000巧m 3min，取上清，按體積比1 ;2加PBS，80°C水浴30min，12000巧m 3min取上 清，-20°C凍存?zhèn)溆谩?、黑色素瘤細(xì)胞粘附分子抗體為包被抗體，將黑色素瘤細(xì)胞粘附分子 抗體溶于包被稀釋液中，濃度為100 yg/mL。96孔酶標(biāo)板每孔加入100 包被過(guò)夜。 棄去包被液，加入封閉液200 y以37°C封閉比。棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血 清樣本100 y L(稀釋比1 ;50)和黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚100 y L(l〇 y g/ml)及 上述血清樣本50 y L和黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚50 y L的混合物，分成3組，37°C 解育比。棄去血清，PBST和自來(lái)水間隔洗漆S次。洗漆后，每孔加入樣品稀釋液稀釋酶標(biāo) 二抗100化（稀釋比1:10000)，37°C解育比。棄去二抗，洗漆。洗漆后，每孔加入100化 底物液（50yL底物A，50yL底物B)，37°C反應(yīng)30min后，加入50yL 2M肥S04終止反應(yīng)， 用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的光密度值0D450nm。結(jié)果；黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗 劑多膚可W和黑色素瘤細(xì)胞粘附分子抗體結(jié)合，并可W競(jìng)爭(zhēng)血清中黑色素瘤細(xì)胞粘附分子 括抗劑，故說(shuō)明黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括抗劑多膚用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞粘附分子括 抗劑，實(shí)現(xiàn)腫瘤預(yù)測(cè)；
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 黑色素瘤細(xì)胞粘附分子拮抗劑多肽，其特征在于其序列為HFSISGVECTVLVTPKLPE。
2. 如權(quán)利要求1所述的黑色素瘤細(xì)胞粘附分子拮抗劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物 中的應(yīng)用。
3. -種檢測(cè)黑色素瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的黑色素瘤細(xì)胞粘附分子拮抗 劑多肽。
4. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA (5) 洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 黑色素瘤細(xì)胞粘附分子抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專利摘要】本發(fā)明一種黑色素瘤細(xì)胞粘附分子拮抗劑多肽及其應(yīng)用，涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及抑制腫瘤血管生成，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為HFSISGVECTVLVTPKLPE是全新的序列，它們可以在體外特異性抑制腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，抑制腫瘤血管生成，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】A61P35-00, G01N33-68, G01N33-574, C07K7-08, A61K38-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104725483
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510158834
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請(qǐng)人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月6日