專利名稱：抗urg11單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及基因工程，特別是抗URGll單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞(3D2)。
背景技術(shù)：
目前研究顯示，URGll是利用抑制消減雜交及全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增技術(shù)(RACE-PCR)克隆 的一個(gè)可以被HBx蛋白上調(diào)新基因，此基因全長(zhǎng)3074bp，編碼區(qū)為2022個(gè)堿基對(duì)，含有13 個(gè)外顯子，編碼673個(gè)氨基酸(圖1)、分子量為70KD的蛋白。 經(jīng)NIH人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比較，此基因定位在人類11號(hào)染色體(圖2)，基因庫(kù) 比較無(wú)同源基因，為一新基因。蛋白質(zhì)綜合信息庫(kù)分析(SWISSPROT):①具有一個(gè)穿膜螺 旋(Transmembrane helices :281-297);②發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)血管黏附分子結(jié)構(gòu)域(VWC Domain, Von Willebrand factortype C)， 一個(gè)植物凝集素結(jié)構(gòu)域(Lectin Domain)，推測(cè)此分子可 能和腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及轉(zhuǎn)移有關(guān)；③末端有眾多酪氨酸，(Long tyrosinesin tail)可能有 多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。目前研究顯示，正義URG11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系H印G2，可增強(qiáng)H印G2細(xì) 胞系體外增殖能力，促進(jìn)H印G2細(xì)胞的周期由Gl期向S期進(jìn)展，促進(jìn)肝癌細(xì)胞軟瓊脂中非 錨定生長(zhǎng)能力。和空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，正義轉(zhuǎn)染的H印G2細(xì)胞體內(nèi)SCID小鼠成瘤能 力增強(qiáng)，荷瘤成活時(shí)間縮短。更重要的是將此基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞，可促進(jìn)P-連接蛋白 (e-catenin)的表達(dá)。因胞漿內(nèi)的骨架蛋白P-catenin不僅在維持細(xì)胞正常形態(tài)及介導(dǎo) 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，還是與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)的Wnt (APC/ 13 -catenin/Tcf/ Lef)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子。URG11通過(guò)促進(jìn)P-catenin的轉(zhuǎn)錄增加蛋白的表達(dá)而 上調(diào)P-catenin，胞漿中P-catenin表達(dá)升高后聚集而進(jìn)入核內(nèi)，從而引起一系列的靶基 因的上調(diào)。現(xiàn)有研究初步表明URG11可能是一癌基因，并可能成為癌癥治療的靶基因，目前 雖然發(fā)現(xiàn)了不少癌癥治療的靶基因，但臨床效果均不理想，有待更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)更多 或臨床效果更好的治療癌癥的靶基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制作一種抗URG11單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞，它能穩(wěn)定分泌 抗URGll單抗的雜交瘤細(xì)胞株(3D2)，進(jìn)一步研究URG11的功能，用于癌癥治療的研究。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種抗URGll單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞，它的保 藏號(hào)為CGMCCN0. 1907的雜交瘤細(xì)胞株。 所述的保藏號(hào)為CGMCCN0. 1907的雜交瘤細(xì)胞株用于分泌抗URG11單抗的雜交瘤 細(xì)胞株。 所述的保藏號(hào)為CGMCCN0. 1907的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法是取血清效價(jià)大于 1 : 32000的小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50% PEG-4000進(jìn)行融合；用 含1XHAT和20X小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)，融合后三天開(kāi)始出現(xiàn)融合細(xì)胞，以連接BSA 牛血清蛋白的多肽包被，通過(guò)ELISA法篩選；同時(shí)配合Western blot法，凡上述兩種方法陽(yáng) 性的雜交瘤細(xì)胞予保留，通過(guò)四次有限稀釋克隆，最后獲得一株穩(wěn)定分泌抗URGll單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)記為3D2。 本發(fā)明通過(guò)以URGll蛋白的多肽為免疫原，應(yīng)用現(xiàn)有的單克隆抗體制備技術(shù)(根 據(jù)金伯泉主編，《細(xì)胞和分子免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)》，西安，第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2002年)得 到一株能穩(wěn)定分泌抗URG11單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3D2)。應(yīng)用此株雜交瘤細(xì)胞以 IX 106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先用液體石蠟致敏8-10周齡的BALB/C雌性小鼠，10-14天 后采集腹水，以連接BSA(牛血清蛋白)的多肽包被，通過(guò)ELISA法檢測(cè)腹水陽(yáng)性，并用此腹 水行Western blot法證明其能識(shí)別變異的URG11蛋白，同時(shí)將此腹水用于行免疫組化證明 其能識(shí)別自然的URG11蛋白。此株雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗為進(jìn)一步研究新基因URG11奠定 了基礎(chǔ)，同時(shí)擬進(jìn)一步研究此單抗的功能，以期能根據(jù)此單抗通過(guò)人工合成治療癌癥的抗 人URGll蛋白的單抗片斷，達(dá)到擴(kuò)大臨床癌癥治療方法的目的。


下面結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1是多肽質(zhì)譜圖； 圖2是用Western blot法檢測(cè)URG11在不同細(xì)胞中的表達(dá)；
圖3是用免疫組化檢測(cè)URG11蛋白在胃癌組織中的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
1、抗原根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)(Lian Z， Liu J， Li L， Li X， TufanNL， Clayton M，
Wu MC， Wang HY， Arbuthnot P， Kew M， and FeitelsonMA :Upregulated expression
of a unique gene by hepatitis B_antigen promotes hepatocellular growth and
tumorigenesis. Neoplasia 2003;5:229-244.)中的多肽序列(HPPDGSFSTFHKGPQPLEDPC)，
通過(guò)人工合成多肽如圖l所示，并將此多肽分別連接血藍(lán)蛋白(p印tide-KLH)或牛血清蛋
白(p印tide-BSA)，并以連接KLH的多肽做為抗原。 2、免疫以連KLH的多肽免疫BALB/C小鼠(4-8周齡，雌性)。第一次免疫取0.5ml p印tide-KLH(濃度240ug/ml)與等體積的福氏完全佐劑
混勻后，多點(diǎn)皮下注射BALB/C小鼠； 第二次免疫隔3周后，取0. 5ml p印tide-KLH(濃度240ug/ml)與等體積的福氏 不完全佐劑混勻后，多點(diǎn)皮下注射BALB/C小鼠； 第三次免疫再隔3周后，取0. 5ml p印tide-KLH(濃度240ug/ml)與等體積的生 理鹽水混勻后，腹腔注射BALB/C小鼠；第三次免疫的10天后取小鼠尾靜脈以連接BSA(牛 血清蛋白)的多肽包被，通過(guò)ELISA法測(cè)定血清效價(jià)，取效價(jià)大于1 : 32000的小鼠的脾細(xì) 胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；第四次免疫融合前3天，取0. 5ml p印tide-KLH(濃度240ug/ml)與等體積的生
理鹽水混勻后，腹腔注射要融合的BALB/C小鼠。 福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑均使用商品化產(chǎn)品。 3、雜交瘤細(xì)胞株的制備和篩選 取血清效價(jià)大于l : 32000的小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用 50% PEG-4000進(jìn)行融合。用含1XHAT和20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。融合后三天
4開(kāi)始出現(xiàn)融合細(xì)胞，以連接BSA(牛血清蛋白)的多肽包被，通過(guò)ELISA法篩選；同時(shí)配合 Western blot法，凡上述兩種方法陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞予保留，通過(guò)四次有限稀釋克隆，最后 獲得一株穩(wěn)定分泌抗URG11單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)記為3D2。
4、腹水的制備及抗體亞型的鑒定 將3D2雜交瘤細(xì)胞株以1 X 106個(gè)/只的量腹腔注射預(yù)先用液體石蠟致敏8_10周 齡的BALB/C雌性小鼠，10-14天后采集腹水，以連接BSA(牛血清蛋白)的多肽包被，通過(guò) ELISA法檢測(cè)腹水陽(yáng)性，并用此腹水行Western blot法證明其能識(shí)別變異的URG11蛋白如 圖2所示，同時(shí)將此腹水用于行免疫組化證明其能識(shí)別自然的URG11蛋白如圖3所示，圖 3是用免疫組化檢測(cè)URG11蛋白在胃癌組織中的表達(dá)。Al和A2(B1和B2)是同一個(gè)標(biāo)本； (Al)用腹水X200 ;(A2)用骨髓瘤細(xì)胞上清做為陰性對(duì)照X200 ;(B1)用腹水X200 ;(B2) 用骨髓瘤細(xì)胞上清做為陰性對(duì)照X200。 用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙夾心ELISA確定細(xì)胞株3D2分泌的抗體亞型為IgG2a/
本發(fā)明中未提及部分為本行業(yè)公知技術(shù)，在此不作過(guò)多說(shuō)明。 本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所用的菌種是申請(qǐng)人在2007年1月11日在《中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心》保藏的用于分泌抗URG11單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分類命名 為雜交瘤細(xì)胞，它的保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCCNO. 1907。
權(quán)利要求
抗URG11單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞，它的保藏號(hào)為CGMCCNO.1907的雜交瘤細(xì)胞株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗URGll單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞，其特征是所述的 保藏號(hào)為CGMCCNO. 1907的雜交瘤細(xì)胞株用于分泌抗URG11單抗的雜交瘤 細(xì)胞株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗URGll單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞，其特征是所述的 保藏號(hào)為CGMCCNO. 1907的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法是取血清效價(jià)大于1 : 32000的小鼠 的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50% PEG-4000進(jìn)行融合；用含IXHAT和20% 小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)，融合后三天開(kāi)始出現(xiàn)融合細(xì)胞，以連接BSA牛血清蛋白的多肽 包被，通過(guò)ELISA法篩選；同時(shí)配合Western blot法，凡上述兩種方法陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞予 保留，通過(guò)四次有限稀釋克隆，最后獲得一株穩(wěn)定分泌抗URGll單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株，標(biāo)記為3D2。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及基因工程，特別是抗URG11單克隆抗體的一株雜交瘤細(xì)胞(3D2)，它的保藏號(hào)為CGMCC NO.1907的雜交瘤細(xì)胞株。所述的保藏號(hào)為CGMCC NO.1907的雜交瘤細(xì)胞株用于分泌抗URG11單抗的雜交瘤細(xì)胞株。它能穩(wěn)定分泌抗URG11單抗的雜交瘤細(xì)胞株(3D2)，進(jìn)一步研究URG11的功能，用于癌癥治療的研究。
文檔編號(hào)C12N5/20GK101735989SQ200810232138
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者劉杰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院