專利名稱：一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病mplw515k突變的試劑盒及其專用引物與探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的試劑盒及其專用引 物與探針。
技術(shù)背景骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders, MPDs)是一組造血干細(xì)胞腫瘤 增生性疾病，在骨髓細(xì)胞普遍增生的基礎(chǔ)上有一個(gè)系列細(xì)胞尤其突出，呈持續(xù) 不斷的過度增殖。臨床上根據(jù)增生為主細(xì)胞系列的不同分為4種①以紅細(xì)胞 系增生為主者，稱真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemiavera， PV);②以粒細(xì)胞系 增生為主者，稱慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML);③ 以巨核細(xì)胞系增生為主者，稱原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia， ET);④以原纖維細(xì)胞增生為主者，稱原發(fā)性骨髓纖維化癥(idiopathic myelofibrosis, IMF)。其中，95%的CML患者存在BCR/ABL融合基因，PCR-BCR/ABL 檢測(cè)已成為用于CML診斷的常規(guī)項(xiàng)目，而其余三種MPDs分別是影響紅細(xì)胞、巨核 細(xì)胞、血小板及骨髓微環(huán)境的惡性腫瘤，長(zhǎng)期以來，未發(fā)現(xiàn)特異的分子診斷標(biāo)志。近年來，有關(guān)MPDs發(fā)病機(jī)理研究的主要進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)部分PV、 IMF和ET患者具 有JAK2V617F突變，該突變是后天獲得性的髓系細(xì)胞中JAK2激酶自氨基末端第617 位氨基酸殘基由纈氨酸(V)突變?yōu)楸奖彼?F)，造成JAK2激酶活性增加，細(xì) 胞生長(zhǎng)信號(hào)系統(tǒng)獲得活化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。這一發(fā)現(xiàn)，不僅使快速、可靠、 準(zhǔn)確診斷MPDs成為可能，而且可針對(duì)JAK2V617F突變開發(fā)出與格列衛(wèi)類似的新的 靶向療法(格列衛(wèi)目前正在被用來治療慢性髓性白血病)，將為治療MPDs提供一 種新的治療方法。目前，己發(fā)現(xiàn)74-97%以上的PV、 23-57X的ET以及35-95%的 IMF患者中JAK2V617F突變的檢測(cè)結(jié)果呈陽性。在慢性髓性單核細(xì)胞白血病(C麗L)、 慢性中性粒細(xì)胞白血病(CNL)和急性髓性白血病(旭L,尤其是M2、 M6、 M7型)患 者中，該突變的檢測(cè)陽性率可達(dá)13-18% (其中CNL、 C麗L已被世界衛(wèi)生組織新的 分型歸為MPD及MPD/MDS);而在急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血 病(CLL)、慢性髓性白血病及繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥等疾病患者中，該突變的檢測(cè) 結(jié)果為陰性，JAK2V617F突變的檢測(cè)已廣泛用于白血病的鑒別和診斷中。但在MPDs病人中，仍然有相當(dāng)一部分病人JAK2V617F突變是陰性的，缺乏特異的分子診斷標(biāo)志o近一年來，MPDs研究出現(xiàn)了重要的進(jìn)展，在JAK2V617F突變陰性的患者中發(fā)現(xiàn) 存在MPL (myeloproliferative leukemia virus oncogene homology, MPL)突變(包括 MPLW515L突變和MPLW515K突變)。MPL突變?cè)贘AKV617F突變陰性的MF和ET患者 中約占5-10%。 MPLW515K突變是MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸編碼的密碼子 由TGG突變?yōu)锳AG，導(dǎo)致MPL編碼的氨基酸在該處由色氨酸(密碼子TGG)突變?yōu)?賴氨酸(密碼子AAG)。與JAK2V617F突變檢測(cè)一樣，MPLW515K突變的檢測(cè)也為明 確MPDs診斷提供了可靠依據(jù)，還有可能作為治療MPDs的一個(gè)藥物靶標(biāo)，用來治療 這一類疾病。目前，國(guó)際上已報(bào)道的用于檢測(cè)MPL突變的方法主要包括PCR直接測(cè)序和定性 PCR等，這些方法普遍存在靈敏度低、特異性不高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力且易污染等缺點(diǎn)，使 應(yīng)用受到一定限制。2000年美國(guó)ABI公司推出了一種新TaqMan-MGB探針(TaqMan⑧ Minor Groove Binder Probe, TaqMan-MGB探針)，TaqMan-MGB探針是帶有一個(gè)小溝 結(jié)合物基團(tuán)的寡核苷酸探針，工作原理與TaqMan探針相同，報(bào)告熒光基團(tuán)連接在 探針的5'端(如FAM、 HEX、 VIC等)，3'端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)，不同的是淬滅基團(tuán) 為不發(fā)光的淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher, NFQ)，淬滅基團(tuán)吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能 量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號(hào)的干擾。此外，MGB探針的3'端還連接了一個(gè) 二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide， DPI3) ， DPI3可折疊進(jìn)由 探針末端5-6bp核苷酸形成的小溝內(nèi)。DPI3呈新月行，與B型DNA螺旋的淺深小溝 一樣螺旋，主要通過范德華力穩(wěn)定。TaqMan-MGB探針顯示了更強(qiáng)的序列特異性。可 以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，升高探針Tm值，使較短的探針同樣能達(dá)到較高的 Tm值一而短探針的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的距離更近，淬滅效果更好，熒光背景 更低，使得信噪比更高， 一個(gè)15bp的MGB探針的信噪比大于6,優(yōu)于理想狀態(tài)下的 25bp的普通TaqMan探針(信噪比約為1.5)。允許采用更短的探針也簡(jiǎn)化了探針 的設(shè)計(jì)和成本。與傳統(tǒng)的TaqMan探針比較，TaqMan-MGB探針有以下優(yōu)勢(shì)MGB增 加了探針熔點(diǎn)溫度(Tm)，這樣可使探針較短，尤其適合富含A/T的序列，并且提高 配對(duì)與非配對(duì)模板間的Tm值差異，可進(jìn)行更多重的PCR;提高信噪比，由于在探針 的3'端的淬滅基團(tuán)為不發(fā)光的熒光基團(tuán)，并且與報(bào)告基團(tuán)在空間的位置更接近， 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更精確，分辨率更高；且實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單，雜交的穩(wěn)定性大大提高，重復(fù)性大大提高。但是，目前尚沒有專門用于檢測(cè)基因組DNA上的MPLW515K突變的合適的引物 和特異性的TaqMan-MGB熒光探針。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的試劑盒，包括用于 檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的引物和TaqMan-MGB探針。所述用于對(duì)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變進(jìn)行定性、定量檢測(cè)的引物的核苷 酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。其中，序列表中的SEQ ID NO. 1 由21個(gè)堿基組成，該序列為1號(hào)染色體GC01P043576自5，端第43587604-43587624 位堿基的反向互補(bǔ)序列，SEQ ID NO. 2由21個(gè)堿基組成，該序列為1號(hào)染色體 GC01P043576自5，端第43587534-43587554位堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為91bp。所述TaqMan-MGB探針的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4 所示；所述探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，5'端標(biāo)記有發(fā)光顏色不同的報(bào)告熒光基團(tuán)，3' 端不僅標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅基團(tuán)，還連接有二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽 (dehydrocyclopyrroindole tripetide， DPI3)。所述報(bào)告熒光基團(tuán)可為F細(xì)、HEX或VIC等，不發(fā)光的淬滅基團(tuán)可為 NFQ (Non-Fluorescent Quencher ， NFQ)等。將具有序列表中SEQ ID NO. 3的TaqMan-MGB探針命名為W515wt-MGB-Probe， 序列表中的SEQ ID NO. 3由16個(gè)堿基組成，該序列為1號(hào)染色體GC01P043576自5， 端第43587586-43587601位堿基的反向互補(bǔ)序列，針對(duì)43587595位的堿基T及 43587596位的堿基G。將具有序列表中SEQ ID NO. 4的TaqMan-MGB探針命名為W515K-MGB-Probe， 序列表中的SEQ ID NO. 4由17個(gè)堿基組成，該序列為1號(hào)染色體GC01P043576自5' 端第43587585-43587601位堿基的反向互補(bǔ)序列，針對(duì)43587595位及43587596位 的2個(gè)突變堿基AA。上述試劑盒中還包括陽性對(duì)照、野生型對(duì)照和陰性對(duì)照；所述陽性對(duì)照為MPLW515K突變陽性病人細(xì)胞的DNA;所述野生型對(duì)照為正常人 細(xì)胞的DNA;所述陰性對(duì)照為不含DNA的PCR擴(kuò)增體系。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的方法，包 括以下步驟1) 提取受試者的骨髓、外周血或組織的基因組DNA;2) 以受試者骨髓或外周血的基因組DNA為模板，用上述試劑盒對(duì)上述步驟l) 提取到的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3) 對(duì)步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行MPL激酶基因的等位基因鑒別分析，若用于標(biāo)記 SEQ ID NO: 3的熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度呈S型增長(zhǎng)，同時(shí)用于標(biāo)記SEQ ID NO: 4的熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度無增長(zhǎng)，表示野生型基因型；反之，表示MPLW515K 純合突變基因型；若兩種熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度同時(shí)呈S型增長(zhǎng)，則表示 MPLW515K雜合突變基因型；4) 根據(jù)步驟3)的基因型分析結(jié)果進(jìn)行判斷，具有MPLW515K純合突變基因型 或MPLW515K雜合突變基因型的受試者的MPLW515K突變檢測(cè)結(jié)果為陽性。在上述檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中的MPLW515K突變的方法中，為了便 于對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，還可在步驟2)中添加MPLW515K突變陽性對(duì)照質(zhì)粒、野生 型質(zhì)粒和陰性對(duì)照，其中，MPLW515K突變陽性對(duì)照質(zhì)粒、野生型對(duì)照質(zhì)粒分別來自 以MPLW515K突變陽性病人及正常人細(xì)胞的DNA為模板，用SEQ ID NO. 5和SEQ ID N0.6引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別被克隆進(jìn)入pMD18-T 質(zhì)粒載體，經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序驗(yàn)證及擴(kuò)增后，提取DNA分別得到MPLW515K 突變及野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，通過測(cè)定吸光度值計(jì)算出拷貝數(shù)，分別制備十倍梯度稀 釋(107， 106， 105， 104， 103， 102個(gè)拷貝)樣品，用于制作MPLW515K突變及野生 型的標(biāo)準(zhǔn)曲線；MPLW515K雜合突變基因型可為來自MPLW515K質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒的 不同比例的混合物，并以MPL歸k突變/MPL總與ACt (CW眼5k突變-CWl野生)做標(biāo)準(zhǔn)曲 線。測(cè)試樣本的平均ACt分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MPLW515K突變基因占MPL總基因 型(MPL,k突變/MPL總)的百分比值。陰性對(duì)照可為不含DNA的PCR擴(kuò)增體系。此外，根據(jù)步驟3)的分析結(jié)果，測(cè)試樣本為MPLW515K雜合突變基因型的，可 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MPLW515K突變基因占MPL總基因型(JMPU孤突變/MPL總)的百分 比值。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中 MPLW515K突變的引物。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的引物， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中 MPLW515K突變的TaqMan-MGB探針。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的 TaqMan-MGB探針，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示;所述SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的5，端標(biāo)記有發(fā)光顏色不同的報(bào)告熒光 基團(tuán)，3'端標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅基團(tuán)和二氫環(huán)化卩引哚卟啉-三肽。所述報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM或HEX,所述不發(fā)光的淬滅基團(tuán)為NFQ。通過提取待測(cè)樣品的基因組DNA，再將本發(fā)明的引物和TaqMan-MGB探針結(jié)合實(shí) 時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，通過檢測(cè)人MPL激酶自氨基末端第515位的氨基酸，可 達(dá)到檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的目的。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨 床及科研中對(duì)MPLW515K突變進(jìn)行檢測(cè)，不僅為MPDs的診斷提供了一條快速、可靠、 準(zhǔn)確的新途徑，而且可進(jìn)一步提供MPLW515K突變基因與野生MPL基因的確切比值， 從而可為療效觀察、微小殘留病的動(dòng)態(tài)觀察提供依據(jù)。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā) 揮重要作用。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為十倍梯度稀釋MPLW515野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2為十倍梯度稀釋MPLW515K突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3為MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位點(diǎn)為野生型的擴(kuò)增曲線 圖4為MPL激酶自氨基末端第515位氨基酸位點(diǎn)為W515K雜合型的擴(kuò)增曲線 圖5為測(cè)序驗(yàn)證部分樣品的MPLW515K突變的結(jié)果 圖6為計(jì)算MPLW515K突變基因占MPL總基因型的百分比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖7為本發(fā)明的MPLW515K突變檢測(cè)方法的穩(wěn)定性及靈敏度測(cè)定結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物、TaqMan-MGB 探針的合成及序列測(cè)定工作均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。實(shí)施例1、用于對(duì)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變進(jìn)行檢測(cè)的引物和TaqMan-MGB 探針的設(shè)計(jì)根據(jù)MPL激酶基因(1號(hào)染色體GeneLoc map region ， 41,576,062 - 45,592,722 bp ， GeneLoc location for GC01P043576)及其反向互補(bǔ)序列用Primer Express Software 2.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，同時(shí)根據(jù)野生型MPL激酶基因及MPL激酶 MPLW515K突變基因的反向互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)2條TaqMan-MGB探針，將2條TaqMan-MGB 探針的5，端分別依次標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)HEX和F細(xì)，3，端標(biāo)記不發(fā)光的淬滅基團(tuán)， 并連接DPI3，引物、TaqMan-MGB探針序列如表1所示表l檢測(cè)MPLW515K突變的引物、探針序列序列編號(hào)引物或探針序列長(zhǎng)度 (bp)SEQ ID NO. 1W515vrt-FP5' —GCGGTACCTGTAGTGTGCA&G—3'21SEQ ID NO, 2W515wt—RP5' -GGTGAGCGCTGTGGATGTAGT-3'21SEQ ID NO. 3W515wt—MGB—Probe5' —HEX—ACTGCCACCTGAOCAG—3'16SEQ ID NO. 4W515K—MGB—Probe5' -FAM-AGTGCTTGGTCAGCAGC —3'17用SEQ ID NO. 1與SEQ ID NO. 2引物擴(kuò)增片段91SEQ ID NO. 5SEQ—5' -CAGAGAGCGAAGGAAGAAT—3'SEQ ID NO. 65' — GGATGTCGCTAGGG I I t AG—3'19測(cè)序用SEQ ID NO. 5與SEQ ID NO. 6引物擴(kuò)增片段549序列表中的SEQ ID NO. 1由21個(gè)堿基組成，該序列為1號(hào)染色體GC01P043576 自5'端第43587604-43587624位堿基的反向互補(bǔ)序列，SEQ ID NO. 2由21個(gè)堿基 組成，該序列為1號(hào)染色體GC01P043576自5'端第43587534-43587554位堿基， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為91bp。將具有序列表中SEQ ID NO. 3的TaqMan-MGB探針命名為W515wt-MGB-Probe， 序列表中的SEQ ID NO. 3由16個(gè)堿基組成，該序列為1號(hào)染色體GC01P043576自5' 端第43587586-43587601位堿基的反向互補(bǔ)序列，針對(duì)第43587595位及第43587596 位的堿基T和G。將具有序列表中SEQ ID NO. 4的TaqMan-MGB探針命名為 W515K-MGB-Probe，序列表中的SEQ ID NO. 4由17個(gè)堿基組成，該序列為1號(hào) 染色體GC01P043576自5'端第43587585-43587601位堿基的反向互補(bǔ)序列，針對(duì) 第43587595位及第43587596位的2個(gè)突變堿基AA。實(shí)施例2、骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的檢測(cè)一、用根據(jù)MPL基因組基因設(shè)計(jì)的引物和TaqMan-MGB探針進(jìn)行骨髓增殖性疾 病MPLW515K突變檢測(cè)用實(shí)施例1中根據(jù)MPL基因組基因設(shè)計(jì)的引物和TaqMan-MGB探針對(duì)MPDs患者，包括ET、 MF、未歸類的MPDs，及CML等骨髓或外周血標(biāo)本(來自人民醫(yī)院)進(jìn)行 骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的檢測(cè)，同時(shí)以正常供者的離體骨髓(NDM)為對(duì)照， 具體方法如下 1) 待測(cè)樣品基因組DNA的提取按DNAzol試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)并參照試劑盒說明書在無菌條件下 提取MPDs患者及正常骨髓移植供者(見表l)的骨髓標(biāo)本的基因組DNA，方法為 用EDTA抗凝，用淋巴細(xì)胞分層液(相對(duì)密度1.077g/L，上海華精高科技有限公司) 分離出單個(gè)核細(xì)胞，將分離出的單個(gè)核細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次后，加入600 u 1 DNA zol試劑，輕輕混合吹打后加入600ul無水冷乙醇，4°C、 12000rpm離心1分鐘， 棄上清，將沉淀用80%的冷乙醇洗滌一次，室溫干燥，用適量的滅菌注射用水溶解 沉淀，最后用DNA/RNA紫外檢測(cè)儀測(cè)定DNA含量及純度，結(jié)果A260/A280>1. 8，表 明所提取的DNA純度較高。2) PCR擴(kuò)增以步驟l)提取的DNA為模板，在實(shí)施例1中所述引物SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2 及由序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4組成的TaqMan-MGB探針的引導(dǎo)下，用 ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體 系為lXTaqMa,通用PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑(購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，弓i物 SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2各400nM，熒光標(biāo)記的W515wt—MGB-Probe lOOnM， W515K—MGB-Probe 300 nM， 150-500 ng DNA。 PCR反應(yīng)條件為先50°C 2分鐘； 然后95。C IO分鐘；最后95。C 15秒，60°C 1分鐘，共45個(gè)循環(huán)。為了便于對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)設(shè)置MPLW515K突變陽性對(duì)照質(zhì)粒、野生 型質(zhì)粒和陰性對(duì)照，其中，MPLW515K突變陽性對(duì)照質(zhì)粒、野生型對(duì)照質(zhì)粒分別來自 以MPLW515K突變陽性病人及正常人細(xì)胞的DNA為模板，用SEQ ID NO. 5和SEQ ID N0.6引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別克隆入pMD18-T質(zhì)粒 載體，經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序驗(yàn)證及擴(kuò)增后，提取DNA分別得到MPLW515K突 變及野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，通過測(cè)定吸光度值計(jì)算出拷貝數(shù)，分別制備十倍梯度稀釋 (107， 106， 105， 104， 103， 102個(gè)拷貝)樣品，用于制作MPLW515K突變及野生型 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。十倍梯度稀釋的MPLW515野生型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示，十倍梯度稀釋的MPLW515K突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。 陰性對(duì)照為不含DNA的PCR擴(kuò)增體系。3) PCR擴(kuò)增曲線鑒別分析對(duì)步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等位基因鑒別分析，若用于標(biāo)記T叫Man-MGBSEQID NO. 3的熒光染料HEX發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度呈S型增長(zhǎng)，同時(shí)用于標(biāo)記TaqMan-MGB SEQ ID N0.4的熒光染料FAM發(fā)出的藍(lán)色熒光強(qiáng)度無增長(zhǎng)，表示野生型基因型，擴(kuò) 增曲線見圖3 (箭頭指示的曲線表示熒光強(qiáng)度變化)；反之，表示純合突變基因型; 若兩種熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度同時(shí)呈S型增長(zhǎng)，則表示雜合突變基因型，擴(kuò)增曲 線見圖4 (箭頭指示的曲線分別表示熒光強(qiáng)度變化，在圖4中分別表示MPLW515K 突變基因型和野生型基因型)。4) 結(jié)果判斷根據(jù)步驟3)的基因型分析結(jié)果進(jìn)行判斷，具有雜合突變基因型或純合突變基 因型的待測(cè)樣品的MPLW515K突變檢測(cè)結(jié)果為陽性，受試者為骨髓增殖性疾病患者， 檢測(cè)結(jié)果如表l所示。對(duì)其中5例標(biāo)本(陽性3例，陰性2例)用測(cè)序的方法進(jìn)行 了驗(yàn)證，其中3例標(biāo)本的測(cè)序檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，與以上方法的檢測(cè)結(jié)果一致。 表明用本發(fā)明的引物、TaqMan-MGB探針及方法可對(duì)MPLW515K突變進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè) 結(jié)果準(zhǔn)確。表1 MPLW515K突變?cè)贘AK2V617F陰性的MPDs中的檢出情況疾病類型例數(shù)陽性例數(shù)陰性例數(shù)陽性率ET19901990PV320320MF241234.2%未分類MPD362345.6%CML400400HES120120MDS230230ITP130130畫2902905)同時(shí)對(duì)陽性對(duì)照突變基因型MPLW515K的質(zhì)粒DNA依次用野生基因型質(zhì)粒DNA 稀釋為80%、 40%、 20%、 10%、 5%的比例，每梯度重復(fù)3-5管進(jìn)行擴(kuò)增，以MPL醒 突變/MPL總與其相應(yīng)的平均ACt (Ctw隨區(qū)效-Ct帆野生)做標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = -O. 0699x + 0.185,檢測(cè)MPLW515K突變，相關(guān)系數(shù)r= 0.99，其中Y代表不同的突變基因百分比，X j戈表平均ACt (CtMPLW515K突變一 Ct肌野生)，測(cè)試樣本的平均ACt代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出測(cè)試樣本的突變基因百分比(MPLW515K突變/MPL總)。對(duì)上述陽性的MPDs患者的結(jié)果根據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖6)計(jì)算其突變基因百分比(MPLW515K突變/MPL總)，結(jié)果平均值為39.92±23.18%。二、本發(fā)明骨髓增殖性疾病MPLW515K突變檢測(cè)方法的靈敏度測(cè)定 將陽性對(duì)照突變基因型MPLW515K的質(zhì)粒DNA依次用野生基因型質(zhì)粒麗A稀釋為60%、 40%、 20%、 10%、 5% (突變基因型/ (突變基因型+野生基因型)的比例，按上述相同方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在5X梯度均可檢出MPLW515K突變擴(kuò)增曲線，表明本發(fā)明方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)5% (見圖7)。序列表〈160〉 6<210〉 1<211〉 21〈212〉 DNA <213>人工序列〈220〉 〈223〉〈400〉 1gcggtacctg tagtgtgcag g 21<210〉 2〈211> 21〈212〉 薩 〈213〉人工序列<220〉 <223〉〈400〉 2ggtgaccgct ctgcatctag t 21〈210〉 3<211〉 16<212〉 DNA -〈213〉人工序列<220> 〈223〉<400> 3actgccacct cagcag〈210〉 4<211〉 17<212〉 腿 <213>人工序列<220〉 〈223〉<400〉 4actgcttcct cagcagc〈210〉 5<211〉 19〈212〉 DNA <213>人工序列<220> <223〉<400〉 5cacagagcga accaagaat<210〉 6<211〉 19〈212〉 DNA 〈213〉人工序列〈220〉 <223〉說明書第11/12頁1617〈400〉 6cgatctcgct accgtttac 19
權(quán)利要求
1、一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的試劑盒，包括用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的引物和TaqMan-MGB探針；所述用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；所述TaqMan-MGB探針，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO3和SEQ ID NO4所示。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述T叫Man-MGB探針的5， 端標(biāo)記有發(fā)光顏色不同的報(bào)告熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅基團(tuán)和二氫環(huán) 化吲哚卟啉-三肽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述報(bào)告熒光基團(tuán)為F屈或 HEX,所述不發(fā)光的淬滅基團(tuán)為NFQ。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包 括陽性對(duì)照、野生型對(duì)照和陰性對(duì)照；所述陽性對(duì)照為MPLW515K突變陽性病人細(xì)胞的DNA; 所述野生型對(duì)照為正常人細(xì)胞的DNA; 所述陰性對(duì)照為不含DNA的PCR擴(kuò)增體系。
5、 一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的方法，包括以 下步驟1) 提取受試者的骨髄、外周血或組織的基因組DNA;2) 以受試者骨髓或外周血的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1-3中任一所述 的試劑盒對(duì)上述步驟1)提取到的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3) 對(duì)步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行MPL激酶基因的等位基因鑒別分析，若用于標(biāo)記 SEQ ID NO: 3的熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度呈S型增長(zhǎng)，同時(shí)用于標(biāo)記SEQ ID NO: 4的熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度無增長(zhǎng)，表示野生型基因型；反之，表示MPLW515K 純合突變基因型；若兩種熒光染料發(fā)出的熒光強(qiáng)度同時(shí)呈S型增長(zhǎng)，則表示 MPLW515K雜合突變基因型；4) 根據(jù)步驟3)的基因型分析結(jié)果進(jìn)行判斷，具有MPLW515K純合突變基因型 或MPLW515K雜合突變基因型的受試者的MPLW515K突變檢測(cè)結(jié)果為陽性。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟2)中還包括添加陽性 對(duì)照、野生型對(duì)照和陰性對(duì)照的步驟；所述陽性對(duì)照為MPLW515K突變陽性病人細(xì)胞的DNA; 所述野生型對(duì)照為正常人細(xì)胞的DNA; 所述陰性對(duì)照為不含DNA的PCR擴(kuò)增體系。
7、 用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的引物，其核苷酸序 列如序列表中SEQ ID NO:. 1和SEQ ID NO: 2所示。
8、 用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病基因組DNA中MPLW515K突變的TaqMan-MGB探針， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；所述SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4的5'端標(biāo)記有發(fā)光顏色不同的報(bào)告熒光 基團(tuán)，3，端標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅基團(tuán)和二氫環(huán)化吲哚葉啉-三肽。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的TaqMan-MGB探針，其特征在于所述報(bào)告熒光基團(tuán) 為FAM或HEX，所述不發(fā)光的淬滅基團(tuán)為NFQ。
10、 權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒、權(quán)利要求7所述的引物、權(quán)利要求8 或9所述的探針在檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的試劑盒及其專用引物與探針。本發(fā)明所提供的試劑盒，包括引物和TaqMan-MGB探針；所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；所述TaqMan-MGB探針的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)骨髓增殖性疾病MPLW515K突變的試劑盒可用于臨床及科研中對(duì)MPLW515K突變進(jìn)行檢測(cè)，不僅為MPDs的診斷提供了一條快速、可靠、準(zhǔn)確的新途徑，而且可進(jìn)一步提供MPLW515K突變基因與野生MPL基因的確切比值，從而可為療效觀察、微小殘留病的動(dòng)態(tài)觀察提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101403010SQ20081022651
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者李玲娣, 李金蘭, 濱 江, 牛繼紅, 阮國(guó)瑞, 陳珊珊, 黃曉軍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院