專利名稱：：植物花色素苷合成后期關(guān)鍵酶—花色素合成酶編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與植物花色素苷形成相關(guān)的酶編碼基因勾應(yīng)用。賴駄花的顏色是決定花觀賞價(jià)值的重要因素之一，花色主要由類黃酮(flavonoids)、類胡蘿卜素(carotenoids)、生物堿(alkaloid)三大類物質(zhì)決定(TanakaY,STsuda，TKusumi.MetabolicEngineeringtomodifyflowerscolor.PlantCellPhysioloy，1998(1l):l119-1126.)?；ㄉ剀?anthocyanins)是類黃酮中一類主耍色素，控制著花的粉紅色、紅色、磚紅色、藍(lán)色、紫色等花色，植物中基本的花色素苷有3種，即花葵素、花青素、花翠素，以及這些花色素的甲基化衍生物等。(徐紀(jì)尊,王麗輝,潘慶玉.觀賞植物花色基因轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2006,8(5):5660.)?；ㄉ睾铣擅甘腔ㄉ剀丈锖铣赏緩街泻笃诒磉_(dá)的第二個(gè)關(guān)鍵酶，催化無(wú)色的原花色素(leucoarthocyanidins)氧化產(chǎn)生有色的花色素(anthocyanidin)對(duì)植物的色彩形成至關(guān)重要。ANS在催化反應(yīng)時(shí)會(huì)選擇攜帶有一個(gè)"P-face"碳-3羥基基團(tuán)的二氫黃酮醇為底物，并通過"a-face"脫水作用生成戊二醇(祝欽瀧.彩葉草(50/^0敗,《^她//^0^^)葉色形成相關(guān)的花色素苷合成途徑的分子調(diào)控:[博士學(xué)位論文].重慶:西南人學(xué)，2007)。目前報(bào)道的大多數(shù)^VS基因的結(jié)構(gòu)均由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，且剪接位點(diǎn)一致，如擬南芥(AT4G2288)、裂葉牽牛(/po/Kora/2e<ieracra,AY257210)、草莓(FragcWa(3wawoS(3,AY695818)、金鐘連翹(Fors^Wa!'"ferwefi/a;Rosati,SimoneauP.MoleeularcharacterizationoftheanthocyanidinsynthasegeneinForsythiaxintermediarevealsorgan-specificexpressionduringflowerdevelopment.PlantSci.，1999，149:73-79)等，但小麥(7W"cwwaeWvMw,AB247921)和水稻的Q^AW(Os06g0626700)卻沒有內(nèi)含子。^VS基因在紫蘇中冇2-3個(gè)拷貝(Gongetal.Cloningandmolecularanalysisofstructuralgenesinvolvedinanthocyaninbiosynthesisandexpressedinaforma-specificmannerinPm7/a并z/tocmy.PlantMolBiol1997,35:925-927)，在金鐘連翹中有2個(gè)拷貝，而在葡萄中只有1個(gè)拷貝(Sparvolietal.Cloningandmolecularanalysisofstructuralgenesinvolvedinflavonoidandstibenebiosynthesisingrape(Ftov/"z/erai.).PlantMolBiol,1994,24:743-755),因此推測(cè)^A^基因是由單基因或小基因家族構(gòu)成。多序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域搜索顯示，ANS蛋白都含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，20G-FeII—Oxy(20G-Fe(H)氧化酶超家族)結(jié)構(gòu)域和PcbC(COG3491，異青霉素N-合成酶和相關(guān)雙加氧酶)結(jié)構(gòu)域，與2-ODD家族的F3H，F(xiàn)LS及FNSI有大約30。/。左右的序列同源性，被推測(cè)屬于2-ODD(2-酮戊二酸依賴的氧化酶)家族(PrescottandJohn,1996)。這個(gè)推測(cè)被兩個(gè)獨(dú)立的研究證明(Saitoetal.Directevidenceforanthocyanidinsynthaseasa2-oxoglutarate-dependentoxygenase:molecularcloningandfunctionalexpressionofcDNAfromaredformaofPerillafrutescens.PlantJ,199917(2),17(2),181-189,;Turnbulletal.purificationcrystallizationandpreliminaryX-raydiffractionofanthocyanidinsynthasefrom^ra6油/M!'sf/2a//awa,ActaCrystallographica,SectionD,2001，57(Pt3):425-427)。Rupert等在擬南芥中得到了ANS的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其活性位點(diǎn)是一個(gè)金屬離子、共底物(cosubstrate)和兩分子的底物類似物(substrateanalog)共同構(gòu)成的多復(fù)合體(RupertC,WilmouthR,JonathanJ,etal.StructureandmechanismofanthocyanidinsynthasefromJra/^o/whStructure,2002，10:93-103)。擬南芥ANS是S前唯一己知三維結(jié)構(gòu)的2-ODD家族的蛋白，是黃酮類化合物合成途徑中其它2-ODD蛋白三維建模的基礎(chǔ)。ANS已開始作為花色基因工程和代謝工程的調(diào)控點(diǎn)，Rosati等將紫羅蘭的^W基因?qū)虢痃娺B翹CForj^Wa/"tenwe&a)中使原為黃色的金鐘花開出了棕色的花朵(Rosati，SimmoneauPetal.TransformationofForsythiaXintermediacv'SpringGlory'withtwoflovonoidpathwaygenesleadstoanthocyaninsynthesisinpetalsatearlyfloweringstages.PolyphenolsCommun，2000，l:57-58)。Carlo等將C7/S和^VS基因同時(shí)轉(zhuǎn)入美國(guó)金鐘連翹獲得了具有深橙黃色花朵的新品種，而分別轉(zhuǎn)入這兩種基因則無(wú)改變花色的效果(CarloR,PhilippeS,DieterT,etal.Engineeringofflowercolorinforsythiabyexpressionoftwoindependentlytransformeddihydroflavonol4-reductaseandanthocyanidinsynthasegenesofflavonoidpathway.MolBreed,2003,12:197-208)。Nakatsuka等發(fā)現(xiàn)，爿AW基因的突變是導(dǎo)致龍膽花變?yōu)榘咨闹匾?NakatsukaT,NishiharaM，MishibaK，etal.Twodifferentmutationsareinvolvedintheformationofwhite-floweredgentianplants.PlantSci,2005,169:949-58)。Ambavaram等在果皮有原花色素積累，其余組織不含無(wú)任何花色素苷的水稻W(wǎng)尸(Mx^^a//^/^taW)突變體中，超量表達(dá)水稻^VS基因，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的葉鞘、節(jié)間、稻殼中出現(xiàn)不同程度的花色素苷的積累，并在整個(gè)轉(zhuǎn)基因植株抗氧化能力的增強(qiáng)(Ambavarametal.Noveltransgenicriceoverexpressinganthocyanidinsynthaseaccumulatesamixtureofflavonoidsleadingtoanincreasedantioxidantpotential.MetabolicEngineering,2007,9:95-111》。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種與植物花色素苷形成相關(guān)的酶及其編碼基因。本發(fā)明所提供的與植物花色素苷形成相關(guān)的酶，名稱為ANS，來源于蘋果屬王族海棠(Malus)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷形成相關(guān)的由l)衍生的酶。上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的cDNA基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的cDNA基因具體可為如下l)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1350位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的DNA分子；4)與l)的基因具有95%以上的同源性，且編碼上述與植物花色素苷形成相關(guān)的酶的DNA分子。序列表中的序列1由1350個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1-1350位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的ANS。擴(kuò)增上^AW基因全長(zhǎng)或任一片段的弓I物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體實(shí)施例方式卜述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說明均為常規(guī)方法，所用引物合成及測(cè)序工作均由上海生i:生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。限制性內(nèi)切酶EcoRl、HindIII和Taq酶，T4DNA連接酶均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，pBS-T-VectorKit載體試劑盒購(gòu)自天為時(shí)代生物公司，BDSMARTRACEcDNAAmplificationKit購(gòu)自Clontech公司。Amp抗生素、Tris飽和酚、水飽和酚、DEPC、DL2000DNAMarker、瓊脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。一、MMA^基因3'端序列的獲得以王族海棠(Mate/o戸^)(北京農(nóng)學(xué)院海棠種質(zhì)資源圃)為實(shí)驗(yàn)材料，提取其根的總RNA，將提取得到的總RNA用50^1的DEPC水溶解，電泳檢測(cè)。經(jīng)甲醛變性凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以清晰地看到28SrRNA禾tl18SrRNA兩條帶，且28SrRNA禾U18SrRNA含a之比大約為1:1-2:1。結(jié)果表明，提取得到的RNA是完整的，染色結(jié)果顯示，提取得到的總RNA可以用來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。~以上述提取得到的根總RNA為模板，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以此cDNA為模板，跟據(jù)近緣物種植物^AW基因保守區(qū)段序列，設(shè)計(jì)3'race上游引物ANS3F擴(kuò)增A/MWS基因的3'端序列。MasterMix預(yù)混物體系如下預(yù)混物體積(nL)ddH2025.810PCR緩沖液4dNTPMixture(2.5mM)3.2T叫酶(5U/1)1總體積34pL，將上述MasterMix預(yù)混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:雙引物對(duì)照樣品(序列表中序列3)i^IANS3F(序列表中序列4)lpl模板一lpl5PCR反應(yīng)條件先95。C預(yù)變性3min;然后95'C變性15S;68。C退火6min，共30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。取10nLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，其中，M為MARKERII的DNA分于量標(biāo)準(zhǔn)，1為樣品組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，2為ANS3F和3R雙引物對(duì)照。結(jié)果表明，雙引物對(duì)照組沒有擴(kuò)增出特異條帶，只有樣品組擴(kuò)增得到900bp左右的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時(shí)代生物公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的899bp片段即是^VS基因的3'端序列。二、^VS基因5'端序列的獲得以步驟一獲得的保守序列為模板，在其5'端設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增MMAW基因的5'端序列。MasterMix預(yù)混物體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>總體積34^L，將上述MasterMix預(yù)混物平均分成2管，每管，按照下表加入引物:雙引物對(duì)照樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>PCR反應(yīng)條件先95。C預(yù)變性3min;然后95'C變性15S;68'C退火6min，共30個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸7min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋1000倍，取lnL作為模板，以5F和ANS5R2(序列表中序列6)為引物，進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件與第一輪相同。取10nL第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，其中，M為MARKERII的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為樣品組的PCR擴(kuò)增結(jié)果，2為ANS5R2和5F雙引物對(duì)照。結(jié)果表明，雙引物對(duì)照組沒有擴(kuò)增出特異條帶，只有樣品組擴(kuò)增得到750bp左右的片段。切下目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時(shí)代生物公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上，進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)同源性比較分析后確定獲得的781bp片段即是A/MAW基因的5'端序列。三、M/"AVS基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得將上述PCR擴(kuò)增獲得的Mvi膽基因5'端序列以及3'端序列進(jìn)行同源性比較，利用DNAMAN等生物軟件進(jìn)行拼接校正，拼接出MM7VS基因全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接的MMAW基因全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)引物ANSF和ANSR(序列表中序列7和序列8)，提取王族海棠葉根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增全長(zhǎng)MMAW基因，用高保真Pfu酶替換rag酶，PCR反應(yīng)混合物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR反應(yīng)條件先94'C預(yù)變性3min;然后94°C50S，62°Clmin，72°C2min，共35個(gè)循環(huán)；再72。C延伸7min，4'C保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，其中，M為MARKERII的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為A^4MS基因全長(zhǎng)cDNA序列的PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明獲得約1100bp的條帶。切下該目的條帶，純化回收后按照pBS-T-VectorKit載體試劑盒(天為時(shí)代生物公司)說明書將PCR產(chǎn)物連接到pBS-T載體上。對(duì)擴(kuò)增得到的MMA/S基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，獲得1074bp的條帶，該1074bp的核苷酸片段即為A/MMS，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。序列表序列一DNA蘋果屬王族海棠1074CAACCATCCC121TCGAACAAGA181AGTCTGATAA241ACTGGGGTGT301GGAAGGCCGG361ACCAGGCCTC421AGCTTGAGTG481CTATTTGGCC541TGAGGGAGTT601GGAGGCTGGA661ACTACCCAAA721GTGCACTCAC781AGTGGGTCAC841AGATTTTGAG901AGGTGAGGAT961CACTGCCGGA1021AGCACATTCA1081CGTTGTGCTA1141AGTTGGTATG81201GCTACTCCTG1261GAATGGCTAT1321TTTCAAGTCAAGATTTCAACAAAAAAAAAA序列二PRT蘋果屬王族海棠161lEQKEKYAND121QASGKIQGYGSKLANNASGQLEWEDYFFHCVYPEDKRDLSIWPQTPADYIEATAEYAK(^LLGVEAHTDVS241ALTFILHNMVPGLQLFYEGKWVTAKCVPNSIVMHIGDTLEILSNGKYKSILHRGMVNKEK301序列三DNA人工序列3R和5F:Long(0.4(iM):Short(2nM):5'—CTAATACGACTCACTATAGGGC_3'序列四DNA人工序列ANS3F:5，-gggaGGACTACTTCTTCCAC-3，。序列五DNA人工序列ANS5R1:5，-GGAACCATGTTGTGGAGGATG-3，。序列六DNA人工序列ANS5R2:5'-GGCGAGTGCACTCACGTCAG-3'序列七DNA人工序列ANSF:5，-ATGGTGAGTTCTGATTCAGTGAAT-3'序列八DNA人工序列ANSR:5，國(guó)TCACTTGGGGAGCAAAGCCTC-3'10圖1為王族海棠葉總RNA的題取結(jié)果圖2為JWh4iVS基因的5'RACEPCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為MrJiVS基因的3'RACEPCR擴(kuò)增結(jié)果圖4為MMAW基因全長(zhǎng)cDNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花色素苷形成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的cDNA基因?yàn)槿缦耹)-4)中任一所述的基因[1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第1-1350位脫氧核糖核苷酸；[2)其核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi);[3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子；[4)與l)的基因具有95。/。以上的同源性且編碼編碼權(quán)利要求l所述蛋白的DNA分子。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物花色素苷合成后期關(guān)鍵酶的編碼基因。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能改變植物花色或葉色的由1)衍生的蛋白質(zhì)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101538559SQ20081022609公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2008年11月6日優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日發(fā)明者姚允聰,宋婷婷,沈紅香,佶田申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院;姚允聰