專利名稱：：一株植物根際促生細菌的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一株植物根際促生細菌，可廣譜防治多種植物土傳真菌病害，在植物根際可大量定殖，對植物的生長發(fā)育有明顯的促進作用，屬于農(nóng)用微生物
技術領域：
，也屬于植物生物防治
技術領域：
。技術背景從20世紀60年代末期以來，隨著大量化學農(nóng)藥長期的不合理使用，植物病蟲害的化學防治嚴重威脅著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展和人類的健康，已成為人類社會進入21世紀的嚴重挑戰(zhàn)。隨著科學技術的發(fā)展，面對環(huán)境的日趨惡化，人們對有害生物的認識和農(nóng)作物保護策略發(fā)生了轉變，從對有害生物的"斬盡殺絕"轉變?yōu)?適度容忍"。農(nóng)業(yè)部于2002年啟動實施了"無公害食品行動計劃"，這標志著我國農(nóng)業(yè)結構調整已進入新的發(fā)展階段。展望今后食品安全的發(fā)展需要，生物防治將成為病蟲害防治的重要措施，有著廣闊的發(fā)展前景。但生物防治從整體上看仍存在一些不足一是被用來篩選的樣品材料主要集中在根際土壤、被感染的病體組織、易感植株的內生菌等處，限制了微生物資源的多樣性；二是篩選的生防菌常常是針對某一種或某一類病原菌有較好的抑菌效果，缺乏抑菌的廣譜性；三是外界條件的變化會直接影響生防菌劑的生防機制和生防效果，即防效不穩(wěn)定；四是生防菌的生產(chǎn)和使用技術不夠完善等等。為全面貫徹落實"預防為主，科學防控，依法治理，促進健康"的生物防治方針，指導各地安全、科學、合理的使用農(nóng)藥和綜合防治，進一步促進農(nóng)林業(yè)有害生物的無公害防治，保護生態(tài)環(huán)境和生物多樣性，結合目前我國農(nóng)作物的防治結構，提出了一系列新的防治技術。生物防治的新技術之一就是分離和篩選植物根際促生菌(plantgrowth—promotingrhizobacteria,PGPR)，其能夠高密度地在植物根際定殖，兼有抑制植物病原菌、根際有害微生物，以及促進植物生長并增加作物產(chǎn)量的作用，更重要的是有些PGPR還能誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性(Inducedsystemicresistance,ISR)，從而提高植物整體的抗病能力。故PGPR的深入研究和發(fā)展，將為解決植物土傳病害防治這一難題展現(xiàn)誘人的前景。番茄早疫病(TomatoEarlyBlight)又稱為"輪紋病"或"夏疫病"，在番茄的整個生長期間可隨時隨地普遍發(fā)生，是危害較嚴重的真菌病害之一。此病原的寄主范圍廣泛，除危害番茄外，還可危害茄子、辣椒和馬鈴薯等茄科蔬菜作物。目前番茄早疫病害的防治主要依賴于化學藥劑。國外雖然獲得了一些有較好防治效果的拮抗菌，但沒有專門進行以番茄早疫病菌為防治對象的拮抗微生物的篩選工作，國內目前也僅僅局限于簡單的實驗室篩選工作，拮抗微生物以酵母為主。
發(fā)明內容技術問題本發(fā)明的目的正是為了克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一株能有效防治番茄早疫病害、能有效促進植物生長、能有效定殖于植物根際、具有拮抗廣譜性的、有益的植物根際促生細菌菌株。技術方案本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明新型植物根際促生細菌菌株為枯草芽孢桿菌(5ac///^^"fc)QM34，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其單位簡稱為CGMCC，保藏日2008年09月22日，保藏編號CGMCCNo.2669。(下面簡稱及>s"^7&QM34)。本發(fā)明的及wZ^'foQM34菌株是首次從青海牦牛糞中分離得到了廣譜拮抗微生物。尋找不同地理環(huán)境的微生物群落，從青海牦牛糞中開發(fā)和利用有益微生物資源，在生防領域將是一個重大的突破。本發(fā)明及ra6"fcQM34菌株的形態(tài)特征為QM34菌落不透明，表面有皺褶，邊緣缺刻狀；菌體形態(tài)桿狀、革蘭氏陽性，產(chǎn)生中生芽孢，芽孢橢圓。與已有的枯草芽孢生防菌株相比，孢囊稍有膨大。本發(fā)明及w^/fcQM34菌株，對12種土傳性植物真菌病原菌均有拮抗作用，特別是對番茄早疫病菌有明顯的抑制效果。因此，是一株具有廣譜拮抗性的生防菌株。本發(fā)明5.犯6"&QM34菌株，對番茄早疫病害有明顯的防治效果；對番茄植株的生長有明顯的促進作用；可在番茄植株根際大量定殖。因此是一株有潛在應用價值的植物根際促生細菌。本發(fā)明5.w^/foQM34菌株，是首次選育的番茄早疫病害的廣譜拮抗性生防菌株，是首次選育的以番茄早疫病害為主要防治對象，且兼有促生、防病等多功能的一株植物根際促生細菌菌株。圖1為經(jīng)不同稀釋度的QM34菌株發(fā)酵液處理后，3個品種的番茄植株根際土壤總芽孢桿菌數(shù)量的變化趨勢。具體實施方式實施例lQM34菌株的分離篩選試驗經(jīng)梯度稀釋法從青海牦牛糞中分離，經(jīng)平板對峙生長法篩選得到一株植物根際促生細菌，5.w&船QM34菌株。具體實施過程包括稱青海牦牛糞樣品10.0g，研碎，于無菌條件下加入到90ml無菌水中搖動均勻，取其上清液稀釋成合適(l(T5、l(T6、10'7)的濃度梯度，將梯度液在IO(TC水浴加熱IO分鐘，用常規(guī)稀釋法涂布接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)1天,挑選細菌菌落形態(tài)差異比較明顯的菌落，重復劃線接種于相應的瓊脂平板上，純化得到單菌落；采用PDA平板對峙生長法初篩以12種病原真菌為指示菌，在平板中央點接病原菌，待病原菌生長到菌落直徑約l-1.5cm時，將接入初篩的菌株，接種點距平板中央2.5ctn處，點接6角點上，以不點接初篩菌株為對照，置于28'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-5天，觀察記錄病原真菌的生長情況。選出對病原菌生長有相對較強抑制作用的菌株進入復篩。復篩的具體操作同初篩，以12種病原菌分別為指示菌，拮抗平板培養(yǎng)5天或10天后，分別測量相關數(shù)據(jù)，并記錄R值(R^病原菌與拮抗菌的菌絲邊緣距/拮抗菌中心到病原菌菌絲邊緣的距離)，根據(jù)R值的大小，篩選得到具有廣譜拮抗作用的、抑菌效果好的、拮抗作用持久的丑w^/toQM34菌株(見表l)，每處理3個觀察值，試驗重復2次。QM34菌落不透明，表面有皺褶，邊緣缺刻狀；菌體形態(tài)桿狀、革蘭氏陽性，產(chǎn)生中生芽孢，孢囊有膨大，芽孢橢圓。表15.w6"'fcQM34菌株對12種土傳植物真菌病菌的拮抗作用病原菌名學名抑菌效果R'番茄早疫病菌so/an/0.921灰霉病菌0週番茄葉霉病菌0.446赤霉病菌0.891刺盤孢菌0.596黃瓜枯萎病菌i^"r/zwo平;or/w附f鄰，w've,0.778未鑒定病原真菌Unidentification0扁棉枯萎病菌0.890小麥白粉病菌grflw/w/sDC.f.sp.7>zY/c/0.672蘋果白粉病菌/Was//zaera/ewc^Wcte(Ell.etEv.)Salm.0.459蘋果干腐菌0.721煙草赤星菌0.5卯R':病原菌與拮抗菌的菌絲邊緣距/拮抗菌中心到病原菌菌絲邊緣的距離實施例2QM34菌株對番茄早疫病的盆栽防效試驗試驗分別用QM34菌株的發(fā)酵液和無菌液防治番茄早疫病，每一種防治液各設2個處理，即在接種番茄早疫病病原菌的前一天和后一天分別進行防治液的接種(分別記為前、后)。以接種無菌水為對照。所有處理同時在三個番茄品種中實施。整個試驗設2次重復，隨機排列。5.犯6"fcQM34菌株，接種于YPF-Ca液體培養(yǎng)基，35°C，搖瓶培養(yǎng)4d，濃度約為109cfWml，稀釋10倍即為QM34菌株的發(fā)酵液；將QM34菌株的發(fā)酵液10000rpm離心20分鐘，去除沉淀，將上清液用微孔濾膜(0.22um)過濾除菌，稀釋3倍后即為QM34菌株無菌液。番茄品種分別為l號，大紅合作903，上海番茄研究所；2號，紅果王大民601，大民農(nóng)業(yè)科學研究院；3號，秦豐大紅保冠(抗病)，西安臨潼區(qū)秦豐蔬菜研究所。三種番茄種子發(fā)芽率均大于85%。番茄早疫病菌C4//emaA7'fl在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后，皿內注入4。C冷水，刮除氣生菌絲，紫外線照射2min，25。C下恒溫培養(yǎng)2d，然后與早疫病菌的查氏液體培養(yǎng)液混合，即為病原菌液，病原菌液孢子數(shù)為106cfii/ml。供試番茄苗長至5-6片葉時，開始接種試驗。同時用針剌涂抹和灌根法接種番茄早疫病菌，接種2次；用涂抹接種QM34菌株發(fā)酵液和QM34菌株無菌液后，再灌根接種10ml/每株。盆栽防治試驗得出(見表2)，各處理均有一定的防治效果，且存在著顯著差異。三個品種都是先于病原菌之前接種QM34菌株發(fā)酵液的防治效果明顯強于之后接種的；對3號品種的試驗結果顯示，用QM34菌株無菌液的防治效果也是先于接種病原菌之前較好；對于3號番茄，直接接種QM34發(fā)酵液的防治效果強于接種無菌液的防治效果。實施例3菌株QM34對番茄植株生長的促進試驗用稀釋倍數(shù)為l、10、20倍的QM34發(fā)酵液分別接種三種番茄植株，以接無菌水為對照，從接種當天開始測定葉片數(shù)和株高，每隔7天記錄一次數(shù)據(jù)。28天后隨機選取每處理組平均株高的植株各2株，調査其葉片大小、根部發(fā)育、葉片間距離、地莖直徑等生理指標指標(見表3)。取根的方法將植株和苗缽體一起浸泡水中，然后換水沖洗干凈，得到根的樣品并照相；將根放入一個透明的托盤內，并注入35mm深的tK，直接測定并記錄總根長;將根放在105'C的烘箱中殺青1h后置于55'C恒溫下烘48h，冷卻后取出計算根系干重。經(jīng)不同稀釋倍數(shù)的QM34發(fā)酵液處理后，發(fā)現(xiàn)三種番茄品種的平均葉片數(shù)和平均株高的變化情況不同，平均葉片數(shù)和株高都在隨時間的延長而增加，平均葉片數(shù)和平均株高均增加(除2號番茄)，并沒有對植株產(chǎn)生抑制作用(見表3)。對1號、2號和3號番茄品種最適宜的QM34發(fā)酵液稀釋倍數(shù)分別是20、10和1倍。在整個試驗過程中，2號番茄品種從發(fā)芽率的大小、發(fā)芽的快慢和長勢上均優(yōu)于1號和3號品種，所以在加入QM34發(fā)酵液后葉片數(shù)仍在增加，而株高相對于對照增加較慢，這正說明QM34發(fā)酵液可以促進植株有效的生長，而避免植株出現(xiàn)徒長現(xiàn)象。另外發(fā)現(xiàn)三種QM34發(fā)酵液的濃度倍數(shù)處理植株后，葉片大小、葉間距、地莖直徑等特征指標與對照間均有不同程度的增加(見表3)。1號番茄品種中的10倍稀釋液和2號番茄對照組的葉片間距離明顯大于其他處理組，且莖直徑也較其他處理組細，其他處理組的基莖都已經(jīng)木質化，莖顏色也已經(jīng)變成紅褐色；l號番茄品種中的20倍稀釋液處理組的葉片面積和根總長明顯大于其他處理組，可見雖然平均株高的變化小，但其葉片數(shù)目等其他特征指標增加，在育苗管理上這種狀態(tài)是非常理想的，是真正的壯苗。這說明QM34菌株發(fā)酵液對三種番茄品種的生長均有一定的促進作用。表2QM34菌株對番茄早疫病的防病效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3經(jīng)QM34菌株發(fā)酵液處理后各番茄植株的生理指標<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4菌株QM34在番茄植株根際的定殖試驗以接種無菌水為對照，對3個番茄品種經(jīng)接種不同濃度的QM34發(fā)酵液的根際土壤，用平板稀釋法進行了總芽孢桿菌數(shù)量的動態(tài)檢測(見圖l)。每7天取樣一次，試驗重復3次。試驗發(fā)現(xiàn)各處理番茄植株根際土壤總芽孢桿菌的數(shù)量變化隨著時間的延長都在增加，比沒有灌根接種的數(shù)量明顯增加(2.8X106cfu/g)(p<0.01)，說明QM34菌株具有很強的競爭力，能夠在植物的根際土壤中定殖并大量繁殖。權利要求1、一株植物根際促生細菌，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其單位簡稱為CGMCC，保藏名枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)QM34，保藏日2008年09月22日，保藏編號CGMCCNo.2669。2、根據(jù)權利要求1所述的一株植物根際促生細菌菌株，其特征在于，從青海牦牛糞中分離得到。QM34菌落不透明，表面有皺褶，邊緣缺刻狀；菌體形態(tài)桿狀、革蘭氏陽性，產(chǎn)生中生芽孢，孢囊稍有膨大，芽孢橢圓。3、根據(jù)權利要求1和2所述的一株植物根際促生細菌菌株，其特征在于，對12種土傳性植物真菌病原菌均有拮抗作用，特別是對番茄早疫病菌有明顯的抑制效果。4、根據(jù)權利要求3所述的一株植物根際促生細菌菌株，其特征在于，對番茄早疫病害有明顯的防治效果。5、根據(jù)權利要求3所述的一株植物根際促生細菌菌株，其特征在于，對番茄植株的生長有明顯的促進作用。6、根據(jù)權利要求3所述的一株植物根際促生細菌菌株，其特征在于，可在番茄植株根際大量定殖。全文摘要本發(fā)明公開了一株植物根際促生細菌。菌株從青海牦牛糞中分離，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名為BacillussubtilisQM34，保藏日2008年09月22日，保藏號CGMCCNo.2669；本發(fā)明QM34菌株對12種土傳性植物真菌病原菌均有拮抗作用；菌株QM34發(fā)酵液和QM34發(fā)酵液的無細胞培養(yǎng)液對番茄早疫病有明顯的防治效果，對番茄植株的生長有明顯的促進作用，且能在番茄植株根際大量定殖。故本發(fā)明是用于番茄早疫病害生物防治的一株廣譜性根際促生細菌，定會倍受人們青睞。文檔編號C12R1/125GK101402930SQ20081018129公開日2009年4月8日申請日期2008年11月15日優(yōu)先權日2008年11月15日發(fā)明者徐建國,胡青平申請人:山西師范大學