專利名稱：一種能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拮抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)生細(xì)菌，尤其涉及一種能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拮抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌，同時(shí)還涉及一種該內(nèi)生細(xì)菌的分離方法。
背景技術(shù)：
番爺早疫病是由半知菌亞門(mén)爺鏈格孢菌(Alternaria solani)引起,在全國(guó)各地都有發(fā)生，是番茄的主要病害之一。目前對(duì)于該病的防治主要依靠化學(xué)藥劑，然而隨著對(duì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，人們?cè)絹?lái)越重視化學(xué)農(nóng)藥所造成殘留和環(huán)境污染問(wèn)題。生物防治已經(jīng)成為控制病害的重要手段，而植物內(nèi)生細(xì)菌作為植物病害生物防治的潛在資源菌具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并且已經(jīng)顯示出很好的利用前景。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拮抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌。
同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供一種該內(nèi)生細(xì)菌的分離方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拮抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌，命名為Fb9(Bacillum sp.)，保藏于位于中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2011年12月8日，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011448。
本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種內(nèi)生細(xì)菌的分離方法，包括以下步驟采集健康番茄植株的根、莖、葉各3g，在75%的酒精中浸泡30s，然后用O. I %的升汞消毒3min，用無(wú)菌水沖洗5次后,于滅菌的研缽中研磨,加入5ml無(wú)菌水混勻，分別取最后一次的沖洗液和研磨液200ul，涂布于NB培養(yǎng)基平板上，在28°C下培養(yǎng)，逐日觀察，如最后一次沖洗液涂布的培養(yǎng)基中無(wú)菌落，在研磨液涂布的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌落為內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)行純化培養(yǎng)后，4°C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 所述的沖洗液組成為75%的酒精中浸泡30s，l%的升汞消毒3min，無(wú)菌水沖洗5 次，無(wú)菌水是經(jīng)過(guò)高壓蒸 汽滅菌鍋滅菌的蒸餾水。
所述的研磨液為無(wú)菌水，無(wú)菌水是經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌的蒸餾水。
所述的NB培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂條18g，加蒸餾水至 1000mL。
本發(fā)明利用稀釋分離法，從健康的番茄植株中分離得到11個(gè)細(xì)菌菌株。通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選出對(duì)三種病菌抑菌效果最好的Fb9菌株，對(duì)番茄早疫病菌、番茄菌核病菌、黃瓜枯萎病菌抑菌率分別為70. 81%,74. 35%,65. 17%。Fb9菌株對(duì)番茄的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，對(duì)番茄早疫病的室內(nèi)盆栽防治效果為63. 7%。經(jīng)試驗(yàn)通過(guò)分離篩選獲得對(duì)番茄早疫病具有防治效果的番茄內(nèi)生細(xì)菌菌株，并鑒定出該菌株對(duì)番茄的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。
本發(fā)明的內(nèi)生細(xì)菌，命名為Fb9 (Bacillum sp.)，保藏于位于中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2011年12月8日，保藏編號(hào)為CCTCC NO M2011448。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的內(nèi)生細(xì)菌的具體分離過(guò)程如下
I.材料與方法
I. I供試菌株與番茄品種
番爺早疫病菌Alternaria solani和黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum從田間發(fā)病植株上分離得到，番爺菌核病菌Sclerotinia scIerotiorum由河南科技大學(xué)林學(xué)院植保系實(shí)驗(yàn)室保存；供試番爺品種為‘中蔬四號(hào)’。
I. 2培養(yǎng)基
細(xì)菌培養(yǎng)用NB培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)及平板對(duì)峙試驗(yàn)用PDA培養(yǎng)基。
L 3番茄內(nèi)生細(xì)菌的分離
米集健康番爺植株的根、圣、葉各3g,在75%的酒精中浸泡30s,然后用1%的升萊消毒3min,用無(wú)菌水沖洗5次后,于滅菌的研缽中研磨，加入5ml無(wú)菌水混勻,分別取最后一次的沖洗液和研磨液200ul，涂布于NB培養(yǎng)基平板上，在28°C下培養(yǎng)，逐日觀察，如最后一次沖洗液涂布的培養(yǎng)基中無(wú)菌落，在研磨液涂布的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌落是內(nèi)生菌，進(jìn)行純化培養(yǎng)后，4 C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> I. 4拮抗活性測(cè)定
番茄早疫病菌、番茄菌核病菌、黃瓜枯萎病菌活化培養(yǎng)，制成8mm的菌餅放置于 PDA培養(yǎng)基中心，四周40mm處分別放置三片8mm大小含有內(nèi)生細(xì)菌的濾紙片，置于28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 5天，測(cè)量抑菌圈半徑并計(jì)算抑菌率。
權(quán)利要求
1.一種能夠促進(jìn)番爺生長(zhǎng)并拈抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌Fb9(Baci I Ium sp.),保藏日期為2011年12月8日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2011448。
2.一種能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拈抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌的分離方法，其特征在于包括以下步驟采集健康番茄植株的根、莖、葉各3g，在75%的酒精中浸泡30s，然后用O. 1%的升汞消毒3min，用無(wú)菌水沖洗5次后，于滅菌的研缽中研磨，加入5ml無(wú)菌水混勻，分別取最后一次的沖洗液和研磨液200ul，涂布于NB培養(yǎng)基平板上，在28°C下培養(yǎng)，逐日觀察，如最后一次沖洗液涂布的培養(yǎng)基中無(wú)菌落，在研磨液涂布的培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的菌落為內(nèi)生細(xì)菌， 進(jìn)行純化培養(yǎng)后，4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拈抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌的分離方法， 其特征在于所述的沖洗液為75%的酒精中浸泡30s，0. 1%的升汞消毒3min，無(wú)菌水沖洗 5次，無(wú)菌水是經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌的蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拈抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌的分離方法， 其特征在于所述的研磨液是無(wú)菌水，無(wú)菌水是經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌的蒸餾水。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拈抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌的分離方法，其特征在于所述的NB培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，加蒸餾水至 IOOOmL0
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拈抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌的分離方法， 其特征在于向NB培養(yǎng)基中加入瓊脂條18g，為固體培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)并拈抗三種病害的內(nèi)生細(xì)菌及其分離方法，內(nèi)生細(xì)菌Fb9(Bacillum sp.)，保藏日期為2011年12月8日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 2011448。本發(fā)明通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選出對(duì)三種病菌抑菌效果最好的Fb9菌株，對(duì)番茄早疫病菌、番茄菌核病菌、黃瓜枯萎病菌抑菌率分別為70.81％、74.35％、65.17％。Fb9菌株對(duì)番茄的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，對(duì)番茄早疫病的室內(nèi)盆栽防治效果為63.7％。經(jīng)試驗(yàn)通過(guò)分離篩選獲得對(duì)番茄早疫病具有防治效果的番茄內(nèi)生細(xì)菌菌株，并鑒定出該菌株對(duì)番茄的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102864092SQ20121001152
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者李永麗, 周洲, 崔林開(kāi), 胡艷紅, 李凡, 于雪 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)