一種含acc脫氨酶的pgpr篩選和分離方法
【技術領域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種含ACC脫氨酶的PGPR篩選和分離方法。
【背景技術】
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[0002]在所有根際促生菌中，尤以含ACC (l-aminocyclopropane-l-carboxylicacid)脫氨酶活性的PGPR，不僅能有效的促進植物的生長，而且在逆境條件下(重金屬污染、干旱、洪澇、高鹽等)能大大提高植物的抗逆性。
[0003]球花石楠是很好的園林綠化樹種，四季常綠，同時在常綠的樹種中也是十分難得的季節(jié)性色葉樹種。它的觀賞價值主要體現(xiàn)在它的葉、花、果實以及樹形等觀賞特性上[62]。球花石楠在園林上的觀賞價值十分高，其樹冠圓整，果實呈鮮艷的紅色，一年四季都有其可觀賞的價值，在園林綠化中扮演著十分重要的角色。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0004]本發(fā)明目的是，用來彌補現(xiàn)有技術的不足，提供一種含ACC脫氨酶的PGPR篩選和分離方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下:
[0006]一種含ACC脫氨酶的PGPR篩選和分離方法，包括以下幾個步驟:
[0007](1)采集:采集植物根系和根際土壤，備用；
[0008](2)根際菌的分離和純化:將采集的根際土壤放于裝有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)自然風干，5-7d后稱取lg根際土壤，將其溶解于裝有10ml無菌水和玻璃珠的錐形瓶里，振蕩兩小時，吸取1ml渾濁液，加無菌水稀釋到10ml，振蕩搖勻后吸取1ml渾濁液，將其稀釋到10ml，制成菌懸液；然后再吸取50 μ L菌懸液用涂布器均勻的涂布在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培養(yǎng)基平板中，然后用封口膜封口，放置于30 ± 2 °C不需光照的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；48-72h后，挑取單菌落，反復劃線驗證觀察其是否能生長，然后接種于38號培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，連續(xù)劃線3次，得到細菌的純培養(yǎng)物；
[0009](3)內(nèi)生菌的分離和純化:根系用自來水洗凈泥土等臟物，將根切成約0.5cm的小段，無菌水沖洗3-5次，Tween-20處理60s，5%次氯酸鈉溶液消毒6min，2.5%的硫代硫酸鈉處理lOmin，無菌水沖洗3_4次，75%酒精浸泡lmin，無菌水洗滌3_4次，最后將其放入已滅菌的硅膠中，封口放入55°C烘箱中烘干，將已烘干的組織放入已消毒的豆?jié){攪拌機里打碎成粉末，然后取少許粉末均勻灑在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培養(yǎng)基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2°C不需光照的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；48-72h后，挑取單菌落，反復劃線驗證觀察其是否能生長，然后接種于38號培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，連續(xù)劃線3次，得到細菌的純培養(yǎng)物。
[0010]所述的一種含ACC脫氨酶的PGPR篩選和分離方法，采集的為月季根際土壤及其根系Ο
[0011 ] 所述的一種含PGPR菌株的種子萌發(fā)液，將PGPR菌株接種于ADF培養(yǎng)基平板中，然后挑取單菌落接種于lOOmLADF液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，1-1.5d后將其分別移入離心管中，于臺式高速冷凍離心機中，8500rpm、4°C、10min，離心棄上清，然后用配置好的30mmol.L_1硫酸鎂緩沖溶液洗滌兩次，得到種子萌發(fā)液。
[0012]所述的一種種子萌發(fā)液的使用方法，將種子萌發(fā)液于紫外可見分光光度計下稀釋到0.01-0.05Abs，浸泡種子即可。
[0013]所述的一種種子萌發(fā)液用于球花石楠種子萌發(fā)的方法，包括以下幾個步驟:
[0014](1)球花石楠果實處理:將采集后的球花石楠果實放入水中浸泡2h左右，然后揉搓去除果肉，再用細篩過濾出球花石楠種子，并去除其中雜質，于陰涼通風處晾干，l-2d后將風干后的種子，放入種子萌發(fā)液中浸泡12h，過濾放入裝有濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；
[0015](2)培養(yǎng):將上述經(jīng)過處理的球花石楠種子移入光照培養(yǎng)箱中予以培養(yǎng)，溫度設定為22°C，光照強度為4LS，濕度為90%，光周期設定為16h白晝，8h黑夜。
[0016]本發(fā)明的有益效果如下:
[0017]本發(fā)明的篩選和分離方法簡單，效果好，分離得到的PGPR菌株可以用來作為種子萌發(fā)液，在用來萌發(fā)球花石楠種子時，發(fā)芽率為86% -87.3%，發(fā)芽勢為72%-73%,平均根長為1.90-1.93cm,沒有采用種子萌發(fā)液處理的球花石楠種子發(fā)芽率為67.7%，發(fā)芽勢為66%，根長為 1.05cm。
【具體實施方式】
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[0018]為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0019]實施例1
[0020]一種含ACC脫氨酶的PGPR篩選和分離方法，包括以下幾個步驟:
[0021](1)采集:采集月季根系和根際土壤，備用；
[0022](2)根際菌的分離和純化:將采集的根際土壤放于裝有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)自然風干，5-7d后稱取lg根際土壤，將其溶解于裝有10ml無菌水和玻璃珠的錐形瓶里，振蕩兩小時，吸取1ml渾濁液，加無菌水稀釋到10ml，振蕩搖勻后吸取1ml渾濁液，將其稀釋到10ml，制成菌懸液；然后再吸取50 μ L菌懸液用涂布器均勻的涂布在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培養(yǎng)基平板中，然后用封口膜封口，放置于30 ± 2 °C不需光照的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；48-72h后，挑取單菌落，反復劃線驗證觀察其是否能生長，然后接種于38號培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，連續(xù)劃線3次，得到細菌的純培養(yǎng)物；
[0023](3)內(nèi)生菌的分離和純化:根系用自來水洗凈泥土等臟物，將根切成約0.5cm的小段，無菌水沖洗3-5次，Tween-20處理60s，5%次氯酸鈉溶液消毒6min，2.5%的硫代硫酸鈉處理lOmin，無菌水沖洗3_4次，75%酒精浸泡lmin，無菌水洗滌3_4次，最后將其放入已滅菌的硅膠中，封口放入55°C烘箱中烘干，將已烘干的組織放入已消毒的豆?jié){攪拌機里打碎成粉末，然后取少許粉末均勻灑在用ACC替代其氮源的GTN、M9或DF等培養(yǎng)基平板中，然后用封口膜封口，放置于30±2°C不需光照的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；48-72h后，挑取單菌落，反復劃線驗證觀察其是否能生長，然后接種于38號培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，連續(xù)劃線3次，得到細菌的純培養(yǎng)物。
[0024]所述的一種含PGPR菌株的種子萌發(fā)液，將PGPR菌株接種于ADF培養(yǎng)基平板中，然后挑取單菌落接種于lOOmLADF液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，1-1.5d后將其分別移入離心管中，于臺式高速冷凍離心機中，8500rpm、4°C、10min，離心棄上清，然后用配置好的30mmol.L_1硫酸鎂緩沖溶液洗滌兩次，得到種子萌發(fā)液。
[0025]所述的一種種子萌發(fā)液的使用方法，將種子萌發(fā)液于紫外可見分光光度計下稀釋到0.01-0.05Abs，浸泡種子即可。
[0026]所述的一種種子萌發(fā)液用于球花石楠種子萌發(fā)的方法，包括以下幾個步驟:
[0027](1)球花石楠果實處理:將采集后的球花石楠果實放入水中浸泡2h左右，然后揉搓去除果肉，再用細篩過濾出球花石楠種子，并去除其中雜質，于陰涼通風處晾干，l-2d后將風干后的種子，放入0.0lAbs種子萌發(fā)液中浸泡12h，過濾放入裝有濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng);
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