專利名稱：膽色素原脫氨酶基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列和攜帶這些序列的核酸構(gòu)建體。 本發(fā)明還涉及新的基因治療載體以及使用所述載體治療和預(yù)防膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況的方法。更具體而言，本發(fā)明的基因治療載體可以用于緩解包括急性間歇性卟啉病在內(nèi)的這類疾病狀況的癥狀的方法。發(fā)明背景 急性間歇性卟啉病(AIP)是遺傳代謝病，其特征為膽色素原脫氨酶(PBGD)即血紅素合成途徑的第三個(gè)酶缺乏。該酶的活性在繼承該遺傳性狀的人中為正常活性的約50% 該疾病以常染色體顯性方式遺傳，并且是最常見的急性卟啉病。盡管其發(fā)生于所有的種族中，但是其在北歐最流行，主要在瑞典、英國(guó)和愛爾蘭。在美國(guó)和其他國(guó)家，估計(jì)的流行程度為5/100000，在瑞典北部高達(dá)60-100/100000。目前，PB⑶基因中超過225個(gè)突變已有描述。顯性臨床特征為由于神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙導(dǎo)致的急性間歇性發(fā)作，包括腹部疼痛、腦脊髓交感神經(jīng)系統(tǒng)障礙和循環(huán)障礙。腹部疼痛已在85-95%的病例中有報(bào)道，并且是最常見的特征，隨后是神經(jīng)變化或與神經(jīng)變化有關(guān)。如果AIP未被識(shí)別到，且未撤回有害藥物，如可以促使發(fā)作發(fā)生的肝細(xì)胞色素P450酶所代謝的藥物，就會(huì)發(fā)生向呼吸麻痹和延髓麻痹以及死亡的進(jìn)展。由于心律失常，還可以發(fā)生突然死亡。也會(huì)發(fā)生原發(fā)性肝癌和腎功能受損。PB⑶的遺傳缺乏不足以出現(xiàn)癥狀。繼承PB⑶突變的高比例的個(gè)體從未發(fā)展卟啉病癥狀，即臨床外顯率很低。AIP攜帶者的臨床癥狀與卟啉前體Δ -氨基乙酰丙酸(ALA)和膽色素原(PBG)的產(chǎn)生和分泌增加(由于激發(fā)急性發(fā)作的藥物或其他誘發(fā)因素導(dǎo)致血紅素合成要求增加)有關(guān)。在這些情況中，PB⑶缺乏限制了血紅素合成，結(jié)果血紅素介導(dǎo)的ALA 合成酶(ALASl)抑制受到削弱。有證據(jù)表面，肝是過量卟啉前體的主要來源。這些化合物在傾向于重復(fù)卟啉病危險(xiǎn)期的那些人的發(fā)作中升高，并在危險(xiǎn)期中進(jìn)一步增加。如果疾病長(zhǎng)時(shí)期保持無活性，它們可以降低至正常。急性發(fā)作經(jīng)常在青春期后發(fā)生，并且可以通過內(nèi)分泌因素和類固醇激素以及多種環(huán)境因素在潛伏的個(gè)體中誘發(fā)，包括藥物、營(yíng)養(yǎng)因素、受限的碳水化合物和熱量攝取、抽煙、 類固醇激素和口服避孕藥、鉛中毒、并發(fā)感染、外科手術(shù)以及心理壓力。藥物是最重要的促使急件發(fā)作發(fā)牛的因素，并目.安全藥物名錄可在www. druRs-porphyria. com中獲得。抽煙、 酒精以及為CYP450所代謝的藥物極大地增加了肝血紅素需求并導(dǎo)致ALASl誘導(dǎo)，ALASl增加卟啉前體的產(chǎn)生并促使急性發(fā)作發(fā)生。同樣，ALASl受在禁食期在肝中被誘導(dǎo)的過氧化物酶體增生物激活受體Y共激活劑la (PGCla)的正向調(diào)節(jié)。在誘發(fā)因素中，類固醇激素看起來發(fā)揮重要作用。這一概念受到疾病很少在青春期前表現(xiàn)出來以及口服避孕藥在一些患有PB⑶缺乏的女性中使發(fā)作加劇這一事實(shí)的支持。同樣，女性感染(80%)比男性感染 (20%)更頻繁。急性發(fā)作用輸注葡萄糖和氯高鐵血紅素治療(Normosang，Orphan Europe)。葡萄糖看起來拮抗PGC-I α所介導(dǎo)的ALASl誘導(dǎo)。氯高鐵血紅素恢復(fù)調(diào)節(jié)血紅素庫并抑制肝ALASl誘導(dǎo)。一些女性發(fā)展了可通過促性腺素釋放素(&iRH)類似物預(yù)防的經(jīng)期前發(fā)作。一些患者表現(xiàn)出復(fù)發(fā)的急性發(fā)作和嚴(yán)重的致殘性神經(jīng)功能障礙(disabling neurological dysfunction) 0晚期神經(jīng)損傷和亞急性和慢性癥狀對(duì)血紅素治療無應(yīng)答。這是僅能通過異源肝移植治愈的威脅生命的疾病狀況，異源肝移植目前在3名患者中阻止了神經(jīng)毒性ALA 和PBG累積。然而，肝移植可獲得的相容供體有限和具有顯著的發(fā)病率和死亡率。因此，基因替代治療在除了 PBGD缺乏肝功能完全正常的患者中是肝移植的潛在可選方案?；蛑委熓峭ㄟ^使用載體將特定基因?qū)爰?xì)胞來控制疾病的方法。旨在校正肝酶缺陷的基因送遞治療的可行性正在AIP(AIP小鼠)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭醒芯俊Ｏ俨《据d體介導(dǎo)的PBGD向卟啉病小鼠的基因轉(zhuǎn)移，由于PBGD的短暫肝表達(dá)而表現(xiàn)出短期治療功效(Johansson, 2004, Mol. Ther. 10(2) :337-43)。這些結(jié)果建立了原理驗(yàn)證 (proof-of-principle)，表明病毒載體介導(dǎo)的PB⑶基因送遞可以在AIP小鼠中短暫地緩解苯巴比妥誘發(fā)的卟啉病發(fā)作的嚴(yán)重表現(xiàn)。EP 1 049 487僅在概念水平上公開了含有人B⑶cDNA的rAAV載體的構(gòu)建。然而，本領(lǐng)域仍然需要用于AAV介導(dǎo)的向有需要的對(duì)象送遞hPBGD的改善的載體和方案。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了核苷酸序列，即核酸或多核苷酸，其編碼人膽色素原脫氨酶 (PB⑶)，其中至少約320個(gè)編碼人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO 1中的密碼子相同，或其中至少約305個(gè)編碼人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO :3中的密碼子相同。 優(yōu)選地，通過Needleman和^msch全局比對(duì)算法測(cè)定，所述編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列與SEQ ID NO :1或3的全長(zhǎng)具有至少95%相同性。SEQ ID NO :1和3中的“密碼子”指從SEQ ID NO :1和3的核苷酸1開始的讀框中的密碼子，即不是從SEQ ID NO :1和3的核苷酸2或3開始的讀框。換而言之，SEQ ID NO :1和3的第一個(gè)密碼子以核苷酸數(shù)1-3表示。在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中至少約320個(gè)編碼人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO :1中的密碼子相同，或其中至少約305個(gè)編碼人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO 3中的密碼子相同。優(yōu)選地，在所述核酸構(gòu)建體中，編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列可操作地連接于用于在人細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，優(yōu)選肝特異性啟動(dòng)子。在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的病毒基因治療載體，所述核苷酸序列可操作地連接于用于在人細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述載體是重組細(xì)小病毒載體或腺伴隨病毒(AAV)載體。在另一方面，本發(fā)明涉及核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體(包含重組細(xì)小病毒載體或AAV載體)，所述載體包含編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列。仍然在另一方面，本發(fā)明涉及包含此類核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明的其他方面涉及這些核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體作為藥物和在治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況中的用途，其中優(yōu)選所述疾病狀況是急性間歇性卟啉病(AIP)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體在制備用于治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況的藥物中的用途。還提供了將編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列送遞到哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括a.提供本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體；以及b.在使得蛋白以在哺乳動(dòng)物中提供治療效果的水平表達(dá)的條件下，給所述哺乳動(dòng)物施用所述核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體。本發(fā)明還涉及治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況的方法，其中所述方法包括給患有膽色素原脫氨酶缺乏的對(duì)象施用有效量的藥物組合物，所述組合物包含具有編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體，其中，優(yōu)選地， 所述疾病狀況是急性間歇性卟啉病。發(fā)明描述定義“核酸”包括由單體核苷酸組成的或包含單體核苷酸的任何分子。術(shù)語“核苷酸序列”在本文中可以與“核酸”互換使用。核酸可以說是寡核苷酸或多核苷酸。核酸可以是 DNA或RNA。核酸可以是化學(xué)修飾的或人工的。人工核酸包括肽核酸(PNA)、嗎啉代核酸和鎖核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和蘇糖核酸(TNA)。這些核酸中的每一種與天然存在的DNA或RNA的區(qū)別在于分子主鏈的變化。同樣，也可以使用硫代磷酸酯核苷酸。其他脫氧核苷酸類似物包括甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3' P5'-氨基磷酸酯以及寡核糖核苷酸硫代磷酸酯和它們的2' -0-烯丙基類似物和2' -0-甲基核糖核苷酸甲基磷酸酯，其可以用于本發(fā)明的核酸中?！昂怂針?gòu)建體”在本文中理解為，表示使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的人造核酸分子。核酸構(gòu)建體是單鏈或雙鏈核酸分子，其被修飾為含有核酸的片段，所述核酸的片段以不在自然界另外存在的方式組合和并列。核酸構(gòu)建體通常是“載體”，即用于將外源產(chǎn)生的DNA送遞到宿主細(xì)胞的核酸分子。—種類型的核酸構(gòu)建體是“表達(dá)盒”或“表達(dá)載體”。這些術(shù)語指核苷酸序列，所述核苷酸序列能實(shí)現(xiàn)基因在與這類序列相容的宿主細(xì)胞或宿主生物中表達(dá)。表達(dá)盒或表達(dá)載體通常包括至少合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，和任選地3’轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。還可以存在有助于實(shí)現(xiàn)表達(dá)或?qū)崿F(xiàn)表達(dá)所需的其他因子，如表達(dá)增強(qiáng)子元件。術(shù)語“同源的”，當(dāng)用于表示給定的(重組)核酸或多肽分子與給定的宿主生物體或宿主細(xì)胞間的關(guān)系時(shí)，應(yīng)理解為表示所述核酸或多肽分子本質(zhì)上是由相同種類的宿主細(xì)胞或生物產(chǎn)生的。術(shù)語“異源的”可以用于表示核酸或多肽分子本質(zhì)上是用不同種類的宿主細(xì)胞或生物產(chǎn)生的。如本文所用，術(shù)語“可操作地連接”指多核苷酸(或多肽)元件在功能關(guān)系中的連接。當(dāng)將核酸置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，所述核酸是“可操作地連接”的。例如， 如果轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作地連接于該編碼序列。 可操作地連接表示連接的DNA序列通常是連續(xù)的，并且，如果需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)，則是連續(xù)的和符合讀框的?！氨磉_(dá)控制序列”指調(diào)節(jié)與其可操作地連接的核苷酸序列的表達(dá)的核酸序列。當(dāng)表達(dá)控制序列控制并調(diào)節(jié)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯時(shí)，所述表達(dá)控制序列“可操作地
6連接”于所述核苷酸序列。因此，表達(dá)控制序列可以包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ、轉(zhuǎn)錄終止子、位于蛋白編碼基因前的起始密碼子、內(nèi)含子剪接信號(hào)以及終止密碼子。術(shù)語“表達(dá)控制序列”意圖最低限度包括其存在被設(shè)計(jì)為影響表達(dá)的序列，并且還可以包括其他有利的組分。例如，前導(dǎo)序列和融合伴侶序列是表達(dá)控制序列。該術(shù)語也可以包括核酸序列的設(shè)計(jì)，以至將讀框內(nèi)外不需要的、潛在的起始密碼子從序列中去除。其也可以包括核酸序列的設(shè)計(jì)，以至去除不需要的潛在剪接位點(diǎn)。其包括指導(dǎo)PolyA尾添加的序列或聚腺苷酸化序列，PolyA是位于mRNA 3'末端的一串腺嘌呤殘基，其可以稱為polyA序列。其還可以被設(shè)計(jì)為增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性。適用于昆蟲細(xì)胞中的影響轉(zhuǎn)錄和翻譯穩(wěn)定性的表達(dá)控制序列即啟動(dòng)子，以及影響翻譯的序列，如Kozak序列(Kozak sequence)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。表達(dá)控制序列可以具有如調(diào)節(jié)與其可操作地連接的核苷酸序列的這種性質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)更低或更高的表達(dá)水平。如本文所用，術(shù)語“啟動(dòng)子”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”指核酸片段，其功能是控制一個(gè)或多個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，并且對(duì)于編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向而言位于上游，并且在結(jié)構(gòu)上由DNA依賴性RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其他DNA序列的存在所鑒定，包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、阻遏和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的作用是直接或間接調(diào)節(jié)由啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的量的任何其他核苷酸序列，包括例如衰減子或增強(qiáng)子以及沉默子?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中有活性的啟動(dòng)子。“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子是受到生理或發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，如通過應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)。 “組織特異性”啟動(dòng)子僅在特定類型的組織或細(xì)胞中有活性?！?，UTR，，或“3，非翻譯序列”(也稱為3，非翻譯區(qū)，或3’末端)指在基因的編碼序列的下游所發(fā)現(xiàn)的核酸序列，其包含例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和(在大多數(shù)但不是所有的真核 mRNA中)聚腺苷酸化信號(hào)(如AAUAAA或其變體)。在轉(zhuǎn)錄終止后，mRNA轉(zhuǎn)錄物可以在聚腺苷酸化信號(hào)的下游受到切割，并且可以添加poly㈧尾，poly㈧尾參與mRNA向細(xì)胞質(zhì) (發(fā)生翻譯的地方)的轉(zhuǎn)運(yùn)。術(shù)語“實(shí)質(zhì)上相同(substantially identical) ”、“實(shí)質(zhì)相同性”或“基本上相似” 或“基本相似性”表示，兩個(gè)肽或兩個(gè)核苷酸序列，當(dāng)最佳比對(duì)時(shí)，比如通過GAP或BESTFIT 程序，利用默認(rèn)參數(shù)，共享本文其他地方所限定的某些百分比的序列相同性。GAP利用 Needleman和^msch全局比對(duì)算法對(duì)它們的全長(zhǎng)比對(duì)兩個(gè)序列，從而使匹配最大化而使空位最小化。通常，使用GAP默認(rèn)參數(shù)，空位產(chǎn)生罰分=50 (核苷酸)/8(蛋白)，空位延伸罰分=3 (核苷酸)/2 (蛋白)。對(duì)于核苷酸，所用的默認(rèn)評(píng)分矩陣是nwsgapdna，對(duì)于蛋白，默認(rèn)評(píng)分矩陣是 Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89,915-919) 顯然，當(dāng)認(rèn)為 RNA 序列與DNA序列基本上相似或具有某種程度的序列相同性時(shí)，認(rèn)為DNA序列中的胸腺嘧啶 ⑴等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。序列比對(duì)和序列百分比相同性得分可以利用計(jì)算機(jī)程序測(cè)定，如 GCG Wisconsin Package，版本 10. 3，可從 Accelrys Inc. , 9685Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752，USA獲得，或開放源碼軟件用于Windows的Emboss (當(dāng)前版本 2. 7. 1-07)?？蛇x地，相似性或相同性百分比可通過針對(duì)諸如FASTA、BLAST等的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索而測(cè)定。在本說明書和權(quán)利要求書中，動(dòng)詞“包含”和其變形以其非限制性意義使用，表示包括該詞語后的項(xiàng)目，但不排除未明確提到的項(xiàng)目。另外，不定冠詞“a ( —個(gè))”或“an ( 一個(gè))”所提到的元件不排斥存在多于一個(gè)該元件的可能性，除非上下文明確要求存在且僅存在一個(gè)該元件。不定冠詞“a (—個(gè))”或“an (—個(gè))，，因此通常表示“至少一個(gè)”。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列。所述編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列優(yōu)選是合成核苷酸序列。術(shù)語“合成核苷酸序列”在本文中理解為，表示該核苷酸序列在自然界中并不如此存在，而是受到人的干預(yù)的設(shè)計(jì)、改造和/或構(gòu)建。術(shù)語“合成”因此并不一定意味著序列無一例外地和/或完全通過化學(xué)合成獲得。更確切地是，盡管合成序列的部分在一個(gè)階段可能已經(jīng)通過化學(xué)合成獲得，但是包含本發(fā)明的合成序列的分子通常通過生物來源如(培養(yǎng)的，如重組)細(xì)胞獲得。本發(fā)明的核苷酸序列可以編碼紅系(erythroid)或非紅系膽色素原脫氨酶。優(yōu)選地，所述核苷酸序列編碼人來源的膽色素原脫氨酶。所述核苷酸序列因此可以編碼等位基因形式的人膽色素原脫氨酶的任何天然存在的氨基酸序列。然而，本發(fā)明明確包括的是編碼與例如天然存在的氨基酸序列相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入的膽色素原脫氨酶的改造突變蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述核苷酸序列編碼具有膽色素原脫氨酶活性(EC 2.5. 1.61)的蛋白，所述活性可以通過諸如feight and Lim(1983, Biochem. J. 213 :85-88)所述的測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列與天然存在的編碼脫氨酶的核苷酸序列相比，具有對(duì)于人細(xì)胞而言改善的密碼子使用偏好。編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列對(duì)人細(xì)胞的密碼子使用的適應(yīng)性可以表示為密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index, CAI)。密碼子適應(yīng)指數(shù)在本文中定義為對(duì)高表達(dá)的人基因的密碼子使用，基因的密碼子使用的相對(duì)適應(yīng)性的度量。每個(gè)密碼子的相對(duì)適應(yīng)性(w)，是每個(gè)密碼子的使用與同一個(gè)氨基酸最豐富密碼子的使用的比率。將CAI定義為這些相對(duì)適應(yīng)性值的幾何平均數(shù)。排除非同義密碼子和終止密碼子(取決于遺傳密碼)。CAI值的范圍為0-1，較高的值表示較高比例的最豐富的密碼子(參閱Siarp and Li, 1987,Nucleic Acids Research 15 :1281-1295 ；還參閱Kim et al. ,Gene. 1997,199 :293-301 ；zur Megede et al. , Journal of Virology, 2000, 74 :2628-2635)。優(yōu)選地編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的CAI為至少 0. 8、0· 85、0· 90、0· 92、0· 94、0· 95、0· 96 或 0. 97。在本發(fā)明優(yōu)選的核苷酸序列中，編碼非紅系膽色素原脫氨酶的所有密碼子中有至少 320、330、340、345、350、355、356、357、358、359、360 或 361 個(gè)密碼子與 SEQ ID NO 1 中 (相應(yīng)位置中)的密碼子相同。更優(yōu)選，所述核苷酸序列編碼SEQ ID NO :2的氨基酸序列?？蛇x地，在本發(fā)明優(yōu)選的核苷酸序列中，編碼細(xì)胞胞類膽色素原脫氨酶的密碼子中有至少 305、310、315、320、325、330、335、340、341、342、343 或 344 個(gè)密碼子與 SEQ ID NO 3中(相應(yīng)位置中)的密碼子相同。更優(yōu)選地，所述核苷酸序列編碼SEQ ID N0:4的氨基酸序列。SEQ ID NO :1和3中的“密碼子”指從SEQ ID NOs :1和3的核苷酸1開始的讀框內(nèi)的密碼子，即不是從SEQ ID NO :1和3的核苷酸2或3開始的讀框。換而言之，SEQ ID NO :1和3的第一個(gè)密碼子以核苷酸數(shù)1-3表示。本發(fā)明另一優(yōu)選的核苷酸序列編碼具有膽色素原脫氨酶活性的多肽，由此，該核苷酸序列在其全長(zhǎng)與SEQ ID NO :1或3具有至少95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列相同性，這通過Needleman和mmsch全局比對(duì)算法測(cè)定。更優(yōu)選，核苷酸序列編碼SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷酸序列具有SEQ ID NO :1或3的核苷酸序列。在另一方面，本發(fā)明涉及包含本文上文所限定的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體。在所述核酸構(gòu)建體中，編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列優(yōu)選地可操作地連接于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞相容表達(dá)控制序列，如啟動(dòng)子。許多此類啟動(dòng)子在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參閱Sambrook and RuSSell，2001，同上)?？梢允褂迷谠S多細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)的組成型啟動(dòng)子，如CMV 啟動(dòng)子。然而，誘導(dǎo)型、組織特異性、細(xì)胞類型特異性或細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子可以是優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列可操作地連接于肝特異性啟動(dòng)子。肝特異性啟動(dòng)子特別優(yōu)選用于與非紅系脫氨酶一起使用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的構(gòu)建體中，用于肝特異性表達(dá)的表達(dá)控制序列例如選自α 1抗胰蛋白酶(AAT)啟動(dòng)子、甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、甲狀腺素結(jié)合球蛋白(TBG)啟動(dòng)子、肝控制區(qū)(Hepatic Control Region, HCR)-ApoCII雜合啟動(dòng)子、HCR-hAAT雜合啟動(dòng)子、與小鼠白蛋白基因增強(qiáng)子(Ealb)元件組合的AAT啟動(dòng)子，以及載脂蛋白E啟動(dòng)子。其他實(shí)例包括用于腫瘤選擇性表達(dá)和特別是神經(jīng)細(xì)胞腫瘤選擇性表達(dá)的E2F啟動(dòng)子(Parr et al.，1997，Nat. Med. 3 1145-9)或用于單核血細(xì)胞的 IL-2 啟動(dòng)子(Hagenbaugh et al.，1997，J Exp Med ； 185 2101-10)。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中啟動(dòng)子具有SEQ ID NO :5的序列。在本發(fā)明核酸構(gòu)建體的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，3' UTR(或3'非翻譯序列)可以位于編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的下游。技術(shù)人員可獲得合適的3' UTR序列。它們可以衍生于任何哺乳動(dòng)物且優(yōu)選人基因，并且通常包含轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和聚腺苷酸化信號(hào) (如AAUAAA或其變體)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體包含衍生于人PBGD基因的 3' UTR，如 SEQ ID NO :6。在本發(fā)明核酸構(gòu)建體的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，可操作地連接于編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的表達(dá)控制序列的上游前面是PolyA絕緣子(polyA insulator)，以便終止從可能的上游轉(zhuǎn)錄單元開始的貫通轉(zhuǎn)錄。如上文所述且優(yōu)選地至少包含轉(zhuǎn)錄終止序列的3' UTR可以用于本目的。優(yōu)選的polyA絕緣子是具有SEQ ID NO :7的序列的合成polyA 絕緣子。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以包含在編碼膽色素原脫氨酶核苷酸序列的起始密碼子周圍的Kozak共有序列。Kozak共有序列在本文中定義為 GCCRCC (AUG) A (SEQ ID NO :8)，其中R是嘌呤(即A腺苷，或G鳥苷)，且其中(AUG)代表膽色素原脫氨酶編碼序列的起始密碼子。盡管在通常的Kozak共有序列中，直接在AUG起始密碼子之后的核苷酸是G (鳥苷)，但在本發(fā)明中，這個(gè)核苷酸在紅系和非紅系膽色素原脫氨酶編碼序列中優(yōu)選是A(腺苷)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Kozak共有序列的前面可以是另一 GCC三聯(lián)體。在其他方面，本發(fā)明涉及包含編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體， 所述核苷酸序列可操作地連接于上文所限定的表達(dá)控制序列，其中構(gòu)建體是適于哺乳動(dòng)物的基因治療優(yōu)選人的基因治療的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的核酸構(gòu)建體是病毒基因治療載體。病毒基因治療載體在本領(lǐng)域中是公知的，并且例如，包括基于腺病毒和細(xì)小病毒科
9(Parvoviridae)成員的載體，如腺伴隨病毒(AAV)或皰疹病毒、痘病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選的病毒基因治療載體是AAV、腺病毒載體或慢病毒載體。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的基因治療載體是細(xì)小病毒載體。因此，在該優(yōu)選的方面， 本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)小病毒的用途，特別是諸如感染性人或猿AAV的依賴病毒以及其組分 (如動(dòng)物細(xì)小病毒基因組)用作載體，將編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)該核苷酸序列。細(xì)小病毒科的病毒是小DNA動(dòng)物病毒。細(xì)小病毒科可以分成兩個(gè)亞科細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)，其感染脊椎動(dòng)物，和濃核癥病毒亞科(Densovirinae)，其感染昆蟲。 細(xì)小病毒亞科的成員在本文中稱為細(xì)小病毒，并包括依賴病毒屬(Dependovirus)。正如可以根據(jù)它們屬的名稱所推斷的，依賴病毒屬的成員是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兺ǔＲ笈c諸如腺病毒、皰疹病毒的輔助病毒的共感染，用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行生產(chǎn)性感染。依賴病毒屬包括AAV，其通常感染人(如血清型1、2、3A、;3B、4、5和6)或靈長(zhǎng)類(如血清型1和4)，以及感染其他溫血?jiǎng)游锏南嚓P(guān)病毒(如牛、犬、馬和綿羊的腺伴隨病毒)。有關(guān)細(xì)小病毒亞科的細(xì)小病毒和其他成員的其他信息描述于Kenneth I. Berns, “ Parvoviridae :The Viruses and Their Replication, " Chapter 69in Fields Virology(3d Ed. 1996)。為了方便，參照AAV，在本文中進(jìn)一步舉例說明和描述了本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于AAV，而可以等同應(yīng)用于其他細(xì)小病毒。所有已知的AAV血清型的基因組結(jié)構(gòu)都是非常相似的。AAV的基因組是線性的單鏈DNA分子，其長(zhǎng)度小于約5000個(gè)核苷酸(nt)。反向末端重復(fù)(ITR)位于非結(jié)構(gòu)復(fù)制 (Rep)蛋白和結(jié)構(gòu)(VP)蛋白的獨(dú)特的編碼核苷酸序列的側(cè)翼。VP蛋白(VPl、-2以及_3) 形成殼體。末端145nt是自我互補(bǔ)的，并且可以被組織以形成充分穩(wěn)定的分子內(nèi)雙鏈體的方式組織，所述雙鏈體形成T形發(fā)夾。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)揮病毒DNA復(fù)制的起點(diǎn)的功能，充當(dāng)細(xì)胞DNA聚合酶復(fù)合體的引物。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，野生型(Wt)AAV感染后，Rep基因(即 Rep78和R印5 分別由P5啟動(dòng)子和P19啟動(dòng)子表達(dá)，并且兩個(gè)R印蛋白都在病毒基因組復(fù)制中具有功能。R印ORF中的剪接事件導(dǎo)致實(shí)際上4個(gè)R印蛋白(即R印78、R印68、Rep52 和R印40)的表達(dá)。然而，已經(jīng)證明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編碼R印78和R印52蛋白的未剪接的mRNA足以用于AAV載體產(chǎn)生。同樣，在昆蟲細(xì)胞中，R印78和R印52蛋白足以使AAV載體產(chǎn)生?！爸亟M細(xì)小病毒載體或AAV載體”(或“rAAV載體”)在本文中指包含側(cè)翼為至少一個(gè)細(xì)小病毒反向末端重復(fù)序列(ITR)或AAV反向末端重復(fù)序列(ITR)的一個(gè)或多個(gè)目的多核苷酸序列、目的基因或“轉(zhuǎn)基因”的載體。當(dāng)存在于正在表達(dá)AAV r印和cap基因產(chǎn)物(即AAV R印和Cap蛋白)的昆蟲宿主細(xì)胞中時(shí)，可以使此類rAAV載體復(fù)制并包裝成感染性病毒顆粒。當(dāng)將rAAV載體并入更大的核酸構(gòu)建體(如在染色體中或在另一個(gè)諸如用于克隆或轉(zhuǎn)染的質(zhì)?；驐U狀病毒的載體中)中時(shí)，則rAAV載體通常稱為“前載體 (pro-vector) ”，在存在AAV包裝功能和必須的輔助功能的情況下，其可以通過復(fù)制和殼體化“營(yíng)救(rescue)”。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及包含如上文所述編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中核酸構(gòu)建體是重組細(xì)小病毒載體或AAV載體，因此包含至少一細(xì)小病毒ITR或AAVITR。優(yōu)選地，在核酸構(gòu)建體中，編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的側(cè)翼是位于任一側(cè)的細(xì)小病毒ITR或AAV ITR0任何細(xì)小病毒ITR或AAV ITR都可以用于本發(fā)明的構(gòu)建體中，包括來自AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8和/或AAV9的ITR。 AAV2的ITR是最優(yōu)選的。用于本發(fā)明優(yōu)選的核酸構(gòu)建體的優(yōu)選的ITR序列的實(shí)例是給定的 SEQ ID NO 9 (左或上游 ITR)和 SEQ ID NO 10(右或下游 ITR)。AAV能感染許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞。參閱如Tratschin et al. (1985，Mol. Cell Biol. 5 :3251-3260)和 Grimm et al. (1999，Hum. Gene Ther.邊2445-2450)。然而，人滑液成纖維細(xì)胞的AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著地比在相似的鼠細(xì)胞中更有效，Jennings et al.，Arthritis Res，3 :1(2001),且AAV的細(xì)胞向性(tropicity)在血清型中不同。參閱，例如Davidson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :3似8_3432)，對(duì)于哺乳動(dòng)物 CNS 細(xì)胞向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，其討論了 AAV2、AAV4 和 AAV5 中的差異，還參閱 Goncalves，2005，Virol J. 2(1) 43，其討論了修飾AAV向性的方法。對(duì)于肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有AAV1、AAV8和AAV5殼體蛋白的rAAV病毒體是優(yōu)選的(Nathwani et al. ,2007,Blood 109(4) :1414-1421 ；Kitajima et al. ,2006, Atherosclerosis 186(1) :65-7 ，其中具有 AAV5 殼體蛋白的 rAAV 病毒體是最優(yōu)選的?？捎糜诒景l(fā)明用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生rAAV載體的AAV序列可以衍生于任何AAV 血清型的基因組。通常，AAV血清型在氨基酸水平和核酸水平具有顯著同源性的基因組序列。這提供了產(chǎn)生病毒體的一套相同的遺傳功能，所述病毒體實(shí)質(zhì)上在物理和功能方面是等同的。有關(guān)各種AAV血清型的基因組序列和基因組相似性綜述，參閱例如GenBank登錄號(hào) U89790、GenBank 登錄號(hào) J01901、GenBank 登錄號(hào) AF043303、GenBank 登錄號(hào) AF085716、 Chlorini 等(1997，J.Vir. 71 :6823-33)、Srivastava 等(1983，J.Vir. 45 :555-64)、 Chlorini 等(1999，J. Vir. 73 :1309-1319)、Rutledge 等(1998，J.Vir. 72 :309-319)和 Wu 等0000，J. Vir. 74 :8635-47)。rAAV血清型1、2、3、4以及5是用于本發(fā)明的AAV核苷酸序列的優(yōu)選來源。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的AAV ITR序列衍生于AAV1、AAV2和/或AAV4。同樣，Rep (R印78/68和R印52/40)編碼序列優(yōu)選衍生于AAV1、AAV2和/或AAV4。然而，編碼用于本發(fā)明的病毒蛋白(VP) VP1、VP2和VP3殼體蛋白的序列，可以取自已知的42個(gè)血清型中的任何血清型,更優(yōu)選地取自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9，或通過殼體改組技術(shù)(capsid shuffling technique)和AAV殼體文庫獲得的新研發(fā)的AAV 樣顆粒。AAV Rep和ITR序列在大多數(shù)血清型中特別保守。各種AAV血清型的R印78蛋白例如超過89%相同，且在AAV2、AAV3A、AAV;3B和AAV6之間在基因組水平上總核苷酸序列相同性為約 82% (Bantel-Schaal et al. , 1999, J. Virol. ,73(2) :939-947)。而且，已知許多 AAV血清型的Rep序列和ITR，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生AAV顆粒時(shí)，有效地與來自其他血清型的相應(yīng)序列交叉互補(bǔ)(即在功能上取代)。US2003148506報(bào)道，AAV Rep和ITR序列在昆蟲細(xì)胞中也有效地與其他AAV R印和ITR序列交叉互補(bǔ)。已知AAV VP蛋白決定AAV病毒體的細(xì)胞向性。在不同AAV血清型中，VP蛋白編碼序列明顯沒有R印蛋白和基因保守。R印和ITR序列與其他血清型的相應(yīng)序列交叉互補(bǔ)的能力允許產(chǎn)生包含一血清型(如AAV5)的殼體蛋白和另一 AAV血清型(如AAV2)R印和/或 ITR序列的假型rAAV顆粒。這類假型rAAV顆粒是本發(fā)明的一部分。在本文中，假型rAAV 顆?？梢苑Q為是“x/y”型，其中“X”表示ITR的來源，而“y”表示殼體的血清型，如2/5rAAV 顆粒具有來自AAV2的ITR和來自AAV5的殼體。
修飾的“AAV”序列也可以用于本發(fā)明中，如用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生rAAV載體。這類修飾的序列，例如，包括與 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 或 AAV9 的 ITR、 R印或VP具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約 95%或更多核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(如具有約75%至約99%核苷酸序列同一性的序列)，其可用于取代野生型AAV ITR、Rep或VP序列。盡管在許多方面與其他AAV血清型相似，但是AAV5與其他人和猿AAV血清型的不同，多于其他已知的人和猿血清型。據(jù)此，在昆蟲細(xì)胞中，rAAV5的產(chǎn)生，可以不同于其他血清型的產(chǎn)生。如果使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生rAAV5，優(yōu)選的是，一個(gè)或多個(gè)構(gòu)建體包含，如果是多個(gè)構(gòu)建體則共同包含，包含AAV5 ITR的核苷酸序列，包含AAV5 R印編碼序列的核苷酸序列(即包含AAV5 Rep78的核苷酸序列)?？梢愿鶕?jù)需要修飾此類ITR和R印序列，以獲得rAAV5或假型rAAV5載體在昆蟲細(xì)胞中的有效產(chǎn)生。例如，可以修飾Rep序列的起始密碼子，可以修飾或去除VP剪接位點(diǎn)，和/或可以修飾VPl起始密碼子和附近的核苷酸，以改善rAAV5載體在昆蟲細(xì)胞中的產(chǎn)生。修飾優(yōu)選的腺病毒載體，以便減少宿主應(yīng)答，如Russell (2000, J. Gen. Virol. 81 2573-2604)所評(píng)述，或如 US20080008690 和 Zaldumbide and Hoeben (Gene Therapy 2008 239-246)所述。因此本發(fā)明也涉及包含本文上文所限定的核酸構(gòu)建體和本文上文所限定的細(xì)小病毒殼體蛋白的細(xì)小病毒病毒體。在其他方面，本發(fā)明涉及在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生重組細(xì)小病毒(如rAAV)病毒體(包含上文所限定的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體)方法。優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟(a) 在使重組細(xì)小病毒(例如rAAV)載體產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)本文所限定的昆蟲細(xì)胞；以及(b) 回收重組細(xì)小病毒(例如rAAV)載體。在此應(yīng)當(dāng)理解的是，在該方法中所產(chǎn)生的重組細(xì)小病毒(rAAV)載體優(yōu)選是感染性細(xì)小病毒病毒體或AAV病毒體，其包含重組細(xì)小病毒(rAAV) 載體核酸。用于培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞的生長(zhǎng)條件，以及培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中異源產(chǎn)物的產(chǎn)生，在本領(lǐng)域中是公知的，并且描述于例如上文所引用的有關(guān)昆蟲細(xì)胞的分子工程的參考文獻(xiàn)中。用于產(chǎn)生本發(fā)明rAAV病毒體的優(yōu)選的方法和構(gòu)建體，公開于例如W02007/046703和 W02007/148971 中。優(yōu)選地，用于產(chǎn)生重組細(xì)小病毒病毒體的方法還包括利用抗AAV抗體，優(yōu)選地固定的抗體，親和純化(病毒體所包含的)重組細(xì)小病毒(rAAV)載體的步驟?？笰AV抗體優(yōu)選地是單克隆抗體。特別合適的抗體是如可從駱駝或美洲駝(llamas)獲得的單鏈駱駝抗體或其片段(參閱例如Muyldermans，2001，Biotechnol.li :277-302)。用于親和純化rAAV 的抗體優(yōu)選地是特異性結(jié)合AAV殼體蛋白上的表位的抗體，由此，優(yōu)選地，該表位是存在于多種AAV血清型的殼體蛋白上的表位。例如，抗體可以基于與AAV2殼體的特異性結(jié)合選擇或產(chǎn)生，但同時(shí)，其也可以與AAV1、AAV3和AAV5殼體特異性結(jié)合。本發(fā)明還涉及本文上文所限定的細(xì)小病毒病毒體，其用作藥物。換而言之，本發(fā)明提供了本發(fā)明的細(xì)小病毒病毒體在治療人或動(dòng)物體的方法中的用途。本發(fā)明還涉及本文上文所限定的細(xì)小病毒病毒體，其用于治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況。優(yōu)選地，此類疾病狀況是急性間歇性卟啉病。本發(fā)明的核酸或核酸構(gòu)建體也適于此類用途。
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因此，本發(fā)明涉及用于制備用于治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況的治療方法中的藥物的本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體或細(xì)小病毒病毒體。優(yōu)選地，此類疾病狀況是急性間歇性卟啉病。此類治療可以緩解、改善、減少AIP的一種或多種癥狀的嚴(yán)重性，例如減少發(fā)作的發(fā)生率或嚴(yán)重性。例如，本發(fā)明的治療可以緩解、改善、減少神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、 腹部疼痛或腦脊髓交感神經(jīng)系統(tǒng)障礙和/循環(huán)障礙的嚴(yán)重性。此外，本發(fā)明涉及包含本文上文所限定的細(xì)小病毒病毒體的藥物組合物。藥物組合物還優(yōu)選地包含藥學(xué)可接受的載體。任何合適的藥學(xué)可接受的載體或賦形劑都可以用于本組合物中(參閱例如 Remington :The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor)Mack Publishing Company, April 1997)。 iftit白勺
鹽水、葡萄糖溶液或緩沖溶液或其他藥學(xué)可接受的無菌流體組合?？蛇x地，可以使用固體載體，如微載體珠。藥物組合物通常是無菌的，且在制備和儲(chǔ)藏條件下是穩(wěn)定的。可以將藥物組合物配制為適于容納高藥物濃度的溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是含有例如水、乙醇、多羥基化合物(例如丙三醇、丙二醇以及液態(tài)聚乙二醇等)和其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？梢酝ㄟ^以下方式維持流動(dòng)性例如通過使用諸如卵磷脂的包被，通過在分散情況下維持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑。在許多情況下，優(yōu)選的是在組合物中包括等滲劑，例如糖，諸如甘露醇、山梨醇的多元醇或氯化鈉。可注射的組合物的延長(zhǎng)吸收，可以通過在該組合物中包括可延遲吸收的試劑來實(shí)現(xiàn)，所述試劑例如單硬脂酸鹽和明膠。細(xì)小病毒病毒體可以以定時(shí)釋放或控制釋放制劑的方式施用，例如，以包括緩釋聚合物或會(huì)保護(hù)所述化合物免于快速釋放的其他載體的組合物的形式，包括移植物和微膠囊化的送遞系統(tǒng)。例如可以使用生物可降解的生物相容聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸聚乙醇酸共聚物 (polylactic, polyglycolic copolymers, PLG)。本發(fā)明還提供了將編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列送遞到哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括a.提供本文上文所限定的核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物；以及b.在使得蛋白以在所述哺乳動(dòng)物中提供治療效果的水平表達(dá)的條件下，給所述哺乳動(dòng)物施用所述核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物。本發(fā)明還涉及用于治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況的方法，其中所述方法包括以下步驟給患有膽色素原脫氨酶缺乏的個(gè)體施用有效量的本文上文所限定的核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物。優(yōu)選地，所述個(gè)體患有急性間歇性卟啉病疾病狀況。在本發(fā)明的治療或療法中，膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況通過給個(gè)體施用有效量的本文所限定的核酸、核酸構(gòu)建體細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物來治療?；加写祟惣膊顩r的患者的狀況可以通過施用本發(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物來改善?？梢詫⒅委熡行Я康谋景l(fā)明的核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物給予有需要的患者。核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物通常包括于藥物組合物中，任選地與藥物載體、稀釋劑和/或佐劑組合。此類組合物包括足以提供期望的治療或預(yù)防效果的有效量的核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物，和藥效可接受的載體或賦形劑?！坝行Я俊卑ㄖ委熡行Я炕蝾A(yù)防有效量?！爸委熡行Я俊敝冈诒匾膭┝亢蜁r(shí)間段內(nèi)，有效實(shí)現(xiàn)期望的治療結(jié)果的量，例如 PBGD活性的升高。核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物的治療有效量，可以根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別、重量的因素以及核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物在該個(gè)體中引發(fā)期望的應(yīng)答的能力而變化?？梢哉{(diào)整劑量治療方案，以便提供最佳的治療應(yīng)答。治療有效量還通常是核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物的任何毒性或有害作用被治療有益效果超過的量?！邦A(yù)防有效量”指在必要的劑量和時(shí)間段內(nèi)，有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防結(jié)果的量，如預(yù)防或抑制各種疾病狀況，包括與PBGD水平降低有關(guān)的疾病狀況。在疾病的早期階段或在疾病的早期階段之前，可以在個(gè)體中使用預(yù)防劑量，并且在許多情況下，預(yù)防有效量可以比治療有效量多或少。在具體實(shí)施方案中，核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物的治療或預(yù)防有效量的范圍可以是從IxlO12和IxlO13個(gè)基因組拷貝(gc)/kg，例如從IxlO11到 lxl012gc/kgo應(yīng)當(dāng)指出，劑量值可以隨著待緩解的疾病狀況的嚴(yán)重性而變化。對(duì)于任何具體對(duì)象，可以根據(jù)個(gè)體需要和管理和監(jiān)督組合物施用的人員的專業(yè)判斷，隨時(shí)間調(diào)整具體的劑量治療方案。本文所提出的劑量范圍僅僅是示例性的，并且不限制開業(yè)醫(yī)師(medical practitioner)可選擇的劑量范圍。對(duì)于基因治療載體，如本發(fā)明的細(xì)小病毒病毒體，待施用的劑量可以在很大程度上依賴于正被治療的對(duì)象的狀況和大小以及治療制劑、治療頻率和施用途徑。繼續(xù)治療的治療方案，包括劑量、制劑以及頻率，受到初始應(yīng)答和臨床判斷的指導(dǎo)?？梢詢?yōu)選注射到組織胞間隙的胃腸外途徑，盡管其他具體施用可能需要其他胃腸外途徑，如氣霧劑的吸入。在某些方案中，將在水性載體中包含基因和基因送遞系統(tǒng)的制劑以合適的量注射到組織中。組織靶可以是特定的，如肝組織，或其可以是幾個(gè)組織的組合，如肌肉組織和肝組織的組合。示例性的組織靶可以包括肝、骨骼肌、心肌、脂肪沉積(adipose cbposit)、腎、 肺、血管內(nèi)皮、上皮和/或造血細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，肌肉內(nèi)注射后，對(duì)于小動(dòng)物(小鼠)而言，有效劑量范圍可以為介于IxlO12和IxlO13基因組拷貝(gc)/kg之間，對(duì)于更大的動(dòng)物(貓)和人對(duì)象而言，介于 IxlO11 和 lxl012gc/kg 之間。在本發(fā)明的組合物中，活性核酸、核酸構(gòu)建體、細(xì)小病毒病毒體或藥物組合物的量，可以根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀況、年齡、性別和重量的因素而變化。可以調(diào)整劑量治療方案，以便提供最佳的治療應(yīng)答。例如可以給予單個(gè)大丸劑，可以隨時(shí)間給予幾個(gè)分開的劑量，或可以如治療情形的緊急情況所示按比例增加或減少劑量。配制劑量單位形式的胃腸外組合物是有利的，便于施用和劑量的均勻性。本文所用的“劑量單位形式”指適宜作為待治療的對(duì)象的均勻劑量的物理上離散的單位；每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算產(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)定量的活性化合物，和所需的藥物載體。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格可以通過以下規(guī)定活性化合物的獨(dú)特特性和待實(shí)現(xiàn)的具體治療效果，以及混合用于治療個(gè)體的疾病狀況的此類活性化合物領(lǐng)域所固有的限制。
本文所用的“藥學(xué)可接受的載體”或“賦形劑”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包被、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑以及生理上相容的試劑。在一實(shí)施方案中，載體適于胃腸外施用，胃腸外施用包括靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用或肌肉內(nèi)施用?？蛇x地，載體可以適于舌下施用或口服施用。藥學(xué)可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用于即時(shí)制備無菌可注射的溶液或分散體的無菌粉末。藥物活性物質(zhì)的此類介質(zhì)的使用在本領(lǐng)域中是公知的。除了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容的情況，考慮了其在本發(fā)明藥物組合物中的使用。還可以將輔助活性化合物并入本發(fā)明的藥物組合物中。有關(guān)其他治療劑共給藥的指導(dǎo)可以見于例如 Compendium of Pharmaceutical and Specialties (CPS) of the Canadian Pharmacists Association。


圖1. AAV2/8_hPB⑶注射對(duì)雄性AIP小鼠血紅素前體分泌的劑量效應(yīng)。AIP小鼠具有25-30 %的正常PB⑶活性，是由PB⑶一等位基因的破壞和另一等位基因的部分破壞導(dǎo)致的。LUC是熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體；PB⑶是各種劑量的rAAV-PB⑶載體。表示為基因組拷貝 /kg ；Pb是苯巴比妥。圖2.在施用hl012vg/kg治療載體ssAAV2/8_hPB⑶或?qū)φ蛰d體ssAAV2/8_Luc后， 在苯巴比妥誘發(fā)的急性發(fā)作后，PBG和ALA在雌性AIP小鼠中的尿分泌。LUC是熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體；PB⑶是各種劑量的rAAV-PB⑶構(gòu)建體Jb是苯巴比妥。圖3.通過蛋白質(zhì)印跡分析所測(cè)量的在雄性AIP小鼠的肝中的PB⑶轉(zhuǎn)基因表達(dá)。圖4.通過蛋白質(zhì)印跡分析所測(cè)量的在雌性AIP小鼠的肝中的PB⑶轉(zhuǎn)基因表達(dá)。圖5.在用不同劑量的SSAAV2/8轉(zhuǎn)導(dǎo)的AIP雄性小鼠中注射后3個(gè)月的肝PB⑶ 活性。圖6.在用攜帶熒光素酶或PB⑶基因的SSAAV2/8載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的AIP雌性小鼠的肝中注射后3個(gè)月的PB⑶活性。圖7.在水力注射(hydrodynamic injection)包含野生型PBGD編碼序列(PBGD) 和SEQ ID NO 1的合成(即密碼子優(yōu)化)的PB⑶編碼序列(coPB⑶)的質(zhì)粒DNA構(gòu)建體后，PBGD在野生型小鼠(WT小鼠)和AIP小鼠(AIP小鼠)中體內(nèi)酶促活性的比較。存在于肝中的載體DNA的水平通過使用與轉(zhuǎn)基因雜交的引物證實(shí)?；赒-PCR的內(nèi)源管家基因 GADPH和PB⑶轉(zhuǎn)基因的DNA拷貝間的比率表示在PB⑶酶促活性的上方，并且未表現(xiàn)出顯著差異。圖8和9. AAV2/5-PBGD保護(hù)雄性小鼠(圖8)和雌性小鼠(圖9)免于苯巴比妥誘發(fā)的急性卟啉病發(fā)作。ALA和PBG在AIP小鼠中的基礎(chǔ)水平以及在第一、第二和第三次苯巴比妥誘發(fā)的急性卟啉病發(fā)作后ALA和PBG水平，表示于用5el2gc/kg劑量的對(duì)照載體 (AAV2/5-EalbAAT-熒光素酶)治療的小鼠和用kl2gc/kg AAV8和AAV5-PB⑶載體治療的小鼠中。圖10.在施用AAV8-PB⑶和AAV5-LUC后，肝勻漿中PB⑶酶促活性(n = 4-6)。圖11. Α.在單次注射1. 25xlOngc攜帶來自人的PBGD cDNA(wt PB⑶)或密碼子優(yōu)化的PB⑶(coPB⑶；SEQ ID NO 1)的ssAAV2/5載體后1、2或3個(gè)月，AIP雄性小鼠的肝勻漿中的PBGD酶活性。B.在注射后1、2和3個(gè)月，載體拷貝水平的半定量PCR分析。C.來自雄性小鼠的肝的代表性免疫組織化學(xué)分析，所述小鼠注射了攜帶受肝特異性啟動(dòng)子控制的WtPB⑶或coPB⑶轉(zhuǎn)基因的ssAAV2/5載體。D.來自每同期組(cohort)動(dòng)物的用PB⑶ 抗體染色的細(xì)胞的比例。圖12.AIP小鼠的周圍神經(jīng)病變的神經(jīng)學(xué)評(píng)估。在接受了 3種不同劑量的 rAAV2/8-PBGD的兩種性別的AIP小鼠中，確定大軸突(直徑5 μ m)的百分比和軸突密度。 未治療的小鼠和野生型(WT)小鼠充當(dāng)對(duì)照。圖13. AIP小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和肌肉性能的滾輪分析(Rotarod analysis)。在本研究開始時(shí)，和施用AAV2/8-PBGD 90天后誘發(fā)卟啉病發(fā)作時(shí)，測(cè)量雄性和雌性AIP小鼠能停留在旋轉(zhuǎn)的傳力桿上的時(shí)間長(zhǎng)度。通過每對(duì)小時(shí)腹膜內(nèi)注射劑量漸增的苯巴比妥，為期4天， 誘發(fā)卟啉病發(fā)作。
實(shí)施例實(shí)施例1 :AAV介導(dǎo)的膽色素原脫氨酶的肝特異性表達(dá)在急性間歇性卟啉病小鼠模型中回復(fù)生物化學(xué)改變并防止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變1. 1材料和方法1. 1. 1動(dòng)物模型通過Lindberg et al. (Nature genetics，1996)所述的基因?qū)ぐ挟a(chǎn)生急性間歇性卟啉病(AIP)小鼠。Tl和T2轉(zhuǎn)基因系由巴塞爾大學(xué)的tos Meyer教授慷慨提供，且納瓦拉大學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了這些動(dòng)物的群體。在Tl轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，已經(jīng)將新霉素基因插入PB⑶基因的第一個(gè)外顯子中，并且純合動(dòng)物肝中PB⑶活性丟失45%。在T2小鼠中，已經(jīng)將新霉素基因插入PBGD基因的第一內(nèi)含子。純合狀況是致死的，且雜合動(dòng)物表現(xiàn)出肝中 PBGD活性丟失43%。在用苯巴比妥(Pb)和/或雌二醇處理后，所述系既沒有表現(xiàn)出卟啉病體癥也沒有增加血紅素前體的尿分泌(數(shù)據(jù)未顯示)。為了進(jìn)一步降低PBGD活性，進(jìn)行兩個(gè)系的雜交育種。攜帶敲除的Tl和T2等位基因的復(fù)合(compound)雜合體動(dòng)物用作AIP 的疾病模型。這些小鼠在用諸如苯巴比妥的藥物處理后，表現(xiàn)出典型的人卟啉病生物化學(xué)特征，特別是肝PBGD活性降低，以及血紅素前體的尿分泌大量增加。卟啉，主要是尿卟啉和糞卟啉在AIP中也升高，但是尿卟啉的增加的特異性特征不及PBG和ALA水平的增加的特異性特征。諸如滾輪測(cè)驗(yàn)的動(dòng)作測(cè)驗(yàn)表明，在施用1 后運(yùn)動(dòng)功能降低，且組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)包括軸突神經(jīng)病變和隨老化而降低的神經(jīng)傳導(dǎo)。1.1.2AAV 載體質(zhì)粒和序列本研究所用的AAV質(zhì)粒含有側(cè)翼為來自AAV2的兩個(gè)ITR的表達(dá)盒和適當(dāng)?shù)奶畛湫蛄?，以便將AAV基因組的大小調(diào)整到針對(duì)AAV所述的最佳包裝容量。轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒具有下列元件來自AAV2的5’ ITR、具有來自白蛋白增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)序列的肝特異性啟動(dòng)子 felbAATp (Kramer et al·，2003，Mol Ther. 7(3) :375-85)、管家 PBGD cDNA (GenBank acc#X04808)或熒光素酶報(bào)道基因(GenBank aCC#M15077)。添加牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化序列[bGH poly (A)] ( ^ 2326-2533 GenBank acc#M57764)，即土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WP拙)(堿基1021-1750 GenBank acc#J04514)，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄(Donelloet al. , 1998 J Virol. 72(6) :5085-92)，和來自 AAV2 的 3，ITR。這兩個(gè) AAV 質(zhì)粒稱為 ssAAV-polyA-felbAAT-PB⑶-WPRE (表達(dá)治療基因)和 ssAAV-polyA-EalbAAT-熒光素酶-WPRE (表達(dá)報(bào)道基因GFP)。AAV載體的制備通過在293細(xì)胞中磷酸鈣介導(dǎo)共轉(zhuǎn)染3種不同質(zhì)粒pAdDeltaF6、p5E18_VD2/8 和治療基因(AAV-polyA-felbAAT-PB⑶-WPRE)或報(bào)道基因(AAV-po 1 yA-Ea 1 bAAT-Lucif erase-WPRE), (Hermens et al,1999 Hum Gene Ther. 10(11) :1885-91 ；and Gao et al 2002, Proc Natl Acad Sci USA，盟(18) :11854-9)產(chǎn)生 AAV2/8 載體。簡(jiǎn)而言之，通過磷酸鈣，用pAdDeltaF6、p5E18_VD2/8和靶載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)， 通過凍融細(xì)胞，收獲病毒。通過離子交換柱層析和碘克沙醇梯度離析隨后過濾和針對(duì)磷酸緩沖鹽溶液(PBQ-5%蔗糖進(jìn)一步濃縮，純化病毒。通過以三個(gè)重復(fù)進(jìn)行的Q-PCR TaqMan(AppliedBiosystems)分析，利用引物 pr300fw5，CCCTGTTTGCTCCTCCGATAA3，pr301r ν 5，GTCCGTATTTAAGCAGTGGATCCA 3，擴(kuò)增hAAT啟動(dòng)子區(qū)的95bp片段，測(cè)定基于基因組拷貝/ml的病毒滴度。通過十二烷基硫酸鈉聚酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定蛋白質(zhì)組成和純度。1.1. 3實(shí)驗(yàn)設(shè)置初步測(cè)驗(yàn)為了測(cè)驗(yàn)感染能力和評(píng)估AAV2/8載體的PB⑶表達(dá)，用9xl012vg劑量的 AAV2/8-PB⑶注射2個(gè)AIP動(dòng)物，并在第6天處死它們。原理驗(yàn)證測(cè)定(Proof-of-principle assay)通過比較注射AAV2/8-hB⑶后AIP小鼠肝中PB⑶表達(dá)水平，我們?cè)u(píng)估了 AAV2/8介導(dǎo)的肝轉(zhuǎn)導(dǎo)。用總計(jì)100-200 μ 1對(duì)應(yīng)于kl2vg/kgAAV2/8-hPB⑶或AAV2/8-熒光素酶對(duì)照載體，經(jīng)由尾靜脈靜脈內(nèi)注射12-25周齡的C57B1/6背景中的復(fù)合雜合體AIP小鼠(每組10只小鼠，5只雄性，5只雌性)。用5ellvg/kg或5el0vg/kg AAV2/8_hPBGD注射2個(gè)其他(與以前的年齡相同)5只AIP雄性小鼠組。包括額外的野生型和AIP小鼠組。劑量方案顯示在表2中。表2.通過Q-PCR測(cè)定的所用的載體劑量(Gcs)
權(quán)利要求
1.包含編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的核酸，其中至少320個(gè)編碼所述人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO 1中的密碼子相同，或其中至少305個(gè)編碼所述人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO :3中的密碼子相同。
2.權(quán)利要求1的核酸，其中通過Needleman和^msch全局比對(duì)算法測(cè)定，所述編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列與SEQ ID NO :1或3的全長(zhǎng)具有至少95%的相同性。
3.權(quán)利要求1或2的核酸，其中所述核苷酸序列編碼SEQID NO :2或4的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的核酸，其中所述核苷酸序列具有SEQID NO :1或3的核苷酸序列。
5.包含編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，其中至少320個(gè)編碼所述人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO 1中的密碼子相同，或其中至少305個(gè)編碼所述人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO :3中的密碼子相同。
6.權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體，其中通過Needleman和^msch全局比對(duì)算法測(cè)定，所述編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列與SEQ ID NO :1或3的全長(zhǎng)具有至少95%的相同性。
7.權(quán)利要求5或6的核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列編碼SEQID NO :2或4的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7的核酸構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列具有SEQID NO :1或3的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列可操作地連接于用于在人細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求9的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子是肝特異性啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體，其中所述肝特異性啟動(dòng)子選自α1抗胰蛋白酶(AAT) 啟動(dòng)子、甲狀腺激素結(jié)合球蛋白啟動(dòng)子、白蛋白啟動(dòng)子、甲狀腺素結(jié)合球蛋白(TBG)啟動(dòng)子、肝控制區(qū)(HCR)-Ap0CII雜合啟動(dòng)子、HCR-hAAT雜合啟動(dòng)子、與小鼠白蛋白基因增強(qiáng)子 (Ealb)元件組合的AAT啟動(dòng)子以及載脂蛋白E啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子具有SEQID NO 5的序列。
13.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是病毒基因治療載體的形式，優(yōu)選細(xì)小病毒載體。
14.細(xì)小病毒病毒體，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求5-13中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體。
15.權(quán)利要求14的細(xì)小病毒病毒體，其用作藥物或用于人或動(dòng)物體的治療。
16.權(quán)利要求14或15的細(xì)小病毒病毒體，其用于治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況。
17.權(quán)利要求16的細(xì)小病毒病毒體，其中所述疾病狀況是急性間歇性卟啉病。
18.藥物組合物，其包含權(quán)利要求14的細(xì)小病毒病毒體和藥學(xué)可接受載體。
19.權(quán)利要求14的細(xì)小病毒病毒體在制備用于治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況的藥物中的用途。
20.用于將編碼膽色素原脫氨酶的核苷酸序列送遞到哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括a.提供權(quán)利要求14的細(xì)小病毒病毒體或權(quán)利要求18的藥物組合物；以及b.在使得蛋白以在所述哺乳動(dòng)物中提供治療效果的水平表達(dá)的條件下，給所述哺乳動(dòng)物施用所述細(xì)小病毒病毒體。
21.治療膽色素原脫氨酶缺乏所引起的疾病狀況的方法，其中所述方法包括給患有膽色素原脫氨酶缺乏的對(duì)象施用有效量的權(quán)利要求14的細(xì)小病毒病毒體或權(quán)利要求18的藥物組合物的步驟，優(yōu)選地所述疾病狀況是急性間歇性卟啉病。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列，所述序列經(jīng)優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中更高地表達(dá)。本發(fā)明還涉及包含此類優(yōu)化的合成編碼序列的DNA構(gòu)建體，其用于膽色素原脫氨酶缺乏所引起的諸如急性間歇性卟啉病的疾病狀況的基因治療。因此，本發(fā)明涉及包含編碼人膽色素原脫氨酶的核苷酸序列的核酸或核酸構(gòu)建體，其中至少320個(gè)編碼人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO1中的密碼子相同，或其中至少305個(gè)編碼人膽色素原脫氨酶的密碼子與SEQ ID NO3中的密碼子相同。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102227500SQ200980147755
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月29日
發(fā)明者A·豐塔內(nèi)利亞斯羅馬, G·岡薩雷斯阿薩吉諾拉薩, H·彼得里, J·M·普列托巴爾圖埃納, J·特威斯克, M·A·帕內(nèi)達(dá)羅德里格斯, M·S·羅德里格斯培尼亞, S·J·H·范德芬特 申請(qǐng)人:阿姆斯特丹分子治療(Amt)有限公司, 頂端生物醫(yī)藥項(xiàng)目公司