專(zhuān)利名稱(chēng)：一種防病促生長(zhǎng)植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防病促生長(zhǎng)植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)及其在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用，屬于農(nóng)作物防病控病技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物內(nèi)生菌是指能夠生活在植物體內(nèi)，但不造成明顯癥狀的正常微生物。這類(lèi)微生物能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合的關(guān)系。自上個(gè)世紀(jì)初，人們就開(kāi)始了對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的研究，近年來(lái)的研究結(jié)果表明植物內(nèi)生細(xì)菌不僅將寄主植物作為其棲息的場(chǎng)所，而且對(duì)寄主植物具有促生、防病、固氮等生物學(xué)作用，同時(shí)內(nèi)生細(xì)菌還是將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)的良好載體。因此，植物內(nèi)生細(xì)菌是植物病蟲(chóng)害生物防治的天然資源菌，具有十分廣泛的理論研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。植物內(nèi)生細(xì)菌與從土壤中分離到的拮抗細(xì)菌相比，具有不易受環(huán)境條件的影響，在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，可以在植物體內(nèi)獨(dú)立的分裂繁殖和傳遞等優(yōu)勢(shì)，篩選有益的內(nèi)生細(xì)菌有可能成為生物防治中最具潛力的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌或作為潛在的生防載體菌而加以利用。利用內(nèi)生細(xì)菌對(duì)土傳維管束病害進(jìn)行生物防治的優(yōu)勢(shì)更為突出，由于土傳維管束病害的病原菌侵染后，就在寄主植物維管束中生長(zhǎng)、繁殖、為害，造成化學(xué)藥劑防治困難，效果不理想又污染環(huán)境，而內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)在植物體內(nèi)定殖，與病原菌爭(zhēng)奪生存空間，產(chǎn)生拮抗物質(zhì)直接對(duì)病原菌作用等達(dá)到防病控病的目的。
隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，農(nóng)業(yè)機(jī)械化程度提高，導(dǎo)致農(nóng)田耕作方式單一化，化肥、農(nóng)藥的大量使用，造成環(huán)境污染致使農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中生物多樣性下降，甚至生態(tài)平衡的破壞。而植物內(nèi)生細(xì)菌在與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中形成密切的相互關(guān)系，且生存微環(huán)境穩(wěn)定，是化肥、農(nóng)藥和其他微生物制劑的最佳競(jìng)爭(zhēng)者，它的合理使用將減少化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染，提高農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的生物多樣性，有利于保護(hù)生態(tài)平衡實(shí)現(xiàn)可持續(xù)性發(fā)展。生活水平的提高和科技的發(fā)展使人們對(duì)限制使用化學(xué)農(nóng)藥和環(huán)境保護(hù)的要求越來(lái)越高，利用內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物防治適合我國(guó)無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的要求。具有抗病促生長(zhǎng)作用的植物內(nèi)生細(xì)菌的報(bào)道雖已經(jīng)有一些，但多為枯草芽孢桿菌，如何紅等從辣椒體內(nèi)分離到2株枯草芽孢桿菌BS-1和BS-2。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于多粘類(lèi)芽孢桿菌的研究多集中在聯(lián)合固氮作用方面，還沒(méi)有具有防病促生長(zhǎng)作用的內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠在植物體內(nèi)定殖、對(duì)多種病原菌具有拮抗作用，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌，從而能開(kāi)發(fā)出新型的生防菌劑，滿(mǎn)足無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的要求。
本發(fā)明所提供的植物內(nèi)生細(xì)菌是1995年從中國(guó)江蘇省南京市的棉花組織中分離獲得的，在2003-2005年期間，對(duì)該菌株進(jìn)行了菌種鑒定，結(jié)果為多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)。2004年將該菌株命名為Jaas cd，并于2005年3月10日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1325。該菌株具有下述性質(zhì)1.菌落形態(tài)特征該菌株在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，單個(gè)菌落呈半玻璃珠狀，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)光滑，菌落淡乳黃色，無(wú)光澤，隆起，不透明。
2.菌體形態(tài)特征菌體細(xì)胞桿狀，形成莢膜，產(chǎn)生芽孢，中生，孢囊膨大。
3.主要生理生化特征革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性；過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陽(yáng)性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)氣；V.P反應(yīng)陽(yáng)性，水解明膠、酪素、淀粉。
4.遺傳學(xué)特征用968 f-gc和1401r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出的該菌株的16S rRNA基因的部分序列423bp，并向GenBank提交，登錄號(hào)為AY942618。該菌株的16S rRNA基因的部分序列為1 AGAACCTTAC CAGGTCTTGA CATCCCTCTG ATCGGTCTAG AGATAGATCT TTCCTTCGGG61 ACAGAGGAGA CAGGTGGTGC ATGGTTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG121 TCCCGCAACG AGCGCAACCC TTATGCTTAG TTGCCAGCAG GTCAAGCTGG GCACTCTAAG181 CAGACTGCCG GTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA241 TGACCTGGGC TACACACGTA CTACAATGGC CGGTACAACG GGAAGCGAAA TCGCGAGGTG301 GAGCCAATCC TAGAAAAGCC GGTCTCAGTT CGGATTGTAG GCTGCAACTC GCCTACATGA361 AGTCGGAATT GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC CCGGGTCTTG421 TAC將該序列在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上用BLAST工具與GenBank中已登錄的部分菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果表明與多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)的相似性達(dá)99％。另外，根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心對(duì)該菌株進(jìn)行的形態(tài)特征、生理生化以及Biolog自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀的鑒定結(jié)果，本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌屬于(Paenibacillus polymyxa)。
通過(guò)常規(guī)的微生物發(fā)酵方法可以培養(yǎng)本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌，并制得以本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌為有效成分的生防菌劑。該菌的最適pH為6.0-8.0，最適培養(yǎng)溫度為25-30℃，可用一般發(fā)酵工業(yè)中的通用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)。在制造以本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌為生防菌劑時(shí)，可同樣使用該技術(shù)領(lǐng)域中已知生防菌劑通用的培養(yǎng)基，配制成水劑、粉劑等任意的劑型。
本發(fā)明的所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌及制得的以其為有效成分的生防菌劑與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)。
1、可以在植株體內(nèi)定殖傳導(dǎo)。
將本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌用抗利福平與拮抗病原真菌雙標(biāo)記進(jìn)行內(nèi)生測(cè)定，幾天后從植株體內(nèi)回收分離。結(jié)果表明該菌株可以在多種作物體內(nèi)定殖，并且可以在植株體內(nèi)向上和向下傳導(dǎo)。
2、可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量。
用本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌菌液潑澆催芽后的棉種以及茄子苗，可顯著提高植株的苗高和鮮重。用本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌菌液對(duì)棉花進(jìn)行灌根，可以顯著提高棉花的產(chǎn)量。
3、對(duì)土傳維管束病害具有突出的防治效果。
用本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌菌液對(duì)植株進(jìn)行灌根對(duì)棉花黃萎病、茄子黃萎病等土傳維管束病害具有突出的防治效果。
4、具有誘導(dǎo)植物抗病的作用。
將本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌接種植株，幾天后測(cè)定植株體內(nèi)的過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、酯酶的同工酶酶譜，結(jié)果表明這些酶譜都不同程度的出現(xiàn)酶帶增多、加寬和加深的現(xiàn)象；對(duì)過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的測(cè)定也表明這兩種酶的活性明顯增強(qiáng)。說(shuō)明該菌株可以通過(guò)誘導(dǎo)植物體內(nèi)這些與抗病性相關(guān)酶的活性來(lái)誘導(dǎo)植株抗病。
5、對(duì)多種作物病原真菌具有拮抗活性。
室內(nèi)拮抗活性測(cè)定結(jié)果表明本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌具有較廣的抑菌譜，對(duì)棉花黃萎病菌、茄子黃萎病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌等多種病原真菌都具有明顯的拮抗活性。
6、可以與肥料一起使用。
本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌在黃腐酸綠源寶等多種肥料中可以存活。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1 液體制劑將植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)Jaas cd菌株接種到試管斜面上，培養(yǎng)基為NA，25℃恒溫培養(yǎng)2-4天，獲得試管種。
將試管種接種到NB培養(yǎng)基中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，按0.1％的接種量轉(zhuǎn)接于NB培養(yǎng)基中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)14小時(shí)后的培養(yǎng)液即可為制劑。也可轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基為豆餅粉培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
配方一、普通細(xì)菌NA培養(yǎng)基(重量％)牛肉浸膏0.3％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.5％， 葡萄糖1.0％，瓊脂1.5-2.0％，pH 6.8-7.0。
配方二、普通細(xì)菌NB培養(yǎng)基(重量％)牛肉浸膏0.3％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.5％， 葡萄糖1.0％，pH 6.8-7.0。
配方三、豆餅粉培養(yǎng)基(重量％)豆餅粉2.5％，淀粉1.0％實(shí)施例2 對(duì)棉花的增產(chǎn)試驗(yàn)在棉花品種、密度、肥料用量、栽培管理措施相同的前提下，設(shè)用稀釋后的Jaas cd菌液灌根和用水灌根2個(gè)處理，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)4次，小區(qū)面積不小于20m2。灌根用藥時(shí)間分別為7月13日和7月22日。9月10日調(diào)查大鈴數(shù)、小鈴數(shù)和吐絮數(shù)。結(jié)果表明用本發(fā)明采用的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌菌液灌根比用水灌根的對(duì)照組增產(chǎn)8.22％。
實(shí)施例3 對(duì)棉苗的促生長(zhǎng)作用將催芽的棉花種子播種于溫室盆缽中，同時(shí)將稀釋后的Jaas cd菌液潑澆于棉種及盆缽?fù)寥乐校?0天后測(cè)量苗高并稱(chēng)鮮重，試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株對(duì)棉苗具有明顯的促生長(zhǎng)作用，株高比對(duì)照增長(zhǎng)29.9％，鮮重比對(duì)照增長(zhǎng)45.2％。
實(shí)施例4 對(duì)棉花黃萎病的防治作用溫室盆缽中的棉苗長(zhǎng)至2片真葉期，在棉花主莖距土層2cm處接種經(jīng)NB液體培養(yǎng)的本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌，5天后在距細(xì)菌接種點(diǎn)下約1cm處同樣用針刺接種棉花黃萎病菌，以不接種本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌為對(duì)照，連續(xù)調(diào)查黃萎病的病情。本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)棉花黃萎病的生防效果為67.21％。
在棉花品種、密度、肥料用量、栽培管理措施相同的前提下，設(shè)用稀釋后的Jaas cd菌液灌根和用水灌根2個(gè)處理，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)4次，小區(qū)面積不小于20m2。在7月13日棉花黃萎病發(fā)病初期第一次用藥，7月22日第二次用藥。第1次用藥前調(diào)查病情基數(shù)，7月31日、9月10日調(diào)查病情指數(shù)。結(jié)果表明用本發(fā)明采用的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌菌液灌根后，7月31日的防治效果為51.2％，9月10日的防治效果為49.9％，具有較長(zhǎng)的持效期。
實(shí)施例5 對(duì)茄子防病促生長(zhǎng)作用溫室盆缽中的茄子苗長(zhǎng)至4-5片真葉期時(shí)，用稀釋后的Jaas cd菌液灌根，3天后接種茄子黃萎病菌，7天后再用稀釋后的Jaas cd菌液灌根。以不接種本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌為對(duì)照，連續(xù)調(diào)查黃萎病的病情，40天后調(diào)查茄苗的株高和鮮重。結(jié)果表明本發(fā)明所述的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)茄子具有明顯的促生長(zhǎng)作用，對(duì)茄子黃萎病具有良好的防治效果。
實(shí)施例6 對(duì)多種病原真菌的拮抗作用在PDA平板中心處接直徑為5mm病原真菌菌餅，25℃，培養(yǎng)1-3天后，在菌落邊緣1.5cm處接活化好的Jaas cd，6-7d后測(cè)量抑菌圈。結(jié)果表明本發(fā)明所述的植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌具有較廣的抑菌譜，對(duì)棉花黃萎病菌、茄子黃萎病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、小麥紋枯病菌、小麥赤霉病菌等多種病原真菌都具有明顯的拮抗活性。
權(quán)利要求
1.一種具有防病促生長(zhǎng)作用的植物內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于該菌是一種多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，已于2005年3月10日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1325。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物內(nèi)生細(xì)菌，其特征在于，該菌株細(xì)胞桿狀，形成莢膜，產(chǎn)生芽孢，中生，孢囊膨大；菌落無(wú)光澤。革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性；過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陽(yáng)性；利用阿拉伯糖、木糖、甘露醇產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)氣；V.P反應(yīng)陽(yáng)性，水解明膠、酪素、淀粉。用抗利福平與拮抗病原真菌雙標(biāo)記進(jìn)行內(nèi)生測(cè)定，從植株體內(nèi)回收分離的菌株，在含利福平培養(yǎng)基上出現(xiàn)相同的菌落。
3.以權(quán)利要求1或2所述植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)制劑。
4.以權(quán)利要求1或2所述植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防病促生長(zhǎng)植物內(nèi)生多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)及其應(yīng)用，屬于農(nóng)作物防病控病技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用的菌株Jaas cd已于2005年3月10日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1325。該菌株可在較低的菌液濃度下進(jìn)入植物體內(nèi)，并能在植物體內(nèi)定殖、繁殖和傳導(dǎo)；對(duì)植物同時(shí)具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量和防病的作用，特別是對(duì)于土傳維管束病害具有良好的防治效果。該菌株抑菌譜廣，用于制劑生產(chǎn)成本低廉，操作簡(jiǎn)單，有利于保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，減少農(nóng)藥殘留，適合于我國(guó)無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的要求。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1687399SQ20051003875
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月8日
發(fā)明者林玲, 顧本康, 夏正俊 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院