專利名稱：提取大蒜超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體是應(yīng)用超濾技術(shù)從大蒜中分離提取超 氧化物歧化酶的方法，單步操作即可獲得純度達(dá)95%的超氧化物歧化酶，進(jìn)一步超濾 純化可獲得純度高達(dá)99%且收率達(dá)96%的超氧化物歧化酶。
技術(shù)背景超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體 的氧自由基，從而避免當(dāng)生物體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過高時(shí)引起的不良反應(yīng)，在 防輻射、抗衰老、消炎、抑制腫瘤和癌癥、自身免疫治療等方面顯示出獨(dú)特的功能， 具有廣泛的醫(yī)用價(jià)值。自1938年Mannn和Keilin從牛血紅細(xì)胞中分離發(fā)現(xiàn)該蛋白以來，長(zhǎng)期使用有機(jī) 溶劑沉淀、離子交換、疏水色譜、凝膠過濾和金屬螯合親和層析法等技術(shù)從動(dòng)物血液 中提取SOD。這些方法步驟復(fù)雜，SOD損失率高，易失活。1997年1月，受瘋牛病 的影響，歐盟規(guī)定不準(zhǔn)使用牛血SOD作為食品添加劑。另外，由于動(dòng)物血液和內(nèi)臟 器官來源有限，且成分復(fù)雜，易受污染，在儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)确矫娲嬖谥T多不便。因此人們 轉(zhuǎn)而尋求從植物中提取SOD。大蒜是超氧化物歧化酶(SOD)含量最高的植物之一，其含量可達(dá)20,000 30，000U/100g。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前從大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)多采用分 步鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、層析法等傳統(tǒng)分離純化技術(shù)。然而這些技術(shù)均存在一定 的局限性，其中，鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法容易引起蛋白質(zhì)的失活和變性；層析法則 成本高，處理量小，難于工業(yè)放大，目前都僅局限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的制備。膜分離法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動(dòng)力， 對(duì)雙組份或多組分的混合物進(jìn)行分離、提純和富集的方法。膜分離技術(shù)是20世紀(jì)50 年代發(fā)展起來的一項(xiàng)高效分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有分離效率高、能耗 低、可連續(xù)操作、易于放大、無污染等優(yōu)點(diǎn)。超濾膜是指膜孔徑在1 100nm之間，具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。由于其孔徑尺寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。超 濾分離是分子級(jí)的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，而使小分子溶質(zhì)透過，有時(shí)也可 以通過調(diào)節(jié)溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷，再 通過蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達(dá)到分離的目的。目前，在 生物加工領(lǐng)域，超濾技術(shù)常用于純化和濃縮蛋白質(zhì)，在工業(yè)上已有較多應(yīng)用，但由于 自然體系中蛋白質(zhì)種類復(fù)雜，且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高純度 的功能蛋白質(zhì)的實(shí)例極少，且這方面的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)單、易于工業(yè)應(yīng)用的大蒜超氧化物歧 化酶(SOD)超濾提取方法，且所得產(chǎn)品純度高、收率高。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其目的所采取的技術(shù)路線是
1. 將去皮大蒜勻槳1 2分鐘，向取出的勻漿液中加入3 5倍體積的去離子水或 磷酸鹽緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液由0~300mM NaCl (最佳為50~200mM)和 20 300mM磷酸鹽(最佳為50 150mM)組成、pH6.0~8.5，充分?jǐn)嚢?0 30分鐘；
2. 將上述溶液在30 70°C (最佳為50 65'C)下恒溫15 30分鐘，使不耐熱的 蛋白質(zhì)變性，以沉淀形式析出，濾除沉淀；
3. 將上述溶液進(jìn)行離心操作，條件室溫，轉(zhuǎn)速為5000 8000rpm，棄去沉淀， 取上清液；
4. 利用截留分子量為10~50kDa的市售超濾膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分 離，條件室溫、pH6.0 8.5，所得截留液為超氧化物歧化酶溶液；
5. 再利用截留分子量為70 150kDa的市售超濾膜在室溫下對(duì)步驟4所得超氧化物 歧化酶溶液做進(jìn)一步純化，條件室溫、pH6.0~8.5，濾出液即為高純度超氧化物歧 化酶(SOD)溶液；
6. 將所得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-6(TC冷阱中凍干8 10小時(shí)，即 獲超氧化物歧化酶(SOD)干粉。
本發(fā)明直接應(yīng)用超濾分離技術(shù)，只用粉碎、熱擊、離心和超濾四個(gè)步驟就可從大 蒜溶液中提取獲得純品超氧化物歧化酶(SOD)，與文獻(xiàn)報(bào)道的鹽析法相比，使用相 同原料和緩沖溶液條件時(shí)，本發(fā)明所獲得的產(chǎn)品活性約為2500U/mg，高于鹽析法 (2300U/mg);收率為6.32mg/100g大蒜鮮重，是鹽析法(0.87mg/100g大蒜鮮重)的7倍；且純度可達(dá)99%，較鹽析法(83%)高。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例l:從白皮大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法，步驟1. 取白皮大蒜去皮后250g，利用勻漿機(jī)勻漿1分鐘，再向取出的勻漿液中加入 750mL的pH6.0、由50mM氯化鈉和50mM磷酸鹽組成的緩沖溶液，充分?jǐn)嚢?0分 鐘。2. 將上述所得溶液在5(TC下恒溫15分鐘，使不耐熱的蛋白質(zhì)變性，以沉淀形式 析出，濾除沉淀；3. 將步驟2得到的溶液在室溫下進(jìn)行離心操作，轉(zhuǎn)速為5000rpm。棄去沉淀，取 上清液；4. 利用市售截留分子量為10kDa的超濾膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分離， 分離條件為室溫，pH6.0，所得截留液即為超氧化物歧化酶溶液，純度93.8%，活 性2180U/mg;5. 使用市售截留分子量為70kDa的超濾膜對(duì)步驟4所得超氧化物歧化酶溶液進(jìn)一 步純化，條件同步驟4，濾出液即為高純度超氧化物歧化酶溶液，純度97.9%，活性 2370U/mg;6. 將得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-6(TC冷阱中凍干8小時(shí)，即獲超氧 化物歧化酶(SOD)干粉15.8mg。實(shí)施例2:從紫皮大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法，步驟1. 取市售紫皮大蒜去皮后200g，利用勻漿機(jī)勻漿2分鐘，再向取出的勻漿液中加 入1000mL的pH8.5、由200mM氯化鈉和150mM磷酸鹽組成的緩沖溶液，充分?jǐn)嚢?0分鐘；2. 將上述步驟所得溶液在65。C下恒溫30分鐘，使不耐熱的蛋白質(zhì)變性，以沉淀 形式析出，濾除沉淀；3. 將步驟2得到的溶液在室溫下進(jìn)行離心操作，轉(zhuǎn)速為8000rpm。棄去沉淀，取 上清液；4. 利用市售截留分子量為50kDa的超濾膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分離， 分離條件為室溫，pH8.5，所得截留液即為超氧化物歧化酶溶液，純度95.8%，活性2430U/mg;5. 使用市售截留分子量為150kDa的超濾膜對(duì)步驟4所得超氧化物歧化酶溶液進(jìn) 一步純化，條件同步驟4，濾出液即為高純度超氧化物歧化酶溶液，純度99.2%，活 性2540U/mg;6. 將得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-6(TC冷阱中凍干10小時(shí)，即獲超氧 化物歧化酶(SOD)干粉12.2mg。實(shí)施例3:從大蒜中提取超氧化物歧化酶(SOD)的方法，步驟1. 用勻漿機(jī)將300g去皮大蒜勻漿2分鐘，再向取出的勻漿液中加入1000mL去 離子水，充分?jǐn)嚢?5分鐘；2. 將步驟1所得溶液在6(TC下恒溫20分鐘，使不耐熱的蛋白質(zhì)變性，以沉淀形 式析出，濾除沉淀；3. 將步驟2所得溶液進(jìn)行離心操作，條件室溫，轉(zhuǎn)速為8000卬m。棄去沉淀， 取上清液；4. 利用市售截留分子量為50kDa的超濾膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分離， 分離條件為室溫，pH7.0，所得截留液即為超氧化物歧化酶溶液，純度92.7%，活 性2010U/mg;5. 使用市售截留分子量為100kDa的超濾膜對(duì)步驟4所得超氧化物歧化酶溶液進(jìn) 一步分離，分離條件同步驟4，濾出液即為高純度超氧化物歧化酶溶液，純度97.0%， 活性2240U/mg;6. 將所得到的超氧化物歧化酶(SOD)溶液在-6(TC冷阱中凍干10小時(shí)，即獲超 氧化物歧化酶(SOD)干粉14.8mg。本發(fā)明工藝僅涉及粉碎、熱擊、離心和超濾四個(gè)簡(jiǎn)單步驟，即可從大蒜溶液中提 取獲得純品超氧化物歧化酶(SOD)，相對(duì)于目前的工業(yè)、實(shí)驗(yàn)室提取工藝，具有操 作簡(jiǎn)單、分離濃縮同步進(jìn)行、活性損失小、回收率高的特點(diǎn)，且未使用有機(jī)溶劑，可 有效避免傳統(tǒng)提取方法中有機(jī)溶劑引起的蛋白變性，杜絕了有機(jī)溶劑殘留造成的產(chǎn)品 安全隱患；能耗低、環(huán)境污染小、分離效率高、產(chǎn)品純度可調(diào)控、控制因素單一，便 于工業(yè)放大。
權(quán)利要求
1.一種提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行①用勻漿機(jī)將去皮大蒜勻漿1～2分鐘，再向取出的勻漿液中加入3～5倍體積的去離子水或磷酸鹽緩沖溶液，磷酸鹽緩沖溶液由0～300mM NaCl和20～300mM磷酸鹽組成、其pH6.0～8.5，充分?jǐn)嚢?0～30分鐘；②將上述溶液在30～70℃下恒溫15～30分鐘，使不耐熱的蛋白質(zhì)變性，以沉淀形式析出，濾除沉淀；③將上述溶液進(jìn)行離心操作，條件室溫，轉(zhuǎn)速為5000～8000rpm，棄去沉淀，取上清液；④利用截留分子量為10～50kDa的市售超濾膜對(duì)步驟3得到的上清液進(jìn)行超濾分離，條件為室溫、pH6.0～8.5，所得截留液為超氧化物歧化酶溶液；⑤使用截留分子量為70～150kDa的市售超濾膜在室溫下對(duì)步驟4所得超氧化物歧化酶溶液做進(jìn)一步純化，條件為室溫、pH6.0～8.5，濾出液即為高純度超氧化物歧化酶溶液；⑥將所得到的超氧化物歧化酶溶液凍干8～10小時(shí)，即獲超氧化物歧化酶干粉。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，其特征是所說的磷酸 鹽緩沖溶液是由50 200mMNaCl和50~150mM磷酸鹽組成。
3.依據(jù)權(quán)利要求1所述的提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，其特征是大蒜勻漿液 與去離子水或與磷酸鹽緩沖液的混合液是在50 65'C恒溫15 30分鐘，析出不耐熱 的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取大蒜超氧化物歧化酶的方法，屬于生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域，主要是應(yīng)用超濾分離技術(shù)，經(jīng)過粉碎、熱擊、離心和超濾四個(gè)簡(jiǎn)單步驟，即可從大蒜中提取高純度的超氧化物歧化酶，在提取過程中，未使用有機(jī)溶劑，有效避免了有機(jī)溶劑引起的蛋白變性，杜絕了溶劑殘留造成的產(chǎn)品安全隱患，可生產(chǎn)無任何化學(xué)添加的高純度超氧化物歧化酶，環(huán)境污染小，分離效率高、產(chǎn)品純度可調(diào)控、便于工業(yè)推廣。
文檔編號(hào)C12N9/08GK101402946SQ20081015969
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者劉建國, 娟 楊, 汪利平, 王晶冰 申請(qǐng)人:中國石油大學(xué)(華東)