專利名稱：玉米超氧化物歧化酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物中制備超氧化物歧化酶的方法，具體是以玉米為原料制備超氧 化物歧化酶的方法。
背景技術(shù)：
SOD (超氧化物歧化酶)是一種源于生命體的活性物質(zhì)，是生物體內(nèi)重要的抗氧化 酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物 體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)； 現(xiàn)已證實(shí)，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的 損害，并及時修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對細(xì)胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污 染，各種輻射和超量運(yùn)動都會造成氧自由基大量形成，因此，生物抗氧化機(jī)制中SOD的地位 越來越重要，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品和食品等諸多領(lǐng)域?，F(xiàn)有的生產(chǎn)超氧化物歧化酶的方法主要有兩種，一種是從動物內(nèi)臟和血液中提 取，一種是從植物中提取。從動物血液中提取不但代價昂貴，而且動物性SOD的排他性、不 易常溫保存。從玉米中提取超氧化物歧化酶大都進(jìn)行一次超濾提純，不能有效去除雜蛋白， 所提取的SOD產(chǎn)品純度不高，活性蛋白含量低，難以達(dá)到藥用級的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種玉米超氧化物歧化酶的制備方 法，以便有效去除雜蛋白，減少酶活損失，提高玉米SOD產(chǎn)品純度，達(dá)到藥用級要求。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其 特征在于制備方法為(1)消毒浸泡將玉米用濃度1-3%的氯化鈉溶液清洗3-6次，進(jìn)行殺菌消毒，用 250C _33°C的去離子水浸泡25-35小時，浙水；(2)萌芽控制萌芽室溫度在25 V -330C，每隔2小時對玉米進(jìn)行一次水淋，水溫 保持25°C _33°C，隨時查看萌芽情況，待萌芽長出1-3毫米，萌芽結(jié)束；(3)清洗將萌芽玉米用濃度1-3%氯化鈉溶液清洗2-3遍；(4)磨漿將萌芽玉米按2_6L/kg加入50umol/L的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行研磨，首 先粗磨，然后精磨，充分磨細(xì)；(5) 一次酶解將研磨完畢的玉米漿加入酶，混合均勻后，再后按50_100mL/kg加 入濃度為15-30%的氯化鈣溶液，靜置1-2小時進(jìn)行沉淀；(6) 一次分離將沉淀分層的玉米漿粗濾得濾液，然后用轉(zhuǎn)速8000-15000r/min高 速管式分離機(jī)離心5-10分鐘，留取上清液；(7)超濾濃縮將上清液進(jìn)行超濾得濾液，用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液， 將濾液濃縮至原體積的10%，得濃縮液，然后冷凍、干燥，即得玉米sod粗粉；所述的玉米超氧化物歧化酶的制備方法，還包括
(8) 二次酶解將濃縮液加入酶進(jìn)行酶解，調(diào)PH至6. 8-7. 2 ；(9) 二次分離用轉(zhuǎn)速8000-15000r/min的高速管式分離機(jī)離心4_8分鐘，得二次 上清液，將二次上清液進(jìn)行超濾，得超純?yōu)V液，將超純?yōu)V液濃縮至原體積的5 %，然后冷凍、 干燥，即得玉米sod凍干精粉。所述的步驟(1)消毒浸泡步驟之前可增加揀選步驟，通過風(fēng)選，玉米應(yīng)為無霉?fàn)€、 無雜質(zhì)，苞粒飽滿的優(yōu)質(zhì)玉米。所述的步驟(5) —次酶解步驟中可先按0. 1-0. 4g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再 按0. 1-0. 4g/kg加入果膠酶，混合均勻，然后按50-100mL/kg加入濃度為15-30%的氯化鈣 溶液進(jìn)行沉淀；所述的步驟(6) —次分離步驟中的粗濾用的是150-200目的濾袋。所述的步驟(7)和(9)超濾濃縮步驟中超濾用的是截留分子量3000-20000的中
空纖維超濾柱。所述的步驟(8) 二次酶解步驟中，可先按0.09_0.35g/kg加入纖維素酶，攪拌均 勻，再按0. 09-0. 35g/kg加入果膠酶混合均勻進(jìn)行酶解。本發(fā)明的有益效果是經(jīng)過二次酶解和二次分離可以有效去除雜蛋白，提高玉 米SOD產(chǎn)品純度，從而達(dá)到藥用級的要求。經(jīng)國家檢測中心檢測，產(chǎn)品比活性最高可達(dá)到 3000U/mg。下表是一次酶解分離和二次酶解分離所得產(chǎn)品比活的數(shù)據(jù)
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 玉米超氧化物歧化酶的制備方法，具體步驟為(1)揀選，通過風(fēng)選，選擇無霉?fàn)€、無雜質(zhì)，苞粒飽滿的優(yōu)質(zhì)玉米。(2)消毒浸泡用濃度的氯化鈉溶液清洗3-4次，進(jìn)行殺菌消毒，用25°C _28°C 的去離子水浸泡25小時，浙水；(3)萌芽控制萌芽室溫度在25 V -28 V，每隔2小時對玉米進(jìn)行一次水淋，水溫 保持25°C _28°C，隨時查看萌芽情況，待萌芽長出1-2毫米，萌芽結(jié)束；(4)清洗將萌芽玉米用濃度2%氯化鈉溶液清洗2-3遍；(5)磨漿將萌芽玉米按2L/kg加入50umol/L的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行研磨，首先 粗磨，然后精磨，充分磨細(xì)；(6) 一次酶解將研磨完畢的玉米漿先按0. lg/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按 0. 2g/kg加入果膠酶，混合均勻，然后按50mL/kg加入濃度為15%的氯化鈣溶液，靜置1小 時進(jìn)行沉淀；(7) 一次分離將沉淀分層的玉米漿用150目的濾袋粗濾得濾液，然后用轉(zhuǎn)速 8000-10000r/min的高速管式分離機(jī)離心10分鐘，留取上清液；(8)超濾濃縮將上清液用截留分子量8000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾得濾液， 用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液，將濾液濃縮至原體積的10 %，得濃縮液，然后冷凍、干 燥，即得玉米SOd粗粉;(9) 二次酶解將濃縮液先按0. 09g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按0. 15g/kg 加入果膠酶混合均勻進(jìn)行酶解，調(diào)pH至6. 8 ；(10) 二次分離用轉(zhuǎn)速8000r/min的高速管式分離機(jī)離心8分鐘，得二次上清液， 將二次上清液用截留分子量3000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾，得超純?yōu)V液，將超純?yōu)V液濃 縮至原體積的5%，然后冷凍、干燥，即得玉米sod凍干精粉。實(shí)施例2 玉米超氧化物歧化酶的制備方法，具體步驟為(1)揀選，通過風(fēng)選，選擇無霉?fàn)€、無雜質(zhì)，苞粒飽滿的優(yōu)質(zhì)玉米。(2)消毒浸泡用濃度2%的氯化鈉溶液清洗4-5次，進(jìn)行殺菌消毒，用28°C -30°C 的去離子水浸泡26-28小時，浙水；(3)萌芽控制萌芽室溫度在28V -30°C，每隔2小時對玉米進(jìn)行一次水淋，水溫 保持28°C -30°C，隨時查看萌芽情況，待萌芽長出2-3毫米，萌芽結(jié)束；(4)清洗將萌芽玉米用濃度3%氯化鈉溶液清洗2-3遍；(5)磨漿將萌芽玉米按3_4L/kg加入50umol/L的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行研磨，首 先粗磨，然后精磨，充分磨細(xì)；(6) 一次酶解將研磨完畢的玉米漿先按0.2g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按 0. lg/kg加入果膠酶，混合均勻，然后按50mL/kg加入濃度為20%的氯化鈣溶液，靜置1. 5 小時進(jìn)行沉淀；
(7) 一次分離將沉淀分層的玉米漿用200目的濾袋粗濾得濾液，然后用轉(zhuǎn)速 10000-13000r/min的高速管式分離機(jī)離心8分鐘，留取上清液；(8)超濾濃縮將上清液用截留分子量10000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾得濾液， 用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液，將濾液濃縮至原體積的10 %，得濃縮液，然后冷凍、干 燥，即得玉米sod粗粉;(9) 二次酶解將濃縮液先按0. 15g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按0. 09g/kg 加入果膠酶混合均勻進(jìn)行酶解，調(diào)pH至6. 9 ；(10) 二次分離用轉(zhuǎn)速lOOOOr/min的高速管式分離機(jī)離心6_7分鐘得二次上清 液，將二次上清液用截留分子量8000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾，得超純?yōu)V液，將超純?yōu)V 液濃縮至原體積的5%，然后冷凍、干燥，即得玉米sod凍干精粉。實(shí)施例3 玉米超氧化物歧化酶的制備方法，具體步驟為(1)揀選，通過風(fēng)選，選擇無霉?fàn)€、無雜質(zhì)，苞粒飽滿的優(yōu)質(zhì)玉米。(2)消毒浸泡用濃度3%的氯化鈉溶液清洗5-6次，進(jìn)行殺菌消毒，用30°C-33°C 的去離子水浸泡28-32小時，浙水；(3)萌芽控制萌芽室溫度在30°C -33°C，每隔2小時對玉米進(jìn)行一次水淋，水溫 保持30°C _33°C，隨時查看萌芽情況，待萌芽長出1-2毫米，萌芽結(jié)束；(4)清洗將萌芽玉米用濃度2. 5%氯化鈉溶液清洗3遍；(5)磨漿將萌芽玉米按5L/kg加入50umol/L的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行研磨，首先 粗磨，然后精磨，充分磨細(xì)；(6) 一次酶解將研磨完畢的玉米漿先按0.3g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按 0. 4g/kg加入果膠酶，混合均勻，然后按50mL/kg加入濃度為25%的氯化鈣溶液，靜置2小 時進(jìn)行沉淀；(7) 一次分離將沉淀分層的玉米漿用200目的濾袋粗濾得濾液，然后用轉(zhuǎn)速 13000-15000r/min的高速管式分離機(jī)離心6分鐘，留取上清液；(8)超濾濃縮將上清液用截留分子量15000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾得濾液， 用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液，將濾液濃縮至原體積的10 %，得濃縮液，然后冷凍、干 燥，即得玉米SOd粗粉;(9) 二次酶解將濃縮液先按0. 25g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按0. 35g/kg 加入果膠酶混合均勻進(jìn)行酶解，調(diào)PH至7 ；(10) 二次分離用轉(zhuǎn)速12000r/min的高速管式分離機(jī)離心5_6分鐘得二次上清 液，將二次上清液用截留分子量12000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾，得超純?yōu)V液，將超純?yōu)V 液濃縮至原體積的5%，然后冷凍、干燥，即得玉米sod凍干精粉。實(shí)施例4:玉米超氧化物歧化酶的制備方法，具體步驟為(1)揀選，通過風(fēng)選，選擇無霉?fàn)€、無雜質(zhì)，苞粒飽滿的優(yōu)質(zhì)玉米。(2)消毒浸泡用濃度3%的氯化鈉溶液清洗5-6次，進(jìn)行殺菌消毒，用31°C-33°C 的去離子水浸泡32小時，浙水；(3)萌芽控制萌芽室溫度在31°C -33°C，每隔2小時對玉米進(jìn)行一次水淋，水溫保持31°C _32°C，隨時查看萌芽情況，待萌芽長出2-3毫米，萌芽結(jié)束；(4)清洗將萌芽玉米用濃度3%氯化鈉溶液清洗3遍；(5)磨漿將萌芽玉米按6L/kg加入50umol/L的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行研磨，首先 粗磨，然后精磨，充分磨細(xì)；(6) 一次酶解將研磨完畢的玉米漿先按0.4g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按 0. 3g/kg加入果膠酶，混合均勻，然后按50mL/kg加入濃度為30%的氯化鈣溶液，靜置2小 時進(jìn)行沉淀；(7) 一次分離將沉淀分層的玉米漿用180目的濾袋粗濾得濾液，然后用轉(zhuǎn)速 15000r/min的高速管式分離機(jī)離心5分鐘，留取上清液；(8)超濾濃縮將上清液用截留分子量20000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾得濾液， 用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液，將濾液濃縮至原體積的10 %，得濃縮液，然后冷凍、干 燥，即得玉米sod粗粉;(9) 二次酶解將濃縮液先按0. 35g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按0. 25g/kg 加入果膠酶混合均勻進(jìn)行酶解，調(diào)PH至7. 2 ；(10) 二次分離用轉(zhuǎn)速15000r/min的高速管式分離機(jī)離心4分鐘得二次上清液， 將二次上清液用截留分子量15000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾，得超純?yōu)V液，將超純?yōu)V液 濃縮至原體積的5%，然后冷凍、干燥，即得玉米sod凍干精粉。實(shí)施例5 玉米超氧化物歧化酶的制備方法，具體步驟為(1)消毒浸泡將風(fēng)選優(yōu)質(zhì)玉米100kg，用濃度2%的氯化鈉溶液清洗5次，進(jìn)行殺 菌消毒，用29°C的去離子水浸泡30小時，浙水；(2)萌芽控制萌芽室溫度在29°C -31°C，每隔2小時對玉米進(jìn)行一次水淋，水溫 保持29°C -31°C，隨時查看萌芽情況，待萌芽長出2-3毫米，萌芽結(jié)束；(3)清洗將萌芽玉米用濃度2%氯化鈉溶液清洗3遍；(4)磨漿將萌芽玉米加入400升50umol/L磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行研磨，首先粗磨， 然后精磨，充分磨細(xì)，越細(xì)越好；(5) 一次酶解將研磨完畢的玉米漿先加入280g纖維素酶，攪拌均勻，再加入320g 果膠酶，混合均勻，然后加入5升濃度為20%的氯化鈣溶液，靜置2小時進(jìn)行沉淀；(6) 一次分離將沉淀分層的玉米漿用200目的濾袋粗濾得濾液，然后用轉(zhuǎn)速 8000r/min的高速管式分離機(jī)離心9分鐘，棄沉淀物，可獲取上清液約300升；(7)超濾濃縮將上清液用截留分子量13000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾，得濾 液，用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液，將濾液濃縮至原體積的10%，約得30升濃縮液；(8) 二次酶解將濃縮液先加入200g纖維素酶攪拌均勻，再加入280g果膠酶混合 均勻后，調(diào)PH至7. 1 ；(9) 二次分離再次離心分離，用轉(zhuǎn)速12000r/min的高速管式分離機(jī)離心7分鐘， 將所得上清液用截留分子量10000的中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾，得超純?yōu)V液，將超純?yōu)V液 濃縮至原體積的5%，然后冷凍、干燥，即得玉米sod凍干精粉約40g。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于制備方法為(1)消毒浸泡將玉米用濃度1 3％的氯化鈉溶液清洗3 6次，進(jìn)行殺菌消毒，用25℃ 33℃的去離子水浸泡25 35小時，瀝水；(2)萌芽控制萌芽室溫度在25℃ 33℃，每隔2小時對玉米進(jìn)行一次水淋，水溫保持25℃ 33℃，隨時查看萌芽情況，待萌芽長出1 3毫米，萌芽結(jié)束；(3)清洗將萌芽玉米用濃度1 3％氯化鈉溶液清洗2 3遍；(4)磨漿將萌芽玉米按2 6L/kg加入50umol/L的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行研磨，首先粗磨，然后精磨，充分磨細(xì)；(5)一次酶解將研磨完畢的玉米漿加入酶，混合均勻后，再后按50 100mL/kg加入濃度為15 30％的氯化鈣溶液，靜置1 2小時進(jìn)行沉淀；(6)一次分離將沉淀分層的玉米漿粗濾得濾液，然后用轉(zhuǎn)速8000 15000r/min高速管式分離機(jī)離心5 10分鐘，留取上清液；(7)超濾濃縮將上清液進(jìn)行超濾得濾液，用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液，將濾液濃縮至原體積的10％，得濃縮液，然后冷凍、干燥，即得玉米sod粗粉。
2.如權(quán)利要求1所述的玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于還包括(8)二次酶解將濃縮液加入酶進(jìn)行酶解，調(diào)pH至6. 8-7. 2 ；(9)二次分離用轉(zhuǎn)速8000-15000r/min的高速管式分離機(jī)離心4_8分鐘，得二次上清 液，將二次上清液進(jìn)行超濾，得超純?yōu)V液，將超純?yōu)V液濃縮至原體積的5%，然后冷凍、干燥， 即得玉米sod凍干精粉。
3.如權(quán)利要求1所述的玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于所述的步驟(1) 消毒浸泡步驟之前可增加揀選步驟，通過風(fēng)選，玉米應(yīng)為無霉?fàn)€、無雜質(zhì)，苞粒飽滿的優(yōu)質(zhì) 玉米。
4.如權(quán)利要求1所述的玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于所述的步驟(5) 一次酶解步驟中可先按0. 1-0. 4g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按0. 1-0. 4g/kg加入果膠 酶，混合均勻，然后加入50-100mL/kg濃度為15-30%的氯化鈣溶液進(jìn)行沉淀；
5.如權(quán)利要求1所述的玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于所述的步驟(6) 一次分離步驟中的粗濾用的是150-200目的濾袋。
6.如權(quán)利要求1或2所述的玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于所述的步驟 (7)和步驟(9)中超濾用的是截留分子量3000-20000的中空纖維超濾柱。
7.如權(quán)利要求2所述的玉米超氧化物歧化酶的制備方法，其特征在于所述的步驟(8) 二次酶解步驟中，可先按0. 09-0. 35g/kg加入纖維素酶，攪拌均勻，再按0. 09-0. 35g/kg加 入果膠酶混合均勻進(jìn)行酶解。全文摘要
本發(fā)明涉及玉米超氧化物歧化酶的制備方法，主要包括(1)消毒浸泡；(2)萌芽；(3)清洗；(4)磨漿；(5)一次酶解將研磨完畢的玉米漿纖維素酶和果膠酶，混合均勻，加入氯化鈣溶液進(jìn)行沉淀；(6)一次分離將沉淀分層的玉米漿粗濾然后用高速分離機(jī)離心，留取上清液；(7)超濾濃縮將上清液用中空纖維超濾柱進(jìn)行超濾，得濾液。用納米過濾器進(jìn)行精濾，得純凈濾液，將濾液濃縮至原體積的10％。(8)二次酶解；(9)二次分離再次離心分離，超濾得超純?yōu)V液，速凍得玉米sod凍干粉。本發(fā)明經(jīng)過二次酶解和二次分離可以最大限度地去除雜蛋白，提高玉米SOD產(chǎn)品純度，從而達(dá)到藥用級的要求。
文檔編號C12N9/08GK101892204SQ201010204239
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者徐殿英, 李作紅, 李潔 申請人:李作紅