專利名稱：一種提高真菌產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)率的雙液相發(fā)酵方法
一種提高真菌產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)率的雙液相發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種提高真菌產(chǎn) 紫杉醇產(chǎn)率的雙液相發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(paclitaxd，商品名Taxol)是一種復(fù)雜的天然的抗癌藥物，屬于 二萜生物堿，其基本結(jié)構(gòu)由漿果赤霉素III (baccatin III)和連接其13位碳上一苯丙氨酸 衍生物構(gòu)成。
由于紫杉醇的市場供應(yīng)受制于原料來源和制備技術(shù)兩方面的制約，使得藥價(jià)昂貴。為 此，制藥界和學(xué)術(shù)界一直在尋找新的更好的原料及方法，來代替現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)，以提高 紫杉醇的產(chǎn)量、滿足臨床需求。過去十余年中取得的最有意義的進(jìn)展，是發(fā)現(xiàn)了與紅豆杉 等植物共生的一些真菌產(chǎn)生紫杉醇，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性與紅豆杉所產(chǎn)紫杉醇完全 相同。
1993年，Stierle等從太平洋紅豆杉的韌皮部分離到1株內(nèi)生真菌-安德烈紫杉菌 (7axow_yce m￡^a"ae)，經(jīng)培養(yǎng)，采用質(zhì)譜、色譜(TLC/HPLC)和放射性化學(xué)標(biāo)記等方法， 發(fā)現(xiàn)該菌的發(fā)酵液中存在紫杉醇，盡管產(chǎn)量較低，每升發(fā)酵液含紫杉醇24-50 ng。同時(shí)還 證實(shí)，這些真菌紫杉醇與紅豆杉紫杉醇結(jié)構(gòu)和性質(zhì)完全一樣。隨后，許多人分離到不同的 產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)共生真菌。我國境內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了多種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)共生真菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國內(nèi)外 已報(bào)道的產(chǎn)生紫杉醇真菌種類已超過三十種，這些真菌絕大多數(shù)是子囊菌或半知菌，而且 都是內(nèi)共生真菌。由于目前這些真菌發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉醇的含量很低，不能達(dá)到工業(yè)發(fā)酵生 產(chǎn)的水平，因此遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過多年大量的深入研究，發(fā)現(xiàn)并培 養(yǎng)了一種腐生真菌-擬盤多毛孢尸eWa/o"opw;s w/cra^pora NK-17 (菌種保藏號(hào) CGMCC2694),該菌紫杉醇產(chǎn)量較高，發(fā)酵條件容易控制，培養(yǎng)周期短，是一株工業(yè)化發(fā) 酵生產(chǎn)紫杉醇的優(yōu)勢菌。
發(fā)酵工業(yè)中，除單液相發(fā)酵(如氨基酸發(fā)酵、酶制劑發(fā)酵、有機(jī)酸發(fā)酵等)占有極重 要位置外，雙液相發(fā)酵系統(tǒng)在以石油為底物的發(fā)酵(如十三碳二元酸生產(chǎn))及生物制藥中 也占有重要位置。目前，發(fā)酵生產(chǎn)中雙液相發(fā)酵體系有三類，第一類是已商品化的以烷烴 或油脂為碳源的發(fā)酵體系；第二類是氧載體發(fā)酵體系，即將對(duì)氧有較高溶解度，但又不溶 于水的有機(jī)溶劑(稱為氧載體)加入到好氧發(fā)酵體系中，加快發(fā)酵體系的氧傳遞速度；第 三類是近幾年開始研究的，在上述兩類雙液相發(fā)酵體系中引入一種固體載體(或乳化劑)， 利用這種載體所具有的很強(qiáng)的與水和油的雙重吸附能力，增加雙液相之間的接觸面積，從 而提高傳質(zhì)與發(fā)酵產(chǎn)率。
本發(fā)明即提供了一種，利用第一類雙液相發(fā)酵體系提高真菌擬盤多毛孢生產(chǎn)紫杉醇的 方法。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足和滿足市場對(duì)紫杉醇的
需求，提供一種利用雙液相發(fā)酵提高真菌產(chǎn)紫杉醇的方法。
本發(fā)明提供的一種能生產(chǎn)紫杉醇的菌種是擬盤多毛孢(i^W"/加'o戸"w&my/wr") NK17(菌種保藏號(hào)CGMCC2694)。
本發(fā)明所述的利用雙液相發(fā)酵提高真菌產(chǎn)紫杉醇的方法是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)擬盤多 毛孢i^Wa/orio;w/s脂'cmy; oraNKn，當(dāng)菌體生長達(dá)到平臺(tái)期，加入有機(jī)溶劑繼續(xù)培養(yǎng)， 以使在所述微生物細(xì)胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集紫杉醇，以及從所述細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基 中回收并提純紫杉醇。
所述的培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，其組成為g/L:馬鈴薯180-220 g，蔗糖20 g，自然pH。
所述的菌體培養(yǎng)是在500 mL-lL三角瓶中、需氧條件下進(jìn)行的發(fā)酵培養(yǎng)，接種方式 采用塊狀菌絲體的接種方式，培養(yǎng)溫度為28-30°C ，發(fā)酵初始pH值為PDB培養(yǎng)基自然pH，， 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180-220 rpm 。
繼續(xù)培養(yǎng)中選擇加入的有機(jī)溶劑是甲醇、乙酸乙酯或三氯甲烷，體積濃度的范圍為
0.5%-2% 。
以上所述的培養(yǎng)可以在本領(lǐng)域的常規(guī)或已知的條件下進(jìn)行。培養(yǎng)時(shí)間依培養(yǎng)條件而 定，時(shí)間范圍為6-10天，菌體生長進(jìn)入平臺(tái)期。
為了從培養(yǎng)基分離出紫杉醇，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的用于從微生物的培養(yǎng)基中 分離代謝物的任何分離方法。例如，菌絲體可以通過離心或過濾從發(fā)酵液中分離出來，紫 杉醇可以用一種或一種以上不與水相混的有機(jī)溶劑從濾液中萃取出來。另一方面，分離出 的菌絲體中所包含的紫杉醇可以通過例如用一種溶劑(例如甲醇)從菌絲體中提取出來。 所得紫杉醇粗產(chǎn)物可以使用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的純化方法純化，例如色譜法。
從所述細(xì)胞和培養(yǎng)基中提取和純化紫杉醇的方法包括以下步驟
(1) 將所述培養(yǎng)過程所得液分離出發(fā)酵菌體和發(fā)酵上清液；
(2) 用有機(jī)溶劑提取所得發(fā)酵菌體，提取液與上步發(fā)酵上清液一起進(jìn)行濃縮；
(3) 將第(2)步所得物用色譜純化的方法純化，得產(chǎn)物紫杉醇。
所述第(1)步中，可以按本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行分離，例如將所得發(fā)酵液離 心或過濾。
所述第(2)步中可將所得發(fā)酵菌體千燥粉碎后，再用有機(jī)溶劑提取。用飽和Na2CCb 溶液調(diào)節(jié)提取液與發(fā)酵上清液的pH值為6.0- 8.0。所述干燥可按照本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方 法進(jìn)行，例如真空冷凍干燥法。所述從發(fā)酵菌體中提取紫杉醇用的有機(jī)溶劑可以是本領(lǐng)域 常規(guī)或已知的溶劑，例如甲醇。所述濃縮方法可按照本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行，例如 減壓濃縮。
所述第(3)步中的色譜純化可以按照本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行，色譜柱填料可 以用C18，流動(dòng)相可以用甲醇/1120，也可以使用一個(gè)以上的色譜柱。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果
采用本發(fā)明的雙液相發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的方法，產(chǎn)率可以達(dá)到551.72 Mg/L，產(chǎn)率高于 現(xiàn)有的組織培養(yǎng)法和微生物發(fā)酵法l倍以上。本技術(shù)周期短，成本低，產(chǎn)率高，應(yīng)用于工 業(yè)化生產(chǎn)，可解決紫杉醇的工藝問題，即保護(hù)了自然資源，又可滿足臨床用藥的需要。


圖1是本發(fā)明中不同種類及配比的雙液相系統(tǒng)對(duì)擬盤多毛孢NK17菌株紫杉醇產(chǎn)量的 影響。
本發(fā)明提供的能產(chǎn)紫杉醇的新菌株是一株腐生真菌擬盤多毛孢，己于2008年10月8 曰保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號(hào)中國 科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)CGMCC2694，分類命名尸eWa/o"op^ m/cnw/wra NK17 。
具體實(shí)施方式
下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步 的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)發(fā)明技術(shù)特征所作的等同替換、或相應(yīng)的改進(jìn)，仍 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1、產(chǎn)紫杉醇菌株NK17的發(fā)酵培養(yǎng)
用手術(shù)刀切取一小塊NK17菌絲體接入滅好菌的PDB培養(yǎng)基中，PDB組成為(g/L): 馬鈴薯180-220 g (如180、 200或220g)，蔗糖20 g，自然pH。菌體培養(yǎng)是在500 mL-lL 三角瓶中，需氧條件下進(jìn)行的發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28-3(TC，發(fā)酵初始pH值為PDB培 養(yǎng)基自然pH,培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180-220 rpm (如180、 200或220 rpm)。待菌體生長達(dá)到平 臺(tái)期后(第7天)，選擇加入有機(jī)溶劑為甲醇、乙酸乙酯或三氯甲烷，體積濃度的范圍為 0.5%-2% 。
具體選擇加入的有機(jī)溶劑為1%甲醇，或0.5%乙酸乙酯，或1%乙酸乙酯，或2%乙 酸乙酯，或0.5%三氯甲烷，或1%三氯甲烷。然后繼續(xù)培養(yǎng)3 4天。
實(shí)施例2 、產(chǎn)紫杉醇菌株NK17發(fā)酵產(chǎn)物前處理過程
將上例發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，使得菌絲同發(fā)酵上清液分離開來；將抽濾后所得菌絲冷凍 干燥，液氮研磨破碎細(xì)胞之后使用甲醇抽提l-2天；將抽提液與之前的發(fā)酵上清液混合后 再次進(jìn)行抽濾，除去沉淀物，并調(diào)節(jié)pH至7.0 (pH值為6.0或8.0均可，優(yōu)選pH為7.0);使 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對(duì)上步所得濾液濃縮后得到粗提產(chǎn)物，進(jìn)行下一步產(chǎn)物的分離和純化。
實(shí)施例3 、產(chǎn)物的分離和純化
選擇分析型C-18 ODS色譜柱(4.6x250 mm, Kromasil)對(duì)實(shí)施例2所得的NK粗提產(chǎn)物 進(jìn)行純化和分析，色譜條件檢測波長227nm，流速1 mL/min，柱溫是室溫，流動(dòng)相為 甲醇水=7: 3。根據(jù)HPLC過程中得出的各樣品中的紫杉醇的鋒面積，運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng) 得到的計(jì)算紫杉醇含量的標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算得率。從圖1中可以看出，當(dāng)加入1%甲醇的時(shí)候， 紫杉醇的含量有大幅度的提高。與對(duì)照組相比較，增加了將近一倍。而加入2%乙酸乙酯， 或0.5%三氯甲烷，或1%三氯甲垸時(shí)，紫杉醇的產(chǎn)量也有不同程度的提高。
權(quán)利要求
1、一種提高真菌產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)率的雙液相發(fā)酵方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora NK17，當(dāng)菌體生長達(dá)到平臺(tái)期，加入有機(jī)溶劑繼續(xù)培養(yǎng)，以使在所述微生物細(xì)胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和聚集紫杉醇，以及從所述細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中回收并提純紫杉醇。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l戶，的方法，，征在于fM的培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基，其鄉(xiāng)M為g/L: 馬鈴薯180-220 g，蔗糖20g，自然pH。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1 所述的方法,其特征在于所述的培養(yǎng)是在需氧條件下進(jìn)行，溫度為28-30°C， 發(fā)酵初始pH 值為 PDB培養(yǎng)基自然pH,，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180-220 ipm 。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于菌體是在500 mL-lL三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng)，接種 方式用塊狀菌絲體的接種方式。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，特征在于選擇加入的有機(jī)溶劑是甲醇、乙酸乙酯或三氯甲烷。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，特征在于選擇加入的有有機(jī)溶劑的體積濃度范圍為0.5%-2% 。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的方法，，征在于阮悉的回收并提純紫杉醇的步驟包括(1) 從所得培養(yǎng)液分離出發(fā)酵菌體和發(fā)酵上清液；(2) 用有機(jī)溶劑提取所得發(fā)酵菌體，提取液與上步的發(fā)酵上清液一起進(jìn)行濃縮；(3) 將第(2)步所得物用色譜純化的方法純化，得產(chǎn)物紫杉醇。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于在第(2)步濃縮前用飽和Na2C03溶液調(diào)節(jié)提 取液與發(fā)酵上清液的pH值為6.0 - 8.0。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于第(3)步所述的色譜純化方法中，使用 一個(gè)或一個(gè)以上的色譜柱，填料為C18，流動(dòng)相為甲醇/H20 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用雙液相發(fā)酵提高真菌產(chǎn)紫杉醇的方法。其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇真菌擬盤多毛孢(Pestalotiopsis microspora)NK17，當(dāng)菌體生長達(dá)到平臺(tái)期，加入有機(jī)溶劑繼續(xù)培養(yǎng)，以使在所述菌株細(xì)胞內(nèi)和所述培養(yǎng)基中更多地產(chǎn)生和聚集紫杉醇，以及從所述細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中回收并提純紫杉醇。本發(fā)明紫杉醇產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，紫杉醇產(chǎn)率可提高2倍。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101386874SQ200810152499
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2008年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日
發(fā)明者冰 嚴(yán), 劉志鵬, 朱旭東, 畢建男, 皎 潘 申請(qǐng)人:南開大學(xué)