專利名稱：人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所
述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備VEGF相關(guān) 的腫瘤的臨床檢測試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
VEGF是一種功能強大且能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，它是1989年 Ferrarra等在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中分離純化出來的一類糖蛋白，是血 小板衍生生長因子家族的一個成員，分子量為34-45 kDa，序列高度保守，廣泛 分布于人和動物的大腦、腎臟、肝臟、脾臟、胰腺、和骨骼等組織中。人VEGF 是由兩條糖蛋白鏈形成的同源二聚體，由于基因轉(zhuǎn)錄水平剪切方式不同，VEGF 至少有5種亞型，VEGF121、 VEGF145、 VEGF艦、VEGF冊和VEGF2M，其中VEGF^和VEGF版
功能最強且以可溶性蛋白形式分泌于細(xì)胞外。
單克隆抗體由兩條相同的重鏈和輕鏈組成。每一條重鏈(VH)和輕鏈(VL)都分 為恒定區(qū)和可變區(qū)兩大部分。其中，VH和VL共同組成抗原結(jié)合部位。抗體的特 異性正是由這一部位決定的。VH和VL長約110氨基酸，分別占輕重鏈的1/2和 1/4。在抗原結(jié)合部位中真正與抗原決定簇空間構(gòu)象互補的是3個氨基酸變化較 大的區(qū)域(CDR)。與可變區(qū)相對的是骨架區(qū)，其氨基酸序列相對保守。scFv是由 VH和VL與一柔性氨基酸短肽拼接而成。
國外有報道從噬菌體展示文庫篩選到VEGF的抗體(Baca M等J Biol Chem. 1997 Nov;272(16) :—10678-84.)，但由于這種抗體是沒有經(jīng)過免疫過的，一 般親和力較抵，不適合作為臨床檢測試劑。國內(nèi)有VEGF抗體雜交瘤細(xì)胞株建立 的報道(石琦等，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2008年02期)，但迄今為止還沒有相關(guān)基因序列的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了尋找針對用于VEGF相關(guān)的腫瘤的臨床檢測試劑，針對抗體雜交瘤細(xì)胞 株應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)上容易突變，細(xì)胞株不穩(wěn)定，容易丟失，代價昂貴等諸多缺 點，本發(fā)明應(yīng)用基因工程手段，提供了一種人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體輕鏈 可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因及其表達(dá)產(chǎn)物，并組裝了 scFv型的基因工程抗體 片段，使得大規(guī)模廉價生產(chǎn)抗體成為可能。
本發(fā)明的另一個目的在于人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體及其scFv抗體 片段在制備用于VEGFw相關(guān)的腫瘤疾病的檢測試劑中的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明的人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的 基因，該基因包括重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，重鏈可變區(qū)基因具有SE Q ID N0:1的核苷酸序列，輕鏈可變區(qū)基因具有SEQ ID N0:3的核苷酸序列。
由上述的基因編碼的多肽，該多肽具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列和SEQ ID N(h4的氨基酸序列。
一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有SEQ ID N0:1的核苷酸序列的重鏈可變區(qū) 基因和SEQ ID N0:3的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)基因。
作為優(yōu)選，該表達(dá)載體為pET28a-scFv。
上述的表達(dá)載體所表達(dá)的多肽。
上述的表達(dá)載體所表達(dá)的多肽的生產(chǎn)方法，包括以下的步驟從VEGF165 單克隆細(xì)胞株分離出抗體的重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因VL，并組裝 scFv，用組裝的scFv構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建基因工程菌，并 誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和復(fù)性。
作為優(yōu)選，上述的表達(dá)載體所表達(dá)的多肽的生產(chǎn)方法，包括以下的步驟① 從VEGF皿單克隆細(xì)胞株分離抗體的可變區(qū)基因
收集生長良好，能分泌VEGF^單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，提取總RNA， 設(shè)計兼并引物，重鏈可變區(qū)基因VH采用引物VH Back (5， -AGGTSMARCTGC AGSAGTCWGG-3，)和引物VH For (5， -TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG -3，);輕鏈可變區(qū)基因VL采用引物VL back (5， -GACATTGAGCTCACCCAGTCTCC A-3，)和引物VL For (5， -GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3，)，
按照一步法RT-PCR試劑盒分別擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因 VL，分別采用RT-PCR方法，釣取抗體可變區(qū)重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū) 基因VL，分別克隆進(jìn)入載體pMD18-T;
② 重鏈可變區(qū)基因VH，輕鏈可變區(qū)基因VL擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆 引物設(shè)計如下
VH Pi (5， -ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3，)，含有五co/ff酶切 位點，
VH P2 (5， -AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3，)， VL Pi (5， -CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3，)， VL P2 (5， -GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3，)，含有歷/ dn酶 切位點，
采用Over-lap PCR，在VH和VL之間設(shè)計一段柔性linker (G4S)3 ， VH-linker-VL，克隆于高效原核表達(dá)載體pET28a;
③ 高效表達(dá)，純化，復(fù)性scFv:
pET28a-scFv轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21 (DE3)， IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集包含體沉淀，尿 素溶解，Ni2+_IDA His-bind親和層析純化蛋白，稀釋法和透析法對目的蛋白 復(fù)性，純化的蛋白稀釋到復(fù)性緩沖液I，復(fù)性18 30h，然后將蛋白裝入復(fù)性緩沖液II，透析復(fù)性10 15h， 超濾管Centricon30濃縮蛋白，13。/。SDS-PAGE檢 測，蛋白-20° C保存。
作為優(yōu)選，上述的復(fù)性緩沖液I選用50mMTris-HC1、0. 15mMNaCl、 2Murea、 0. 5Mm還原型谷胱甘肽、0. lmM氧化型谷胱甘肽、pH 8. 0，終濃度為100 u g/ml， 復(fù)性24h。
作為優(yōu)選，上述的復(fù)性緩沖液II選用50mmol/LTris-HCl、 0. 15mol/LNaCl、 pH 8.0。
本發(fā)明利用基因工程手段首先從分泌VEGF165的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 中獲得了單克隆抗體的輕重鏈可變區(qū)基因，并組裝了 scFv小分子抗體，克隆到 pET28a表達(dá)載體中，并能在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)保留了 與抗體結(jié)合的能力，能夠與VEGF版作用，而且與傳統(tǒng)意義上雜交瘤抗體比較具 有以下優(yōu)勢scFv分子小，容易通過基因工程技術(shù)的改造，與一些其他效應(yīng)分子 結(jié)合,為構(gòu)建生物導(dǎo)彈打下基礎(chǔ)；雜交瘤細(xì)胞株不容易保存，規(guī)?；a(chǎn)成本高， 而基因工程抗體可以采用原核表達(dá)系統(tǒng)，可以很方便的生產(chǎn)抗體，成本大大降 低，利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此基因工程抗體的生產(chǎn)較雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生抗體優(yōu)勢 明顯，從而可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)雜交瘤細(xì)胞株生產(chǎn)抗體。此外，VEGFw5的基因工程抗體 可以用來制作VEGF165的親和層析介質(zhì)用于VEGF版的純化。


圖1是VEGF165抗體可變區(qū)VH和VL的RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié) 果，其中泳道l為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2為VH基因，分子量大約在340bp;泳道3為 VL基因，分子量大約在330bp;泳道4為VH-linker-VL基因，大小在750bp左右。 圖2是VEGF165 scFv基因的組裝以及表達(dá)載體構(gòu)建的示意圖。 圖3是VEGF165 scFv的誘導(dǎo)表達(dá)，純化和鑒定的分析結(jié)果，其中(A1):標(biāo)準(zhǔn)蛋白；(A2):未誘導(dǎo)全齒蛋白；(A3):誘導(dǎo)后全菌蛋白；(A4):超聲上清；(A5): 超聲沉淀；(A6):純化產(chǎn)物；(Bl) :Western blotting檢測蛋白的表達(dá)。
圖4是非競爭性ELISA測定scFv與VEGF165的結(jié)合示意圖。
圖5是競爭性ELISA測定scFv抑制單克隆抗體與VEGF165的結(jié)合示意圖。
圖6是Western blotting檢測scFv與VEGF165的結(jié)合，其中(A1):標(biāo)準(zhǔn) 蛋白；(A2):純化VEGF165蛋白;(B) : mAb與VEGF165的結(jié)合(C) : scFv與VEGF165 的結(jié)合；(D):無關(guān)IgG與VEGF165的結(jié)合(作為陰性對照)。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。 實施例l:從VEGF165單克隆細(xì)胞株分離抗體的可變區(qū)基因
收集生長良好，能分泌VEGF165單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ABL-1107個(本 石開究室構(gòu)建，按照"Current protocol in immunology" Production of Monoclonal Antibodies)，用TRIZ0L試劑提取總RNA。 RT-PCR釣取VH基因
參照Promega公司的(Access RT-PCR System and Access RT-PCR Introductory System)提供的方法 一步法RT-PCR試劑盒分別擴(kuò)增VH基因
VH基因采用引物VH Back (5， -AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3，)和引物VH For (5， -TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3，)，
RT-PCR反應(yīng)總共為50u 1體系1 u g的總RNA， 10u 1的5XAMV/7Y7反 應(yīng)緩沖液，濃度為10 pmol的引物VH Back和VH For各5 y 1，濃度為500 uM 的dNTPl wl， 3mM的MgS(X2 u 1; 5 u AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 u 1禾n 5 u 7Y7 DNA聚合 酶lw。反應(yīng)歩驟48° C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)45分鐘；94° C變性30秒；55° C退火1 分鐘；68° C延伸l分鐘，共35個循環(huán)。RT-PCR釣取VL基因
VL基因采用引物VLback (5， -GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3，)和VL For (5， -GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3，)。按照Promega公司一步法RT-PCR試劑盒 擴(kuò)增VL。 50ix 1反應(yīng)體系如下1 " g的總RNA， 10u 1的5XAMV/7Y7反應(yīng)緩 沖液，濃度為10 pmol的引物VL back和VL For各5u "L，濃度為500 uM的 dNTPl tU， 3mM的MgS042 1; 5 u AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 u 1和5 u 7Y7 DNA聚合酶 ly。反應(yīng)步驟48° C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)45分鐘；94° C變性30秒；60° C退火1分 鐘；68° C延伸l分鐘，共35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結(jié)果如圖l。
VH和VL基因擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆
引物設(shè)計如下
VH Pi (5， -ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3，)，含有AcoM酶切 位點，
VH P2 (5， -AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3，)， VL Pi (5， -CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3')， VLP2 (5， -GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3，)，含有歷'/7dlI酶 切位點，
PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒純化。取載體pMD18-T lul， PCR產(chǎn)物4ul， T4連接酶lul， 5iilT4連接酶緩沖液(2倍)，16度連接18小時。連接產(chǎn)物 10 nl轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 a 。鋪板，第二天挑取單克隆，采用菌落PCR鑒 定，并送交上海博亞公司測序。測序結(jié)果如序列表SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3所示。
實施例2: scFv基因的組裝之間添加一柔性linker (G4S)3，為防止在擴(kuò)增過 程中引人突變,我們采用高保真酶Pyrobest (大連寶生物).整個組裝示意圖為 圖2，結(jié)果如圖l。 第一輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增VH:
50u 1 PCR反應(yīng)體系如下5p1的10X反應(yīng)緩沖液；濃度為10uM的引物 VHP^卩VHP2 2. 5u l:4u 1的dNTP; 35ulH20;高保真Pyrobest酶0. 5u 1。 95° C變性5min; 95° C變性30s， 55° C退火30s， 72° C延伸30s，共26個 循環(huán)；72° C，延伸5min. 第二輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增VL:
50ixl PCR反應(yīng)體系如下:5"1的10X反應(yīng)緩沖液；濃度為10uM的引物 VL P,和VL P2 2. 5u l:4u 1的dNTP; 35ixlH20;高保真Pyrobest酶0. 5 u 1。 95。 C變性5min; 95° C變性30s， 52° C退火30s， 72° C延伸30s，共26個 循環(huán)；72° C，延伸5min.割膠回收PCR產(chǎn)物. 第三輪PCR反應(yīng)擴(kuò)增VH-1 inker-VL:
50ul PCR反應(yīng)體系如下5txl的10X反應(yīng)緩沖液；濃度為10pM的引物 VH P,和VL P2 2. 5u l:4u 1的dNTP; 35ulH20;高保真Pyrobest酶0. 5 ji 1， 上兩輪PCR產(chǎn)物各lu 1做為模板。95° C變性5min;95。 C變性30s， 52° C退 火30s， 72° C延伸30s，共26個循環(huán)；72° C，延伸5min.反應(yīng)。1%瓊脂糖凝 膠電泳，割膠回收產(chǎn)物. 實施例3: scFv基因的酶切消化和連接 雙酶切pET28a:
fcoM和歷77offl為Takara產(chǎn)品。2 w 1的10XM反應(yīng)緩沖液；10ul的載體
pET28a; ^co/ I和歷威I各1 u 1; 7 u 1 H20。 37° C反應(yīng)6小時。:
ii雙酶切實施例2中的第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物
2U 1的IOXM反應(yīng)緩沖液；IOU 1的第三輪PCR產(chǎn)物；^CO/a和歷/70ffl各
lul; 7ul H20。 37° C反應(yīng)6小時。1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收產(chǎn)物。 連接反應(yīng)
T4連接酶為Takara產(chǎn)品。2 ul的連接反應(yīng)緩沖液H20;上輪酶切產(chǎn)物各 16 ul H20。 16° C反應(yīng)12小時.
取10ul產(chǎn)物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5ci.鋪板，第二天挑取單克隆，采用菌落 PCR鑒定，并送交上海博亞公司測序。 實施例4: scFv單鏈抗體在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá).
挑取測序正確的克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3).挑取單個菌落接種到3 ml LB 培養(yǎng)液(含50 u g/ml卡那霉素)中，37° C培養(yǎng)10小時，收集細(xì)菌，按l:100接 種到50 ml含相同濃度抗生素LB中，37° C培養(yǎng)至OD600=0. 6時，加IPTG (lmmol/L)誘導(dǎo)，37° C培養(yǎng)5小時，13% SDS-PAGE檢測表達(dá)情況.結(jié)果如圖3， 清楚表明表達(dá)的蛋白分子量在27Kd左右。主要存在于包含體內(nèi)。 實施例5:表達(dá)產(chǎn)物的分離純化和復(fù)性
4。 C 5000g/min離心10min收集菌體，以5 ml 50mmol/L Tris-HC1， 0. 15mol/L NaCl重懸沉淀，然后冰上超聲(超聲5s，間隙5s，反復(fù)160次)，至 細(xì)胞懸液不再粘稠.室溫12000 g/min離心10min，分別收集上清和沉淀.沉 淀加入2. 5 ml Binding緩沖液(50腿ol/L Tris-HC1， 0. 15mol/L NaCl， 8M urea, 5mM咪唑，pH 8. 0),室溫溶解2小時.室溫12000 g/min離心10min，收集上清. 取肌2+-IDA His-bind resin 1ml裝柱，按照Novagen公司提供的操作手冊純化 蛋白.
收集Elution緩沖液洗脫的蛋白，測定蛋白濃度，用復(fù)性緩沖液I (50咖ol/L Tris-HCl， 0. 15mol/L NaCl， 2M urea， 0. 5mmol/L還原型谷胱甘 肽，0. lmmol/L氧化型谷胱甘肽pH 8. O)稀釋蛋白至終濃度為100 u g/M1.復(fù)性 24h，接著將蛋白裝人透析袋，用復(fù)性緩沖液II(50mmol/LTris-HC1， 0. 15mol/L NaCl， pH 8.0)透析復(fù)性12h.超濾管Centricon 30 (Millipore， USA)濃縮蛋 白.13%SDS-PAGE檢測.蛋白-20° C保存. 實施例6: scFv單鏈抗體與VEGF165結(jié)合活性測定
1) 非競爭ELISA法測定
10 tig/ml VEGF165 (NaHC03, pH9. 6 ) 4。 C包板過夜.第二天用1%脫脂牛 奶封閉(37° C，2h).系列稀釋的scFv分別與VEGF165孵育(37。 C，2h).以抗His 單克隆抗體(Novagen， USA)為一抗，HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG為二抗，常規(guī)ELISA 檢測(參照Current protocol in immunology imit2. 1-2. 3 ).結(jié)果如圖4
2) 競爭ELISA法測定
10 tig/ml VEGF165 (腿C0:,， pH9. 6 ) 4° C包板過夜.系列稀釋的scFv分 別與ABL-1 mAb混合，與VEGF165孵育(37。 C， 2h).用HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG 檢測scFv抑制ABL-1 mAb與VEGF165的結(jié)合.結(jié)果如圖5，結(jié)果證實ABL-1 scFv 與ABL-1單克隆抗體是同一表位結(jié)合VEGF165.
3) Western blotting測定
取VEGF165 20 ul， 13%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，1%BSA封 閉后，加scFv 37° C孵育2h，抗His單克隆抗體(Novagen， USA)為一抗，HRP 偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG為二抗，頂B顯色.(具體參照Current protocol in immunology unit 8.10).結(jié)果如圖6，結(jié)果表明scFv與單克隆抗體識別 hsVEGF165的線性表位。
13序列表
<110>林值華
<120>人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的基因及其應(yīng)用
<160>4
<210〉 1
<211>342
<212>DNA
<213>雜交瘤細(xì)胞株
<220>
<221>
<222> (1)…(342) <400〉 1
gtgcaactgc aggagtcagg aggaggcttg gtacagcctg ggggttctct gagactctcc 60
tgtgcaactt ctgggttcac cttcactgat tactacatga gctgggtccg ccagcctcca 120
ggaa嗎gcac ttgagtggtt gggttttatta ga犯caaacc toatccttag acaaccgagt 180
acactgctac tgtgaagcct cggttcacca tctccagaca taattcccaa agcatcctct 240
atcttcaaat gaacaccctg agagctgagg acagtgcca cttattactg tgcaagagat 300
atcacccttc tgggccaagg gaccacggtc accgtctcct ca 342
<210>2
<211〉114
<212>PRT
<400>2GTTVTVSS <210>3 <211>318 <212>DNA <213>雜交瘤細(xì)胞株 <400〉3
gacattgagc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctg aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcacaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggatttat accacatcca acctccctte tcgagtccca 180 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgcgacc tcttactctc tcacaatcac cagcatccag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgta cacgttcgga 300 gccgggacca agctcgag 318 <210〉4 <211> 106 <212>PRT <400>4
LPSRVPARFSGSGSATSYSLTITSIQAEDAATYYCHQYHRSPYTFGAGTKLE
權(quán)利要求
1. 人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的基因，其特征在于該基因包括重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因，重鏈可變區(qū)基因具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，輕鏈可變區(qū)基因具有SEQ ID NO3的核苷酸序列。
2. 由權(quán)利要求l的基因編碼的多肽，其特征在于該多肽具有SEQ ID N0:2的 氨基酸序列和SEQ ID N0:4的氨基酸序列。
3. —種表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體含有SEQ ID N0:1的核苷酸序列的 重鏈可變區(qū)基因和SEQ ID N0:3的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體為pET28a-
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4的表達(dá)載體所表達(dá)的多肽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽在制備用于VEGF165相關(guān)的腫瘤的檢測試劑中的 應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下的步驟從 VEGF165單克隆細(xì)胞株分離出抗體的重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因 VL，并組裝scFv，用組裝的scFv構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建 基因工程菌，并誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化和復(fù)性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽的生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下的歩驟 ①從VEGF165單克隆細(xì)胞株分離抗體的可變區(qū)基因收集生長良好，能分泌VEGF165單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，提取總■，設(shè)計兼并引物，重鏈可變區(qū)基因VH采用引物VH Back (5， -AGGTSMAR CTGCAGSAGTCWGG-3，)和引物VH For (5， -TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTT GGCCCCAG-3')，輕鏈可變區(qū)基因VL采用引物VL back (5， -GACATTGAGCTCACCCAGTCTC CA-3，)和引物VL For (5， -GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3，)，按照一步法RT-PCR試劑盒分別擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū) 基因VL，分別采用RT-PCR方法，釣取抗體可變區(qū)重鏈可變區(qū)基因VH和輕 鏈可變區(qū)基因VL，分別克隆進(jìn)入載體pMD18-T;② 重鏈可變區(qū)基因VH，輕鏈可變區(qū)基因VL擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆引物設(shè)計如下VH P, (5， -ACCATGGAATTCCTGCAGGAGTCTGGTGGCTTG-3，)，含有fco/a 酶切位點，VH P2 (5， -AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTG-3，)， VL (5， -CAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGACATTGAGCTCAC-3，)， VL P2 (5， -GTGGTGAAGCTTTCACTCGAGCTTGGTACCACCTC-3，)，含有歷/ c/ III酶切位點；采用Over-lap PCR，在重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因VL之間 設(shè)計一段柔性linker (G4S):i， VH-linker-VL，克隆于高效原核表達(dá)載體 pET28a;③ 高效表達(dá)，純化，復(fù)性scFv:pET28a-scFv轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21 (DE3)， IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集包含體沉淀， 尿素溶解，Ni2+-IDA His-bind親和層析純化蛋白，稀釋法和透析法對目 的蛋白復(fù)性，純化的蛋白稀釋到復(fù)性緩沖液I ，復(fù)性lS 30h，然后將蛋白 裝入復(fù)性緩沖液II ，透析復(fù)性10 15h，超濾管Centricon 30濃縮蛋白， 13呢SDS-PAGE檢測，蛋白-20° C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽的生產(chǎn)方法，其特征在于復(fù)性緩沖液I選用50mMTris-HC1、 0. 15mMNaCl、 2M urea、 0. 5Mm還原型谷胱甘肽、0. lmM氧化 型谷胱甘肽、pH8.0，終濃度為100tig/ml，復(fù)性24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽的生產(chǎn)方法，其特征在于復(fù)性緩沖液n選用 50腿ol/L Tris-HC1、 0. 15mol/L NaCl、 pH 8.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及人血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，由所述基因編碼的多肽，含有所述基因的載體及所述的基因和多肽在制備VEGF相關(guān)的腫瘤的臨床檢測試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明利用基因工程手段首先從分泌VEGF₁₆₅的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株中獲得了單克隆抗體的輕重鏈可變區(qū)基因，重鏈可變區(qū)基因具有SEQ ID NO1的核苷酸序列，輕鏈可變區(qū)基因具有SEQ ID NO3的核苷酸序列，并組裝了scFv小分子抗體，克隆到pET28a表達(dá)載體中，并能在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)保留了與抗體結(jié)合的能力，能夠與VEGF₁₆₅作用。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)的改造，為構(gòu)建生物導(dǎo)彈打下基礎(chǔ)；并且可以很方便的生產(chǎn)抗體，成本大大降低，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/13GK101487005SQ200810120430
公開日2009年7月22日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者林植華 申請人:林植華