專利名稱：：一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有的釀酒酵母生產(chǎn)乙醇均是以己糖為原料，由于釀酒酵母缺乏代謝木糖的兩種關(guān)鍵酶——木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH)，所以不能使木糖代謝后產(chǎn)生乙醇。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前釀酒酵母缺乏木糖醇脫氫酶(XDH)，而不能使木糖代謝后產(chǎn)生乙醇問題，而提供的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法。本發(fā)明表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進行一、以休哈塔假絲酵母基因組為模板克隆^^2基因；二、回收、純化;j72基因片段后與pGMTvector載體在16-C的條件下連接1012h，得到pGMT-xyl2;三、重組質(zhì)粒p406ADHl-l的構(gòu)建，克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以釀酒酵母整合載體p406ADHl為骨架引入ADHt基因；四、重組質(zhì)粒p406ADHl-2的構(gòu)建，克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因，再將KanR基因加入質(zhì)粒p406ADHl-l;五、重組質(zhì)粒p406ADHl-3的構(gòu)建，克隆釀酒酵母中的rDNA基因，再將rDNA基因加入質(zhì)粒p406ADHl-2;六、將xy72基因加入質(zhì)粒p406ADHl-3，即得到表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5，-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3，，下游引物序列為5，-TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3，；步驟三中ADHt基因序列擴增上游引物序列為5'誦AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3，，下游弓|物序歹!j為5'-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3，；步驟四中KanR基因擴增上游引物序列為5，-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3，，下游引物序列為5'-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3，；步驟五中rDNA基因擴增上游引物序列為5，-CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3，，下游引物序列為5,誦TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT腸3，。本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒，用本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母工業(yè)菌株得到的重組菌HDTG-;qy/2能夠產(chǎn)生休哈塔假絲酵母中Ay/2基因編碼的木糖醇脫氫酶(XDH)，其木糖醇脫氫酶活力較出發(fā)菌株大大提高，出發(fā)菌株不產(chǎn)生木糖醇脫氫酶，重組菌株的木糖醇脫氫酶的酶活為1.51U/mg，酶活力提高，表明構(gòu)建的表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母后實現(xiàn)了木糖醇脫氫酶基因的高效穩(wěn)定表達(dá)。對本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母進行穩(wěn)定性測定，結(jié)果現(xiàn)實60世代后的穩(wěn)定性為99%,在非選擇性壓力下，整合于釀酒酵母染色體上的外源基因片斷具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能適合用于工業(yè)生產(chǎn)的粗放環(huán)境。具體實施例方式具體實施方式一本實施方式表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進行一、以休哈塔假絲酵母基因組為模板克隆xy72基因；二、回收、純化xy72基因片段后與pGMTvector載體在16'C的條件下連接10~12h，得到pGMT-:cj;/2;三、重組質(zhì)粒p406ADHl-l的構(gòu)建，克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以釀酒酵母整合載體p406ADHl為骨架引入ADHt基因；四、重組質(zhì)粒p406ADHl-2的構(gòu)建，克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因，再將KanR基因加入質(zhì)粒p406ADHl-l;五、重組質(zhì)粒p406ADHl-3的構(gòu)建，克隆釀酒酵母中的rDNA基因，再將rDNA基因加入質(zhì)粒p406ADHl-2;六、將義/22基因加入質(zhì)粒p406ADHl-3，即得到表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒，其中步驟一中擴增上游引物序列為5'-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3，，下游引物序列為5'國TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3，；步驟三中ADHt基因序列擴增上游引物序列為5'-AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3，，下游引物序列為5'-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3，；步驟四中KanR基因擴增上游引物序列為5，-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3，，下游引物序列為5，-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3，；步驟五中rDNA基因擴增上游引物序列為5'腸CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3，，下游引物序列為5，-TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT-3,。本實施方式步驟二用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的DNA膠回收試劑盒(GelExtractionMiniKit)進行回收。本實施方式步驟一在引物的兩端加入XbaI和XhoI的酶切位點；步驟三在引物的兩端加入Xhol和Kpnl的酶切位點；步驟四在引物的兩端加入KpnI和NdeI的酶切位點；步驟五在引物的兩端加入NdeI的酶切位點；步驟六將pGM-和p406ADHl-3用XbaI禾QXhoI雙切酶切后再進行連接。本實施方式質(zhì)粒pKT0150購自于Addgene公司，休哈塔假絲酵母基因組DNA利用天凈沙公司的真菌基因組DNA提取試劑盒得到。本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒等均容易購得，若無特殊要求則濃度為產(chǎn)品標(biāo)注濃度。本實施方式步驟二至六參見試劑盒使用操作手冊。本實施方式步驟二至六各步驟得到的質(zhì)粒經(jīng)PCR驗證后可轉(zhuǎn)化入DH5a中保存和擴增。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟一中PCR反應(yīng)體系為IO^aL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^L濃度為lpmol/^L的上游引物、l^iL濃度為lpmol/nL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的模板DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C7min，變性94°Clmin，退火42。Clmin，延伸72°C1.5min，共30個循環(huán)，延伸72。C10min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟一中PCR反應(yīng)體系為50|aL由5^L10xPCRbuffer、4pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、5pL濃度為lpmol/nL的上游引物、5pL濃度為lpmol&L的下游引物、4pL濃度為25mmol/L的MgCl2、IO^iL模板DNA、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C7min，變性94°Clmin，退火42。Clmin，延伸72°Cl.5min，共30個循環(huán)，延伸72。Cl0min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。本實施方式中所用10xPCRbuffer中不含有Mg2+。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟二中"72基因片段與pGMTvector載體的連接體系為lOpL由5^iL的基因、lpLpGM-Teasy載體、lpLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟三中克隆ADHt基因的PCR反應(yīng)體系為10pL由luL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l(iL濃度為lpmol/pL的上游引物、l^iL濃度為lpmol/nL的下游引物、0.8(xL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的質(zhì)粒pKT0150、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C7min，變性94°C45s，退火49°C30s，延伸72°C45s，共30個循環(huán)，延伸72'C10min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。具體實施方式六本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟三中ADHt基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-A，然后用限制性內(nèi)切酶XhoI和KpnI對pGM-A和p406ADHl分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-l。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。本實施方式ADHt基因與質(zhì)粒載體pGMTvector的連接體系為lOpL由5pL的ADHt基因、l^LpGMTvector載體、lpLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-A的雙切酶體系為20pL由5pL濃度為lpg/nL的pGM-A、2pL10xPCRbuffer、lpLXhoI、l^iLKpnI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl的雙切酶體系為20mL由5pLp406ADHl、2&10xPCRbuffer、lpLXhoI、lpLKpnI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-A和p406ADHl的連接體系為lOpL由2pLpGM-A、2pLp406ADHl、lMLLigase和余量無菌去離子水組成。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟四中克隆的KanR基因的PCR反應(yīng)體系為10^L由lpL10xPCRbuffer、0.8nL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^L濃度為lpmol/^iL的上游引物、l^L濃度為lpmol/^L的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的質(zhì)粒pKT0150、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C7min，變性94。Clmin，退火43。Clmin，延伸72°C90s,共30個循環(huán)，延伸72'Cl0min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式八本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟四中KanR基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-K,然后用限制性內(nèi)切酶KpnI和NdeI對pGM-K和p406ADHl-l分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-2。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。本實施方式KanR基因與質(zhì)粒載體pGMTvector的連接體系為10pL由5pL的KanR基因、lpLpGMTvector載體、lpLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-K的雙切酶體系為20pL由5pL濃度為lng/^iL的pGM-K、2pL10xPCRbuffer、lpLKpnI、l^LNdeI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl-l的雙切酶體系為20pL由5pLp406ADHl-l、2jxL10xPCRbuffer、lpLKpnI、lnLNdeI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-K和p406ADHl-l的連接體系為lO^iL由2|xLpGM-K、2jiLp406ADHl-l、lpLLigase和余量無菌去離子水組成。具體實施方式九本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟五中克隆的rDNA基因的PCR反應(yīng)體系為IO^iL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5腿ol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/^iL的上游引物、lML濃度為lpmol/^L的下游引物、0.8^iL濃度為25mmol/L的MgCl2、2|iL的釀酒酵母、0.2^L濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C7min，變性94。C2min，退火45。Clmin，延伸72°C2min，共35個循環(huán)，延伸72'Cl0min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式十本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟五中rDNA基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-R，然后用限制性內(nèi)切酶NdeI對pGM-R和p406ADHl-2分別進行單酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-3。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。本實施方式rDNA基因與質(zhì)粒載體pGMTvector的連接體系為10pL由5pL的rDNA基因、lpLpGMTvector載體、lpLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-R的單切酶體系為20nL由5pL濃度為1pg/nL的pGM-R、2pL10xPCRbuffer、2pLNdeI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl-2的單切酶體系為20^L由5pLp406ADHl-2、2pL10xPCRbuffer、2pLNdeI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-R和p406ADHl-2的連接體系為lO^iL由2pLpGM-R、2pLp406ADHl-2、lpLLigase和余量無菌去離子水組成。具體實施方式十一本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟六中用限制性內(nèi)切酶XbaI禾HXhoI對pGM-R和p406ADHl-3分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。本實施方式pGM-R的雙酶切體系為20nL由5pL濃度為1pg4iL的pGM-R、2pL10xPCRbuffer、lpLXbaI、lpLXhoI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl-3的雙酶切體系為20pL由5^Lp406ADHl-3、2pL10xPCRbuffer、lpLXbaI、lpLXhoI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-R和p406ADHl-3連接體系為10joL由5jiL的pGM-R基因、l|iLp406ADHl-3載體、lpLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。具體實施方式十二本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟一中PCR反應(yīng)體系為lOpL由lpL10xPCRbuffer、0.8nL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/pL的上游引物、1^L濃度為lpmol/^iL的下游引物、0.8^L濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的模板DNA、0.2^L濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C7min，變性94°Clmin，退火42。Clmin,延伸72°C1.5min，共30個循環(huán)，延伸72。C10min;步驟一中PCR反應(yīng)體系為50^iL由5joL10xPCRbuffer、4pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、5pL濃度為lpmol4iL的上游引物、5pL濃度為lpmol/^L的下游引物、4pL濃度為25mmol/L的MgCl2、10pL模板DNA、0.2^iL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C7min，變性94°Clmin，退火42。Clmin，延伸72°C1.5min，共30個循環(huán)，延伸72。C10min;步驟二中^72基因片段與pGMTvector載體的連接體系為lO^L由5pL的基因、1^LpGM-Teasy載體、ljxLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成；步驟三中克隆ADHt基因的PCR反應(yīng)體系為10^L由1pL10xPCRbuffer、0.8nL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/pL的上游引物、1^iL濃度為lpmol/pL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的質(zhì)粒pKT0150、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C7min，變性94°C45s，退火49。C30s，延伸72°C45s，共30個循環(huán)，延伸72°C10min;步驟三中ADHt基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-A，然后用限制性內(nèi)切酶XhoI和KpnI對pGM-A和p406ADHl分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-l;步驟四中克隆的KanR基因的PCR反應(yīng)體系為IOjiL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^L濃度為lpmol/^L的上游引物、lpL濃度為lpmol/VL的下游引物、0.8nL濃度為25mmol/L的MgCl2、2|xL的質(zhì)粒pKT0150、0.2nL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94-C7min，變性94°Clmin，退火43。Clmin，延伸72°C90s,共30個循環(huán)，延伸72°C10min;步驟四中KanR基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-K，然后用限制性內(nèi)切酶KpnI和NdeI對pGM-K和p406ADHl-l分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-2;步驟五中克隆的rDNA基因的PCR反應(yīng)體系為10pL由lpL10xPCRbuffer、0.8nL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^L濃度為lpmol/pL的上游引物、lpL濃度為lpmol^iL的下游引物、0.8jiL濃度為25mmol/L的MgCl2、2|aL的釀酒酵母、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C7min，變性94°C2min，退火45°Clmin,延伸72°C2min，共35個循環(huán)，延伸72-Cl0min;步驟五中rDNA基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-R，然后用限制性內(nèi)切酶NdeI對pGM-R和p406ADHl-2分別進行單酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-3;步驟六中用限制性內(nèi)切酶XbaI和XhoI對pGM-R和p406ADHl-3分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。本實施方式中用到的lOxPCRbuffer中不含有Mg2+。本實施方式ADHt基因與質(zhì)粒載體pGMTvector的連接體系為lO^L由5pL的ADHt基因、lpLpGMTvector載體、1mLT4逢接酵、l^L10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-A的雙切酶體系為20nL由5nL濃度為liag^L的pGM-A、2pL10xPCRbuffer、lpLXhoI、l^LKpnI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl的雙切酶體系為20pL由5pLp406ADHl、2pL10xPCRbuffer、lpLXhoI、lpLKpnI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-A和p406ADHl的連接體系為IO^iL由2nLpGM-A、2jjLp406ADHl、lpLLigase和余量無菌去離子水組成。本實施方式KanR基因與質(zhì)粒載體pGMTvector的連接體系為lOpL由5pL的KanR基因、l^LpGMTvector載體、lpLT4連接酶、ljiL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-K的雙切酶體系為20pL由5pL濃度為1pg^iL的pGM-K、2pL10xPCRbuffer、lpLKpnI、l]iLNdeI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl-l的雙切酶體系為20pL由5pLp406ADHl-l、2pLlOxPCRbuffer、lpLKpnI、l^iLNdeI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-K和p406ADHl-l的連接體系為10|iL由2|_iLpGM-K、2pLp406ADHl-l、IkiLLigase和余量無菌去離子水組成。本實施方式rDNA基因與質(zhì)粒載體pGMTvector的連接體系為10nL由5pL的rDNA基因、l^LpGMTvector載體、lnLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-R的單切酶體系為20^L由5pL濃度為l嗎/^L的pGM-R、2nL10xPCRbuffer、2pLNdeI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl-2的雙切酶體系為20pL由5pLp406ADHl-2、2jxL10xPCRbuffer、2^LNdeI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-R和p406ADHl-2的連接體系為10ixL由2nLpGM-R、2pLp406ADHl-2、lpLLigase和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-R的雙酶切體系為20pL由5pL濃度為1pgVL的pGM-R、2pL10xPCRbuffer、lpLXbaI、lpLXhoI和余量無菌去離子水組成；p406ADHl-3的雙酶切體系為20pL由5pLp406ADHl-3、2pL10xPCRbuffer、l^LXbaI、lpLXhoI和余量無菌去離子水組成。本實施方式pGM-R和p406ADHl-3連接體系為10pL由5pL的pGM-R基因、lpLp406ADHl-3載體、ljiLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。將本實施方式得到的表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成釀酒酵母，并進行以下實驗A、考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量1、大腸桿菌及其轉(zhuǎn)化子用50mL培養(yǎng)基培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期(llh左右)，有抗性的菌株相應(yīng)的培養(yǎng)基中加入抗性；2、取上述培養(yǎng)液100mL，在4'C的條件下以5000r/min的速度離心3min，收集菌體，離心管中加入40mL生理鹽水，洗滌菌體，重復(fù)3次，最后用40mL緩沖溶液重懸菌體，取樣，適當(dāng)稀釋后用血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)，計算菌懸液的菌體濃度(cells/mL)，記為NO;3、超聲波處理將上述重懸液轉(zhuǎn)移至50mL離心試管中，冰浴下進行超聲波處理。處理條件功率300W，0>2變幅桿，變幅桿的末端插入液面下約15mm處，超聲波處理5s，間歇10s，全程20min。采用血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)，計算超聲波處理后的菌體濃度(cells/mL)，記為Nl，并計算破壁率(l-N1/NO);4、當(dāng)破壁率〉90%時，將超聲波處理后的菌懸液30000xg,4'C下離心10min，收集上清，分裝于1.5mL的eppendorf管中，直接取樣測定酶活，或一20'C存放，使用時取出。若破壁率<90%，繼續(xù)破壁處理；5、取6支試管，按表l加入試劑。O號管為空白對照管。14號管分別加有不同已知量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(BSA)，用以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。5號管是待測樣品管。用0號管調(diào)分光光度計零點，測量其它各管的OD595值。以BSA濃度(或含量)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD595值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線。根據(jù)待測樣品測得的OD595值，由標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線讀出樣品的蛋白質(zhì)含量。從表1可以看出本實施方式表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒所制備的粗酶液中不含其它蛋白，木糖醇脫氫酶的濃度為10nL/mL。(酶粗液蛋白質(zhì)含量的測定按照蛋白質(zhì)含量測定試劑盒操作說明進行。)表l_試管編號_01234樣品5xCBB(pL)400400400棚4004000.5mg/mLBSA(^L)020406080—待測樣品液OiL)—一—一一20H20_至2mL至2mL至2mL至2mL至2mL至2mLB、轉(zhuǎn)化酵母1、G418抑菌濃度的測定將OD600達(dá)到0.4的釀酒酵母菌株涂布到配置好的含有不同濃度梯度的G418的YPD平板上，(終濃度200、400、600、800、1000、1200pg/mL)每個平板涂布200pL菌液，3(TC培養(yǎng)48h。觀察抑制酵母菌生長的最低G418濃度；2、受體菌的前處理將釀酒酵母菌株在YPD培養(yǎng)及上進行活化，三區(qū)劃線，將單菌落接種于lOmLYPD液體培養(yǎng)基，3(TC180rpm搖床培養(yǎng)過夜。測定菌液的OD值，使其稀釋至50mL時OD600達(dá)到0.4，繼續(xù)培養(yǎng)24h;3、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將酵母菌培養(yǎng)液在無菌條件下室溫i500g離心5min棄上清，加入40mLlxTE溶液將沉淀懸浮洗滌，1500g離心5min棄上清，加入2mLlxLiAc/0.5xTE溶液，懸浮沉淀后，室溫放置10min。在一無菌離心管中分別加入100nL經(jīng)過處理的酵母菌懸液，IOO嗎變性鮭精DNA,l嗎本實施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒，700jiLlxLiAc/40%PEG-4000/lxTE混合。同時取另一無菌離心管，分別加入lOO^L經(jīng)過處理的酵母菌懸液，IOO嗎變性鮭精DNA，700pLlxLiAc/40。/。PEG-4000/lxTE混合，作為對照。30。C反應(yīng)30min，加88nLDMSO原液，混合均勻，40。C水浴7min,13000r/min離心10s棄上清，lxTE洗滌沉淀兩次(加lmLTE洗漆，14000r/min離心10s，吸取上清)，加入50100kiLlxTE，稀釋后涂布于含有G418的平板上3(TC培養(yǎng)2d;4、轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性測定酵母轉(zhuǎn)化子接種40mLYPD液體培養(yǎng)基中，不同時間取樣，系列稀釋，分別在YPD和含G418的YPD平板上菌落計數(shù)，分別記為總菌數(shù)和帶有整合質(zhì)粒的菌落數(shù)，以下式計算質(zhì)粒穩(wěn)定性穩(wěn)定性(％)=(帶有整合質(zhì)粒的菌落數(shù)+總菌數(shù))xl00%將高拷貝轉(zhuǎn)化子HDTG-;^/2，接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基即在非選擇性壓力下?lián)u瓶培養(yǎng)60世代(每24h為10世代)。每隔10世代，平板計數(shù)菌落數(shù)進行穩(wěn)定性測定按公式計算，結(jié)果顯示60世代后的穩(wěn)定性為99%，表明在非選擇性壓力下，整合于釀酒酵母染色體上的外源基因片斷具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能適合用于工業(yè)生產(chǎn)的粗放環(huán)境。C、木糖醇脫氫酶酶活測定以lmL反應(yīng)液在340nm下檢測NAD被還原的量(即在340mn做時間掃描)。酶的比活力定義為每mg酶蛋白，每分鐘轉(zhuǎn)化NAD+的pmol/L數(shù)即U/mg蛋白，反應(yīng)體系如表2所示。表2木糖醇脫氫酶酶活測定體系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>酶活測定結(jié)果顯示，構(gòu)建的表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母工業(yè)菌株得到的重組菌HDTG-矽/2，其木糖醇脫氫酶活力較出發(fā)菌株HDTG-1大大提高，出發(fā)菌株不產(chǎn)木糖醇脫氫酶，重組菌株的酶活力為1.51U/mg，酶活力提高，表明本實施方式構(gòu)建的表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母后實現(xiàn)了木糖醇脫氫酶基因的高效穩(wěn)定表達(dá)，表達(dá)載體構(gòu)建成功。序列表<110>黑龍江大學(xué)<120>—種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法<160〉8<210>1<211〉32<212〉腿<213>人工序列〈220〉<221〉misc一feature<222>(18，24,30)<223〉r=g或a，m=a或c，w=a或t<220>〈223>根據(jù)休哈塔假絲酵母基因組DNA設(shè)計的基因PCR擴增上游引物。<400>1tgttctagaatgactgcwaacccwtcmttrgt32〈210>2〈211〉32<212>腿<213〉人工序列〈220〉〈221>misc—feature<222>(10，13,16，18，22，27，30)〈223>r=g或a，nFa或c，w-a或t，y-t或c,k=g或t〈220〉<223>根據(jù)休哈塔假絲酵母基因組DNA設(shè)計的基因PCR擴增下游引物?！?00>2tatctcgagytaytcwggrccrtcaatkarac32<210>3〈211〉27<212>腿<213〉人工序列<220>〈223〉根據(jù)質(zhì)粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1終止子片段在質(zhì)粒中的相對位置設(shè)計的PCR擴增上游引物。<400〉3aatctcgagtttgttactgctgctggt27〈210〉4〈211>28〈212>腿〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)質(zhì)粒pKT0150的核苷酸序列及ADH1終止子片段在質(zhì)粒中的相對位置設(shè)計的PCR擴增下游引物。<400〉4tatggtacccaagactgtcaaggaggg28〈210〉5〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>根據(jù)質(zhì)粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因片段在質(zhì)粒中的相對位置設(shè)計的PCR擴增上游引物?！?00〉5ttaggtacctctgtttagcttgcct25〈210>6<211>26<212〉賺〈213>人工序列<220>〈223〉根據(jù)質(zhì)粒pKT0150的核苷酸序列及KanR基因片段在質(zhì)粒中的相對位置設(shè)計的PCR擴增下游引物?！?00>6tatcatatgtatcatcgatgaattcg26〈210>7<211〉30〈212〉隨〈213〉人工序列〈220><223>根據(jù)釀酒酵母中的rDNA基因設(shè)計的PCR擴增上游引物?！?00〉7ctgcatatgggaacctctaatcattcgctt30〈210〉8〈211〉29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>根據(jù)釀酒酵母中的rDNA基因設(shè)計的PCR擴增下游引物?！?00>8tcaatatgaacgaacgagaccttaacct29權(quán)利要求1、一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法按以下步驟進行一、以休哈塔假絲酵母基因組為模板克隆xyl2基因；二、回收、純化xyl2基因片段后與pGMTvector載體在16℃的條件下連接10～12h，得到pGMT-xyl2；三、重組質(zhì)粒p406ADH1-1的構(gòu)建，克隆質(zhì)粒pKT0150中的ADHt基因序列，然后以釀酒酵母整合載體p406ADH1為骨架引入ADHt基因；四、重組質(zhì)粒p406ADH1-2的構(gòu)建，克隆質(zhì)粒pKT0150中的KanR基因，再將KanR基因加入質(zhì)粒p406ADH1-1；五、重組質(zhì)粒p406ADH1-3的構(gòu)建，克隆釀酒酵母中的rDNA基因，再將rDNA基因加入質(zhì)粒p406ADH1-2；六、將xyl2基因加入質(zhì)粒p406ADH1-3，即得到表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒；其中步驟一中擴增上游引物序列為5’-TGTTCTAGAATGACTGCWAACCCWTCMTTRGT-3’，下游引物序列為5’-TATCTCGAGYTAYTCWGGRCCRTCAATKARAC-3’；步驟三中ADHt基因序列擴增上游引物序列為5’-AATCTCGAGTTTGTTACTGCTGCTGGT-3’，下游引物序列為5’-TATGGTACCCAAGACTGTCAAGGAGGG-3’；步驟四中KanR基因擴增上游引物序列為5’-TTAGGTACCTCTGTTTAGCTTGCCT-3’，下游引物序列為5’-TATCATATGTATCATCGATGAATTCG-3’；步驟五中rDNA基因擴增上游引物序列為5’-CTGCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCTT-3’，下游引物序列為5’-TCACATATGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中PCR反應(yīng)體系為lOpL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、1^iL濃度為lpmol/pL的上游引物、lpL濃度為lpmol/pL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的模板DNA、0.2^iL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成;PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94。C7min，變性94。Clmin，退火42。Clmin,延伸72°C1.5min，共30個循環(huán)，延伸72。C10min。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中PCR反應(yīng)體系為50pL由5nL10xPCRbuffer、4pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、5|xL濃度為lpmol/nL的上游引物、5|止?jié)舛葹閘pmol/pL的下游引物、4pL濃度為25mmol/L的MgCl2、10pL模板DNA、0.2^L濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C7min，變性94。Clmin，退火42°Clmin，延伸72°CL5min，共30個循環(huán)，延伸72。C10min。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中x^2基因片段與pGMTvector載體的連接體系為10pL由5nL的^^2基因、l(oLpGM-Teasy載體、1(xLT4連接酶、lpL10x連接緩沖液和余量無菌去離子水組成。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中克隆ADHt基因的PCR反應(yīng)體系為IO^iL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/|iL的上游引物、1HL濃度為lpmol/jiL的下游引物、0.8mL濃度為25mmol/L的MgCl2、2^iL的質(zhì)粒pKT0150、0.2i!L濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94"C7min，變性94°C45s，退火49°C30s，延伸72°C45s，共30個循環(huán)，延伸72'C10min。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中ADHt基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-A，然后用限制性內(nèi)切酶XhoI和KpnI對pGM-A和p406ADHl分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-l。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中克隆的KanR基因的PCR反應(yīng)體系為10pL由lpL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、l^iL濃度為lpmol/pL的上游引物、l^L濃度為lpmol/nL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的質(zhì)粒pKT0150、0.2|iL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C7min，變性94°Clmin，退火43。Clmin，延伸72°C90s，共30個循環(huán)，延伸72。Cl0min。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中KanR基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-K，然后用限制性內(nèi)切酶KpnI和NdeI對pGM-K和p406ADHl-l分別進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-2。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中克隆的rDNA基因的PCR反應(yīng)體系為10pL由1^iL10xPCRbuffer、0.8pL濃度為2.5mmol/L的dNTP、lpL濃度為lpmol/pL的上游引物、1jiL濃度為lpmol/pL的下游引物、0.8pL濃度為25mmol/L的MgCl2、2pL的釀酒酵母、0.2pL濃度為5U/mL的Taq酶和余量重蒸餾水組成；PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C7min，變性94°C2min，退火45。Clmin，延伸72°C2min，共35個循環(huán)，延伸72。Cl0min。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于步驟五中rDNA基因與質(zhì)粒載體pGMTvector連接制備重組質(zhì)粒pGM-R，然后用限制性內(nèi)切酶NdeI對pGM-R和p406ADHl-2分別進行單酶切，然后用T4DNA連接酶進行連接，得到質(zhì)粒p406ADHl-3。全文摘要一種表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方法，它涉及一種質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。它解決了目前釀酒酵母缺乏木糖醇脫氫酶(XDH)，而不能使木糖代謝后產(chǎn)生乙醇問題。構(gòu)建方法一、克隆xyl2基因；二、回收、純化xyl2基因片段后與pGMTvector載體連接，得到pGMT-xyl2；三、重組質(zhì)粒p406ADH1-1的構(gòu)建；四、重組質(zhì)粒p406ADH1-2的構(gòu)建；五、重組質(zhì)粒p406ADH1-3的構(gòu)建；六、將xyl2基因加入質(zhì)粒p406ADH1-3，即得到表達(dá)木糖醇脫氫酶基因的質(zhì)粒。本發(fā)明方法所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母后實現(xiàn)了木糖醇脫氫酶基因的高效穩(wěn)定表達(dá)。文檔編號C12N15/66GK101302534SQ200810064830公開日2008年11月12日申請日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者凌宏志,剛宋,平文祥,杜春梅,雪洛,葛菁萍,丹趙,高冬妮申請人:黑龍江大學(xué)