專利名稱：：一種附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法。
背景技術：
：給水管網(wǎng)水質是人們目前十分關注的問題，在出廠水合格的情況下，多數(shù)管網(wǎng)水會出現(xiàn)濁度、色度和細菌等指標超標的現(xiàn)象。占全國供水量42.44Q/^的36個城巿的自來水公司調查發(fā)現(xiàn)，管網(wǎng)水中的平均細菌總數(shù)比出廠水增長接近4倍。管網(wǎng)中細菌再生長不僅是由于出廠水余氯的不足，更為主要的是出廠水中雖然經(jīng)過處理工藝，但仍然含有低濃度的微生物可利用的有機物和其它營養(yǎng)物質，能夠在管壁固液界面交界處形成營養(yǎng)相對豐富的環(huán)境，形成由細菌、菌落及其胞外聚合物組成的生物膜，這種生物膜中藏匿著許多條件致病菌，生物膜在水流的剪切力作用下和自身的新陳代謝作用，從管壁上不定期的脫落，惡化水質，造成水中懸浮細菌數(shù)目的增加；而且這種生物膜在內部停滯不流動的管道輸配水系統(tǒng)、家用管件、瓶裝水以及一些管道裝置(如水軟化器、碳過濾器以及售氷機內)中大量存在。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)上面所述生物膜由附著性異養(yǎng)菌組成，因此準確的測定附著性異養(yǎng)菌的菌落數(shù)量對更好的保證水體質量起著至關重要的作用。傳統(tǒng)附著性異養(yǎng)菌的測定方法(如磷脂法、耗氧呼吸速率等)檢出限高，無法達到測定要求，而分子生物學方法(如FISH等)對分析設備、試劑、操作及定量方法等有較高的要求。目前魯巍等人(魯巍，王云，張曉健.BAR反應器中生物膜的分離與定量，中國給水排水，Vol.21,No.2，2005,91-94)使用棉簽+超聲的方法對附著性生物膜進行了檢測，但由于這種生物膜中存在單個細菌、多個細菌粘附在一起的菌膠團、單一的顆粒物及吸附了細菌的顆粒，所以魯巍等人的方法只能檢測出單個細菌、菌膠團和顆粒的個數(shù)而無法真實的反映出實際的細菌菌落數(shù)，導致測量數(shù)據(jù)明顯低于實際。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)附著性異養(yǎng)菌的測定方法檢出限無法達到測定要求，而分子生物學方法對分析設備、試劑、操作及定量方法要求高，以及目前魯巍等人的方法測量數(shù)據(jù)明顯低于實際的問題，而提供的一種附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法。一種附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法按以下步驟進行實現(xiàn)一、先用無菌水淋洗帶有附著性異養(yǎng)菌的試樣，再用滅菌棉簽采集試樣，然后將棉簽放入10mL的解吸溶液中解吸812min;二、將解吸溶液在超聲頻率為40KHz、溫度為1822。C的條件下超聲處理1317min，得混合溶液；三、取lmL的混合溶液依次進行倍比稀釋；四、取倍比稀釋液涂布平板培養(yǎng)基然后置于23°C的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)168h，再進行異養(yǎng)菌計數(shù)和計算，即測出附著性異養(yǎng)菌菌落的數(shù)量；其中步驟一中解吸溶液中Tris緩沖溶液的濃度為0.01mol/L、Zwittergent3-12的濃度為2Xl(T4mol/L、乙二醇四醋酸的濃度為1Xl(r3mol/L、胰蛋白胨的濃度為lg/L，解吸溶液的pH值為7.0。本發(fā)明方法采用添加含有表面活性劑的解吸溶液和超聲波振蕩聯(lián)合的方式對附著性異養(yǎng)菌試樣進行測定，可以將菌膠團中的細菌分散、將生物膜中的單個細菌分離出來、將顆粒物中的細菌溶出，因此本發(fā)明方法可以最大限度的分離和保留附著性異養(yǎng)菌的活菌，能夠更為準確的測量出附著性異養(yǎng)菌。在完全相同的情況下本發(fā)明方法測得的數(shù)據(jù)比魯巍等人的方法測得的數(shù)據(jù)提高了H.l46倍，更接近實際情況。而且本發(fā)明方法簡單、易操作、工藝容易控制。具體實施方式具體實施方式一本實施方式一種附著性異養(yǎng)菌的檢測方法按以下步驟進行實現(xiàn)一、先用無菌水淋洗帶有附著性異養(yǎng)菌的試樣，再用滅菌棉簽采集試樣，然后將棉簽放入lOmL的解吸溶液中解吸812min;二、將解吸溶液在超聲頻率為40KHz、溫度為1822。C的條件下超聲處理1317min，得混合溶液；三、取lmL的混合溶液依次進行倍比稀釋；四、取倍比稀釋液涂布平板培養(yǎng)基然后置于23"C的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)168h，再進行異養(yǎng)菌計數(shù)和計算，即測出附著性異養(yǎng)菌菌落的數(shù)量;其中步驟一中解吸溶液中Tris緩沖溶液的濃度為0.01mol/L、Zwittergent3-12的濃度為2Xl(T4mol/L、乙二醇四醋酸的濃度為lXl(X3mol/L、胰蛋白胨的濃度為lg/L，解吸溶液的pH值為7.0。本實施方式試樣是通過采用滅菌棉簽先后向下擦試管壁(或載片)58次采集而來的。本實施方式步驟一中試樣獲得和滅菌棉簽采集方法采用魯巍等人的方法。本實施方式試樣從哈爾濱給水管網(wǎng)取得。本實施方式步驟二中的混合溶液均勻是通過漩渦混合器實現(xiàn)的。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟一中解吸時間為10min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式三本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟二中溫度為2(TC。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟二中超聲處理時間為1416min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟二中超聲處理時間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式六本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟三中倍比稀釋的倍數(shù)為10倍。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式一的不同點是步驟四中培養(yǎng)基由0.5g的酵母浸膏、0.5g的多聚蛋白胨、0.5g的酸水解干酪素、0.5g的可溶性淀粉、0.3g的丙酮酸鈉、0.5g的葡萄糖、0.05g的MgS04'7H20、0.3g的K2HP04、1L的蒸餾水和15.0g的瓊脂制成并調節(jié)培養(yǎng)基pH為7.07.2。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。具體實施方式八本實施方式一種附著性異養(yǎng)菌的檢測方法按以下步驟進行實現(xiàn)一、先用無菌水淋洗帶有附著性異養(yǎng)菌的試樣，再用滅菌棉簽采集試樣，然后將棉簽放入10mL的解吸溶液中解吸10min;二、將解吸溶液在超聲頻率為40KHz、溫度為2(TC的條件下超聲處理15min，得混合溶液；三、取lmL的混合溶液依次進行10倍的倍比稀釋；四、取10倍的倍比稀釋液涂布平板培養(yǎng)基然后置于23'C的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)168h，再進行異養(yǎng)菌計數(shù)和計算，即測出附著性異養(yǎng)菌菌落的數(shù)量；其中步驟一中解吸溶液中Tris緩沖溶液的濃度為0.01mol/L、Zwittergent3-12的濃度為2Xl(T4mol/L、乙二醇四醋酸的濃度為lXl(T3mol/L、胰蛋白胨的濃度為lg/L，解吸溶液的pH值為7.0。本實施方式測得附著性異養(yǎng)菌的數(shù)量與魯巍等人(魯巍，王云，張曉健.BAR反應器中生物膜的分離與定量，中國給水排水，Vol.21，No.2，2005,91-94)使用棉簽與超聲的方法對附著性異養(yǎng)菌進行了檢測的數(shù)量對比如表1所示。5組平行測試，通過數(shù)據(jù)還可以看出本實施方式測定穩(wěn)定性好即數(shù)值的偏差小，證明準確率高，而魯巍等人方法的偏差值比較大。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表權利要求1、一種附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法，其特征在于附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法按以下步驟進行實現(xiàn)一、先用無菌水淋洗帶有附著性異養(yǎng)菌的試樣，再用滅菌棉簽采集試樣，然后將棉簽放入10mL的解吸溶液中解吸8～12min；二、將解吸溶液在超聲頻率為40KHz、溫度為18～22℃的條件下超聲處理13～17min，得混合溶液；三、取1mL的混合溶液依次進行倍比稀釋；四、取倍比稀釋液涂布平板培養(yǎng)基然后置于23℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)168h，再進行異養(yǎng)菌計數(shù)和計算，即測出附著性異養(yǎng)菌菌落的數(shù)量；其中步驟一中解吸溶液中Tris緩沖溶液的濃度為0.01mol/L、Zwittergent3-12的濃度為2×10-4mol/L、乙二醇四醋酸的濃度為1×10-3mol/L、胰蛋白胨的濃度為1g/L，解吸溶液的pH值為7.0。2、根據(jù)權利要求1所述的附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法，其特征在于步驟一中解吸時間為10min。3、根據(jù)權利要求1所述的附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法，其特征在于步驟二中超聲處理時間為15min。4、根據(jù)權利要求1所述的附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法，其特征在于步驟四中平板培養(yǎng)基按比例由0.5g的酵母浸膏、0.5g的多聚蛋白胨、0.5g的酸水解干酪素、0.5g的可溶性淀粉、0.3g的丙酮酸鈉、0.5g的葡萄糖、0.05g的MgS(V7H20、0.3gWK2HPO4、1L的蒸餾水和15.0g的瓊脂制成，并調節(jié)培養(yǎng)基pH為7.07.2。5、根據(jù)權利要求1所述的附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法，其特征在于步驟三中倍比稀釋的倍數(shù)為10倍。全文摘要一種附著性異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法，它涉及一種異養(yǎng)菌菌落數(shù)量的測量方法。它解決了傳統(tǒng)附著性異養(yǎng)菌的無法達到測定要求，而分子生物學方法對分析設備、試劑、操作及定量方法要求高，以及目前魯巍等人的方法測量數(shù)據(jù)明顯低于實際的問題。檢測方法一、預處理而后解吸處理；二、超聲振動處理；三、倍比稀釋；四、將涂布平板后的培養(yǎng)基進行恒溫培養(yǎng)、計數(shù)。本發(fā)明方法可以最大限度的分離和保留附著性異養(yǎng)菌的活菌，能夠更為準確的測量出附著性異養(yǎng)菌。本發(fā)明制備方法簡單、易操作、工藝容易控制。文檔編號C12Q1/06GK101289688SQ200810064710公開日2008年10月22日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權日2008年6月12日發(fā)明者周玲玲,張永吉,李圭白,楊艷玲申請人:哈爾濱工業(yè)大學