專利名稱：一株表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一株表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重 組大腸埃希氏菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國是人口大國，同時(shí)也是"肝炎大國"。據(jù)1992年全國病毒性肝炎流 行病學(xué)調(diào)査，全國約有1.2億人攜帶乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中 感染率為3.1%。我國現(xiàn)有2000萬例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能轉(zhuǎn)
化為肝硬化，甚至肝癌。
腺苷蛋氨酸(SAM)是人體內(nèi)一種極為重要的中間代謝產(chǎn)物。它可以通過
轉(zhuǎn)硫途徑生成體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化及解毒物質(zhì)一一半胱氨酸，再生成另 一種關(guān) 鍵的抗氧化和解毒物質(zhì)一一谷胱甘肽，解除肝內(nèi)的氧化物應(yīng)激狀態(tài)，從而達(dá) 到防治肝病的目的。另外SAM還可W促進(jìn)依賴性脂磷脂的合成，降低膽固醇 和磷脂的比例，恢復(fù)細(xì)胞膜的流動性，促進(jìn)膽汁的主動轉(zhuǎn)運(yùn)和甘油酸三脂的 分泌。因此SAM對肝內(nèi)膽汁郁積、各種急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等 肝臟疾病有很好的療效。SAM于20世紀(jì)80年代出現(xiàn)在歐洲醫(yī)藥巿場上，1999 年美國FDA正式批準(zhǔn)SAM上巿，使其迅速成為暢銷的營養(yǎng)保健品之一，年銷 售額超過10億美元。由于其療機(jī)理清楚、效顯著、起效快、副作用小，近年 來在國內(nèi)的需求量也越來越大，有廣闊的巿場前景。
目前，SAM的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法3種。 化學(xué)合成法釆用S —腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和 甲基供體(CH3I)合成，腺苷蛋氨酸有(+)和(一)兩種構(gòu)型，只有(一)構(gòu)型才有 生物活性，但合成產(chǎn)物中含有大量(+)腺昔蛋氨酸，且難以分離。發(fā)酵法采用 在培養(yǎng)基中添加L-甲硫氨酸，用酵母發(fā)酵生產(chǎn)(一)型腺苷蛋氨酸，是60年 代至80年代生產(chǎn)腺普蛋氨酸的主要方法。酶促轉(zhuǎn)化法主要利用腺苷蛋氨酸合
成酶催化底物L(fēng) 一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔蛋氨酸。酶作為生物催化 劑具有快速、專一的特點(diǎn)，因此酶促轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)腺苷蛋氨酸具有高效、工藝 簡單、產(chǎn)品生物活性高且無污染的優(yōu)勢。
要將酶促合成法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，大量獲得催化用的腺苷蛋氨酸合成 酶成為關(guān)鍵，規(guī)模化生產(chǎn)腺苷蛋氨酸合成酶的難題一直困擾著酶促轉(zhuǎn)化法的 工業(yè)化應(yīng)用。本發(fā)明釆用基因工程重組技術(shù)，獲得了高效表達(dá)腺苷蛋氨酸合 成酶的工程菌，對酶促催化腺苷蛋氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一株表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌及 其應(yīng)用，本發(fā)明的又一目的是提供一種腺苷蛋氨酸合成酶的重組表達(dá)載體及 其應(yīng)用。
(二) 技術(shù)方案
本發(fā)明提供了 一株表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌
(^yc/^Wc/n'a co//) CGMCC No.2299。該菌株已于2007年12月26曰被保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號 為CGMCCNo.2299。
該重組大腸埃希氏菌的構(gòu)建方法包括如下步驟
(1) 用PCR法擴(kuò)增編碼大腸埃希長菌腺苷蛋氨酸合成酶的m"K基因；
(2) 將得到的PCR產(chǎn)物克隆到連接載體pBR322上，得到重組表達(dá)載體 pMETK;
(3) 將重組表達(dá)載體pMETK轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5oc，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，
得到表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌。
本發(fā)明還提供了一種腺苷蛋氨酸合成酶的重組表達(dá)載體pMETK，它是將 編碼大腸埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的柳"i:基因克隆到連接載體pBR322上 得到的。
本發(fā)明所述的重組大腸埃希氏菌(Esc/zen'c/2/a co/z〕 CGMCC No.2299
能高效表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶，可應(yīng)用于工業(yè)化合成腺苷蛋氨酸。
本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體pMETK也可應(yīng)用于工業(yè)化合成腺苷蛋氨酸。
(三)有益效果
本發(fā)明提供的表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌(五sc/zen'c/2/a co/z') CGMCC No.2299,其腺苷蛋氨酸合成酶的表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的 31.36%,比野生菌高16倍;表達(dá)的腺苷蛋氨酸合成酶活性高達(dá)7.38U/ml，比
野生菌高22倍。 ，
本發(fā)明所述的菌株已于2007年12月26日被保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2299。


圖1是重組表達(dá)載體pMETK的結(jié)構(gòu)圖2是Pst I和EcoR I雙酶切重組表達(dá)載體pMETK的電泳圖，其中1表 示樣品； '
圖3 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)量的電泳圖，其中，l和3表示樣品，2 表示SDS-PAGE低分子量蛋白Marker。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)驗(yàn)中所用到的主要試劑及設(shè)備 1、主要材料
DNA抽提試劑盒購于QIAGEN公司(DNeasy Tissue Kit，產(chǎn)品目錄號 69504);克隆載體pBR322、大腸埃希氏菌DH5a購于Xenogen公司；限制性
內(nèi)切酶PstI 、 EcoRl ， TaqDNA聚合酶，T4DNA連接酶，溶菌酶及相關(guān)緩 沖液購于Promega公司；LB培養(yǎng)基所用蛋白胨、酵母粉購于OXOID公司； 其余試劑巿購，均為分析純。 2、主要設(shè)備
臺式離心機(jī)Sigma公司；恒溫?fù)u床Infors公司；電泳儀Bio - Rad 公司；紫外投射儀及其成像裝置法瑪西亞公司；PCR擴(kuò)增儀美國應(yīng)用生 物系統(tǒng)公司。
實(shí)施例l表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌的構(gòu)建
一、重組表達(dá)載體pMETK的構(gòu)建
me基因在文獻(xiàn)中已公開(J.Biol. Chem.259(23),14505-14507(1984))
(1) 將五.co/z'DH5a接種到LB固體培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)18小時(shí)，然 后用滅菌的牙簽挑取單菌落接種到50ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C、 180rpm 搖床培養(yǎng)過夜，然后用DNA抽提試劑盒提取其基因組DNA。
(2) 委托上海生工生物工程有限公司合成以下引物 正向引物序列
5 ，-AACTGCAGAGTCGTGGTAGGATCCGCTACCACA-3'，
反向引物序列
5，-GGAATTCATCTGCAATAAACGGCAGTGCGC國3,;
(3 )取DNA模版l嗎，分別加入，步驟(2 )中的引物各2|imol/L， Taq DNA 聚合酶5IU， dNTPs200pmol/L， lxPCR緩沖液20(iL,混合均勻，按以下方 法進(jìn)行PCR擴(kuò)增94。C變性lmin,循環(huán)30次(94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 2,5min)，然后延伸10min。按《分子克隆》的常規(guī)方法回收目的基因m"K。
(4)取含有l(wèi)昭上述目的基因的溶液，依次加入10x尸wl酶切緩沖液 2^1， I酶切緩沖液2pl，用無菌水定容至18^d,再分別加入尸W I限制
性內(nèi)切酶(5U4il) 限制性內(nèi)切酶(5U/jil) l(il，混合均勻，置于
37'C水洛中保溫3小時(shí)；
(5)電泳回收步驟(4)的反應(yīng)液中的m"K基因片段； (6 )取l|ig質(zhì)粒pBR322,依次加入10x尸w I酶切緩沖液2^1,I 酶切緩沖液2pil，用無菌水定容至18^1,再分別加入尸W I限制性內(nèi)切酶(5U/pl) l|il，五coi I限制性內(nèi)切酶(5U/pl) 1^1，混合均句，置于37'C水洛中保溫3 小時(shí)；
(7) 電泳回收酶切后的pBR322質(zhì)粒；
(8) 取O.l昭經(jīng)過上述雙酶切的質(zhì)粒pBR322與0.12嗎步驟(4)回收 的附e/K基因均句混合，加入無菌水8pL， 45。C保溫5min,然后加入10x T4 DNA連接酶緩沖液lpiL、 T4DNA連接酶(5U/iil)0.5jiL,混合均勻后于16°C 保溫24小時(shí)，得到重組表達(dá)載體pMETK,其結(jié)構(gòu)圖如附圖l所示；
二、重組大腸埃希氏菌的構(gòu)建
(1 )從LB固體培養(yǎng)基平板上挑取凡cWDH5a單菌落，接種于5ml LB 液體培養(yǎng)基中，37"C搖床培養(yǎng)12小時(shí)，然后以l: 50接種于100ml LB液體 培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)3小時(shí)，至OD600-0.5左右；
(2)將培養(yǎng)液置于冰浴中冷卻10min， 3000rpm離心收集菌體，用預(yù)冷 的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml輕輕懸浮菌體，再置于冰洛中冷卻30min， 3000rpm收集菌體，然后用4ml含有'15。/。 0.05mol/LCaCl2溶液懸浮細(xì)胞，置 于冰洛中待用；
(3 )取上述重組表達(dá)載體pMETK2^L與200|iL步驟(2 )得到的感受態(tài) 細(xì)胞混懸液均勻混合，冰洛30min，然后轉(zhuǎn)移到37。C水洛中加熱5min，再置 于冰洛中冷卻5min;
(4) 取lOO^L轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，用無菌玻璃棒涂布在含有200嗎/ml氧化 四環(huán)素的LB固體培養(yǎng)基上，37t:培養(yǎng)半小時(shí)，直至液體完全吸收；
(5) 倒置平板，37"C恒溫培養(yǎng)16小時(shí)，待出現(xiàn)明顯而又未互相重疊的 單菌落時(shí)取出平板，挑取平板上的單菌落，篩選腺苷蛋氨酸合成酶表達(dá)量最 高的陽性轉(zhuǎn)化子(酶表達(dá)量的測定方法見實(shí)施例2),最后篩得本發(fā)明所述的 表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌C^c/zeWc/^ co") CGMCC
l
61 1 2 1 1 8 1 241 301 361 42 1 48 1 54 1 601 661 72 1 781 841
No.2299。
其中，陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定方法如下
① 雙酶切鑒定
a. 取步驟(5)中挑取的轉(zhuǎn)化子，用LB液體培養(yǎng)，得到的菌液1.5ml, 12000rpm離心30秒，棄去上清，用'120ml STET緩沖液(O.lmol/L NaCl; 10mmol/LTris-Cl, PH8.0; 10mmol/L EDTA， PH8.0; 5% Triton X — 100 )重
懸菌體；
b. 在菌體混懸液中加入10mg/ml的溶菌酶溶液10ml,振蕩3秒后置于 沸水中加熱50秒，12000rpm離心，棄去上清和菌體碎片；
c. 在上述沉淀中依次加入10x iV I酶切緩沖液2^1， ， ￡coR I酶切緩沖 液2pl，，用無菌水定容至18^1,再分別加入尸Wl限制性內(nèi)切酶(5U/|xl) 1^1， 五"/ I限制性內(nèi)切酶(5U/pl) 1^1,混合均勻，置于37。C水浴中保溫3小時(shí)；
d. 將以上酶切反應(yīng)液進(jìn)行電泳餘測，得到大小約為1.8kb和3.6kb的兩 條帶(見附圖2),與預(yù)期結(jié)果完全一致。
② 基因測序鑒定
按《分子克隆》所述的經(jīng)典方法提取中轉(zhuǎn)化子中的重組表達(dá)質(zhì)粒PMETK， 送人類基因組北方中心進(jìn)行全序列分析，測得總長5407bp,與預(yù)期結(jié)果完全 一致。具體結(jié)果如下
廠GGTCCCGCCACCAAACG<formula>formula see original document page 9</formula>
3961 4021 408 1 4 14 1 420 1 4261 4 3 2 1
4 3 8 1 4441 450 1 45 6 1 462 1 468 1 474 1 480 1 486
492 1 49 8 1
5 04 1 5 10 1 5161 522 1 528 1 5 3 4 1
GGTTCTGAGCGCTATCGGCAA
AGTAATCTTTCTTCACCTGCGT TTCACGCCGCATCCGGC
AT丁ATTCGGTTTTCACAG丁TGTTAi GCGTTTAATCTATGATGATATAAC 1 CAATTATTTTC ATGC ACTTAAATCATA ACTAAGAT
5401
TGAATT
實(shí)施例2構(gòu)建的重組大腸埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的表達(dá)量及活性測定 實(shí)驗(yàn)
(1) 腺苷蛋氨酸合成酶表達(dá)量的測定
挑取實(shí)施例1得到的重組大腸埃希氏菌C&c/zen'c/n'a co/f) CGMCC No.2299的單菌落，接種到10ml液體LB培養(yǎng)基(含25iag/ml的氧化四環(huán)素)， 搖床培養(yǎng)6小時(shí)，取樣用SDS-PAGE聚丙烯酰胺電泳測定其中腺苷蛋氨酸 合成酶的表達(dá)量，電泳結(jié)果如附圖3所示，SAM合成酶的表達(dá)量占菌體可溶 性蛋白的31.36%。
(2) 腺苷蛋氨酸合成酶的活性測定
配制反應(yīng)液由75mmol Tris — HCl( PH8.0 )、250mmol KCl、9mmol MgCl2、
60nmol蛋氨酸、5mmo1 ATP和lml粗酶液組成100ml的反應(yīng)體系，37。C反 應(yīng)30min后，加入高氯酸至終濃度為0.3%使反應(yīng)中止，用HPLC外標(biāo)法測定 反應(yīng)液中腺苷蛋氨酸的量。酶的活力單位定義為在以上反應(yīng)條件下，30min 催化形成lpmol腺苷蛋氨酸所需要的酶量為一個(gè)活力單位。
經(jīng)測量，重組大腸埃希氏菌C&c/zehc/z/a co//) CGMCC No.2299表達(dá)的腺 苷蛋氨酸合成酶的活性為7.38U/ml。
序列表
<110>北京凱因生物技術(shù)有限公司
<120> —株表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌 <130> K0801 <160> 1
< 170> Patentln version 3.2
<210> 1 <211> 5046 <212> DNA
<213> 大腸埃希氏菌(Escherichia coli) <400> 1
tcatgtttga cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg 60 ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac 120 cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg 180 ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc 240 gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg 300
cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactategac tacgcgatca tggcgaccac 360
acccgtcctg tggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg 420
tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt 480
cgggctoatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgagg ccgggggact 540
gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa 600
cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc 660
cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 720
cgcacttatg actgtcttct ttateatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 780
ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 840
ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 900
tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt 960
gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg 1020
cggcateggg atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca 1080
gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ttggaccgct 1140
gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt1200
鄉(xiāng)cgccgcc ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc 1260
cacctogacc tgaatggaag ccggcggcac ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt 1320
ggagccaatc aattcttgcg gagaactgtg aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata 1380
tccatcgcgt ccgccatctc cagcagccgc acgcggcgca tctcgggcag cgttgggtcc 1440
tggccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt1500
tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg attcgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc 1560
tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa 1620
agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc accattatgt tccggatctg catcgcagga 1680
tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc 1740
tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt 1800
tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc 1860
atcggtatca ttacccccat gaacagaaat cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa 1920
caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg 1980
gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac 2040
cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc 2100
tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 2160
caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 2220
tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 2280
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 2340
teaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg cteggtcgtt cggctgcggc 2400
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 2460
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 2520
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca teacaaaaat cgacgctcaa 2580
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 2640
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 2700
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 2760
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 2820
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 2880
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 2940
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 3000
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 3060
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 3120
aagatecttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 3180
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 3240
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 3300
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 3360
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 3420
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 3480
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatecgc ctccatccag tctattaatt 3540
caccgttcgc gaaattggct atgtgcattc cgacatgggc tttgacgcta actcctgtgc 3600
ggttctgagc gctateggca aacagtctcc tgacateaac cagggcgttg accgtgccga 3660
tccgctggaa cagggcgcgg gtgaccaggg tctgatgttt ggctacgcaa ctaatgaaac 3720
cgacgtgctg atgccagcac ctatcaccta tgcacaccgt ctggtacagc gtcaggctga 3780
agtgcgtaaa aacggcactc tgccgtggct gcgcccggac gcgaaaagcc aggtgacttt 3840
tcagtatgac gacggcaaaa tegttggtat cgatgctgtc gtgctttcca ctoagcactc 3900
tgaagagatc gaccagaaat cgctgcaaga agcggtaatg gaagagatca tcaagccaat 3960
tctgcccgct gaatggctga cttctgccac caaattcttc atcaacccga ccggtcgttt 4020
cgttatcggt ggcccaatgg gtgactgcgg tctgactggt cgtaaaatta tcgttgatac 4080
ctacggcggc atggcgcgtc acggtggcgg tgcattctct ggtaaagatc catcaaaagt 4140
ggaccgttcc gcagcctacg cagcacgtta tgtcgcgaaa aacatcgttg ctgctggcct 4200
ggccgatcgt tgtgaaattc aggtttccta cgcaatcggc gtggctgaac cgacctccat 4260
catggtagaa actttcggta ctgagaaagt gccttctgaa caactgaccc tgctggtacg 4320
tgagttcttc gacctgcgcc catacggtct gattcagatg ctggatctgc tgcacccgat 4380
ctacaaagaa accgcagcat acggtcactt tggtegtgaa catttcccgt gggaaaaaac 4440
cgacaaagcg cagctgctgc gcgatgctgc cggtctgaag taatctttct tcacctgcgt 4500
tcaaaggcca gcctcgcgct ggcctttttc ttttggatag gcgttcacgc cgcatccggc 4560
aaaaaaaccg cccgcacaat aacatcattc ttcctgatca cgtttcaccg cagattatca 4620
tcacaactga aaccgattac accaaccaca acagacaaag atttgtaata ttttcatatt 4680
attattcggt tttcacagtt gttacatttc ttttcagtaa agtcttaatt gcagataaca 4740
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aaatgttagt gtaagcgatt acactgatgt gatttgcttc acatcttttt acgtcgtact 4860
cacctatctt aattcacaat aaaaaataac catattggag ggcatcatgc ctgacgctaa 4920
aaaacagggg cggtcaaaca aggcaatgac gtttttcgtc tgcttccttg ccgctctggc 4980
gggattactc tttggcctgg atateggtgt aattgctggc gcactgccgt ttattgcaga 5040
tgaatt 504權(quán)利要求
1、一株表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299。
2、 一種腺苷蛋氨酸合成酶的重組表達(dá)載體pMETK,其特征在于它是將 編碼大腸埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的m"K基因克隆到連接載體pBR322上得到的。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的重組大腸埃希氏菌的構(gòu)建方法，其特征在于它 包括如下步驟(1) 用PCR法擴(kuò)增編碼大腸埃希氏菌腺苷蛋氨酸合成酶的md〖基因；(2) 將得到的PCR產(chǎn)物克隆到連接載體pBR322上，得到權(quán)利要求2所 述的重組表達(dá)載體pMETK;(3) 將重組表達(dá)載體pMETK轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5a,篩選陽性轉(zhuǎn)化子，得到表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸埃希氏菌在合成腺苷蛋氨酸中的應(yīng)用。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體在合成腺苷蛋氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299以及該重組大腸埃希氏菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明還提供了一種腺苷蛋氨酸合成酶的重組表達(dá)載體pMETK。本發(fā)明提供的表達(dá)腺苷蛋氨酸合成酶的重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.2299，其腺苷蛋氨酸合成酶的表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的31.36％，表達(dá)的腺苷蛋氨酸合成酶活性高達(dá)7.38U/ml，遠(yuǎn)高于野生型菌株。
文檔編號C12N1/21GK101392230SQ20081005570
公開日2009年3月25日 申請日期2008年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日
發(fā)明者春 吉, 周德勝, 張春麗, 譚華征 申請人:北京凱因科技股份有限公司