專利名稱：：一種鑒定大白菜—甘藍(lán)異附加系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鑒定大白菜一甘藍(lán)異附加系的方法，屬于分子遺傳學(xué)理論應(yīng)用與育種
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：目前，關(guān)于大白菜(brassiesca順e5^Wssynra，ssp.尸eh'/e7757'51，AA)與甘藍(lán)(丑Weracesvar.L.，CC)染色體的鑒定限于細(xì)胞水平，由于染色體小且形態(tài)相近，核型分析的方法很難在大白菜染色體背景下準(zhǔn)確鑒定甘藍(lán)染色體。Chen等人禾U用^firas57'cacai7pes^rz'5^丑a/eraceavar.a76o《〗a6ra單體異附加系根尖體細(xì)胞前中期染色體核型分析，僅鑒定了附加甘藍(lán)最長(zhǎng)染色體的1個(gè)異附加系；由于大白菜與甘藍(lán)同源性較強(qiáng)，基因組原位雜交不能區(qū)分二者染色體；Robert等人以5SrDNA和25SrDNA為探針的熒光原位雜交，鑒定了5號(hào)、8號(hào)、9號(hào)丑ca歷/es^rz'5^及a/eraceavar.a〗Zwg〗aAra單〈本異附加系，但對(duì)于沒有雜交位點(diǎn)的丑sM^is6ra染色體也不能準(zhǔn)確鑒定。這就制約了大白菜一甘藍(lán)異附加系等重要遺傳材料的鑒定與應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，甘藍(lán)連鎖群已趨于飽和，為利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定甘藍(lán)染色體奠定了基礎(chǔ)。由于大白菜與甘藍(lán)同源性較強(qiáng)，必須選用一種多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的分子標(biāo)記，并且要求操作簡(jiǎn)便，DNA用量小。經(jīng)檢索，現(xiàn)有文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)理想的技術(shù)鑒定大白菜一甘藍(lán)異附加系的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種鑒定大白菜一甘藍(lán)異附加系的方法，為利用甘藍(lán)基因改良大白菜遺傳背景奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的基本原理是利用甘藍(lán)連鎖群相對(duì)大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍(lán)及異附加系基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較它們的擴(kuò)增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物均與大白菜一致，則表明異附加系中沒有附加甘藍(lán)的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交種一致，則表明異附加系中附加了甘藍(lán)的該連鎖群。因此，本發(fā)明的特點(diǎn)是利用甘藍(lán)不同連鎖群相對(duì)于大白菜特異的SSR引物，在分子水平鑒定大白菜一甘藍(lán)異附加系的外源甘藍(lán)連鎖群。具體地，本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)根據(jù)己發(fā)表的甘藍(lán)遺傳圖譜，選用位于甘藍(lán)不同連鎖群的91對(duì)SSR引物；(2)CTAB法提取不同品種的大白菜和甘藍(lán)的基因組DNA，PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測(cè)；(4)篩選甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜特異的SSR引物；篩選在大白菜中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，而甘藍(lán)中有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴(kuò)增產(chǎn)物，但甘藍(lán)的擴(kuò)增產(chǎn)物不同于大白菜擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，作為甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜的特異SSR引物；(5)利用篩選到甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍(lán)及異附加系基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定大白菜—甘藍(lán)異附加系。具體地，本發(fā)明的方法詳述為根據(jù)己發(fā)表的甘藍(lán)遺傳圖譜，選用了位于甘藍(lán)不同連鎖群的91對(duì)SSR引物，引物的連鎖群分布及序列如表1所示，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。將8個(gè)甘藍(lán)品種(春季早熟甘藍(lán)品種中甘ll，8312，極早甘藍(lán)；春季中熟甘藍(lán)品種京豐一號(hào)；春秋兼用早熟甘藍(lán)品種中甘17;秋季中熟甘藍(lán)品種中甘19;秋季晚熟甘藍(lán)品種晚豐甘藍(lán)，中甘18)和7個(gè)大白菜品種(抗抽薹炮彈型大白菜品種強(qiáng)豐春白菜，高抗王；中晚熟直筒合抱大白菜品種多抗75;極早熟疊抱大白菜品種超級(jí)夏陽(yáng)，早熟五號(hào)；早熟高樁直筒大白菜品種秋綠55;中熟矮樁疊抱大白菜品種新鄉(xiāng)小包23)種子播種于穴盤，常規(guī)管理，當(dāng)幼苗長(zhǎng)到46片真葉時(shí)，剪取幼嫩新葉，采用CTAB法提取基因組DNA。以這些材料基因組DNA為模板，以獲取的甘藍(lán)連鎖群SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20叱，含模板DNA50ng，2mmol/LMg2+，1Xbuffer，200Mmol/LdNTP，1UTap酶，正反向引物各2.5ng>L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4。C預(yù)變性2min;94。C變性lmin，6CTC復(fù)性30s，72'C延伸45s，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低O.5°C;94。C變性lmin，55。C復(fù)性30s，72。C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；72"C延伸5min.，4"C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測(cè)。篩選甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜特異的SSR引物，篩選在大白菜中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，而甘藍(lán)中有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴(kuò)增產(chǎn)物，但甘藍(lán)的擴(kuò)增產(chǎn)物不同于大白菜擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，作為甘藍(lán)不同連鎖群的相對(duì)于大白菜特異的SSR引物。結(jié)果表明，25對(duì)引物能夠在甘藍(lán)、大白菜擴(kuò)增出有差異的片段，片段長(zhǎng)度在40-430bp,其中7對(duì)引物在結(jié)球甘藍(lán)中有擴(kuò)增產(chǎn)物而在大白菜中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，18對(duì)引物在大白菜和結(jié)球甘藍(lán)中的擴(kuò)增產(chǎn)物不同，這25對(duì)SSR引物涉及了甘藍(lán)的9個(gè)連鎖群(見表2)，在大白菜和甘藍(lán)中的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。利用這25對(duì)甘藍(lán)連鎖群相對(duì)大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍(lán)及異附加系基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較它們的擴(kuò)增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物與大白菜一致，則異附加系中沒有附加甘藍(lán)的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物都與雜交種一致，則異附加系中附加了甘藍(lán)的該連鎖群。表1SSR引物連鎖群分布及序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2相對(duì)于大白菜特異的甘藍(lán)連鎖群SSR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2中"一"表示尚不清楚。本發(fā)明取得的有益效果是本發(fā)明從分子水平鑒定大白菜一甘藍(lán)異附加系，既提高到了鑒定的準(zhǔn)確性，又使通過這種方法鑒定的異附加系在不同的實(shí)驗(yàn)室間具有很好的交流性。圖1是25對(duì)特異SSR引物在8個(gè)甘藍(lán)品種和7個(gè)大白菜品種中的擴(kuò)增結(jié)果。圖1中的標(biāo)號(hào)代表的含義是1、極早甘藍(lán)2、晚豐甘藍(lán)3、中甘174、京豐一號(hào)5、中甘186、中甘ll7、中甘198、83129、秋綠5510、超級(jí)夏陽(yáng)11、新鄉(xiāng)小包2312、多抗7513、早熟五號(hào)14、高抗王15、強(qiáng)豐春白菜。圖l中A、引物NalOH03擴(kuò)增結(jié)果；B、引物Ni4B10擴(kuò)增結(jié)果；C、引物Nal2C08擴(kuò)增結(jié)果；D、引物O113G05擴(kuò)增結(jié)果；E、引物sORA43擴(kuò)增結(jié)果；F、引物Nal2C03擴(kuò)增結(jié)果；G、引物Nal2H09擴(kuò)增結(jié)果；H、引物0111G11擴(kuò)增結(jié)果；I、引物BN12A擴(kuò)增結(jié)果；J、引物Nal2E05擴(kuò)增結(jié)果；K、引物O110F12擴(kuò)增結(jié)果；L、引物O111H08擴(kuò)增結(jié)果；M、引物NalODll擴(kuò)增結(jié)果；N、引物Ra2A04擴(kuò)增結(jié)果；O、引物Apla5pr擴(kuò)增結(jié)果；P、引物Nal4F11擴(kuò)增結(jié)果；Q、引物O110B01擴(kuò)增結(jié)果；R、引物BN72a擴(kuò)增結(jié)果；S、引物Nal2F03擴(kuò)增結(jié)果；T、引物O110H04擴(kuò)增結(jié)果；U、引物O112D05擴(kuò)增結(jié)果；V、引物O112G04擴(kuò)增結(jié)果；W、引物O112D09擴(kuò)增結(jié)果；X、引物RalF03擴(kuò)增結(jié)果；Y、引物O112A04擴(kuò)增結(jié)果。圖2是甘藍(lán)連鎖群特異SSR引物在雜交種及其親本和大白菜一甘藍(lán)雙單體異附加系中的擴(kuò)增結(jié)果。圖2中的標(biāo)號(hào)含義如下1、大白菜2、甘藍(lán)3、雜交種4、異附加系。圖2中A、引物NalOH03擴(kuò)增結(jié)果；B、引物Ni4B10擴(kuò)增結(jié)果；C、引物Nal2C08擴(kuò)增結(jié)果；D、引物0113G05擴(kuò)增結(jié)果；E、引物sORA43擴(kuò)增結(jié)果；F、引物Nal2C03擴(kuò)增結(jié)果；G引物Nal2H09擴(kuò)增結(jié)果；H、引物OlllGll擴(kuò)增結(jié)果;I、引物BN12A擴(kuò)增結(jié)果；J、引物Nal2E05擴(kuò)增結(jié)果；K、引物0110F12擴(kuò)增結(jié)果；L、引物0111H08擴(kuò)增結(jié)果；M、引物NalODll擴(kuò)增結(jié)果；N、引物Ra2A04擴(kuò)增結(jié)果；0、引物Apla5pr擴(kuò)增結(jié)果；P、引物Nal4F11擴(kuò)增結(jié)果；Q、引物0110B01擴(kuò)增結(jié)果；R、引物BN72a擴(kuò)增結(jié)果；S、引物Nal2F03擴(kuò)增結(jié)果;T、引物0110H04擴(kuò)增結(jié)果；U、引物0112D05擴(kuò)增結(jié)果；V、引物0112G04擴(kuò)增結(jié)果；W、引物0112D09擴(kuò)增結(jié)果；X、引物RalF03擴(kuò)增結(jié)果；Y、引物0112A04擴(kuò)增結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用以說明本發(fā)明。實(shí)施例以大白菜一甘藍(lán)雙單體異附加系(四倍體大白菜與二倍體甘藍(lán)雜交獲得異源三倍體雜交種，雜交種與二倍體大白菜回交，在回交群體中篩選到的2『20A+2022)的鑒定為例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。原理說明利用甘藍(lán)連鎖群相對(duì)大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍(lán)及異附加系基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較它們的擴(kuò)增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物均與大白菜一致，則表明異附加系中沒有附加甘藍(lán)的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物都與雜交種一致，則表明異附加系中附加了甘藍(lán)的該連鎖群。具體方法根據(jù)已發(fā)表的甘藍(lán)遺傳圖譜，選用了位于甘藍(lán)不同連鎖群的91對(duì)SSR引物，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。將8個(gè)甘藍(lán)品種(春季早熟甘藍(lán)品種中甘ll，8312，極早甘藍(lán)；春季中熟甘藍(lán)品種京豐一號(hào)；春秋兼用早熟甘藍(lán)品種中甘17;秋季中熟甘藍(lán)品種中甘19;秋季晚熟甘藍(lán)品種晚豐甘藍(lán)，中甘1S)和7個(gè)大白菜品種(抗抽薹炮彈型大白菜品種強(qiáng)豐春白菜，高抗王；中晚熟直筒合抱大白菜品種多抗75;極早熟疊抱大白菜品種超級(jí)夏陽(yáng)，早熟五號(hào)；早熟高樁直筒大白菜品種秋綠55;中熟矮樁疊抱大白菜品種新鄉(xiāng)小包23)種子播種于穴盤，常規(guī)管理，當(dāng)幼苗長(zhǎng)到46片真葉時(shí)，剪取幼嫩新葉，采用CTAB法提取基因組DNA。以這些材料基因組DNA為模板，以獲取的甘藍(lán)連鎖群SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20ML，含模板DNA50ng，2廳ol/LMg2+，1Xbuffer，200Mmol/LdNTP,1UTap酶，正反向引物各2.5ng/叱。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4。C預(yù)變性2min;94。C變性lmin，60。C復(fù)性30s，72。C延伸45s，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低O.5°C;94。C變性lmin，55。C復(fù)性30s，72。C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；72。C延伸5min.，4。C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測(cè)。篩選甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜特異的SSR引物，篩選在大白菜中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，而甘藍(lán)中有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴(kuò)增產(chǎn)物，但甘藍(lán)的擴(kuò)增產(chǎn)物不同于大白菜擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，作為甘藍(lán)不同連鎖群的相對(duì)于大白菜特異的SSR引物。結(jié)果表明，25對(duì)引物能夠在甘藍(lán)、大白菜擴(kuò)增出有差異的片段，片段長(zhǎng)度在40-430bp，其中7對(duì)引物在結(jié)球甘藍(lán)中有擴(kuò)增產(chǎn)物而在大白菜中無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，18對(duì)引物在大白菜和結(jié)球甘藍(lán)中的擴(kuò)增產(chǎn)物不同，這25對(duì)SSR引物涉及了甘藍(lán)的9個(gè)連鎖群(表2)，在大白菜和甘藍(lán)中的擴(kuò)增結(jié)果如圖1。利用這25對(duì)甘藍(lán)連鎖群相對(duì)大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍(lán)及異附加系基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較它們的擴(kuò)增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物與大白菜一致，則異附加系中沒有附加甘藍(lán)的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴(kuò)增產(chǎn)物都與雜交種一致，則異附加系中附加了甘藍(lán)的該連鎖群。結(jié)果表明，該異附加系對(duì)位于甘藍(lán)01連鎖群的3對(duì)SSR引物NalOH03、Ni4B10、Nal2C08(見圖2，A-C)和08連鎖群的2對(duì)SSR引物0112D05、0112G04(見圖2，U、V)擴(kuò)增出與雜交種相同的片段，而對(duì)位于其他連鎖群引物的擴(kuò)增結(jié)果均與大白菜一致(見圖2)，這就表明，該異附加系是附加2條甘藍(lán)染色體的雙單體異附加系，這2條外源染色體與甘藍(lán)01、08連鎖群相對(duì)應(yīng)。權(quán)利要求1、一種鑒定大白菜—甘藍(lán)異附加系的方法，其特征在于包括以下步驟(1)根據(jù)甘藍(lán)遺傳圖譜，選用位于甘藍(lán)不同連鎖群的91對(duì)SSR引物；(2)CTAB法提取不同品種的大白菜和甘藍(lán)的基因組DNA，PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測(cè)；(4)篩選甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜特異的SSR引物；(5)利用篩選到甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜的特異SSR引物，鑒定大白菜—甘藍(lán)異附加系。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定大白菜一甘藍(lán)異附加系的方法，其特征在于步驟(4)的篩選方法是篩選在大白菜中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，而甘藍(lán)中有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴(kuò)增產(chǎn)物，但甘藍(lán)的擴(kuò)增產(chǎn)物不同于大白菜擴(kuò)增產(chǎn)物的引物，作為甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜的特異SSR引物。全文摘要本發(fā)明公開了一種鑒定大白菜—甘藍(lán)異附加系的方法。該方法包括(1)根據(jù)已發(fā)表的甘藍(lán)遺傳圖譜，選用了位于甘藍(lán)不同連鎖群的91對(duì)SSR引物；(2)提取不同品種的大白菜和甘藍(lán)的基因組DNA，PCR擴(kuò)增；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測(cè)；(4)篩選甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜特異的SSR引物；(5)利用甘藍(lán)連鎖群相對(duì)于大白菜特異的SSR引物，鑒定大白菜—甘藍(lán)異附加系。本發(fā)明可以在分子水平快速、準(zhǔn)確鑒定大白菜與甘藍(lán)的雜交種、異附加系、異代換系、易位系等重要的遺傳分析材料，為利用甘藍(lán)基因改良大白菜遺傳背景奠定基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101423867SQ20081005531公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年7月3日優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日發(fā)明者王彥華,申書興,趙建軍,陳雪平,顧愛俠申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)