專利名稱：重組cecA-mil雜合基因抗菌肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明重組cecA-mil雜合基因抗菌肽用于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程 生產(chǎn)疫苗藥物的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在青霉素發(fā)現(xiàn)以來，抗生素在預(yù)防細(xì)菌感染、治療畜禽疾病等方面發(fā)揮了 重要作用。特別是p-內(nèi)酰胺類抗生素的發(fā)現(xiàn)，對病原菌感染性疾病的治療產(chǎn)生 了革命性飛躍，抗生素成為臨床治療的強(qiáng)有力武器。我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，
抗生素發(fā)揮了不可低估的作用，但抗生素的長期廣泛濫用，不僅導(dǎo)致了嚴(yán)重的 病原菌耐藥性問題，而且也造成了藥物存留等公共衛(wèi)生隱疾。許多耐藥性突變 菌株出現(xiàn)，大大增加了疾病治療的困難，我們面臨重新回到無抗生素時(shí)代的危 險(xiǎn)。 '
其實(shí)，就臨床來說，抗生素耐藥性問題不是近年才發(fā)現(xiàn)的新問題，早在1947 年，抗生素耐藥性的傳播就已受到美國疾控中心(CDC)、英國疾病救治中心 (CDCS)的關(guān)注。據(jù)資料顯示，甲氧西林、萬古霉素、氨芐/羧芐青霉素、慶大 霉素、紅霉素、ciprofloxacin等抗生素耐藥性比例逐年增加。微生物的耐藥性 問題成為困擾醫(yī)學(xué)界及養(yǎng)殖業(yè)的頭號問題之一。
資料顯示，抗生素添加劑的大量使用，不僅造成了畜禽腸道微生物平衡失 調(diào)，并且容易導(dǎo)致抗生素殘留，降低畜產(chǎn)品品質(zhì)，嚴(yán)重影響了畜(禽)產(chǎn)品的 出口及人類的身體健康。就我國而言，由于藥物殘留監(jiān)控體系失控，動(dòng)物源性 食品的出口一直是險(xiǎn)象環(huán)生。歐盟多次農(nóng)藥、藥物殘留等問題對我國閉關(guān)或退 貨賠償，日本、美國等分別對我國動(dòng)物源性食品提出了 ll種藥物殘留檢測要求， 瑞士對我國禽肉的禁令和解禁更是反復(fù)無常。隨著我國加入WTO，傳統(tǒng)的抗生素伺料添加劑必將嚴(yán)重影響我國的家畜產(chǎn)品在國際市場的競爭力。
為了消除抗生素應(yīng)用帶來的負(fù)面影響，減少和杜絕耐藥株的出現(xiàn)和傳播， 世界衛(wèi)生組織呼吁各國采取緊急措施。美國、英國等許多國家都制定了相應(yīng)的
措施。根據(jù)歐盟第70/524號令的精神，傳統(tǒng)抗生素將在很多時(shí)間內(nèi)被逐一取消， 阿伏霉素、螺旋霉素、桿菌肽鋅、磷酸泰樂菌素等抗生素涉及到抗藥性傳遞問 題，禁作飼料添加劑用，并逐步取消在飼料中添加抗生素。我國農(nóng)業(yè)部也出臺 了一系列關(guān)于"獸藥使用監(jiān)督和獸藥殘留監(jiān)控"、"出口動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品防疫檢 疫"、"食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單"等多項(xiàng)整改措施。
面對問題的嚴(yán)峻性，研制和應(yīng)用無毒無公害的新型抗菌劑，代替抗生素在 飼料添加劑及畜禽疾病預(yù)防中的應(yīng)用，已成為當(dāng)前獸醫(yī)工作者的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 近期的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽不但廣潛抗菌，能抑殺耐藥性菌株，而且它的殺菌機(jī) 制使病原菌不易產(chǎn)生耐藥性突變，從而成為最具有開發(fā)前景的抗生素替代品之 一，為解決細(xì)菌耐藥性這一棘手難題提供了新途徑。
抗菌肽是生物體產(chǎn)生的一種陽離子小肽，多數(shù)具有廣潛抗菌活性，是生物 先天性免疫的重要組成成分?？咕牡谋举|(zhì)是一種肽，和其他蛋白質(zhì)藥物一樣， 主要通過降解、排泄、以及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞等作用方式在體內(nèi)被清除。由于其 分子量小于20kDa，代謝過程中易于由腎小球?yàn)V過，并在通過腎小管時(shí)被蛋白酶 部分降解而從尿中排出。至今，已有許多生物包括昆蟲、鳥類、動(dòng)物、植物及 原核生物中發(fā)現(xiàn)1000多種抗菌活性肽?？咕牡膩碓从?種天然資源提取、 人工固相合成及基因工程表達(dá)。從天然資源中提取的抗菌肽成本高、得率低、 工序繁瑣；人工固相合成肽又價(jià)格相當(dāng)昂貴，都難以應(yīng)用于實(shí)際臨床。由于抗 菌肽基因一般都較小，故采用人工合成的方法來獲得目的基因，再通過基因工 程方法進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽則更具有實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本研究的目的就是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出具有良好抑殺各
種致病性細(xì)菌的重組cecA-mil雜合基因抗菌肽，為抗生素研制出合適的替代品， 也可以成為無公害的飼料添加劑，為重組抗菌肽的工程化生產(chǎn)及其為養(yǎng)殖業(yè)的 保駕護(hù)航奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)方案
重組cecA-mil雜合基因抗菌肽，包括
l)重組雜合抗菌肽cecA-mil的基因設(shè)計(jì)與合成
選取天蠶素A (cecropin)成熟肽段1 7個(gè)氨基酸和蜂毒素milittin 成熟肽段N端的5 12個(gè)氨基酸，設(shè)計(jì)兩個(gè)引物片斷F1和F2、 F3和F4，以 Fl序列和F2序列片斷互為模板和互為引物進(jìn)行S0E法PCR出改造的 cecA-mil雜合肽基因序列(45個(gè)堿基)。
EcoRIkex2 KWKLFKKVLKVLTTG--Fl -
5， JAATTCl GAGAAMGA AAG TGG AM CTG TTC AAA AAG GTG CTG MG GTG CTG ACC ACC GGC TAA @3'
3' § CTCTTTTCT TTC ACC TTT GAC AAG TTT TTC CAC GAC TTC CAC GAC TGG TGG CCG ATT |AGATCJ5'
-F2 -
Xbal
設(shè)計(jì)的CecA-mil基因全長60bp，包括15個(gè)氨基酸的編碼序列和終止密碼 子，基因N端、C端分別設(shè)有EcoRI、 Xbal粘性末端，并在基因的N端引入畢 赤酵母Kex2蛋白酶裂解位點(diǎn)。
引物基F3和F4用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，其中F3位于載體序列 上，F(xiàn)4則位于插入外源基因(cecA-mil)區(qū)。
F3: 5 ，-tactttcataattgcgactg-3'
F4: 5 ，畫ccttcttgaacaacttcc-3 ，2) 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
cecA-mil雜合肽基因經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，直接進(jìn)行WoI、 X6al 雙酶切，定向插入酵母表達(dá)載體pPICZa-A中，構(gòu)建cecA-mil重組酵母表達(dá)質(zhì) 粒。經(jīng)Zeocin篩選、特異PCR鑒別和缺失酶切位點(diǎn)鑒定陽性的質(zhì)粒命名為 pPICZa-A-CM。經(jīng)TaKaRa測序，所合成基因序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。
3) 重組菌株的轉(zhuǎn)化
將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌X-33， X-33感受態(tài)的制備、重組酵母的 電擊轉(zhuǎn)化按invitrogen公司酵母表達(dá)手冊Easy Select Pichia Expression Kit進(jìn)
行操作。
將S"cl線性化的重組質(zhì)粒pPICZa-A-CM電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入X-33感受態(tài)細(xì)胞，涂 布于含Zeocin 的YPDS/Z+固體選擇培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)2 4天，轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。 將具有Zeocin抗性的最初轉(zhuǎn)化子菌落，通過影印法克隆到MM平板和MD平板 上培養(yǎng)，選擇在兩種培養(yǎng)基上都生長良好的Mut+菌落，進(jìn)一步依次轉(zhuǎn)移到含 Zeocin不同濃度的YPDS平板上，逐級篩選目的基因高拷貝重組菌株。將篩選 到的高拷貝重組菌株取單菌落的一半放到Eppendof管中，加入50(aLTE(pH8.0)， 采用煮-凍-煮法制備畢赤酵母基因組DNA，利用鑒定引物F3、 F4進(jìn)行PCR鑒 定。
4)重組抗菌肽蛋白的表達(dá)及其抑菌活性的鑒定
將篩選到的陽性酵母菌在接種于含一定濃度甲醇的BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘 導(dǎo)表達(dá)。28°C， 250r/min培養(yǎng)72h，期間每24小時(shí)補(bǔ)加終濃度為0.5% (v/v)的 甲醇。離心收集培養(yǎng)上清，進(jìn)行抑菌活性測定和Tricine-SDS-PAGE鑒定。采用 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行抑菌活性測定， 同時(shí)設(shè)立空載體酵母濃縮上清作陰性對照，Amp為陽性對照。有益效果1. 表達(dá)體系可行抗菌肽本身對原核宿主菌的殺傷作用，不適合在原核系統(tǒng)中直接表達(dá)，一般選用融合表達(dá)或真核表達(dá)。在此，我們選用Pichiapastoris系統(tǒng)，巴斯德畢赤 酵母表達(dá)體系兼具有原核表達(dá)系統(tǒng)的高表達(dá)量和真核表達(dá)系統(tǒng)可進(jìn)行蛋白翻譯后修飾、加工及折疊的優(yōu)點(diǎn)；又不存在原核表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)毒素難以去除和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中病毒和支原體污染等問題，在表達(dá)外源活性蛋白中倍受青 睞。影響外源基因表達(dá)水平的因素很多，而密碼子的選擇是左右表達(dá)量的參數(shù) 之一。我們選用畢赤酵母偏好密碼子，兼顧大腸桿菌偏好性，消除潛在的糖基 化位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了新型雜合抗菌肽cecA-mil基因。對抗菌肽基因修飾和密 碼子優(yōu)化，不僅可提高抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)效率，還可以避免部分專利 的限制，這是建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新產(chǎn)品所必須考慮的因素。2. 本發(fā)明可大量生產(chǎn)關(guān)于抗菌肽的表達(dá)研究，目前存在一個(gè)問題:不論是在微生物中表達(dá)，還是 在植物、昆蟲中表達(dá),表達(dá)量都偏低，固相合成肽又價(jià)格相當(dāng)昂貴，不適合我國 國情，都難以應(yīng)用于實(shí)際臨床。這成了抗菌肽走向產(chǎn)業(yè)化的限制因素?？咕?若要走向產(chǎn)業(yè)化,必須建立其高效表達(dá)體系和快速純化系統(tǒng)。本發(fā)明抗菌肽較小，故采用人工合成的方法來獲得目的基因，再通過基因 工程方法進(jìn)行微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽更切實(shí)可行，具有實(shí)際意義，大量生產(chǎn)發(fā) 酵具有很好的應(yīng)用前景。初步的抗菌活性測定結(jié)果顯示，該重組抗菌肽對標(biāo)準(zhǔn) 菌株和耐藥菌株均具有明顯的殺菌活性。對抗菌肽基因進(jìn)行修飾和密碼子優(yōu)化， 除了可以提高重組抗菌肽的表達(dá)量、確?？咕钚酝猓€可以避免部分專利限制，這是建立具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新產(chǎn)品所必需考慮的因素。3. 生產(chǎn)成本低，易推廣本研究研制的基因工程抗菌肽生產(chǎn)成本低廉，所用的表達(dá)載體pPICZa-A， 其表達(dá)盒的N端帶有引導(dǎo)分泌的cc-交配因子(a-MF)信號肽序列，表達(dá)產(chǎn)物可 以分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。由于酵母本身分泌到培養(yǎng)基中的蛋白很少，因此 表達(dá)上清中的雜蛋白含量很低，為進(jìn)一步純化重組蛋白提供了極大的方便。所 需要的培養(yǎng)基和發(fā)酵用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備均具有價(jià)格低廉和易于操作的優(yōu)點(diǎn)，十分適 于推廣。4. 安全有效酵母不會(huì)分泌像大腸桿菌表達(dá)的外源蛋白那樣附帶一些對機(jī)體細(xì)胞有毒害 的物質(zhì)，而且，許多資料顯示，抗菌肽也不會(huì)像抗生素一樣產(chǎn)生耐藥性，因?yàn)?抗菌肽是蛋白質(zhì)藥物，而抗生素是化學(xué)藥物。由該重組抗菌肽對標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐 藥菌株的抑菌活性結(jié)果可知，雖然和工作濃度的氨芐青霉素相比，該重組雜合 抗菌肽對標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌直徑相對較小，但對耐藥菌株的抑菌效果明顯比氨芐 青霉素好，除了對大腸桿菌顯示有抗菌活性外，對其它革蘭氏陽性菌以及革蘭 氏陰性菌也具有明顯的殺菌活性，再加上無殘留、不會(huì)誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生的特點(diǎn)， 使其在食品防腐、和動(dòng)物飼料添加劑等方面具有很好的應(yīng)用前景。


圖1:重組cecA-mil雜合抗菌肽的Tricine-SDS-PAGELaneh X-33/pPICZa-A空載體所表達(dá)上清，Lane 2: X-33/pPICZa-A-CM所表達(dá) 上清，Lane 3:低分子量蛋白質(zhì)Marker, (Marker,從上到下依次為97.4， 66.2， 43.0， 31.0， 20.1， 14.4KD，購于sigma公司。 圖2:重組抗菌肽對標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coli抑菌活性測定1、 2、 3均為青霉素陽性對照，劑量分別為100ng/ml、 50pg/ml、 10昭/ml， 4、 5均為重組抗菌肽cecA-mill所表達(dá)的上清，6 X-33/pPICZa-A空載體所表達(dá)的 上清對照，7X-33宿主菌表達(dá)上清對照。 圖3:重組抗菌肽對耐藥菌株E.coli抑菌活性測定1、 2均為青霉素陽性對照，劑量均為100ng/ml， 3、 4均為重組抗菌肽cecA-mi11 所表達(dá)的上清，5X-33/pPICZoc-A空載體所表達(dá)的上清對照，6X-33宿主菌表達(dá)上清對照。圖4:重組cecA-mil雜合基因抗菌肽發(fā)明的實(shí)施過程圖1重組抗菌肽基因的設(shè)計(jì)、SOE法PCR擴(kuò)增、純化，2重組抗菌肽表達(dá)質(zhì) 粒的構(gòu)建、酶切鑒定和PCR鑒定，3重組抗菌肽菌株的轉(zhuǎn)化、鑒定和髙拷貝基 因重組菌株篩選，4重組抗菌肽的表達(dá)、抑菌活性鑒定。重組cecA-mi I雜合基因抗菌肽的核酸和氨基酸序列表〈110>瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司 <120〉重組cecA-mil雜合基因抗菌肽 <140> 200810054665.5 〈141〉 2008-03-21 〈160〉 5〈170〉 Patentln version 3.3〈210> SEQ. ID. NO. 1〈211〉 63〈212> DNA〈213〉人工序列〈220〉<221> gene 〈222> (1)…(63) 〈400〉 1aattcg卿a a卿aagtgg ,ctgttca aaaaggtgct gaaggtgctg accaccggct 60 aat 63〈210〉 SEQ. ID. NO. 2 〈211> 63 〈212〉腿 <213>人工序列 〈220>〈221〉 gene 〈222〉 (1)…(63) 〈400> 2gctcttttct ttcacctttg acaagttttt atcccacgacttc cacgactggt ggccgattag 6063〈210〉 SEQ. ID. NO. 3〈211> 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈220〉〈221〉 gene <222> (1)…咖 〈400〉 3tactttcata attgcgactg〈210〉 SEQ. ID. NO. 4 〈211> 18 <212>腿 〈213>人工序列 〈220〉〈221> gene 〈222〉 (1)…(18) 〈400〉 4ccttcttgaa caacttcc〈210> SEQ. ID. NO. 5 <211> 15 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220>〈221> aminoacids 〈222〉 (1)…(15) 〈400〉 5<formula>formula see original document page 12</formula>
權(quán)利要求
1、重組cecA-mil雜合基因抗菌肽，其特征在于重組cecA-mil雜合抗菌肽的基因設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)cecropinA和milittin的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，利用DNASTAR、primer premier軟件設(shè)計(jì)了引物基因片斷F1和F2、F3和F4，引物F1和F2經(jīng)SOE-PCR擴(kuò)增出改造的cecA-mil雜合肽基因序列(45個(gè)堿基)。設(shè)計(jì)的CecA-mil基因全長60bp，包括15個(gè)氨基酸的編碼序列和終止密碼子，基因N端、C端分別設(shè)有EcoRI、XbaI粘性末端，并在基因的N端引入畢赤酵母Kex2蛋白酶裂解位點(diǎn)。F35’-tactttcataattgcgactg-3’F45’-ccttcttgaacaacttcc-3’引物基F3和F4用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，其中F3位于載體序列上，F(xiàn)4則位于插入外源基因(cecA-mil)區(qū)。
2、 重組cecA-mil雜合基因抗菌肽，其特征在于重組表達(dá)載體的構(gòu)建。cecA-mil 雜合肽基因純化后，直接進(jìn)行^7 o1、 ^al雙酶切，定向插入酵母表達(dá)載體 pPICZa-A中，構(gòu)建cecA-mil重組酵母表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)Zeocin篩選、特異PCR鑒 別和缺失酶切位點(diǎn)鑒定陽性的質(zhì)粒命名為pPICZa-A-CM。經(jīng)TaKaRa測序，所合成基因序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。
3、 重組cecA-mil雜合基因抗菌肽，其特征在于重組菌株的轉(zhuǎn)化。將S"cl線性 化的重組質(zhì)粒pPICZa-A-CM電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入X-33感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Zeocin 的YPDS/Z+固體選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將具有Zeocin抗性的最初轉(zhuǎn)化子菌落，通 過影印法克隆到MM平板和MD平板上培養(yǎng)，選擇在兩種培養(yǎng)基上都生長良好 的Mut+菌落，進(jìn)一步依次轉(zhuǎn)移到含Zeocin不同濃度的YPDS平板上，逐級篩選 目的基因高拷貝重組菌株。制備篩選到的高拷貝重組菌株基因組DNA，利用鑒 定引物F3、 F4進(jìn)行PCR鑒定。
4、重組cecA-mil雜合基因抗菌肽，其特征在于重組抗菌肽蛋白抑菌活性的鑒定。 將篩選到的陽性酵母菌在含一定濃度甲醇的BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。72h 后，離心收集培養(yǎng)上清，進(jìn)行抑菌活性測定和Tricine-SDS-PAGE鑒定。采用標(biāo) 準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以￡."http://0115(1為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行抑菌活性測定，同時(shí)設(shè)立 空載體酵母濃縮上清作陰性對照，Amp為陽性對照。分子量為1.8kDa的重組 cecA-mil雜合基因抗菌肽獲得表達(dá)，且具有明顯的抑菌活性。
全文摘要
本發(fā)明重組cecA-mil雜合基因抗菌肽，用于生物技術(shù)制藥工業(yè)中的基因工程生產(chǎn)疫苗藥物的技術(shù)領(lǐng)域。根據(jù)天蠶素A和蜂毒素，以畢赤酵母偏愛的密碼子設(shè)計(jì)合成引物，進(jìn)行SOE法PCR出改造的cecA-mil雜合肽基因序列，同載體pPICZα-A連接后，構(gòu)建重組酵母表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)Zeocin篩選、特異PCR鑒別和缺失酶切位點(diǎn)鑒定陽性的質(zhì)粒命名為pPICZα-A-CM。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌X-33中，篩選目的基因高拷貝重組菌株，在醇氧化酶啟動(dòng)子調(diào)控下，1.8kD的重組蛋白獲得表達(dá)，且具有較為明顯的抑菌活性。以此來開發(fā)研究該重組抗菌肽的基因工程產(chǎn)品研究。
文檔編號C12N15/81GK101323644SQ20081005466
公開日2008年12月17日 申請日期2008年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日
發(fā)明者馮秀麗, 曹瑞兵, 楊保收, 陳溥言, 鮑恩東 申請人:瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司