專利名稱：監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域的土壤污染監(jiān)測方法，具體是一種監(jiān)測土壤重 金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法。
背景技術(shù)：
土壤復合污染是當前進行環(huán)境保護科學研究前沿的一個熱點，但同時也是研 究難點。由于復合污染的復雜性和實驗手段的局限性，對污染物復合污染缺少能 進行定量表征的實驗方法。近年來已相繼開展了利用蚯蚓作為載體對可能造成土 壤環(huán)境污染的化學物質(zhì)進行測試，并根據(jù)這些化學物質(zhì)對蚯頓的毒害程度來評價 其可能對環(huán)境的危害程度。隨著生物技術(shù)在細胞水平、亞細胞水平和分子水平的 發(fā)展，對污染物毒性的檢測手段也隨之得到了提高，流式細胞儀(FCM)是一種 在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，與傳統(tǒng) 的熒光鏡檢査相比，具有高通量、速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，成為當代 最先進的細胞定量分析技術(shù)。
利用Annexin-V和PI雙染色法，用流式細胞儀準確檢測出蚯蚓體腔細胞成 活率及質(zhì)膜的早期變化。根據(jù)Annexin-V和PI熒光燃料與PS及DNA的結(jié)合特性， 在流式細胞儀檢測的散點圖中可以區(qū)分出4種類型細胞A象限內(nèi)的細胞為死亡 晚期細胞，Annexin-V為陰性而PI為陽性(AV—Pr); B象限內(nèi)的細胞為壞死細 胞，Annexin-V和PI均為陽性(AV+—PI+)，雖然這類小質(zhì)膜滲透性受到損傷， 但是質(zhì)膜的完整性還是在一定程度上得到維持；C象限內(nèi)的細胞為活細胞， Annexin-V和PI均為陰性(AV一PI—)，質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能均未發(fā)生變化；D象限 內(nèi)的細胞為活細胞，但處于凋亡早期狀態(tài)，Annexin-V為陽性而PI為陰性(AV+ 一PD這類處于凋亡早期的細胞雖然結(jié)構(gòu)仍然保持著一定的完整性，但是質(zhì)膜 結(jié)構(gòu)受到了一定程度的損傷，是一定量的PS開始由質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)，質(zhì)
膜的通透性增大，早期凋亡率可以作為污染物毒性評價的敏感指標，用于對污染
物毒性的早期預警。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，PLYTYCZ Barbara等在《European journal
of soil biology》(歐洲土壤生物)(2007， 43: 116-120)上發(fā)表的"Flow
cytometric measurement of neutral red accumulation in earthworm
coelomocytes : Novel assay for studies on heavy metal exposure" (細
胞流式技術(shù)檢測蚯躬l體腔細胞中性紅積累檢測重金屬暴露的新方法)，該文中 提出細胞流式技術(shù)是一種快速檢測無脊椎動物體腔細胞中溶酶體中性紅積累情 況的方法，并依據(jù)中性紅積累的量來評價環(huán)境污染狀況。具體方法為重金屬 Cu對不同種無脊椎動物的體腔細胞進行體外脅迫，用中性紅對體腔細胞染色， 利用細胞流式技術(shù)檢測無脊椎動物體腔細胞中溶酶體中性紅積累情況，結(jié)果表明 無脊椎動物體腔細胞中溶酶體中性紅積累的多少可作為Cu污染的生物標志物。 其不足在于該方法局限于體外細胞染毒，以中性紅積累作為檢測指標，實驗周 期長，靈敏度較差，不能真實反映指示生物受到污染物脅迫下體腔細胞的損傷情 況，因而不適用于對土壤污染的監(jiān)測和預警。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以蚯蚓體腔細胞作為標志物 的土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染預警方法，使其以蚯蚓體腔細胞作為生物標志 物對土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染進行監(jiān)測和預警，能對土壤污染檢測起到很 好的警示作用。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，包括以下步驟-
第一步，將指示生物染毒，按照OECD 207推薦標準方法(1984年，經(jīng)濟合 作與發(fā)展組織，化學品測試導則207《蚯蟲引急性毒性試驗》)將安德愛勝蚓 (Eisenia andrei)在土壤中染毒。
第二步，提取蚯蚓體腔細胞，用纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取蚯蚓的體腔細 胞，歩驟為①蚯蚓清腸；②將纖維針細管插入蚯蚓體腔；③用超聲波儀震蕩刺 激蚯蚓④細胞記數(shù)和鏡檢。
纖維針選用長lcm，內(nèi)徑為0.5mm中空的纖維針細管，所選用的超聲波儀頻 率為28KHz 、功率為300W，震蕩刺激蚯蚓的時間為2s。第三步，收集蚯蚓體腔細胞，作為待測細胞，將提取的細胞收集到10mL的 離心管中，800Xg離心5 min，棄去上清液，用緩沖液(Annexin V-PI檢測試 劑盒，美國BD公司)稀釋，調(diào)整待測樣品細胞數(shù)為(2 3) X105mL—、
第四步，待測細胞洗滌，加入2 yL胰蛋白酶消化5 min，然后用緩沖液 (Annexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)洗滌2次，800Xg離心5min。再 用緩沖液(Annexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)重新懸浮細胞，使細胞的 濃度為2X105 mL—、
第五步，待測細胞染色，取195n L細胞懸液，加入5 y L Ann-FITC (Annexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)，室溫下孵化10 min。然后加入10 u L PI染 液，室溫下避光孵育10 15 min。
第六步，測定細胞的成活率和早期凋亡率，用FACSCalibur型流式細胞儀檢 測(Becton Dichinson， San Jose， SA， USA)，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為 488 nm，光源為200 mW。用Cellquest 9. 3版(Becton Dichinson， San Jose' SA， USA)檢測每個細胞的前向角散光(ESC)和側(cè)向光角散光(SSA)。用波長為520 nm的通帶濾器檢測FITC熒光(FL1)，另一波長大于610 nm的濾器檢測PI(FL3)。
第七步，根據(jù)細胞的成活率和早期凋亡率大小判斷土壤重金屬和多環(huán)芳烴復 合污染程度，蚯頓體腔細胞的成活率越低、早期凋亡率越大，說明該染毒組重金 屬和多環(huán)芳烴復合污染程度越嚴重。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是首次用兩種熒光色素的雙染法，用細胞 流式技術(shù)分析蚯蚓體腔細胞的成活率和早期凋亡率大小判斷土壤重金屬和多環(huán) 芳烴復合污染程度，該方法靈敏高效、操作簡便、重復性好，尤其適用于對老工 業(yè)基地中土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染情況的檢測，對土壤中重金屬和多環(huán)芳 烴復合污染有很好的預警作用。
具體實施例方式
下面結(jié)合本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提 下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不 限于下述的實施例。
實施例1 用纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取單一 Cd污染染毒的蚯蚓體腔細胞將平均 體重為300rag具有環(huán)帶的健壯成體蚯蚓。清腸24小時，用濃度為0. Olmol L—1、 pH7. 2的PBS緩沖液反復沖洗干凈蚯蚓，加3mL含有2. 5raM乙二醇-雙-(2-氨基 乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL離心管，用長lcm，內(nèi)徑為0. 5mra中空的纖維 針細管插入蚯蚓體腔后放入離心管。迅速用頻率為28KHz 、功率為300W的超聲 波儀震蕩刺激蚯蚓2秒，可看到纖維針細管內(nèi)液體迅速變黃色，將細胞移入50mL 離心管然后加入12mL的Hank' s液清洗三次。
將待測細胞收集到10 mL的離心管中，800Xg離心5 min，棄去上清液， 用緩沖液(Annexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)稀釋，調(diào)整待測樣品細胞 數(shù)為(2 3) X105 mL—'。
加入2 u L胰蛋白酶消化5 min，然后用緩沖液洗滌2次，800Xg離心5 min。 再用緩沖液重新懸浮細胞，使細胞的濃度為2X105 mL—、
取195y L細胞懸液，加入5 ix L Ann-FITC (Annexin V-PI檢測試劑盒，美 國BD公司)，在室溫下孵化10 min。然后加入10 y L PI染液，室溫下避光孵 育10 15 min。
利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測(Becton Dichinson, San Jose, SA， USA)，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為488 nm，光源為200 mW。用Cellquest 9. 3 版(Becton Dichinson, San Jose， SA， USA)檢測每個細胞的前向角散光(ESC) 和側(cè)向光角散光(SSA)。用一波長為520 nm的通帶濾器檢測FITC熒光(FL1)， 另一波長大于610 nm的濾器檢測PI (FL3)。
得出單一 Cd污染下蚯蚓體腔細胞成活率和凋亡率分別為45. 11%、 12. 54%。 該結(jié)果表明土壤中重金屬Cd的污染脅迫造成了蚯蚓體腔細胞的損傷，蚯蚓 體腔細胞成活率和凋亡率可定量表征土壤中重金屬Cd的污染程度。
實施例2
用纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取單一 Phe污染染毒的蚯蚓體腔細胞將平均 體重為300mg具有環(huán)帶的健壯成體蚯蚓。清腸24小時，用濃度為0. Olmol L—'、 pH7. 2的PBS緩沖液反復沖洗干凈蚯蚓，加3mL含有2. 5mM乙二醇-雙-(2-氨基 乙基)四乙酸(EGTA) PBS于10mL離心管，用長lcm，內(nèi)徑為0. 5腿中空的纖維 針細管插入蚯蚓體腔后放入離心管。迅速用頻率為28KHz 、功率為300W的超聲 波儀震蕩刺激蚯蚓2秒，可看到纖維針細管內(nèi)液體迅速變黃色，將細胞移入50mL 離心管然后加入12mL的Hank， s液清洗三次。
將待測細胞收集到10 mL的離心管中，800Xg離心5 min,棄去上清液， 用緩沖液(Annexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)稀釋，調(diào)整待測樣品細胞 數(shù)為(2 3) X105 mL一1。
加入2 y L胰蛋白酶消化5 min，然后用緩沖液洗滌2次，800Xg離心5 min。 再用緩沖液重新懸浮細胞，使細胞的濃度為2X105 mL—、
取195uL細胞懸液，加入5 nLAnn-FITC (Annexin V-PI檢測試劑盒，美 國BD公司)，在室溫下孵化10 min。然后加入10 u L PI染液，室溫下避光孵 育10 15 min。
利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測(Becton Dichinson， San Jose， SA， USA)，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為488 nm，光源為200 mW。用Cellquest 9. 3 版(Becton Dichinson, San Jose, SA， USA)檢測每個細胞的前向角散光(ESC) 和側(cè)向光角散光(SSA)。用一波長為520 nm的通帶濾器檢測FITC熒光(FLl)， 另一波長大于610 nm的濾器檢測PI (FL3)。
得出單一 Phe污染下蚯蚓體腔細胞成活率和凋亡率分別為56. 33%、 10. 36%。 該結(jié)果表明土壤中重金屬Phe的污染脅迫造成了蚯蚓體腔細胞的損傷，蚯蚓體腔 細胞成活率和凋亡率可定量表征土壤中重金屬Phe的污染程度。
實施例3
用纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取Cd—Phe復合污染染毒的蚯蚓體腔細胞將 平均體重為300mg具有環(huán)帶的健壯成體蚯蚓。清腸24小時，用濃度為O.Olmol L-'、 pH7.2的PBS緩沖液反復沖洗干凈蚯蚓，加3mL含有2.5mM乙二醇-雙-(2-氨基乙基)四乙酸 (EGTA) PBS于10raL離心管，用長lcm,內(nèi)徑為0. 5誦中空的 纖維針細管插入蚯蚓體腔后放入離心管。迅速用頻率為28KHz 、功率為300W的 超聲波儀震蕩刺激蚯蚓2秒，可看到纖維針細管內(nèi)液體迅速變黃色，將細胞移 入50mL離心管然后加入12mL的Hank' s液清洗三次。
將待測細胞收集到10 raL的離心管中，800Xg離心5 min，棄去上清液，
用緩沖液(Annexin V-PI檢測試劑盒，美國BD公司)稀釋，調(diào)整待測樣品細胞 數(shù)為(2 3) X105 mL—、
加入2 y L胰蛋白酶消化5 min，然后用緩沖液洗滌2次，800Xg離心5 min。 再用緩沖液重新懸浮細胞，使細胞的濃度為2X105 mL—'。
取195uL細胞懸液，加入5 uLAnn-FITC (Annexin V-PI檢測試劑盒，美 國BD公司)，在室溫下孵化10 min。然后加入10 u L PI染液，室溫下避光孵 育10 15 min。
利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測(Becton Dichinson, San Jose， SA， USA)，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為488 nm，光源為200 mW。用Cellquest 9. 3 版(Becton Dichinson, San Jose, SA， USA)檢測每個細胞的前向角散光(ESC) 和側(cè)向光角散光(SSA)。用一波長為520 nm的通帶濾器檢測FITC熒光(FLl)， 另一波長大于610 nm的濾器檢測PI (FL3)。
得出Cd—Phe復合污染下蚯頓體腔細胞成活率和凋亡率分別為35.59%、 15. 25%。該結(jié)果表明土壤中重金屬Cd—Phe復合污染的污染脅迫造成了蚯蚓體腔 細胞的損傷，Cd—Phe復合污染的毒性大于單一的Cd或Phe污染。蚯蚓體腔細 胞成活率和凋亡率可定量表征土壤中重金屬Cd—Phe復合污染的污染程度。
權(quán)利要求
1.一種監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特征在于包括以下步驟第一步，將指示生物蚯蚓染毒；第二步，提取第一步得到的蚯蚓體腔細胞；第三步，收集蚯蚓體腔細胞，作為待測細胞；第四步，對收集的待測細胞洗滌；第五步，將洗滌后的待測細胞染色；第六步，測定細胞的成活率和早期凋亡率；第七步，根據(jù)細胞的成活率和早期凋亡率大小判斷土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染程度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特 征是，所述蚯蚓為安德愛勝蚓。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特 征是，所述提取蚯蚓體腔細胞，是用纖維針結(jié)合超聲波刺激法提取蚯蚓的體腔細 胞，步驟為①蚯蚓清腸；②將纖維針細管插入蚯蚓體腔；③用超聲波儀震蕩剌 激蚯蚓④細胞記數(shù)和鏡檢。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特 征是，所述纖維針選用長lcm，內(nèi)徑為0.5mm中空的纖維針細管，所選用的超聲 波儀頻率為28KHz 、功率為300W,震蕩刺激蚯蚓的時間為2s。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特 征是，所述收集蚯蚓體腔細胞，是指將提取的細胞收集到10 mL的離心管中， 800Xg離心5min，棄去上清液，用緩沖液稀釋，調(diào)整待測樣品細胞數(shù)為2X 105 mL_1 3X105 raL—'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其 特征是，所述待測細胞洗滌，是指加入2 yL胰蛋白酶消化5 min，然后用緩 沖液洗滌2次，800Xg離心5min，再用緩沖液重新懸浮細胞，使細胞的濃度為 2X105 mL—、
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特 征是，所述待測細胞染色，是指取195μL細胞懸液，加入5 iiLAnn-FITC， 室溫下孵化IO min，然后加入IO μL PI染液，室溫下避光孵育10 15 min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特 征是，所述測定細胞的成活率和早期凋亡率，是指用FACSCalibur型流式細胞 儀檢測，流式細胞儀氬離子激發(fā)光波長為488 nm，光源為200 mW，用Cellquest 9.3版檢測每個細胞的前向角散光和側(cè)向光角散光，用波長為520 nm的通帶濾 器檢測FITC熒光，另一波長大于610 nm的濾器檢測PI。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法，其特 征是，所述根據(jù)蚯蚓體腔細胞的成活率和早期凋亡率大小判斷土壤重金屬和多環(huán) 芳經(jīng)復合污染程度，其中蚯蚓體腔細胞的成活率越低、早期凋亡率越大，說明該 染毒組重金屬和多環(huán)芳烴復合污染程度越嚴重。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域的監(jiān)測土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染的方法。步驟為第一步，指示生物染毒。第二步，蚯蚓體腔細胞提取。第三步，待測細胞收集。第四步，待測細胞洗滌。第五步，待測細胞染色。第六步，測定細胞的成活率和早期凋亡率。第七步，根據(jù)細胞的成活率和早期凋亡率大小判斷土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染程度。本發(fā)明通過分析蚯蚓體腔細胞的成活率和早期凋亡率大小判斷土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染程度，該方法靈敏高效、操作簡便、重復性好，尤其適用于對老工業(yè)基地中土壤重金屬和多環(huán)芳烴復合污染情況的檢測，對土壤中重金屬和多環(huán)芳烴復合污染有很好的預警作用。
文檔編號C12Q1/02GK101344512SQ20081004248
公開日2009年1月14日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者江 朱, 陸貽通 申請人:上海交通大學