一種紫花苜蓿協(xié)同復(fù)合菌劑修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)，特別涉及一種紫花苜蓿協(xié)同復(fù)合菌劑修復(fù) 多環(huán)芳烴污染土壤的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多環(huán)芳經(jīng)（Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一類由兩個(gè)或兩個(gè) 以上的苯環(huán)以線狀、角狀和簇狀稠合在一起而成碳?xì)浠衔铩＞哂屑?xì)胞毒性、遺傳毒性、免 疫毒性、致畸性和致癌性。近年來越來越引起人們的廣泛關(guān)注。隨著現(xiàn)代城市化進(jìn)程的加 速、石油、煤炭等能源的大規(guī)模開發(fā)使用，多環(huán)芳烴（PAHs)的污染也越來越嚴(yán)重，加至許多 工廠三廢凈化處理系統(tǒng)不完善，導(dǎo)致工業(yè)廢水流入大面積耕地之中，造成多環(huán)芳烴等各種 致癌物質(zhì)土壤殘留量超標(biāo)，過量的PAHs在土壤中的殘留，不僅影響土壤的正常功能、降低 土壤質(zhì)量，更重要的是PAHs進(jìn)入土壤后由于其穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和低溶解性與憎水性，很難 通過光、氧及微生物等自然環(huán)境進(jìn)行降解，因此很容易通過生物鏈進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，并且具有 積累效應(yīng)，嚴(yán)重危及人體健康和生態(tài)安全。目前土壤污染的修復(fù)措施一般有：物理修復(fù)，化 學(xué)修復(fù)、生物修復(fù)、植物修復(fù)、微生物-植物聯(lián)合修復(fù)?；瘜W(xué)修復(fù)是向土壤中注入表面活性 劑，提高PAHs等多環(huán)芳烴的流動性而迀出土壤或形成有機(jī)粘土提高污染物的滯留性和穩(wěn) 定性，降低其迀移進(jìn)入生態(tài)環(huán)境的能力，但化學(xué)修復(fù)易造成地下水等環(huán)境的二次污染，成本 高，難以根治等。微生物修復(fù)是利用篩選、馴化的有針對性的微生物降解土壤中的多環(huán)芳 烴，但是容易和本土微生物進(jìn)行競爭，有潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，且針對性強(qiáng)，適用面不廣。植物修 復(fù)是選用具有超富集的植物，一方面利用植物根際的作用促進(jìn)微生物分解多環(huán)芳烴，另一 方面植物直接吸收多環(huán)芳烴，該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，并可改善生態(tài)環(huán)境，但單純的植物修復(fù)對PA Hs污染土壤的修復(fù)效率難以一步到位。利用單一豆科植物~微生物聯(lián)合修復(fù)土壤是目前 研究的熱點(diǎn)之一。專利CN200510038453. 4提出在污染土壤上種植豆科植物的同時(shí)，接種根 瘤菌與叢枝菌根真菌，促進(jìn)土壤中多氯聯(lián)苯等多環(huán)芳烴的降解能力，但是沒有提出如何縮 短植物生長周期的方法，使得土壤修復(fù)效率降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種紫花苜蓿協(xié)同復(fù)合菌劑修復(fù)多環(huán)芳烴污 染土壤的方法。該方法提高了紫花苜蓿對土壤中PAHs的降解率，降低了修復(fù)成本，縮短了 紫花苜蓿生長周期且操作簡便，適用于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0005] 1、紫花苜蓿種子預(yù)處理：凈選飽滿、無蟲蛀、無霉變的紫花苜蓿種子，浸泡于75% 無水乙醇0. 5~lmin，取出后置于0.lmol/LHgCl2溶液中浸泡20~30min，后用滅菌水漂 洗5~6遍，用紗布吸干表面水分后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中室溫下催芽培養(yǎng)；
[0006] 2、木霉菌孢子懸浮液的制備：將木霉菌菌種接種于種子培養(yǎng)基中，于28°C條件下 培養(yǎng)4~5d，產(chǎn)生大量孢子，用無菌水沖洗孢子，制成濃度為1X10s/ml孢子懸液；
[0007] 3、根瘤菌懸液的制備：將苜蓿根瘤菌接種于瓊脂培養(yǎng)基中，于25°C條件下培養(yǎng) 30~60h，產(chǎn)生孢子，用無菌水沖洗孢子，制成濃度為1X10s/ml菌懸液；
[0008] 4、復(fù)合菌劑的制備：將步驟2與步驟3分別制得的木霉菌孢子懸液、根瘤菌懸液按 10%的接種量接種于同一固體培養(yǎng)基中，于28~30°C條件下培養(yǎng)72h;即得復(fù)合菌劑。
[0009] 進(jìn)一步，所述的木霉菌菌種為：木霉菌T30 (Trichoderma koningii)。
[0010] 進(jìn)一步，所述的根瘤菌菌種為：中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究院）提供的苜蓿根瘤菌ACCC17676
[0011] 進(jìn)一步，所述的高糖培養(yǎng)基原料組成份數(shù)為：酒石酸銨1. 5~2份、葡萄糖20~25 份、磷酸二氫鉀1~2份、硫酸鎂1~2份、三氯化鐵0. 01~0. 05份、馬鈴薯50~100份、 瓊脂10~50份、麩皮1~10份、玉米汁1~10份、蛋白胨1~5份，蒸餾水1000ml、pH為 7. 0〇
[0012] 進(jìn)一步，所述的瓊脂培養(yǎng)基原料組成份數(shù)為：400mg/L硝酸稀土溶液1~5ml、甘露 醇1. 0~5. 0份，酵母膏0. 8~1. 0份，磷酸氫二鉀0. 5~1. 0份，硫酸鎂0. 2~0. 5份，氯 化鈉0. 1~0. 5份，硫酸鈣0. 2~0. 5份，1 %鉬酸鈉溶液1~5mL，1 %硫酸錳1~5mL，瓊 脂18~20份，蒸餾水1000mL，pH為7. 0。
[0013] 進(jìn)一步，所述的固體培養(yǎng)基原料組成份數(shù)為：麥麩1~5份、橘皮1~5份、
[0014] 玉米秸桿粉1~5份、維生素C0. 1~0.5份、維生素A0. 1~0.5份，蒸餾水50~ 100ml,pH為 7. 0。
[0015] 進(jìn)一步，所述的復(fù)合菌劑添加量每公頃15~20kg。
[0016] -種紫花苜蓿協(xié)同復(fù)合菌劑修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤應(yīng)用方法：將催芽的紫花苜蓿 種子播種于多環(huán)芳烴污染的土壤中，待種子發(fā)芽時(shí)，將復(fù)合菌劑單施于紫花苜蓿根部，土壤 水分維持在田間持水量的60%~70%，培養(yǎng)90天其它田間管理措施如：修剪、澆水、除草、 施肥等均一致。
[0017] 本發(fā)明的有益效果如下：通過對紫花苜蓿種子預(yù)處理，將植物發(fā)芽周期縮短2-3 天，增強(qiáng)了植物對PAHs土壤的耐受性，提高了植物對土壤的修復(fù)能力。且在紫花苜蓿-木 霉菌-根瘤菌聯(lián)合修復(fù)體系中，利用木霉菌與根瘤菌之間產(chǎn)生協(xié)同作用促進(jìn)紫花苜蓿對 污染土壤中PAHs的降解。同時(shí)也改變了紫花苜蓿根際土壤微生物群體水平的生理輪廓， 恢復(fù)土壤微生物生態(tài)功能多樣性和穩(wěn)定性，改善農(nóng)作物的生長環(huán)境，提高農(nóng)作物的質(zhì)量和 產(chǎn)量，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 1、紫花苜蓿種子預(yù)處理：凈選飽滿、無蟲蛀、無霉變的紫花苜蓿種子，浸泡于75% 無水乙醇0. 5min，取出后置于0.lmol/LHgCl2溶液中浸泡20min，后用滅菌水漂洗5遍，紗 布吸干表面水分后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中室溫下催芽培養(yǎng)；
[0021] 2、木霉菌孢子懸浮液的制備：將木霉菌T30(Trichodermakoningii)菌種接種于 高糖培養(yǎng)基中，所述的高糖培養(yǎng)基原料組成份數(shù)為：酒石酸銨1. 5份、葡萄糖20份、磷酸二 氫鉀1. 0份、硫酸鎂1. 0份、三氯化鐵0. 01份、馬鈴薯50份、瓊脂10份、麩皮1. 0份、玉米 汁1.0份、蛋白胨1.0份，蒸餾水1000ml、pH為7.0。于28°C條件下培養(yǎng)4d，產(chǎn)生大量孢 子，用無菌水沖洗孢子，制成濃度為1Xl〇s/ml孢子懸液；
[0022] 3、根瘤菌懸液的制備：將苜蓿根瘤菌接種于瓊脂培養(yǎng)基中，所述的瓊脂培養(yǎng)基原 料組成份數(shù)為：400mg/L硝酸稀土溶液1.Oml、甘露醇1. 0份，酵母膏0. 8份，磷酸氫二鉀0. 5 份，硫酸鎂〇. 2份，氯化鈉0. 1份，硫酸鈣0. 2份、1 %鉬酸鈉溶液1.OmL，1 %硫酸錳1.OmL， 瓊脂18份，蒸餾水1000mL，pH為7. 0。于25°C條件下培養(yǎng)30h，產(chǎn)生孢子，用無菌水沖洗孢 子，制成濃度為1Xl〇s/ml菌懸液；
[0023] 4、復(fù)合菌劑的制備：將步驟2與步驟3分別制得的木霉菌孢子懸液、根瘤菌懸液按 10%的接種量接種于同一固體培養(yǎng)基中，所述的固體培養(yǎng)基原料組成份數(shù)為：麥麩1. 〇份、 橘皮1.0份、玉米秸桿粉1.0份、維生素C0. 1份、維生素A0. 1份，蒸餾水50ml，pH為7.0。 于28°C條件下培養(yǎng)72h;即得復(fù)合菌劑。
[0024] -種紫花苜蓿協(xié)同復(fù)合菌劑修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤應(yīng)用方法：選取某地0. 5畝 PAHs污染表層土壤（0-20cm)，將催芽處理的紫花苜蓿種子均勻播種，待種子發(fā)芽時(shí)，將復(fù) 合菌劑直接施用于土壤，可按7. 5kg/公頃土壤的量在紫花苜蓿根部單施，土壤水分維持在 田間持水量的60%，其它田間管理措施如：修剪、澆水、除草、施肥等均一致。
[0025] 紫花苜蓿-微生物協(xié)同處理的PAHs土壤測定試驗(yàn)
[0026] 1材料與方法
[0027] 1. 1 原始土壤
[0028] 將實(shí)施例1處理前PAHs污染表層土壤（0-20cm)剔除石礫等殘留物，塑料袋封裝， 自然避光風(fēng)干，研磨，過4mm篩，于4°C下保藏備用。經(jīng)測定16種EPA優(yōu)先控制的PAHs 總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9. 326ug/kg，其中2~3環(huán)、4環(huán)、5-6環(huán)PAHs含量分別占總量的6.01%、 45. 89%、48· 1%〇
[0029] 1. 2 處理土壤
[0030] 經(jīng)過90天培養(yǎng)，將實(shí)施例1采用紫花苜蓿-微生物處理之后的土壤剔除植物根 系、石礫等殘留物，塑料袋封裝，自然避光風(fēng)干，研磨，過4_篩，于4°C下保藏備用
[0031] 1. 3處理土壤PAHs的提取
[0032] 土壤PAHs提取采用二氯甲烷索氏提取法，提取液使用GC-MS測定。
[0033] 1. 4 土壤降解率的測定
[0034] 土壤PAHs降解率（％) = (原始污染土壤PAHs質(zhì)量分?jǐn)?shù)-處理后PAHs質(zhì)量分 數(shù)）/原始污染土壤PAHs質(zhì)量分?jǐn)?shù)X100 %
[0035] 1. 5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法
[0036] 本研究中所有圖形均采用Origin8. 0制作完成，顯著性分析使用SPSS19. 0進(jìn)行。
[0037] 2結(jié)果與分析
[0038] 2. 1紫花苜蓿-微生物協(xié)