專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高東方擬無(wú)枝酸菌發(fā)酵生產(chǎn)eco-0501的產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高東方擬無(wú)枝酸菌(^^0)/加0戸& w/Mtoto)發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501的產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
東方擬無(wú)枝酸菌(Zmyco/afop57's on'e"fa/is )(原名為東方鏈霉菌( W7'entoto)或東方諾卡氏菌(7VocaW/a 0〃'e"to/k))是由Micormick等于1956年從印尼土壤 中篩選得到，經(jīng)鑒定其發(fā)酵產(chǎn)物為萬(wàn)古霉素(vancomycin),該抗生素是具有抗革蘭氏陽(yáng) 性菌的一種糖肽類(lèi)抗生素。后由美國(guó)禮萊公司開(kāi)發(fā)，于1958年獲FDA批準(zhǔn)上市。最近的研 究表明東方擬無(wú)枝酸菌除產(chǎn)生萬(wàn)古霉素外，還產(chǎn)生至少10種次生代謝產(chǎn)物。Banskota等通 過(guò)DECIPHER技術(shù)分析該菌的基因組，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)生物合成基因簇編碼I型聚酮化合物合 酶(polyketide synthases),并預(yù)測(cè)其能直接合成一種新類(lèi)型化合物。通過(guò)培養(yǎng)基篩選發(fā)酵， 分離出此化合物ECO-0501，其結(jié)構(gòu)式為
同時(shí)發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Stop/^/ococcw awe""禾口耐萬(wàn)古霉素腸球菌(vancomycin-resistant ￡"/eracoccm均有很強(qiáng)的抑 菌活性，因而具有良好的應(yīng)用前景，但是該化合物在東方擬無(wú)枝酸菌"myco/加o;^'s on^toto)發(fā)酵產(chǎn)物中的量很低。(Banskota AH, McApine JB， S0rensen D， Ibrahim A， Aouidate M, Piraee M, Alarco AM, Farnet C， Zazopoulos E (2006b) Genomic analyses lead to novel secondary metabolites. Part 3. ECO-0501, a novel antibacterial of a new class. J. Antibiot. (Tokyo) 59:533-542)
據(jù)研究，天然的萬(wàn)古霉素生物合成共有35步。七肽核鏈?zhǔn)怯砷g-氯-P-羥基酪氨酸(CHT) 單位、3, 5-二羥基苯基甘氨酸(Dpg)單位、精氨酸、N-甲基亮氨酸組成，在酶的催化下生成7種非蛋白氨基酸AA-l AA-7，這7種氨基酸在非核糖體肽合成酶(NRPS)裝配線上 合成一線形的七肽，然后芳基邊鏈在交聯(lián)酶的催化下適時(shí)地組合、交聯(lián)，形成復(fù)雜的七肽 骨架。萬(wàn)古霉素的七肽裝配是在非核糖體多肽合成酶系(nonribosonml peptide synthetases, NRPS)中進(jìn)行的，該酶系是一類(lèi)多功能蛋白質(zhì)復(fù)合體，能識(shí)別、激活、轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸底物 并按特定順序合成多肽，它同時(shí)具有酶和模板的功能，因此又被稱(chēng)為蛋白質(zhì)模板。非核糖 體合成酶系由氨基酸激活功能域(A domain)、氨酰載體功能域(T domain)和縮合功能 域(C domain)組成。首先，氨基酸激活功能域選擇結(jié)合氨基酸底物，ATP依賴(lài)的氨酰基 腺苷酸化形成氨酰腺苷酸；隨后，氨酰腺苷酸的氨酰部分再與共價(jià)結(jié)合在多酶復(fù)合物上面 的磷酸泛酰巰基乙胺的巰基進(jìn)行硫酯化反應(yīng)，形成氨酰載體復(fù)合物。最后，分別攜帶有氨 酰基和肽?；妮d體，在縮合功能域的作用下形成肽鍵，合成的終止——肽的釋放，是由 于水解、環(huán)化或者轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)功能基團(tuán)后引起。
本申請(qǐng)人在申請(qǐng)?zhí)枮?00710036861.5的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)中，公開(kāi)了萬(wàn)古霉素生物合 成基因簇，其中萬(wàn)古霉素合成酶基因有vcm2、 vcm3、 vcm 4。萬(wàn)古霉素前體合成酶基因 有vcml、 vcm 17、 vcm 18、 vcml3; vcm 14、 vcm 15、 vcm 16; vcm23、 vcm24、 vcm25、 vcm26。其中4個(gè)負(fù)責(zé)催化羥基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcml、 vcml7、 vcml8、 vcml3; 4個(gè)負(fù)責(zé)催化二羥基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcm23、 vcm24、 vcm25、 vc26; 3個(gè)負(fù)責(zé)催 化卩-羥基酪氨酸的合成的酶的基因vcm14、 vcml5、 vcml6。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的發(fā)明人通過(guò)阻斷或敲除萬(wàn)古霉素合成酶基因或萬(wàn)古霉素前體合成酶基因的 表達(dá)，以阻斷東方擬無(wú)枝酸菌"w_yco/ato/w&w/e"tofc)萬(wàn)古霉素生物合成途徑，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)萬(wàn)古霉素的合成被阻斷后，東方擬無(wú)枝酸菌的代謝產(chǎn)物中化合物ECO-0501的產(chǎn)量得到 了明顯的提高。
因此，本發(fā)明的目的就在于提供一種提高東方擬無(wú)枝酸菌"m7c0/ato;^"0r/e"tofc) 發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501的產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的提高東方擬無(wú)枝酸菌發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501的產(chǎn)量的方法，是通過(guò)阻斷東方擬 無(wú)枝酸菌合成萬(wàn)古霉素來(lái)實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，所述阻斷萬(wàn)古霉素合成包括阻斷或敲除萬(wàn)古霉素合成酶基因或萬(wàn)古霉素 前體合成酶基因。
4其中，所述萬(wàn)古霉素合成酶基因包括合成萬(wàn)古霉素七肽骨架的基因vcm2， vcm3， vcm斗；
所述萬(wàn)古霉素前體合成酶基因包括
A、 4個(gè)負(fù)責(zé)催化羥基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcml， vcml7， vcml8和vcml3;
B、 4個(gè)負(fù)責(zé)催化二羥基苯甘氨酸的合成的酶基因vcm23， vcm24， vcm25和vcm26;
C、 3個(gè)負(fù)責(zé)催化p—羥基酪氨酸的合成的酶的基因vcm14， vcml5和vcm16。 本發(fā)明的提高東方擬無(wú)枝酸菌"/^co/Wo/75"W7V"/fl/z、)發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501的產(chǎn)量
的方法，在提高ECO-0501產(chǎn)量的同時(shí)，阻斷了萬(wàn)古霉素的合成，因而對(duì)于下游的分離步 驟也非常有利。


圖1是阻斷載體pKOA的構(gòu)建流程圖。
圖2是PCR-Targeting法敲除vcml4的原理圖。
圖3是阻斷載體pKOA的酶切驗(yàn)證電泳結(jié)果。其中Lanel為五coRI、 ///mffll酶切驗(yàn)證 的電泳結(jié)果，Lane2為用五coRI/^w7ffl酶切驗(yàn)證；Lane3為用i5flwHI////"i/in酶切驗(yàn)證； Lane4為lkb DN A Ladder 。
圖4是PCR驗(yàn)證敲除vcm4雙交換突變株染色體鑒定結(jié)果。其中Lanel為lkb DNA Ladder, Lane2為單交換突變株染色體的PCR產(chǎn)物；Lane3為雙交換突變株染色體的PCR 產(chǎn)物；Lane4為出發(fā)菌株染色體的PCR產(chǎn)物。
圖5是阻斷質(zhì)粒pLY26的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。其中Lanel為以pLY26為模板的PCR 產(chǎn)物，Lane2為以東方擬無(wú)枝酸菌染色體為模板的PCR產(chǎn)物；Lane3為lkb DNA Ladder。
圖6是PCR驗(yàn)證敲除vcml4雙交換突變株染色體鑒定結(jié)果。其中Lanel為lkb DNA Ladder, Lane2為以pLY26為模板的PCR產(chǎn)物；Lane3為雙交換突變菌染色體為模板的 PCR產(chǎn)物；Lane4為出發(fā)菌株?yáng)|方擬無(wú)枝酸菌染色體為模板的PCR產(chǎn)物。
圖7是PCR驗(yàn)證敲除vcml3雙交換突變株染色體鑒定結(jié)果。其中Lanel為東方擬無(wú) 枝酸菌染色體為模板的PCR產(chǎn)物，lane2為單交換突變株染色體為模板的PCR產(chǎn)物，Lane3、 4為雙交換突變株染色體為模板的PCR產(chǎn)物，lane5為lkbDNA Ladder, Lane6為pLY27 為模板的PCR產(chǎn)物，lane7為單交換突變株染色體為模板的PCR產(chǎn)物，Lane8為水為模 板的PCR產(chǎn)物。圖8是PCR驗(yàn)證敲除vcml3雙交換突變株染色體鑒定結(jié)果。其中Lanel為東方擬無(wú) 枝酸菌染色體為模板的PCR產(chǎn)物，lane2為可lkbDNA Ladder, Lane3為雙交換突變株染色 體為模板的PCR產(chǎn)物，Lane4為單交換突變株染色體為模板的PCR產(chǎn)物。
圖9是HPLC檢測(cè)圖譜，從上到下依次為萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品、vcm4基因阻斷突變株和 出發(fā)菌株。
圖10是精制的發(fā)酵產(chǎn)物ECO-0501的HPLC圖譜。 圖11是發(fā)酵產(chǎn)物ECO-0501的MS圖譜。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人的《分 子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條 件，或參考Kieser等人 《Practical Streptomyces Genetics》(Norwich, United Kingdom: The John Innes Foundation，2000),或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明使用的菌株和質(zhì)粒分別為
質(zhì)粒pIJ773，具有pBluescript KS(+)，朋c③化orif(RK2) ， FRT; 質(zhì)粒pIJ790，具有orj7 7W, rep力7。/(ts), ara5p-ga歷-力e-質(zhì)粒pUZ8002，具有/m,weo,cos;
菌株￡.co// BW25113，具有K12 derivativeA Z\Wja&4￡>， 菌株j&co//ET12567， 具有dflw,c/cw,/w必caW ， 以上質(zhì)粒和菌株均來(lái)自Prof. Keith Chater from John Innes Center, UK;
質(zhì)粒pKC1139，具有安普霉素(Apra)抗性基因，為鏈霉菌穿梭載體； cos311為東方擬無(wú)枝酸菌庫(kù)質(zhì)粒，含有萬(wàn)古霉素合成基因簇； 以上兩質(zhì)粒來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所；
本發(fā)明中￡.co/z'BW25113/pIJ790/cos311構(gòu)建如下
將￡.co//BW25113/pIJ790接種于10mlLB培養(yǎng)基(含氯霉素25嗎/ml) 30。C過(guò)夜培養(yǎng)。 取100pl過(guò)夜培養(yǎng)物至10mlSOB(含20mM MgS04 ，氯霉素25ng/ml)培養(yǎng)基，30。C，220rpm搖床培養(yǎng)3-4h至OD6oo約為0.4。將培養(yǎng)物倒入預(yù)冷的30ml離心管中，冰上置10min (從 此細(xì)胞溫度要保持在0 4'C)。 4000rpm、 4'C離心5min。棄掉上清，加lml預(yù)冷的10%甘 油，在冰上打散沉淀，再加9mll0。/。甘油，搖勻。4000rpm4。C離心5min，棄掉上清，重 復(fù)上面操作；100nl 10%甘油打散沉淀菌體制成感受態(tài)細(xì)胞。在預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯 中混合50nl感受態(tài)細(xì)胞與cos311，混勻后立即電擊，電擊條件200Q， 25pF， 2.5kv，電 擊時(shí)間為4.5~4.9ms 。立即加1 ml預(yù)冷的LB ， 30 °C培養(yǎng)40min。將其涂布于LB平板(100pg/ml 氨芐青霉素，50pg/ml卡那霉素，25呢/ml氯霉素)，37。C培養(yǎng)16h。從抗性LB平板上挑 出單菌落，即為含cos311的Eco"BW25113/pIJ7卯。
本發(fā)明使用到的培養(yǎng)基及配方為
LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨IO，酵母抽提物IO， NaC15，pH7.4; LB固體培養(yǎng)基另 加入瓊脂粉20;
MS平板(g/L):黃豆粉20,甘露糖20，瓊脂粉20;
YMB液體培養(yǎng)基(g/L):酵母抽提物4，葡萄糖4，麥芽抽提物10，微量元素溶液2ml， pH7.2;
其中微量元素溶液(mg/L) : ZnCl2 40， FeCl3.6H20 200， CuCk.2H20 10， MnCl2.4H20
10， N02B407. 10H2O 10 ， (NH4)6M07024.4H20 10;
高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉20, NaCl 0.5, K2HP04 3H20 0.5, KN03 1.0, MgS04 7H20 0.5, FeS04 7H20 0.01,瓊脂20， pH 7.2-7.4; 2XYT培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨16，酵母抽提物IO, NaC15。
本發(fā)明使用酶購(gòu)自TaKaRa公司；胰蛋白胨，酵母抽提物購(gòu)自O(shè)xoid公司； 其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分裝。
本發(fā)明的基因同源重組原理，是通過(guò)PCR方法分別擴(kuò)增兩個(gè)同源片段，每個(gè)片段的大 小應(yīng)基本相符并大于500bp，在兩個(gè)同源片段連入含有Apra抗性基因的大腸桿菌及鏈霉菌 穿梭載體pKC1139等，構(gòu)建基因阻斷載體；然后將構(gòu)建的基因阻斷載體，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移， 導(dǎo)入東方擬無(wú)枝酸菌中，獲得接合轉(zhuǎn)移子，根據(jù)載體上的Apra抗性基因進(jìn)行篩選，獲得 阻斷載體與宿主菌染色體基因整合的單交換的突變菌株。利用PCR的方法，驗(yàn)證阻斷載體 的整合。單交換突變株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，篩選發(fā)生第二次單交換的基因阻斷菌株。
7本發(fā)明的PCR-Targeting的方法，是指利用人RED (gam》W，e;co)重組酶可以顯著提高 線形DNA的重組頻率的特性，使用帶抗性標(biāo)記和接合轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)on丁 (RK2)的PCR 產(chǎn)物置換科斯質(zhì)粒上的目標(biāo)基因區(qū)域，并通過(guò)兩親本接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入東方擬無(wú)枝酸菌，由于 目標(biāo)基因兩端的同源序列一般長(zhǎng)于10kb，使得篩選周期明顯縮短并且篩選工作量降低。
實(shí)施例l、萬(wàn)古霉素合成酶基因的阻斷
萬(wàn)古霉素合成酶基因vcm2， vcm3和vcm4分別編碼非核糖體肽合成酶，即Vcpl， Vcp2 和Vcp3，這3個(gè)非核糖體肽合成酶共包含有7個(gè)模塊，24個(gè)結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)催化萬(wàn)古霉素七肽 骨架的生物合成；本實(shí)施例以阻斷萬(wàn)古霉素合成酶基因vcm4為例，通過(guò)阻斷萬(wàn)古霉素七肽 骨架的合成來(lái)阻斷萬(wàn)古霉素的合成。
本實(shí)施例利用基因同源重組原理，構(gòu)建基因阻斷載體pKOA;然后將構(gòu)建的基因阻斷 載體，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移，導(dǎo)入東方擬無(wú)枝酸菌中，獲得接合轉(zhuǎn)移子，根據(jù)載體上的Apra抗 性基因進(jìn)行篩選，獲得單交換突變株。對(duì)單交換突變株進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)，篩選獲得缺 失突變菌株，本實(shí)施例中，vcm4的阻斷是通過(guò)基因內(nèi)部DNA片段(26788-27183)缺失完 成，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下
1.1、 引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?00710036861.5的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利中的東方擬無(wú)枝酸菌萬(wàn)古霉素非核糖 體多肽合成酶的基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物
vcpus: 5 ， -GGGAAGCTTTGGACGGTTTCAACGCGACC-3 ，， vcpuas: 5，-GCCGGTGGATCCCGAGGTGTAC-3，; 兩端分別引入歷"dn， 5"mHI酶切位點(diǎn)(下劃線部分) vcpds: 5，-GGGGGATCCACCGAGACCACCCTGTGC-3，， vcpdas: 5，-GGGGAATTCCGCCGCCGGATCTCCTCC-3，; 兩端分別引入SamHI， &0111酶切位點(diǎn)(下劃線部分)
1.2、 上、下游同源臂的PCR擴(kuò)增
以東方擬無(wú)枝酸菌ATCC 43491 DNA (提取方法參考Kieser等人《Practical Streptomyces Genetics》)為模板，以vcpus， vcpuas為引物擴(kuò)增上游同源臂，將擴(kuò)增片段 命名為vcpu;以vcpds， vcpdas為引物擴(kuò)增下游同源臂，將擴(kuò)增片段命名為vcpd，兩片段 長(zhǎng)度均為約500bp。其中，PCR反應(yīng)體系為0.5pmol/L每條引物，1 X Buffer, 50nmol/L dNTPs， 5% DMSO， 2.5UExTaq聚合酶，Mg2+1.5mmol/L。
PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2min; 94。C變性45s， 55。C退火50s， 72。C延伸30s， 30個(gè)循環(huán)；72'C延伸5min。
取上述PCR產(chǎn)物，使用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司的純化試劑盒，參考使用手冊(cè) 進(jìn)行純化，純化后獲得PCR產(chǎn)物均約500bp，濃度為75ng/叱。
1.3、 構(gòu)建pKOA阻斷載體
如圖l的流程圖所示，構(gòu)建pKOA阻斷載體，具體步驟如下
取上述步驟1.2獲得的純化PCR產(chǎn)物vcpu，用歷mffllASawHI酶切得約500bp片段， vcpd用萬(wàn)awffl/i:coRI酶切得約500bp片段；先將vcpu克隆進(jìn)鏈霉菌穿梭載體pKC1139 的77/"^n、 BawHI位點(diǎn)，然后將vcpd克隆進(jìn)pKC1139的5awHI、五coRI位點(diǎn)，構(gòu)建得到 pKOA阻斷載體。
將pKOA阻斷載體用歷mffll、 5flwHI或五coRI酶切并電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示， Lanel 3分別切出lkb、 500bp、 500bp的條帶，證明vcpd、 vupu成功克隆進(jìn)pKC1139， 構(gòu)建成pKOA阻斷載體。
1.4、 vcm4基因阻斷突變株的篩選和獲得
將pKOA阻斷載體電轉(zhuǎn)到含有輔助質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，以載體上 的Apra抗性為篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選(具體的過(guò)程同實(shí)施例2.5 )，得到 ET12567/pUZ8002/pKOA。
將含阻斷載體pKOA的大腸桿菌ET12567/pUZ8002接入3ml的LB培養(yǎng)基(含25pg/ml 氯霉素，50ng/ml安普霉素，50 pg/ml卡那霉素)37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取一部分過(guò)夜培 養(yǎng)物至10ml新鮮的LB培養(yǎng)基(含25pg/ml氯霉素，50pg/ml安普霉素，50 pg/ml卡那 霉素)中，菌體終濃度為1%， 37°C， 220rpm搖床培養(yǎng)3-4h至OD,約為0.4。將培養(yǎng)物 倒入的30ml離心管中，4000rpm 4'C離心5min，棄掉上清，力卩l(xiāng)mlLB打散沉淀，再加 9mlLB，搖勻。4000rpm4。C離心10min，棄掉上清，重復(fù)上面操作，lmlLB打散沉淀。
將10pl東方擬無(wú)枝酸菌ATCC 43491單孢子懸液(>108)加入500nl 2X YT培養(yǎng)基， 50。C熱激10min。冷卻后與500|xl ￡co" ET12567/pUZ8002/pKOA混合，吸取100nl涂布于 MS(10mmol/LMgCl2)培養(yǎng)基，30。C培養(yǎng)16-20小時(shí)左右，用lml無(wú)菌水(含0.5mg萘啶酮 酸和1.25mg安普霉素)覆蓋平板，3(TC培養(yǎng)5天得到接合轉(zhuǎn)移子。挑選接合轉(zhuǎn)移子到MS平板上(含50 pg/ml安普霉素和25 pg/ml萘啶酮酸)，驗(yàn)證pKOA是否已整合到東方擬無(wú) 枝酸菌的染色體上，即篩選單交換突變株。將抗性的單菌落挑入YMB液體培養(yǎng)基中連續(xù) 傳代3次；稀釋涂布于MS培養(yǎng)基，3(TC培養(yǎng)5天。挑取單菌落影印培養(yǎng)-
用無(wú)菌牙簽挑取單菌落分別接種于MS平板和含50pg/ml安普霉素的MS平板，30°C 培養(yǎng)5天；挑出在Apra抗性MS平板上不生長(zhǎng)，而在MS平板上生長(zhǎng)的菌落，置于YMB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，提取染色體。
以vcpus、 vcpdas為鑒定引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，
PCR反應(yīng)體系為0.5|amol/L每條引物，1 XBuffer (TAKARA公司)，50pmol/LdNTPs， 5%DMSO， 2.5UExTaq聚合酶，Mg2+1.5mmol/L。
PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2min; 94。C變性45s， 55。C退火50s， 72 。C延伸1.5min， 30個(gè)循環(huán)；72 。C延伸5min。
PCR電泳結(jié)果如圖4所示，
由圖4的結(jié)果可知以出發(fā)菌株染色體為模板時(shí)，可擴(kuò)增到lkb的片段；以單交換突 變株染色體為模板時(shí)，可擴(kuò)增出1.5kb的片段和lkb片段；以雙交換阻斷突變株染色體為
模板時(shí)，可擴(kuò)增出L5kb的片段。
說(shuō)明東方擬無(wú)枝酸菌分別發(fā)生兩次單交換，第一次單交換使阻斷載體整合東方擬無(wú)枝
酸菌基因組；在第一次單交換的基礎(chǔ)上，發(fā)生的第二次單交換使東方擬無(wú)枝酸菌基因組發(fā) 生缺失突變。(第二次單交換獲得菌株大多數(shù)是回復(fù)突變，PCR驗(yàn)證結(jié)果同出發(fā)菌株)
1.5、 vcm4基因阻斷突變菌株的發(fā)酵驗(yàn)證
東方擬無(wú)枝酸菌ATCC 43491及實(shí)施例1.4所得突變菌株先經(jīng)過(guò)自然分離純化，得到 單一菌落。挑取單菌落涂布于高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)5天，在無(wú)菌條件下，從 新鮮的斜面中用無(wú)菌接種鏟刮取一定量的孢子，接入種子培養(yǎng)基中，置于220rpm旋轉(zhuǎn)搖 床上振蕩培養(yǎng)40 48h，培養(yǎng)溫度28'C。在無(wú)菌條件下，將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵搖瓶 中，接種量8%，置于220rpm旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩培養(yǎng)115 120h，培養(yǎng)溫度28。C。取發(fā)酵液 10mL，置于30mL離心管，12000rpm離心10min。取上清HPLC檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。
流動(dòng)相配制用0.2%的三乙胺溶液，磷酸調(diào)pH至3.2作為緩沖液。緩沖液與乙睛和
四氫呋喃按92 : 7 : l的比例混合，搖勻，作為A液；緩沖液與乙睛和四氫呋喃按70 : 29 :
l的比例混合，搖勻，作為B液，超聲波脫氣20min，備用。A液和B液的比例見(jiàn)表1。 色譜條件色譜柱DiamonsilTMC18， ODS， ID4.6承200mm
10柱溫40°C
檢測(cè)器DAD (HP1100)檢測(cè)器
檢測(cè)波長(zhǎng)240nm 流速lml/min 進(jìn)樣量5pl
洗脫方法梯度洗脫。
表l
洗脫時(shí)間(min)01322262735
A(%)10010000100100
B(%)00100訓(xùn)00
由圖9可見(jiàn)，萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品樣在8min左右開(kāi)始出峰，出發(fā)菌株發(fā)酵液上清在8min 左右開(kāi)始出峰，突變菌株在8min左右則未出峰，說(shuō)明基因阻斷株均不再產(chǎn)生萬(wàn)古霉素。
1.6、發(fā)酵產(chǎn)物ECO-0501的分離及精制
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法發(fā)酵(Banskota AH， McAlpine JB， S0rensen D， Ibrahim A， Aouidate M, Piraee M, Alarco AM, Farnet C, Zazopoulos E (2006b) Genomic analyses lead to novel secondary metabolites. Part 3. ECO-0501, a novel antibacterial of a new class. J Antibiot (Tokyo) 59:533-542)。發(fā)酵液4L，離心，傾去上清，沉淀加300ml乙醇浸提3h，兩次，過(guò)濾，上 清蒸餾至干，乙醇水溶液溶解。100mlJD-l吸附，梯度洗脫乙醇-水溶液分別為1:9， 1:4, 3:7， 2:3， 3:2， 8:1。收集2:3及3:2洗脫液濃縮，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10。
(1) 液相分析條件
色譜柱規(guī)格KromasilC18(4.6mmX250mm)， 5pim;流動(dòng)相0.01M NH4八c(醋酸調(diào) pH5.0):乙腈=62 : 38;檢測(cè)波長(zhǎng)入二360nm;流速lml/min;柱溫30。C。
(2) 液相制備條件
Kromasil Cl8 (4.6mmX250mm);流動(dòng)相0.01M NH4Ac (醋酸調(diào)pH4.6):乙腈=62 : 38;檢測(cè)波長(zhǎng)？^360nm;流速4ml/min;柱溫30°C。
進(jìn)一步將該發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果如圖ll所示，可知該物質(zhì)分子量為836，和 文獻(xiàn)報(bào)道ECO-0501分子量一致，該發(fā)酵產(chǎn)物即為化合物ECO-0501 。
根據(jù)圖譜計(jì)算產(chǎn)峰面積，可知出發(fā)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)峰面積為2773，而突變菌株產(chǎn) 峰面積為5613，產(chǎn)量大為提高，約為出發(fā)菌株的兩倍。由此可見(jiàn)，將萬(wàn)古霉素合成酶基因阻斷，可以阻斷萬(wàn)古霉素的合成，卻大大提高化合 物ECO-0501的產(chǎn)量。
當(dāng)然，針對(duì)其他萬(wàn)古霉素合成酶基因vcm2， vcm3等設(shè)計(jì)引物，通過(guò)基因同源重組 的方法構(gòu)建阻斷載體，獲得突變菌株，發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501對(duì)于本領(lǐng)域的工作人員來(lái)說(shuō)是 顯而易見(jiàn)的，因此這也屬于本發(fā)明所要保護(hù)的內(nèi)容。
實(shí)施例2、催化P—羥基酪氨酸合成的萬(wàn)古霉素前體合成酶基因的敲除 萬(wàn)古霉素前體合成酶基因共有16個(gè)，其中vcml4， vcml5和vcml6分別編碼水解酶，
肽合成酶VCP4， P450氧化酶，這3個(gè)酶負(fù)責(zé)催化p—羥基酪氨酸的合成；本實(shí)施例以將
萬(wàn)古霉素前體合成酶基因vcml4敲除為例，阻斷萬(wàn)古霉素的合成。
本實(shí)施例按照?qǐng)D2所示PCR-targeting的原理，體外將Apra『基因盒替換待敲除的
vcml4基因，構(gòu)建基因阻斷載體pLY26，具體步驟如下
2.1、 引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)東方擬無(wú)枝酸菌ATCC 43491的基因序列設(shè)計(jì)引物對(duì)Dvl4sense和Dvl4anti: Dv14sense: GCGCCGTGGCTGTGCGGTGAGCGGGGAAGGACCATCATGATTCCGGGGATCCGTCGACC; Dv14anti: CGAACAGGGCCGGTGTCGTGGCCGCCGAAAAAACGGTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC 。
2.2、 PCR擴(kuò)增
以&oRI////"^n酶切質(zhì)粒pIJ773，獲得L5kb含Apra抗性基因盒片段，以該片段作 為模板，Dvl4sense和Dvl4anti為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系為0.5pmol/L每條引物，IXBuffer, 50nmoI/LdNTPs， 5%DMSO， 2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1.5mmol/L。
PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2min; 94。C變性45s， 50。C退火45s, 72 。C延伸90s, IO個(gè)循環(huán)；94。C變性45， 55。C退火45s， 72 。C延伸90s， 15個(gè)循環(huán)；72 。C延伸5min。
取上述PCR產(chǎn)物，然后參考使用手冊(cè)，使用杭州維特潔生化技術(shù)有限公司的純化試 劑盒，純化后獲得PCR產(chǎn)物為1.5kb，濃度為95ng/pl。
2.3、 構(gòu)建阻斷質(zhì)粒pLY26
將實(shí)施例2.2所得含安普霉素抗性基因盒的PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入 BW25113/pIJ7卯/cos311。以載體上的安普霉素抗性為篩選標(biāo)記，篩選出已替換目標(biāo)序列的 單菌落，從中提取阻斷載體命名為pLY26，具體步驟如下將含cos311的五.co/!' BW25113/pIJ790接入3ml SOB-MgS04培養(yǎng)基(含25嗎/ml氯霉 素，100 ng/ml氨芐青霉素，50pg/ml卡那霉素)中，3CTC搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取一部分過(guò)夜 培養(yǎng)物至10ml新鮮的SOB-MgS04培養(yǎng)基(含25嗎/ml氯霉素，100嗎/ml氨芐青霉素， 50嗎/ml卡那霉素，含20mMMgSO4)中，菌體終濃度為1% ，添加100^1 1M L-阿拉伯 糖誘導(dǎo)Vred重組系統(tǒng)。3CTC， 220rpm搖床培養(yǎng)3-4h至OD6oo約為0.4。將培養(yǎng)物倒入 預(yù)冷的30ml離心管中，冰上置10min (從此細(xì)胞溫度要保持在0~4°C )。 4000rpm、 4'C離 心5min。棄掉上清，力n lml預(yù)冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油，搖 勻。4000rpm 4。C離心5min，棄掉上清，重復(fù)上面操作；100^1 10%甘油打散沉淀菌體制 成感受態(tài)細(xì)胞。在預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中混合50pl感受態(tài)細(xì)胞與l-2pl純化的PCR 產(chǎn)物，混勻后立即電擊，電擊條件200Q， 25pF， 2.5kv，電擊時(shí)間為4.5~4.9ms。立即加 lml預(yù)冷的LB， 37'C培養(yǎng)40min。將其涂布于LB平板(100叱/ml氨芐青霉素，50嗎/ml 卡那霉素，5(Hig/ml安普霉素)，37'C培養(yǎng)16h。從抗性LB平板上挑出單菌落，抽提質(zhì)粒， 鑒定正確的質(zhì)粒命名為pLY26，其中安普霉素抗性基因盒置換序列在cos311中的位置是 43438-44262。
2.4、 阻斷質(zhì)粒pLY26的鑒定
在安普霉素抗性基因盒插入失活位置上下游約50bp處，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Indvl4a和 Indvl4at，以鑒定質(zhì)粒？!^26-
Indvl4a: ATCGCACGTTCCACATCAGA; Indvl4at: TCCAGGTAGCCGAAATGCCC。
PCR反應(yīng)體系為0.5pmol/L每條引物，lXBuffer， 50pmol/LdNTPs， 5%DMSO， 2.5U Ex Taq聚合酶，Mg2+1.5mmol/L。
PCR反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性2min， 95。C變性45s， 55。C退火50s， 72。C延伸90s， 30個(gè)循環(huán)，72。C延伸5min。
PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖5所示。
由圖5的結(jié)果可知，以東方擬無(wú)枝酸菌染色體為模板，可擴(kuò)增到lkb的片段；以阻斷 載體pLY26為模板時(shí)，可擴(kuò)增出1.5kb的片段，說(shuō)明安普霉素抗性基因盒已替換目標(biāo)基因 vcml4。
2.5、 電轉(zhuǎn)化阻斷質(zhì)粒pLY26
將構(gòu)建好的阻斷載體pLY26電轉(zhuǎn)到含有輔助質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567/pUZ8002中，
13以載體上的Apra抗性為篩選標(biāo)記，從篩選到的Apmr轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，驗(yàn)證其分子量大 小，具體步驟如下
將大腸桿菌ET12567/pUZ8002接入3ml LB培養(yǎng)基(含25嗎/ml氯霉素50嗎/ml卡 那霉素)中，37'C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。取一部分過(guò)夜培養(yǎng)物至10ml新鮮的SOB-MgS04培養(yǎng) 基(含25嗎/ml氯霉素，50pg/ml卡那霉素)中，菌液終濃度為1% ， 37°C， 220rpm搖 床培養(yǎng)3-4h至OD60()約為0.4。將培養(yǎng)物倒入預(yù)冷的30ml離心管中，冰上置10min(從此 細(xì)胞溫度要保持在0~4°C)。 4000rpm 4。C離心5min， 棄掉上清，力tl lml預(yù)冷的10%甘 油，在冰上打散沉淀，再加9mll0。/。甘油，搖勻。4000rpm4。C離心5min，棄掉上清，重 復(fù)上面操作；100^110%甘油打散沉淀菌體。在預(yù)冷的0.2cm的電轉(zhuǎn)化杯中混合5(^1感受 態(tài)細(xì)胞與1-2^1阻斷載體pLY26，混勻后立即電擊，電擊條件200Q， 25pF， 2.5kv，電 擊時(shí)間為4.5~4.9ms。立即加lml預(yù)冷的LB， 37'C誘導(dǎo)培養(yǎng)40min。將其涂布于LB平板 (25pg/ml氯霉素，50 pg/ml卡那霉素，50嗎/ml安普霉素)，37'C培養(yǎng)16h。從抗性LB 平板上挑出單菌落，命名為ET12567/pUZ8002/pLY26。
2.6、含重組載體的大腸桿菌ET12567/pUZ8002/pLY26與東方擬無(wú)枝酸菌成熟孢子接 合轉(zhuǎn)移。
按實(shí)施例1.4所述的方法，將ET12567/pUZ8002/pLY26與東方擬無(wú)枝酸菌成熟孢子接 合轉(zhuǎn)移。
PCR鑒定挑出菌株是雙交換菌株還是單交換菌株，PCR鑒定的引物、體系和條件同 實(shí)施例2.4。 PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖6所示，
由圖6的結(jié)果可知，以pLY26為模板，可擴(kuò)增到1.5kb的片段；以雙交換突變株染色 體為模板，可擴(kuò)增到1.5kb的片段；以出發(fā)菌株染色體為模板時(shí)，可擴(kuò)增出lkb的片段。 說(shuō)明阻斷載體pLY26及雙交換突變株vcml4基因均被安普霉素抗性基因盒所替換。
將突變菌株按照實(shí)施例1.5、 1.6所述的方法進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)同樣的不再產(chǎn)生萬(wàn)古 霉素，其發(fā)酵后的產(chǎn)物ECO-0501產(chǎn)峰面積為5328，約為出發(fā)菌株的1.9倍。
由此可見(jiàn)，將催化(3 —羥基酪氨酸的合成的萬(wàn)古霉素前體合成酶基因敲除，同樣可以 阻斷萬(wàn)古霉素的合成，卻大大提高化合物ECO-0501的產(chǎn)量。
當(dāng)然，針對(duì)其他萬(wàn)古霉素合成酶基因vcml5， vcml6等設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR-Targeting 的方法構(gòu)建敲除載體，獲得突變菌株，發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501對(duì)于本領(lǐng)域的工作人員來(lái)說(shuō)是 顯而易見(jiàn)的，因此這也屬于本發(fā)明所要保護(hù)的內(nèi)容。
14實(shí)施例3、催化羥基苯甘氨酸合成的萬(wàn)古霉素前體合成酶基因的敲除
萬(wàn)古霉素前體合成酶基因共有16個(gè)，其中vcml， vcml7， vcml8和vcml3分別編碼預(yù) 苯酸脫氫酶(prephenate dehydrogenase),羥基扁桃酸合成酶Hmas，羥基扁桃酸氧化酶Hmo 和羥基苯甘氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶HpgT，這5個(gè)酶負(fù)責(zé)催化羥基苯甘氨酸(HPG，萬(wàn)古霉素七肽 骨架中一個(gè)非天然來(lái)源的氨基酸)的合成；本實(shí)施例以將萬(wàn)古霉素前體合成酶基因vcm13 敲除為例，阻斷萬(wàn)古霉素的合成。
同實(shí)施例2所述的PCR-Targeting的方法，構(gòu)建基因阻斷載體pLY27，敲除vcml3基因， 其中安普霉素抗性基因盒置換序列在cos311中的位置是42432-42753。
其中，用于擴(kuò)增的弓I物為Dvcml3sense和Dvcml3anti:
Dvcml3sense: TGCGGGCGAACGAGCGGGACGTGCTGCTCGCCCCGGCGCATTCCGGGGATCCGTCGACC;
Dvcml3anti: GGTCTACATCGGATCCTTCGCCAAGACCGGCATGCCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。
用于鑒定的引物為Idl3sense和Idl3anti:
朗sense: GTACAGGCCACCGCCCGC;
Idl3anti: TCGGTGGTCGTCACCGTCG。
PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖7所示。
如圖7所示，以出發(fā)菌株染色體為模板可擴(kuò)增獲得500bp的片斷，以單交換突變菌染色 體為模板可擴(kuò)增獲得1.5kb和500bp兩條片斷，而以pLY27為模板時(shí)，也可擴(kuò)增獲得1.5kb和 500bp兩條片斷(有時(shí)只能擴(kuò)增獲得1.5kb條帶，如pLY26電泳圖譜)；以雙交換突變株染色 體為模板可擴(kuò)增獲得1.5kb的片斷，而陰性對(duì)照未擴(kuò)增獲得片斷。
說(shuō)明在pLY27中，安普霉素抗性基因盒片段己替換相應(yīng)序列；單交換突變株中，科斯 載體與東方擬無(wú)枝酸染色體發(fā)生整合；雙交換突變株中，安普霉素抗性基因盒片段已替換 相應(yīng)序列，vcml3被阻斷。
將突變菌株按照實(shí)施例1.5、 1.6所述的方法進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)同樣的不再產(chǎn)生萬(wàn)古 霉素，其發(fā)酵后的產(chǎn)物ECO-0501產(chǎn)峰面積為5513，約為出發(fā)菌株的兩倍。
由此可見(jiàn)，將催化羥基苯甘氨酸合成的萬(wàn)古霉素前體合成酶基因敲除，同樣可以阻斷 萬(wàn)古霉素的合成，卻大大提高化合物ECO-0501的產(chǎn)量。
當(dāng)然，針對(duì)其他萬(wàn)古霉素合成酶基因vcml， vcml7， vcml8等設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR-Targeting的方法構(gòu)建敲除載體，獲得突變菌株，對(duì)于本領(lǐng)域的工作人員來(lái)說(shuō)是顯而 易見(jiàn)的，因此這也屬于本發(fā)明所要保護(hù)的內(nèi)容。實(shí)施例4、催化二羥基苯甘氨酸的萬(wàn)古霉素前體合成酶基因的敲除
萬(wàn)古霉素前體合成酶基因共有16個(gè)，其中vcm23， vcm24， vcm25和vcm26分別編 碼二羥基苯乙酸合成酶，烯酰CoA水解酶，羥?；摎涿负拖oA水解酶，這4個(gè)酶 負(fù)責(zé)催化二羥基苯甘氨酸(DHPG，萬(wàn)古霉素七肽骨架中另一個(gè)非天然來(lái)源的氨基酸)的 合成；本實(shí)施例以將萬(wàn)古霉素前體合成酶基因vcm23敲除為例，阻斷萬(wàn)古霉素的合成。
同實(shí)施例2所述的PCR-Targeting的方法，構(gòu)建基因阻斷載體pLY28，敲除vcm23基因， 其中安普霉素抗性基因盒置換序列在cos311中的位置是55082-55803。
其中，用于擴(kuò)增的弓I物為Dvcm23sense和Dvcm23anti: dvcm23sense:TCACGCTCGCCGAGGCGGAACGACAGGGACTGCTGCCGGATTCCGGGGATCCGTCGACC;
dcm23ant i:GACCACCGCGGTCCGCATCGTGCCGTCCAGCGCGTAGGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC。
用于鑒定的引物為Id23sense和Id23anti:
Idvcm23sense:CCCGGGAACGAACTCGCCC;
Idcm23ant i:TGATGATGTAGCTGGCGAAT 。
PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖8所示。
如圖8所示，以出發(fā)菌株染色體為模板可擴(kuò)增獲得lkb的片斷，以單交換突變菌染色體 可擴(kuò)增獲得1.6kb和lkb兩條片斷，以雙交換突變株染色體為模板可擴(kuò)增獲得1.6kb的片斷.
說(shuō)明單交換突變株中，科斯載體與東方擬無(wú)枝酸染色體發(fā)生整合；雙交換突變株中， 安普霉素抗性基因盒片段已替換相應(yīng)序列，vcm23被阻斷。
將突變菌株按照實(shí)施例1.5、 1.6所述的方法進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)同樣的不再產(chǎn)生萬(wàn)古 霉素，其發(fā)酵后的產(chǎn)物ECO-0501產(chǎn)峰面積為5480，約為出發(fā)菌株的2.1倍。
由此可見(jiàn)，將催化羥基苯甘氨酸合成的萬(wàn)古霉素前體合成酶基因敲除，可以阻斷萬(wàn)古 霉素的合成，卻大大提高化合物ECO-0501的產(chǎn)量。
當(dāng)然，針對(duì)其他萬(wàn)古霉素合成酶基因vcm24， vcm25， vcm26等設(shè)計(jì)引物，通過(guò) PCR-Targeting的方法構(gòu)建敲除載體，獲得突變菌株，發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501對(duì)于本領(lǐng)域的工 作人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，因此這也屬于本發(fā)明所要保護(hù)的內(nèi)容。
綜上所述，本發(fā)明將萬(wàn)古霉素合成酶基因及其催化卩一羥基酪氨酸合成、催化羥基苯 甘氨酸合成、催化二羥基苯甘氨酸合成的萬(wàn)古霉素前體合成酶基因阻斷和敲除，能使東方 擬無(wú)枝酸菌喪失產(chǎn)生萬(wàn)古霉素的能力，但能提高對(duì)這類(lèi)多烯聚酮抗菌活性產(chǎn)量，在提高 ECO-0501產(chǎn)量的同時(shí)，阻斷了萬(wàn)古霉素的合成，因而簡(jiǎn)化下游的分離步驟。
權(quán)利要求
1、一種提高東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)發(fā)酵生產(chǎn)ECO-0501的產(chǎn)量的方法，其特征在于，該方法通過(guò)阻斷東方擬無(wú)枝酸菌合成萬(wàn)古霉素來(lái)實(shí)現(xiàn)。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻斷萬(wàn)古霉素的合成包括阻斷或敲 除萬(wàn)古霉素合成酶基因或萬(wàn)古霉素前體合成酶基因。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述萬(wàn)古霉素合成酶基因包括合成萬(wàn)古 霉素七肽骨架的基因vcm2, vcm3， vcm4。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述萬(wàn)古霉素合成酶基因?yàn)関cm4。
5、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述萬(wàn)古霉素前體合成酶基因包括A、 4個(gè)負(fù)責(zé)催化羥基苯甘氨酸的合成的酶的基因vcml， vcml7， vcml8和vcml3;B、 4個(gè)負(fù)責(zé)催化二羥基苯甘氨酸的合成的酶基因vcm23, vcm24， vcm25和vcm26;C、 3個(gè)負(fù)責(zé)催化(3—羥基酪氨酸的合成的酶的基因vcml4， vcml5和vcml6。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化羥基苯甘氨酸的合成的酶的基 因?yàn)関cml3。
7、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化二羥基苯甘氨酸的合成的酶基 因?yàn)関cm23 。
8、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化(3 —羥基酪氨酸的合成的酶的 基因?yàn)関cml4。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高東方擬無(wú)枝酸菌發(fā)酵ECO-0501的產(chǎn)量的方法，該方法是通過(guò)阻斷東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)合成萬(wàn)古霉素來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述阻斷萬(wàn)古霉素合成包括阻斷或敲除萬(wàn)古霉素合成酶基因或萬(wàn)古霉素前體合成酶基因。本發(fā)明的提高東方擬無(wú)枝酸菌發(fā)酵生產(chǎn)化合物ECO-0501的方法，在提高ECO-0501產(chǎn)量的同時(shí)，阻斷了萬(wàn)古霉素的合成，因而對(duì)于下游的分離步驟也非常有利。
文檔編號(hào)C12P19/44GK101545000SQ20081003530
公開(kāi)日2009年9月30日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者姜衛(wèi)紅, 梅 戈, 麗 朱, 晟 楊, 羅敏玉, 酈偉翔, 阮林高, 陳代杰, 維 魏, 鶴 黃 申請(qǐng)人:上海來(lái)益生物藥物研究開(kāi)發(fā)中心有限責(zé)任公司;中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院研究院