專(zhuān)利名稱(chēng)：一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子sptl5-10 及其編碼基因與應(yīng)用。
技術(shù)背景木質(zhì)纖維素是世界上最為豐富的生物質(zhì)資源，量最大、價(jià)最廉，每年的總產(chǎn)量約占 所有生物質(zhì)資源的50%，目前大多數(shù)此類(lèi)的物質(zhì)沒(méi)有得到很好的利用。利用木質(zhì)纖維素 為主的可再生生物質(zhì)資源，生產(chǎn)可再生能源具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)意義。以生物質(zhì)為原 料制取的工業(yè)乙醇，作為一種清潔的可再生能源，是替代石油等化石燃料的必然趨勢(shì)。 傳統(tǒng)的生物乙醇生產(chǎn)主要以糧食發(fā)酵為主，世界糧食緊缺現(xiàn)象嚴(yán)重限制了原料來(lái)源，原 料成本居高不下，低成本的新原料路線(xiàn)是降低生物乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。在傳統(tǒng)的生物 乙醇生產(chǎn)中，以葡萄糖為主的六碳糖易于被微生物發(fā)酵生成乙醇，然而占總糖量約40% 的木糖卻不易于被其利用。充分利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇， 能使乙醇的產(chǎn)量在原有基礎(chǔ)上增加25%。木糖的有效利用是提高乙醇經(jīng)濟(jì)指標(biāo)的重要內(nèi) 容，是生物質(zhì)資源成功工業(yè)化轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。釀酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物，細(xì)胞壁厚、固醇含量高，對(duì)乙醇及木質(zhì)纖 維素水解物中毒性因子的耐受性較高；能在低pH、嚴(yán)格厭氧條件下快速發(fā)酵葡萄糖生 產(chǎn)乙醇，副產(chǎn)物少；不易被細(xì)菌和病毒污染，且相關(guān)工業(yè)技術(shù)成熟， 一直是乙醇發(fā)酵的 研究重點(diǎn)和首選目標(biāo)微生物。但缺乏有效利用木糖的能力。以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙 醇，其關(guān)鍵之一就是產(chǎn)生乙醇的微生物能有效利用各種糖作為碳源。在國(guó)外，早在上世 紀(jì)八十年代初期，國(guó)際上許多實(shí)驗(yàn)室就已經(jīng)開(kāi)始從事其高效生產(chǎn)乙醇的研究。但是天然 的釀酒酵母菌只能非常緩慢的代謝木糖，卻不能有效發(fā)酵木糖。由于天然微生物的木糖 發(fā)酵性能難以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，所以人們利用傳統(tǒng)的菌種篩選方法通常經(jīng)過(guò)大量的 微生物培養(yǎng)、酶活測(cè)定及菌種馴化培養(yǎng)來(lái)選育所需菌種，由于工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)、效率 低，近年來(lái)已轉(zhuǎn)向利用代謝工程原理，通過(guò)分子遺傳改造相關(guān)代謝途徑來(lái)獲得能在厭氧 條件下高效代謝發(fā)酵葡萄糖、木糖及其他各種戊糖的工程菌。但以前的研究大部分沒(méi)有 得到十分理想的目標(biāo)表型。我們認(rèn)為這些單基因或幾個(gè)基因的改造，某種的基因缺失或 者擴(kuò)增，只是改變了細(xì)胞的局部元件，或是重新設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)了細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)代謝產(chǎn)物的平衡系 統(tǒng)，并沒(méi)有解決木糖代謝途徑中的復(fù)雜問(wèn)題。基因表達(dá)調(diào)控是也成為生物學(xué)目前應(yīng)用手段熱點(diǎn)。全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)控工程(globe transcriptional mechanism engineering, gTME)是用分子生物學(xué)方法，如易錯(cuò)PCR、 DNA改組等方法，建立通用轉(zhuǎn)錄因子的突變庫(kù)，針對(duì)目的產(chǎn)品或目標(biāo)表型，通過(guò)定向篩選， 獲得目的代謝流增強(qiáng)或特定表型增強(qiáng)的菌種，是按人們的設(shè)計(jì)獲得目標(biāo)表型的一種方 法。
釀酒酵母具有木糖代謝的完整途徑，但是卻不能有效的發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇。我們解決 這些問(wèn)題模擬微生物適應(yīng)外界環(huán)境的改變，在酵母菌木糖代謝途徑的基因組層面上定向 進(jìn)化或同時(shí)改變多個(gè)相關(guān)基因群，使細(xì)胞在整體水平上適應(yīng)木糖的代謝或利用，我們利 用gTME技術(shù)通過(guò)基因工程方法改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子使整個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程發(fā)生變化 從而改變或提高基因組的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。從而獲得了能夠高效利用木糖并能夠同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)木 糖和葡萄糖產(chǎn)乙醇的釀酒酵母。全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程(gTME)是一種基因轉(zhuǎn)錄重排來(lái)優(yōu)化細(xì)胞表型的主要技術(shù)。正 是通過(guò)基因工程方法改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SPT15，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建該因子突變 庫(kù)，實(shí)現(xiàn)多基因的同時(shí)改變來(lái)調(diào)節(jié)整個(gè)的代謝網(wǎng)絡(luò)?，F(xiàn)在應(yīng)用于提—高釀酒酵母的乙醇耐 受性和產(chǎn)量。基因表達(dá)過(guò)程是從DNA—mRNA—蛋白質(zhì)。基因表達(dá)調(diào)控可以發(fā)生在遺傳 信息傳遞過(guò)程的各個(gè)水平上。已證明轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中效率最高的一個(gè)環(huán) 節(jié)。轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶執(zhí)行的，在原核細(xì)胞中只有一種RNA聚合酶，在真核生物有三 種RNA聚合酶，其中RNA聚合酶II負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大部分功能基因(圖l)的mRNA， RNA 聚合酶II轉(zhuǎn)錄效率是由轉(zhuǎn)錄起始因子和啟動(dòng)子結(jié)合能力決定的(圖2)。釀酒酵母中轉(zhuǎn)錄 起始因子之一的SPT15，是一種TATA結(jié)合蛋白，參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，控制基因 表達(dá)效率。它與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域TATA結(jié)合能力的改變，影響相關(guān)基因表達(dá)效率， 將引起菌種的表型變化，所以用分子生物學(xué)方法建立SPT15基因突變菌種庫(kù)，在突變庫(kù) 中含有眾多菌種表型，通過(guò)定向篩選SPT15基因突變菌種庫(kù)，可獲得具有目標(biāo)表型的釀 酒酵母菌種。本課題組在2007年成功地建立了該項(xiàng)技術(shù)，構(gòu)建釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子spt15 突變庫(kù)，經(jīng)篩選，獲得了共發(fā)酵戊糖和己糖的釀酒酵母菌，得到了重組菌中sptl5的突變 序列。為進(jìn)一步改造菌種有效利用纖維素水解液發(fā)酵高產(chǎn)乙醇研究奠定了基礎(chǔ)。
利用全局調(diào)控技術(shù)對(duì)釀酒酵母菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程改造，獲得提高木糖利用后的突 變sptl5基因。并配合目標(biāo)菌株具體分析，深入研究利用木糖的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及機(jī)制， 找出全局調(diào)控對(duì)釀酒酵母木糖代謝的影響，希望通過(guò)全局調(diào)控的手段優(yōu)化釀酒酵母木糖 代謝網(wǎng)絡(luò)，以實(shí)現(xiàn)最大效率的木糖利用，并為釀酒酵母高效利用木糖產(chǎn)乙醇奠定基礎(chǔ)。 從根本上降低生物乙醇的原料成本，這將對(duì)基因工程和代謝工程技術(shù)理論的發(fā)展帶來(lái)重 大的革新，實(shí)現(xiàn)重組菌株的工業(yè)應(yīng)用也將有著不可估量的巨大推動(dòng)作用和更廣闊的應(yīng)用 前景
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種突變型的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子^(guān),"-70及其基因序列。該 突變的基因的重組菌株能夠利用木糖，并提高木糖利用率和木糖葡萄糖共利用率。 本發(fā)明的另一目的是提供上述釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的可以通過(guò)下列技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子sptl5-10，其氨基酸序列為SEQIDNO: 2所示。 該序列表示原釀酒酵母^〃5氨基酸序列(即Sflcc/zmw^c^ ce v/Wae YPH499 s/ "5基 因所表達(dá)的氨基酸序列)的224位的蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代。一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。 該序列與原釀酒酵母Sacc/ aTOmyces ce"vWae YPH499 ^ 〃5的核苷酸序列相比，第224 位由c突變?yōu)閠，第465位的由c突變?yōu)閠,且末尾缺了15個(gè)堿基。含權(quán)利要求2所述的基因的表達(dá)載體。常用載體如質(zhì)粒、噬菌體等。其中，所述表 達(dá)載體優(yōu)選重組質(zhì)粒pYX212-SPT15 。一種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。宿主可選用細(xì)菌(如大腸桿菌) 或釀酒酵母菌。其中，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選含有重組質(zhì)粒pYX212-SPT15的釀酒酵母菌。上述突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子在木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明提供的突變釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化入酵母菌中可以 提高酵母的木糖利用和葡萄糖、木糖共利用的效率。本發(fā)明還提供了該突變型釀酒酵母 起始轉(zhuǎn)錄因子^(guān)^5-M基因序列，這些序列可用于構(gòu)建利用木糖的重組載體。本發(fā)明所 提供的突變釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子^(guān)^5-70轉(zhuǎn)化入酵母菌可用于酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的 生產(chǎn)。


圖1為陽(yáng)性克隆酶PCR電泳圖。圖2為sptl5-10轉(zhuǎn)化釀酒酵母在木糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況(5%木糖)。圖3為sptl5-10轉(zhuǎn)化釀酒酵母對(duì)木糖和葡萄糖的共利用曲線(xiàn)圖，其中1為2.5%(混合糖中的木糖)；2為5% (混合糖中的木糖)；3為7.5% (混合糖中的木糖)；4為2.5% (混合糖中的葡萄糖)；5為5% (混合糖中的葡萄糖)；6為7.5% (混合糖中的葡萄糖)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限制本發(fā)明。 實(shí)施例1: Sacc/^ra附y(tǒng)cM cewv/w'ae YPH499-3突變sptl5基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選與 鑒定。釀酒酵母(Sacc/wow^cMcerev/^fe YPH499-3)為本實(shí)驗(yàn)室獲得，目前該釀酒酵母 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，登記入冊(cè)的 編號(hào)是CGMCCNo.2255，保藏日期是2007年11月13日。為亮氨酸、組氨酸、尿嘧 啶缺陷型。載體pYX212受贈(zèng)于江南大學(xué)。酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖50g/L，將pH調(diào)至7.0，高壓蒸氣滅菌121'C， 15min。將S. cem^!'ae YPH499-3接種于上述培養(yǎng)基中，置30。C搖床，200rpm,培養(yǎng)12-16 小時(shí)。8000卬m,離心15min，收集菌體。運(yùn)用基因組提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，提取S. cerew^"e YPH499-3 基因組。以S. cewv/w'ae YPH499-3總DNA為模板，使用如下PCR引物(上海博亞公 司合成)引物SPT15_Sense:TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG (SEQ ID No.2)和SPT15—Anti:CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGC ACA(SEQIDNo.3)。PCR擴(kuò)增釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子。PCR循環(huán)參數(shù)為94°C， 5min ; 94°C， lmin; 56°C， lmin; 72°C， 2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。用DNA回收試劑盒(Takara公司)對(duì)擴(kuò)增出的基因進(jìn)行回收純化?；厥蘸笸蛔兓?因sptl5及PMD18-T (Takara公司)載體連接，運(yùn)用常規(guī)基因工程技術(shù)將連接液轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒。運(yùn)用Sail和BamHI雙酶切鑒定突變基因^"5 確定連接到表達(dá)載體pMD18-T上。經(jīng)鑒定過(guò)的重組質(zhì)粒為pMD18-SPT15。金思特測(cè)序 得到突變的sptl5-10基因。實(shí)施例2:突變的sptl5基因轉(zhuǎn)化入釀酒酵母的驗(yàn)證引物同上，以實(shí)施例1中的pMD18-SPT15質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，將氨基酸殘基 Thr224突變?yōu)锳sn224。制備pYX212-T載體，與sptl5-10連接利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化入釀 酒酵母。運(yùn)用常規(guī)基因工程技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞YPX培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，得到含 有突變基因的重組釀酒酵母。得到的重組酵母菌株可以在YPX上很好的生長(zhǎng)，而對(duì)照菌株不能生長(zhǎng)。實(shí)施例3:帶有sptl5-10的重組釀酒酵母木糖利用種子培養(yǎng)基酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去離子水定容至1L。 發(fā)酵培養(yǎng)基酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖25g，葡萄糖25g，去離子水定容至1L。 從新鮮斜面上接一環(huán)由實(shí)施例2得到的重組釀酒酵母接入裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng))中培養(yǎng)24h后，以1%接種量(v/v) 接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)，發(fā)酵72h，所得木 糖的利用率為91%，葡萄糖的利用率為85%，乙醇產(chǎn)率為10%。實(shí)施例4:帶有sptl5-10的釀酒酵母對(duì)木糖和葡萄糖的共利用種子培養(yǎng)基酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去離子水定容至1L。 發(fā)酵培養(yǎng)基酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖25g，葡萄糖25g，去離子水定容至1L。 從新鮮斜面上接一環(huán)由實(shí)施例1得到的釀酒酵母YPH499-3， CGMCCNo.2255接入裝有 種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng))中培養(yǎng)24h后， 以1%接種量(v/v)接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床中培養(yǎng)， 發(fā)酵72h，所得木糖的利用率為91%，葡萄糖的利用率為85%，乙醇產(chǎn)率為10%。序列表<110>南京工業(yè)大學(xué)<120> —種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用<130> nju扁423<160> 2< 170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 708<212> DNA<213>釀酒酵母(S.cerevisiaeYPH499-3)<220><221> CDS <222> (1)..(708)<400> 1atg gcc gat gag gaa cgt tta aag gag ttt aaa gag gca aac aag ata 48 Met Ala Asp Glu Glu Arg Leu Lys Glu Phe Lys Glu Ala Asn Lys lie 15 10 15gtg ttt gat cca aat acc aga caa gta tgg gaa aac cag aat cga gat % Val Phe Asp Pro Asn Thr Arg Gin Val Trp Glu Asn Gin Asn Arg Asp 20 25 30ggt aca aaa cca gca act act ttc cag agt gaa gag gac ata aaa aga 144 Gly Thr Lys Pro Ala Thr Thr Phe Gin Ser Glu Glu Asp lie Lys Arg 35 40 45get gcc cca gaa tct gaa aaa gac acc tec gcc aca tea ggt att gtt 192 Ala Ala Pro Glu Ser Glu Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ser Gly lie Val 50 55 60cca aca eta caa aac att gtg gca act gtg att ttg ggg tgc agg tta 240 Pro Thr Leu Gin Asn lie Val Ala Thr Val lie Leu Gly Cys Arg Leu 65 70 75 80<image>image see original document page 9</image><212> PRT<213>釀酒酵母(S.cerevisiaeYPH499-3) <400> 2Met Ala Asp Glu Glu Arg Leu Lys Glu Phe Lys Glu Ala Asn Lys lie 15 10 15Val Phe Asp Pro Asn Thr Arg Gin Val Trp Glu Asn Gin Asn Arg Asp 20 25 30Gly Thr Lys Pro Ala Thr Thr Phe Gin Ser Glu Glu Asp lie Lys Arg 35 40 45Ala Ala Pro Glu Ser Glu Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ser Gly lie Val 50 55 60Pro Thr Leu Gin Asn lie Val Ala Thr Val lie Leu Gly Cys Arg Uu 65 70 75 80Asp Leu Lys Thr Val Ala Leu His Ala Arg Asn Ala Glu Tyr Asn Pro 85 90 95Lys Arg Phe Ala Ala Val lie Met Arg lie Arg Glu Pro Lys Thr Thr 100 105 110Ala Leu lie Phe Ala Ser Gly Lys Met Val Val Thr Gly Ala Lys Ser 115 120 125Glu Asp Asp Ser Lys Leu Ala Ser Arg Lys Tyr Ala Arg lie. lie Gin 130 135 140Lys lie Gly Phe Ala Ala Lys Phe Thr Asp Phe Lys lie Gin Asn lie 145 150 155 160Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro lie Arg Leu Glu Gly Leu Ala 165 170 175Phe Ser His Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe Pro Gly 180 185 190Leu lie Tyr Arg Met Val Lys Pro Lys lie Val Leu Leu lie Phe Val 195 200 205Ser Gly Lys lie Val Leu Thr Gly Ala Lys Gin Arg Glu Glu lie Tyr 210 215 220Gin Ala Phe Glu Ala lie Tyr Pro Val Leu Ser Glu 225 230 23權(quán)利要求
1. 一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO2所示。
2、 一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，其核苷酸序列為SEQIDNO: 1所示。
3、 含權(quán)利要求2所述的基因的表達(dá)載體。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為重組質(zhì)粒 pYX212陽(yáng)SPT15。
5、 一種宿主細(xì)胞，其特征在于含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞為含有重組質(zhì)粒 pYX212-SPT15的釀酒酵母菌。
7、 權(quán)利要求1所述的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子在木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)的突變釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列為SEQ ID NO2所示，其轉(zhuǎn)化入酵母菌中可以提高酵母的木糖利用和葡萄糖、木糖共利用的效率。本發(fā)明還公開(kāi)了該突變型釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子的基因序列，這些序列可用于構(gòu)建利用木糖的重組載體。本發(fā)明所提供的突變釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化入酵母菌可用于酵母利用木糖產(chǎn)乙醇的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/865GK101270156SQ20081002403
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者明 嚴(yán), 劉紅梅, 來(lái)燦鋼, 歐陽(yáng)平凱, 琳 許, 寧 郝 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)