專利名稱：：通過調(diào)控谷氨酰胺合成酶的活性改進植物的籽粒的生產(chǎn)能力的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過對谷氨酰胺合成酶(GS)活性的調(diào)控來控制植物(特別是谷類作物，優(yōu)選是玉米作物)的產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
：包括玉米、小麥和稻的谷類占全世界糧食產(chǎn)量的70%。當(dāng)為了蛋白質(zhì)含量而種植此類作物時，它們需要大量氮肥以達到最大的產(chǎn)量。過去幾年中，對氮使用效率(nitrogenuseefficiency,NUE)已經(jīng)有相當(dāng)大的興趣，NUE可以被定義為土壤中每單位氮(N)的籽粒(kernal)產(chǎn)量，而N利用效率(Nutilizatione伍ciency，NutE)是每個被吸收的N的產(chǎn)量。(HirelandLemaire,A.Basra,andS.Goyal，eds.(Haworth'sFoodProductPress.Binghamton，New-York),15:213-257,2005)。已經(jīng)進行了許多生理學(xué)和農(nóng)學(xué)的研究來鑒別在植物生長和發(fā)育過程中哪些是控制N吸收、同化以及再循環(huán)的限制性步驟(Jeuffroyetal.J.Exp.Bot.,53809-823,2002)，這些包括谷類，諸如玉米(Hireletal.etal.Physiol.Plant,124:178-188，2005b)、稻(Yamayaetal.etal.，J.Exp.Bot.，53:917-925,2002)以及最近的小麥(Kicheyetal.,NewPhytol.,169:265-278,2006)。利用玉米作為一種模型作物，Hirel等人(如上所述，2005b)已經(jīng)研究了在葉生長的不同階段以及在籽粒灌漿期的植物發(fā)育的不同時期，在單片葉內(nèi)涉及N代謝的代謝物濃度以及酶的活性的變化。結(jié)論是總N、葉綠素、可溶性蛋白含量以及GS活性是很強地相互關(guān)聯(lián)的，并且是主要反映個體葉片關(guān)于N同化以及再循環(huán)的代謝活性的指標(biāo)，無論施N肥的水平如何。谷氨酰胺合成酶(GS;E.C.6.3丄2)催化根據(jù)下列反應(yīng)的無機氮(銨)轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺三磷酸腺苷+1^-谷氨酸酯+NH3=>二磷酸腺苷+磷酸鹽+1^谷氨酰胺。一種植物中的所有的氮，不論最初得自硝酸鹽、銨離子、固氮作用，或通過在該植物內(nèi)釋放銨的其他反應(yīng)生成(甘氨酸在光呼吸作用期間的脫羧反應(yīng)、N轉(zhuǎn)運化合物的代謝以及苯丙氨酸氨裂解酶的作用)，都是通過由GS催化這些反應(yīng)而獲得的。因此，這種酶很可能是一個控制植物生長和生產(chǎn)能力的主要控制點(MiflinandHabash,J.Exp.Bot.,53(370):979-87,2002)。在玉米中，GS對于籽粒生產(chǎn)能力的公認的作用也已經(jīng)利用定量的遺傳方法突出顯示。葉酶活性的QTL與產(chǎn)量的QTL已經(jīng)被證明是一致的(Hireletal.,PlantPhysiol.,125:1258-1270,2001)，并且已經(jīng)觀察到在籽粒產(chǎn)量以及GS活性之間的一種正相關(guān)性(GallaisandHirel,J.Exp.Bot.，55:295-306,2004)。關(guān)于N從葉、莖以及整個植物的再轉(zhuǎn)移、開花期后的N攝取(Gallais和Hirel，如上所述，2004)以及萌芽效率(Limamietal.,PlantPhysiol.,130:1860-1870,2002)己經(jīng)識別出了GS基因座的進一步的QTL。GS在控制谷物生產(chǎn)能力的重要性最近已經(jīng)通過一項在稻中做的研究而得以加強，在這項研究中，在胞質(zhì)GS缺陷的一種突變型中，觀察到生長率和籽粒產(chǎn)量都有一個強烈下降(Tabuchietal.,PlantJ.，42:641-655,2005)。在包括玉米的高等植物中的GS通過標(biāo)準(zhǔn)色譜分析、定位法以及蛋白質(zhì)印跡技術(shù)可以被容易地分離成細胞質(zhì)型(GS1)以及質(zhì)體型(GS2)(HirelandLea,In:PlantNitrogen,P丄LeaandJ.F.Morot-Gaudry，eds(INRA,Springer),pp.79-99,2001)。然而，這種區(qū)別并不像最初想象的那樣簡單，因為雖然僅僅一個基因已經(jīng)被證明編碼該質(zhì)體型，但是高達五個基因的一個小家族現(xiàn)在已知編碼該細胞質(zhì)型(CrenandHirel,PlantCellPhysiol.,40:1187-1193，1999)。初期的實驗表明這五個細胞質(zhì)型GS基因在玉米的根、莖以及葉中被有差別地表達。(Sakakibaraetal.,PlantCellPhysiol.，33:1193-1198,1992;J.Biol.Chem.,271:29561-29568,1996;Lietal.,PlantMol.Biol"23:401-440,1993)。GS1誦2是發(fā)育中的籽粒的一種重要的GS同工酶，它在花梗和粒殼中很豐富，但是也已經(jīng)被證明存在于玉米植物的未成熟的雄花蕊、裂開的花藥、秄粒的穎片、穗的苞葉、穗軸以及莖之中(Muhitcheta1.,PlantSci.,163:865-872,2002;Muhitch,J.PlantPhysiol.,160:601-605,2003)。與其他的四種編碼GS1的基因相比，G/"7-5在葉、根以及莖中的表達水平是極低的(Sakakibara等人，如上所述，1992;Li等人，如上所述，1993)。在由Hirel等人進行的一項更新的關(guān)于玉米葉的研究中(以上提及的，2005b)表明，對GS1進行編碼的這五個基因中的兩個基因(G/"7-3與G/"7一)，無論葉期和N施肥的水平如何都是高表達的，盡管在老的葉中存在一種G/w7j轉(zhuǎn)錄物的增多。它已經(jīng)提示G/W^編碼一種GS同種型，該同種型參與在葉蛋白再轉(zhuǎn)移期間釋放的銨的再同化，而G/w7-J編碼一種GS同種型，它在植物生長期間起到一種管家作用(Hirel等人，如上所述，2005a)。由G/w2編碼的質(zhì)體型GS(GS2)僅在植物發(fā)育的早期表達，大概是為了再同化在光呼吸作用過程中釋放的銨，與一種C3植物相比，在一種C4植物里的該質(zhì)體型GS是出于一個低得多的比率(Uenoetal.，Ann.Bot.,96:863-869,2005)。盡管如上面所列出的可獲得的涉及在玉米中這五個胞質(zhì)GS1基因的表達的信息以及來源于QTL證明的它們的重要性的證據(jù)，單個的GS1同工酶在植物表型以及籽粒產(chǎn)量方面的精確作用是未知的。
發(fā)明內(nèi)容諸位發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了以及G/"7一基因的胞質(zhì)GS同工酶產(chǎn)物在玉米中控制籽粒產(chǎn)量以及籽粒組分的功能的重要性。他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了G/w7-3在控制籽粒的數(shù)目方面起一種主要作用，而G/w7-4在控制籽粒的大小方面起一種主要作用。更進一步的，他們已經(jīng)觀察到這些基因特別地對谷粒生產(chǎn)起作用，而不影響植物的生物質(zhì)的生產(chǎn)。G/W-3對胞質(zhì)GS的同工酶GS1-3進行編碼。G/"7-J的cDNA序列是可得到的，例如在GenBank數(shù)據(jù)庫里在登錄號碼X65928下；GS1-3的多肽序列是可得到的，例如在UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫里在登錄號P38561下。G/w7-3的cDNA序列在此表示為SEQIDNO:1，并且推演出的多肽序列表示為SEQIDNO:2。G/W-4對胞質(zhì)GS同工酶GS1-4進行編碼。的cDNA序列是可得到的，例如在GenBank數(shù)據(jù)庫里在登錄號X65929下；GS1-4的多肽序列是可得到的，例如在UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫里在登錄號P38562下。G/"/一的cDNA序列在此表示為SEQIDNO:3，并且推演出的多肽序列表示為SEQIDNO:4。本發(fā)明提供了一種用于提高玉米植物籽粒生產(chǎn)能力的方法，其中所述方法包括在所述植物中過量表達一種谷氨酰胺合成酶同工酶，該同工酶與多肽SEQIDNO:2具有至少95%的同一性。除非另作說明，在這里提及的兩個序列之間同一性的百分比是從這兩條序列全長的一個比對中計算出的。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方案，籽粒生產(chǎn)能力是通過增加籽粒的數(shù)目而得以提高，并且所述谷氨酰胺合成酶是一種GS1-3同工酶，該酶在41位有一個絲氨酸，并且在278位有一個精氨酸。優(yōu)選地，所述谷氨酰胺合成酶具有序列SEQIDNO:2。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實施方案，籽粒生產(chǎn)能力是通過增加籽粒的大小而得以提高，并且所述谷氨酰胺合成酶是一種GS1-4同工酶，該酶在41位有一個脯氨酸，并且在278位有一個賴氨酸。優(yōu)選地，所述谷氨酰胺合成酶具有序列SEQIDNO:4。有利地，本發(fā)明的一種方法包括在同一植物中對該GS1-3同工酶以及該GS1-4同工酶均進行過量表達，從而使籽粒的大小和數(shù)目均增加。術(shù)語在一種植物中"過量表達"一種谷氨酰胺合成酶同工酶在此是指與一種參照植物相比，人工增加所述植物產(chǎn)生的所述活性GS同工酶的量。對一種谷氨酰胺合成酶同工酶進行過量表達的一種優(yōu)選的方法包括向所述植物的基因組中引入一種DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體含有對所述谷氨酰胺合成酶同工酶進行編碼的一種核苷酸序列，該核苷酸序列置于一種啟動子的控制下。本發(fā)明還提供了進行所述過量表達的手段。這具體包括用于在一種宿主-細胞、或一種宿主生物中，特別是一種植物細胞或一種植物中，表達一種GS1-3同工酶和/或一種GS1-4同工酶的重組DNA構(gòu)建體。這些DNA構(gòu)建體可以通過眾所周知的重組DNA技術(shù)和遺傳工程技術(shù)來獲得并且被引入所述宿主細胞或生物中。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體具體地包括多種表達盒，這些表達盒包含，如以上所定義，在一種異源性啟動子的控制下對一種谷氨酰胺合成酶同工酶進行編碼的一種多核苷酸。根據(jù)一個具體的實施方案，本發(fā)明的一種表達盒可以既包括對一種GSl-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸也包括對一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸。本發(fā)明的異源性啟動子是在一種植物細胞里有功能的任何一種啟動子，即，能夠(如以上所定義)在一個植物細胞里指導(dǎo)編碼一種谷氨酰胺合成酶同工酶的一種多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。更適當(dāng)?shù)膯幼拥倪x擇可以具體取決于用于靶向表達的一個或多個器官或一種或多種組織，以及人們所希望獲得的表達類型(即組成型的或誘導(dǎo)型的)。在本領(lǐng)域中可獲得在植物中，并且特別是在玉米中，大批適合于異源基因表達的啟動子。例如這些啟動子可以從植物、植物病毒、或細菌(例如土壤桿菌屬)中獲得。它們包括組成型的多種啟動子(即在大多數(shù)組織和細胞中以及大多數(shù)環(huán)境下具有活性的那些啟動子)、僅僅或主要在某些組織或某些細胞類型中具有活性的組織或細胞特異性啟動子、以及經(jīng)過物理或化學(xué)刺激而被激活的誘導(dǎo)型啟動子。通常使用的組成型啟動子的非限制性實例是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、胭脂堿合酶(Nos)啟動子、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動子(Verdagueretal.,PlantMol.Bio1.，6:1129-39,1996)、包含在質(zhì)粒pActl-F4中的后面跟隨有稻肌動蛋白內(nèi)含子的稻肌動蛋白啟動子(RAP-RAI)(McElroyetal"Mol.Gen.Genet,231(1):150-160,1991)。可用于本發(fā)明的器官或組織特異性啟動子的非限制性實例包括(例如)籽粒特異的高分子量(HMW)啟動子(ThomasandFlavell,PlantCell"2:1171-80,1990)、或葉特異的啟動子(如pPEPc啟動子)(Jeanneauetal.,Biochimie84:1127-1135,2002)、或維管束鞘特異的Rubisco小亞基啟動子(rbcS)(Katayamaetal.,PlantMol.Biol.,44:99-106，2000)。誘導(dǎo)型啟動子包括例如干旱脅迫應(yīng)答啟動子，如包含一種脫水-應(yīng)答元件的rd29A啟動子(Kasugaetal,，NatureBiotech.,17:287-291，1999;Narusakaetal.,Plant丄，34:137-148,2003)，或衰老特異性SAG12啟動子(NohandAmasino,PlantMol.Biol.,41(2):181194,1999)。這些表達盒通常也包括一種轉(zhuǎn)錄終止子，如35S轉(zhuǎn)錄終止子或Nos終止子(Depickeretal.,J.Mol.Appl.Genet.,1:561-73,1982)。它們還可以包括其他的調(diào)節(jié)序列，例如轉(zhuǎn)錄增強子序列。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體還包括一些包含一種表達盒的重組載體，該表達盒包含，如以上所定義，在一種適當(dāng)?shù)膯幼拥霓D(zhuǎn)錄控制之下對一種谷氨酰胺合成酶同工酶進行編碼的一種多核苷酸。所述表達盒可以是本發(fā)明的一種重組表達盒，或是一種盒，其中對一種谷氨酰胺合成酶進行編碼的多核苷酸是在它的內(nèi)源性啟動子的控制之下。本發(fā)明的一種重組載體可以既包括對一種GSl-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸，也包括對一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸。這些多核苷酸將有利地被置于在不同的啟動子控制之下的單獨的表達盒中；例如，對一種GSl-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸可以被置于CsVMV啟動子的控制之下，而對一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸可以被置于rbcS啟動子控制之下。本發(fā)明的重組載體還可以包括其他相關(guān)的序列，例如，一種或多種標(biāo)記基因，這些基因允許選擇轉(zhuǎn)化的宿主。有利地，該可選擇的標(biāo)記基因被包含在兩個Ds因子(即轉(zhuǎn)座子)之間，以便在隨后的階段通過與Ac轉(zhuǎn)座酶相互作用而去除它。這個消除系統(tǒng)可以從本領(lǐng)域的技術(shù)人員得知。舉例來說，這個消除系統(tǒng)己經(jīng)被Goldsbrough等人描述(Biotechnology,11:1286-1292,1993)。適合的載體的選擇以及在其中插入DNA構(gòu)建體的方法對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是眾所周知的。載體的選擇取決于預(yù)定的宿主以及預(yù)定的所述宿主的轉(zhuǎn)化方法。對于許多植物物種來說，植物細胞或植物的各種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中都是可供使用的。作為非限制性實例，人們可以提及病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、通過微注射的轉(zhuǎn)化、通過電穿孔的轉(zhuǎn)化、微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Ishida，Nat.Biotechnol.，14:745-750,1996)、等等。在此使用的術(shù)語"植物"既包括雙子葉植物也包括單子葉植物，并且特別是那些農(nóng)藝學(xué)感興趣的植物，如谷類作物，如小麥植物或稻植物，優(yōu)選是玉米植物。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的一種重組DNA構(gòu)建體的宿主細胞。這些宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，特別是植物細胞，并且優(yōu)選是玉米細胞。本發(fā)明還提供生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的一種方法，特別是一種玉米植物，該植物具有一個提高的籽粒生產(chǎn)能力。所述方法包括由本發(fā)明的一種DNA構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化一種植物細胞(例如，一種玉米細胞)，并且從所述植物細胞(例如，玉米細胞)再生出對一種GS1-3同工酶和/或一種GSl-4同工酶進行過量表達的一種轉(zhuǎn)基因植物(例如，玉米植物)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案或方法，它包括由本發(fā)明的包含對一種GSl-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸的一種重組載體以及本發(fā)明的包含對一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸的一種重組載體來轉(zhuǎn)化一種植物細胞，特別是一種玉米細胞，并且從所述植物細胞(例如，玉米細胞)再生出對一種GSl-3同工酶和GS1-4同工酶進行過量表達的一種轉(zhuǎn)基因植物(例如，玉米植物)。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案或方法，它包括由本發(fā)明的包含對一種GSl-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸的一種重組載體以及本發(fā)明的包含對一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸的一種重組載體轉(zhuǎn)化一種植物細胞，特別是一種玉米細胞，并且從所述植物細胞(例如，玉米細胞)再生出對一種GS1-3同工酶與GS1-4同工酶進行過量表達的一種轉(zhuǎn)基因植物(例如，玉米植物)。本發(fā)明還包括由本發(fā)明的一種重組DNA構(gòu)建體遺傳轉(zhuǎn)化的、并且過量表達一種GSl-3同工酶和/或一種GS1-4同工酶的植物。優(yōu)選地，所述植物是可以通過本發(fā)明的一種方法獲得的、對一種GS1-3同工酶和/或一種GS1-4同工酶進行過量表達的轉(zhuǎn)基因玉米植物。在所述轉(zhuǎn)基因植物里，本發(fā)明的一種DNA構(gòu)建體被包含在被整合入該植物基因組內(nèi)的一種轉(zhuǎn)基因中(即穩(wěn)定地整合)，這樣它被傳遞給后續(xù)的植物世代。因而本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物不但包括源于該初始的基因轉(zhuǎn)移的植物，而且包括它們的后代，只要它們包含了本發(fā)明的一種重組DNA構(gòu)建體。與不具有所述的一種或多種轉(zhuǎn)基因植物相比，在所述植物中對一種GS1-3同工酶和/或一種GS1-4同工酶的過量表達為它們提供一個改進的籽粒生產(chǎn)能力。因此，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物或它的一種分離的器官或組織，包括穩(wěn)定地整合入其基因組中的一種重組表達盒，該重組表達盒包含如權(quán)利要求2或3中任何一項所限定的對一種GS1-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸，和/或如權(quán)利要求4或5中任何一項所限定的對一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的一種重組表達盒的所述轉(zhuǎn)基因植物的分離的器官或組織(諸如種子、葉、花、根、莖、穗)。具體實施例方式從以下詳細說明與附圖，本發(fā)明的前述的和其他的目的以及本發(fā)明的優(yōu)點將變得更明顯。然而應(yīng)該理解的是這些前述的詳細說明僅僅是示例性的而不是對本發(fā)明的限制。實例1:GLN1-3::與GLN1-4::MU插入事件的表征利用玉米增變株(Mu)系統(tǒng)(Hanleyetal.,PlantJ.,23:557-566,2000)，已經(jīng)分離出了G/"7-3基因與G/"/"基因的基因敲除突變型。G/"7-ivMw與G/W-(:Mw的插入品系已經(jīng)進行了與野生型非-M"品系大規(guī)模的回交，并且已經(jīng)獲得了純合的、雜合的和無效的突變品系。另外，已經(jīng)生產(chǎn)了一種G/"7-3基因與G/w7-4基因的雙重突變型(g/"/-3/g/"/4)。圖1中示出增變株因子(A/wtotorelement)插入該基因與G/"/"基因里的位置。為了清晰起見并且因為該基因與G/"7-4基因顯示了高度的序列相似性，它們被顯示為一個單一結(jié)構(gòu)。利用引物通過對基因組DNA的PCR產(chǎn)物進行測序而測定了G/w7-3基因與G/"7一基因的結(jié)構(gòu)與外顯子大小，該引物是從對應(yīng)的cDNA序列(Li等人，如上所述，1993)、Mm-插入序列以及稻的基因組克隆AC105364設(shè)計的。該玉米G/"7-J基因以及G/"/4基因包括大小范圍從40bp到252bp的10個外顯子(黑色箭頭)以及9個內(nèi)含子(黑線)。最后一個外顯子的大小在G/W-3基因中是150bp，而在G/W-4基因中是147bp。這些內(nèi)含子與外顯子結(jié)構(gòu)是按比例描繪的。該基因編號是從ATG密碼子(lbp)開始，并且延伸至終止密碼子(位置3857bp)。這兩個M"-插入事件用三角形(不成比例)表示。還示出了該GS-NH4+-結(jié)合位點特征標(biāo)記以及該GS-ATP-結(jié)合位點特征標(biāo)記的相對位置。圍繞該M"-因子的側(cè)翼區(qū)的序列分析顯示，在G/w/-3::MW7的情況中，插入已經(jīng)在8號外顯子之內(nèi)發(fā)生，并且在G/"7-(:MW的情況中，插入已經(jīng)在分隔7號外顯子和8號外顯子的內(nèi)含子內(nèi)發(fā)生。實例2:在(7ZA7-3、(^A7一以及雙重突變型中谷氨酰胺合成酶的表達與活性植物材料這三種GS1缺陷突變型的種子，或?qū)?yīng)的野生型的種子被首先播種在粗砂里，并在l星期后，當(dāng)已經(jīng)形成2到3片葉時，要么被轉(zhuǎn)移到水培育中以收獲根，要么轉(zhuǎn)移到土壤中以收獲葉。對于水培育，12株植物(野生型3株以及每種突變型各3株)被隨機地置于一個130L通氣培養(yǎng)單元里。每個品系設(shè)三個重復(fù)實行該實驗，并且植物在一種有16/8(小時)光/暗周期的生長室中生長18天。通過金屬鹵化燈提供一種400molm—2s—1的光合光子通量密度。其中的相對濕度維持在飽和度的60%。在10至11片葉期，在上午9至12點收獲這些植物，并且將其分離成嫩葉(3片最嫩的葉)與根。這些根樣品立即被放入液態(tài)氮氣中，然后存儲在-80。C直至更進一步地分析。這三種突變型的三株植物被轉(zhuǎn)入裝有粘壤土的多個罐中(直徑與高度是30cm)，并且在10至11葉期，收獲3片最嫩的完全展開的葉并儲存作為營養(yǎng)階段(VS)的樣品。在植物發(fā)育的生長后期，包括在吐絲之后15天(15DAS)以及在吐絲之后55天(55DAS)，低于穗的葉被收獲。選中低于穗的葉是因為它已經(jīng)被證明在谷粒灌漿期提供了顯示出源庫關(guān)系轉(zhuǎn)變的一種很好的指示(Hirel等人，如上所述，2005a，b;Martin等人，NewPhytol.，167:483-492，2005)。直到葉發(fā)育的最后階段，在一個單一的葉片內(nèi)沒有觀察到N代謝物含量和酶活性的主要變化。所以，己經(jīng)推斷出該整個葉片能被用于測量與N代謝相關(guān)的生理特性(Hirel等人，如上所述，2005b)。葉樣品是在上午9點至12點收獲并且凍存于液態(tài)氮氣里，研磨成一種均一的粉末并且存儲在-80。C用于隨后的RNA、蛋白質(zhì)以及代謝物分析。在該水培育法中，將植物培養(yǎng)在包含10mMNCV作為唯一N源的一種完全營養(yǎng)溶液中(CoicandLesaint,Hortic.Fransaise，8:11-14,1971)。每天更換該營養(yǎng)溶液。在溫室中，植物每天被用包含10mMN(V作為唯一N源的一種完全營養(yǎng)溶液澆灌(Coic和Lesaint，如上所述，1971)。對于兩種培養(yǎng)方法，該完全營養(yǎng)溶液包含1.25mMK+，0.25mMCa2+，0.25mMMg2+，1.25mMH2P04-，0.75mMS042-，21.5Fe2+(Sequestrene;Ciba-Geigy,Basel,Switzerland),23pMB3+，9nMMn2+，0.3nMMo2+，0.95|iM012+以及3.5Zn2+。谷氨酰胺合成酶蛋白質(zhì)的表達遵循一維聚丙烯酰胺凝膠電泳與蛋白質(zhì)印跡分析，利用針對GS2與GS1的抗體檢測了該野生型以及三種突變型的根與葉的GS同工酶蛋白質(zhì)含量。這項技術(shù)提供了一種可靠的方法，用于估計玉米的葉以及根的粗蛋白質(zhì)提取物中的GS1以及GS2蛋白的相對總量(Beckeretal.,Planta,211:800-806,2000)。在冷的提取緩沖液中將如上所述獲得的蛋白從冰凍的葉和根的粉末中提取出來，該緩沖液包含50mMTris-HCl(pH值7.5)、1mMEDTA、1mMMgCl2、0.5%(重量/體積)PVP、0.1%(體積/體積)2-巰基乙醇以及4mM亮肽素，并且蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離(Laemmli,Nature,227:680-685,1970)。聚丙烯酰胺在凝膠中的百分比是10%，并且在各泳道上載總量相等的蛋白質(zhì)(10iag)。蛋白質(zhì)被電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜用于蛋白質(zhì)印跡分析。用針對煙草的GS2多克隆抗血清(Hireletal.,PlantPhysiol.,74:448-450,1984)、或來自菜豆根瘤的針對GS1的多克隆抗血清(CullimoreandMiflin,J.Exp.Bot.,35:581-587,1984)檢測GS1和GS2多肽。利用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，使用一種可商購的試齊U盒(CoomassieProteinassayreagent,Biorad,Miinchen，Germany)來觀!l定可溶性蛋白。結(jié)果如圖2所示。圖2的說明在營養(yǎng)階段收獲的葉的GS亞基組成的蛋白質(zhì)印跡分析，利用煙草GS抗體(A);在營養(yǎng)階段收獲的葉的蛋白質(zhì)印跡分析，利用菜豆GS抗體(B);在55DAS收獲的葉的蛋白質(zhì)印跡分析，利用煙草GS抗體(C);以及在營養(yǎng)階段收獲的根的蛋白質(zhì)印跡分析，利用煙草GS抗體(D)。在這些圖片右邊顯示了蛋白質(zhì)的分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的位置。WT=野生型glnl-3-g/"/d缺陷突變型glnl-4二g/"7-4缺陷突變型glnl陽3/l-4,"與g/""缺陷突變型在營養(yǎng)階段的野生型植物的葉內(nèi)，利用煙草GS抗體檢測到了相對豐度相似的兩種多肽。該44kD的多肽對應(yīng)于質(zhì)體型GS(GS2)，而40kD多肽相當(dāng)于該細胞質(zhì)型GS(GS1)。在g/W-3以及g/w7-4突變型中，觀察到了GS1蛋白質(zhì)總量的降低，這在前者中更顯著。在g/W-J/g/w7-4中，幾乎沒有檢測到GS1蛋白質(zhì)。在該野生型以及所有三種突變型中，可見到GS2蛋白質(zhì)的類似總量(圖2A)。利用針對菜豆根瘤GS培育的抗體，證實了在營養(yǎng)階段的g/w/-3、^/"7-4以及^"/-3/^"7々突變型的081蛋白質(zhì)含量的下降。然而，因為制備的這些抗體明顯地是對胞質(zhì)GS(GS)更為特異，因而在該蛋白質(zhì)印跡上，不容易看見GS2蛋白質(zhì)(圖2B)。當(dāng)利用煙草抗體分析55DAS的葉中的GS蛋白時，在該突變體中獲得了GS1蛋白含量下降的一種類似模式。然而，在植物發(fā)育的更晚的階段，從全部的四個品系中分離的GS2蛋白質(zhì)的總量更低(圖2C)。在野生型植物的根組織里，檢測到了與兩種胞質(zhì)型GS(分別是GSr以及GS1)對應(yīng)的38kD和40kD的兩種多月太(圖2D)。如Sakakibara等人已經(jīng)描述的(如上所述，1992)，上面的帶對應(yīng)于在葉中發(fā)現(xiàn)的一種大小相似的GS1蛋白質(zhì)，而下面的帶是一種根特異性胞質(zhì)GS(GSr)。在該g/"J4突變型中，僅可看到GS1多肽(40kD)的總量有一個小的下降，而在該g/"7-3突變型中，清楚地可檢測到一個明顯的下降。在該g/"7-3/g/"7一雙重突變型中，沒有檢測到GS1(40kD)多肽。在野生型以及所有三種突變型中，檢測到了總量相似的GSr多肽C38kD)(圖2D)。谷氨酰胺合成酶蛋白質(zhì)的活性利用在營養(yǎng)階段的植物，遵循離子交換色譜法以及酶促測定法，檢査了野生型以及三種突變型的GS同工酶活性成分(質(zhì)體和胞質(zhì)GS活性的相對比例)。在冷的提取緩沖液中，將蛋白質(zhì)從冰凍的葉和根的粉末(按實例l的描述所獲得)中提取出來，該緩沖液包含100mMTEA、lmMEDTA、10mMMgSO4、5mM谷氨酸、10%(體積/體積)乙二醇、6mMDTT，pH值7.6。然后將提取物在4°C以10000g離心15分鐘。在附著于一種高效液相層析儀(DX500;Dionex(UK)Ltd.Camberley,Surrey,UK)的一種單Q陰離子交換柱(AmershamPharmaciaBiotech)上進行分離，除了一種0.1-0.7MNaCl線性梯度被用于洗脫并且1ml餾分被收集以外，該分離如Habash等人描述的那樣進行(Ann.Appl.Biol"138:83-89,2001)。根據(jù)Lea等人(1999)的方法，對于轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)測量谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，并根據(jù)CTNeal和Joy的方法(Archiv.Biochem.Biophys.，159:113-122,1973)對合成酶反應(yīng)進行測量。用三種獨立的提取法從葉材料獲得的結(jié)果顯示在圖3里。圖3的說明在源自野生型(A)，g/"/-4(B),g/"7-3(C)以及g/"7-3/g/"7-4(D)的葉提取物中，GS活性的離子交換色譜分析。GS活性的第一個峰對應(yīng)于胞質(zhì)GS(GS1)，而第二個峰對應(yīng)于質(zhì)體GS(GS2)。在括號內(nèi)標(biāo)明的GS1和GS2活性的相對量值是用對于該野生型中GS1和GS2活性的量所測量的數(shù)值作為最大值而計算出來的。與野生型(圖3A)相比，在g/"7-4突變型中觀察到了GSl活性的16。/。的下降(圖3B)。在g/W-J突變型中，GS1活性的下降更多(45%)(圖3C)。在g/"7-J/g/"/"突變型中，只保留了該野生型GS1活性的26。/。(圖3D)。有趣的是在所有三個突變型中都觀察到了GS2活性的增大，范圍從11%至47%(圖3B-D)。與野生型相比，利用在營養(yǎng)階段合成酶反應(yīng)測量的三種突變型的根的GS活性都是相似的(野生型是3.2士0.06^uno1.min".g"DW，g/"7-4突變型是3.4±0.3，g/"7-3突變型是2.8±0.05，并且g/"7-J/g/Wj突變型是3.1±0.05)。這些結(jié)果表明根的GS活性主要由GSr蛋白代表，GSr蛋白由G/W-7基因編碼，它的mRNA在根部表達最豐富。GS蛋白質(zhì)序列的識別利用在營養(yǎng)階段收獲的植物，從以上描述的野生型、g/W-3、g/"/一以及g/"7-3/g/"/一突變型中提取出的葉蛋白通過二維凝膠電泳進行分離。從野生型的葉中提取出的蛋白的二維凝膠顯示在圖4A里。為/明確地證明在g/W-3、g/W-4以及g/"7-3/g/w7"突變型中缺乏相應(yīng)的GS蛋白質(zhì)，通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法(LC-MS/MS)分析了在來自所述區(qū)域的GS的等電點和分子量(MM)范圍內(nèi)的三十六個蛋白質(zhì)的斑點。結(jié)果在圖4B中示出。蛋白質(zhì)的識別揭示了在這36個斑點中有四個(斑點8、9、14以及38)包含一種GS蛋白質(zhì)。與野生型的蛋白質(zhì)分布型相比，可以看出^//7/-_突變型以及^/"/一突變型是分別缺乏斑點8和9，而且在g/"7-3/g/w/4突變型中，斑點8和9都不存在。斑點8和9彼此非常靠近，并且表現(xiàn)出部分重疊。它們具有相同的表觀的等電點，但在它們的表觀的分子量有細小的差別。這項發(fā)現(xiàn)并不出乎意料，因為根據(jù)由Li等人分離的基因的序列(如上所述，1993)，GS1-3和GS1-4蛋白質(zhì)有一樣的等電點，并且它們的分子量只表現(xiàn)出188D的差異。由Sakakibara等人(如上所述，1992)分離的等位基因形式(分別是OSW2和對應(yīng)GW-J和GW一)的兩種產(chǎn)物具有有一個堿性更大的氨基酸，并因此也表現(xiàn)出相似的等電點。將具有序列多態(tài)性的兩個位點用于對這些GSl-3與GSl-4蛋白質(zhì)的相互區(qū)分。結(jié)果如圖4C所示。圖4C的說明給出了在UNIPROTDatabase的序列的登錄名稱。GSl-3和GSl-4的Ref2是指Sakakibara等人測序的等位基因形式(如上所述，1992)。除GS2之外，位置與所有GS的第一個甲硫氨酸有關(guān)，在GS2中，位置與信號肽后的第一個氨基酸有關(guān)。陰暗背景顯示了在GSl-3與GSl-4之間以及在GSl-3等位形式之間的差異。在GS1-3與GS1-4作為一方面而其余的GS蛋白質(zhì)作為另一方面之間的差異用下劃線表示。序列比對顯示出在GS1-3中的41位上的氨基酸是一個絲氨酸，而GS1-4的41位上的氨基酸是一個脯氨酸，并且GS1-3的278位上的氨基酸是一個精氨酸，而GSl-4的278位上的氨基酸是一個賴氨酸。包含這些多態(tài)性位點的肽被鑒定出TLSGPVTDPSK(SEQIDNO:5)(以及該誤剪切的TLSGPVTDPSKLPK(SEQIDNO:6))允許對GS1-3的鑒定，而根據(jù)該41位的絲氨酸/脯氨酸的多態(tài)性，TLPGPVTDPSK(SEQIDNO:7)(和TLPGPVTDPSKLPK(SEQIDNO:8))允許對GSl-4的鑒定；并且HKEHIAAYGEGNER(SEQIDNO:9)和HKEHIAAYGEGNER(SEQIDNO:10)，根據(jù)該278位的精氨酸/賴氨酸的多態(tài)性，分別允許對GS1-3和GS1-4蛋白質(zhì)鑒定。應(yīng)當(dāng)注意到肽HREHIAAYGEGNER(SEQIDNO:9)與Sakakibara等人(如上所述，1992)測序的GSl-3等位形式相似，而與Li等人(如上所述，1993)測序的等位形式不同，其中肽的最后兩個氨基酸ER被DG代替。實例3:GS1缺陷突變型的表型和籽粒生產(chǎn)根據(jù)由Martin等人描述的方法(如上所述，2005)測定了籽粒的產(chǎn)量、它的成分、以及在植物從吐絲到成熟的發(fā)育階段的不同部分的氮含量。為了確定這些突變對植物表型以及籽粒產(chǎn)量的影響，將植物種植在一個溫室里的土壤中，并且每天用一種Coi'c和Lesaint描述的(如上所述，1971)包含10mMNCV(氮最適度以下的條件)的營養(yǎng)液澆灌。在成熟期收獲植物，并且利用杜馬燃燒法(Dumascombustionmethod)測量總氮含量。在GS1缺陷突變型中，苗和穗的干重(DW)積聚野生型、g/7-3、以及g/"7-J/g/w/^的苗營養(yǎng)部分的總干重(A)和穗的總干重(B)在圖5中示出。圖5的說明Ord=以克單位(g)的干重(DW)數(shù)值是三種個體植物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。苗的營養(yǎng)部分的(圖5A)干物質(zhì)產(chǎn)量未見顯著差異。相比之下，在穗的干物質(zhì)含量方面觀察到了較大的下降，與野生型的相比，g/"7-3、g/"7-么g/"7-3/g/"74突變型分別降低了68%、48%、84%。在禾Q突變型中觀察到了穗的大小的下降，并且這在g/w7J/g/"/一突變型中更嚴(yán)重(圖5B)。在GS1缺陷突變型中穗的表型玉米植物(品系B73)的野生型、g/W-么以及的穗在圖6中示出。在g/"7-3和g/W"兩種突變型中，在籽粒的產(chǎn)量方面觀察到了強烈的下降，這在前者中更為重要，因此證實了如圖6所示的表型。在氮最適度以下的條件下生長的三種GS突變型的籽粒產(chǎn)量的主要組成在表1中示出。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>0.08(118)a每個值是從三株個體植物中獲得的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。在括號里顯示的值表示該值在野生型中的百分比。a與野生型的顯著性差異在0.05概率水平上。在glnl-3/glnl-4突變型中，籽粒的產(chǎn)量下降至僅為野生型的12%。與g/"7-3相比，在g/n/j中籽粒的重量有一個較大的下降，但是籽粒的數(shù)目較多。在g/W-3/g/wW突變型中，與野生型以及兩種單突變型相比，兩種產(chǎn)量成分都強烈地下降。與野生型相比，在這三種突變型中，在氮籽粒含量方面觀察到了一個大約20%的增長。實例4:GS1缺陷突變型的生理學(xué)在三種玉米突變型中檢査了GS1活性水平下降對葉的氮和碳代謝的代表性標(biāo)志物的影響(Hirel等人，如上所述，2005b)。代謝物提取與分析對營養(yǎng)階段的玉米植物的代謝物進行定量。凍干的植物材料用于代謝物提取。NH4+和氨基酸用2%的5-磺基水楊酸提取(10mgDW，ml";Ferrario-M6ryetal.,PlantPhysiol.，117:293-302,1998)?？偘被岷恳约皞€體氨基酸組成由離子交換層析對從等量的干重材料提取出的庫樣品進行測定?？偟挠坞x氨基酸由Rosen比色法進行測定，利用亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)(Rosen,Arch.Biochem.Biophvs.,67(1):10-15,1957)。個體氨基酸的組成通過離子交換層析進行，然后是利用AminoTac幾C-500/V氨基酸分析器根據(jù)廠家的說明書(JEOL[Europe],Croissy-sur-Seine，F(xiàn)rance)以水合茚三酮進行檢測。通過苯酚次氯酸鹽實驗(Berthelot反應(yīng))測定游離的NH4+，當(dāng)NH4+濃度低時，該實驗提供了用于比較研究的可靠的資料，盡管可以通過其他方法獲得一種更精確的定量(Hustedetal.,Physiol.Plant,109:167-179,2000)。如Ferrario-M^y等人描述的方法(如上所述，1998)，用1MHC104(每5至10mg植物材料的干重用lml)提取蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉。利用一種可商購的試劑盒(BoehringerMannheim,Germany)通過酶催化測量這些可溶性糖(葡萄糖、果糖以及蔗糖)。結(jié)果如表2中所示。表2代謝物濃度Oimolg干重")與總氮(。/0)代謝物野生型NH4+24.22±1.941.5±3.1a43.6±2.3a99.15±11.4aN03-64±2.557.3±11.461.5±6.764±2.1可溶性糖2350±1101930±2201980±楊2030±306氨基酸73.20±1793.03±6.583.1±398.9±30總氮4.36±0.084.31±0.14.28±0.14.42±0.31數(shù)值是三種植物的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。對于可溶性糖，蔗糖代表總量的98%。1與野生型相比，顯著性差異在0.05概率水平上。表2顯示與野生型相比，在g/W-3和g/W-4突變型中，GS1活性下降導(dǎo)致在葉中游離的NH4+的數(shù)量有一個幾乎2倍的增加，而在g/"7-3/g/"74突變型中，這個量比野生型大約高出四倍。在營養(yǎng)階段，在野生型與三種突變型之間在N(V、可溶性糖、游離氨基酸(從質(zhì)量和數(shù)目兩方面)以及葉的總氮含量方面沒有觀察到顯著性差異。雖然不太顯著，在三種GS突變型中，在15DAS,仍然觀察到了游離的NH4+量值的增加。在植物發(fā)育的這個階段上，N03'、氨基酸以及可溶性糖的相對濃度也在減小，但是在野生型與突變型之間沒有檢測到顯著的變化(數(shù)據(jù)未顯示)。如較早時候已經(jīng)報告的(Hirel等人，如上所述，2005b)，在55DAS葉中，N(V、NH/以及可溶性糖的總量在野生型和三種GS突變型中都至少降低四倍。然而在野生型與三種突變型之間沒有觀測到明顯的差異。在該55DAS階段，調(diào)查了GS1活性的減小對氨基酸和氮水平的影響。結(jié)果如表3中所示。表3氨基酸濃度(gmoig干重")與比例(。/。y氨基酸野生型天冬氨酸1.85±0.52(11)4.19±1.24(10)1.61±0.31(6)1.07±0.24(3)天冬酰胺0.58±0.07(3)6.18土1.61(15)b1.58±0.10(6)b11.91土1.60(29)b谷氨酸1.03±0.15(6)2.27±0.22(5)b3.56士0.55(14)b9.57±3.88(23)b谷氨酰胺3.56±1.01(21)6.85土1.63(16)c3.57土0.10(14)c1.96士0.44(5)c丙氨酸4.80±1.41(29)IO息I.58(25)4.02±0.12(16)4.61±1.59(11)Y-氨基丁酸0.11±0.02(1)0.15±0.04(1)0.21±0.02(1)0.30±0.08(1)脯氨酸0.86±0.32(5)1.25±0.46(3)1.17±0.22(5)0.64±0.09(2)其他的氨基酸3.88±0.67(23)10.63±1.61(25)9.50±0.51(37)10.90±(27)總量16.67±3.66(100)41.92土7.20(100)b25.22士0.6(脂)b40.96±4.73(100)b總氮(％)2.43±0.162.84±0.18b2.80±0.16b2.77±0.14b'數(shù)值是三種植物的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。括號里給出相對氨基酸比例。'與野生型相比，氨基酸含量與氮含量的顯著性差異在0.05概率水平上。同野生型相比，沒有顯著變化。與營養(yǎng)階段相比，在植物發(fā)育的55DAS階段，三種突變型的葉的總氨基酸含量有了一個明顯的增加。這種增加的部分原因是天冬酰胺與谷氨酸含量的增加，該增加在g/W-3/g/W一突變型中分別高達20倍與10倍。在這三種突變型的葉中還觀察到了總氮的量的增加。木質(zhì)部與韌皮部汁液收集利用King與Zeevaart描述的技術(shù)(PlantPhysiol.,53:96-103,1974)獲得韌皮部溢泌物。在迅速浸入收集緩沖液之前，將葉切斷并且在水下再切割。對每個實驗，在一個恒濕箱中(相對濕度〉卯％)并且在黑暗中將三種個體植物(野生型和三種突變型)的完全展開的葉分離地置于一種溶液中，該溶液含10mMHepes，10mMEDTA(用NaOH將pH值調(diào)至7.5)。從早上10點至下午4點的6個小時期間收集溢泌物。然后測量葉的鮮重并且將該溢泌物儲存在-80。C下。韌皮部溢泌物(在EDTA溶液里)的pH值被調(diào)至2.1并進行離心以除去雜物和EDTA，在該pH下雜物和EDTA會沉淀。結(jié)果如表4所示。表4氨基酸濃度Ounol^L")與比例(。/。)a氨基酸野生型天冬氨酸81.1±10.1(1043.9土8.4(13)b60.5±6.8(16)b46.9土4.6(14)b天冬酰胺21.2±10.5(3)5.2土1.3(2)b2.6±0.4(l)b4.3士0.4(l)b谷氨酸79.5士15.1(10)c46.8土9.5(14)c79.5土13(21)c56.3土6.2(17)c谷氨酰胺159.8±42.5(19)70.5±19.4(21)b66±32(18)b67.1土6.6(20)b丙氨酸85.6±1.4(4.6)22.1士4.5(7)b10.9±12(3)b18.3士1.2(5)bY-氨基丁酸48.0±29.1(6)9.2±5.3(3)4.9±2.4(1)4.5±1.1(1)脯氨酸9.9±2.1(1)5.2±0.9(2)b2.8±0.6(2)b2.8±2.8(l)b其他的氨基酸289.7±24.7(35)116.3±9.3(35)136.4.±10.8(38)126.8±26(37)總量825±28.2(100)329±64b367±54(100)b335±24(100,'數(shù)值是三種植物的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。在括號里給出相對氨基酸比例。'與野生型相比，氨基酸含量的顯著性差異在0.05概率水平上。與野生型相比，沒有顯著性變化。在營養(yǎng)階段的韌皮部汁液的組成的分析顯示，在三種突變型中，除谷氨酸之外的所有主要氨基酸濃度都有一種普遍的下降。對于天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸，這種下降大約是2倍，而對天冬酰胺與丙氨酸則至少是4倍。然而，除谷氨酸之外，這些氨基酸的相對比例沒有明顯地改變，對于谷氨酸觀察到了一種輕微的增加。對于籽粒的游離氨基酸含量沒有觀察到明顯的變化，除了這些突變型中的天冬酰胺有一個2倍的下降，在野生型里，天冬酰胺大約占總量的14%(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定在三種突變型里根是否能為苗提供充足的氮同化產(chǎn)物，分析了木質(zhì)部汁液的氨基酸組成。為了收集木質(zhì)部汁液，植物根系2厘米以上的莖被切下，并且將切下的莖用水浸透并且吸干。根壓傷流液(每株植物大約200至400pL)用一種微量吸液管收集，并且立即將樣品儲存在-80。C下。氨基酸分析由以前說明過的方法進行。結(jié)果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>a數(shù)值是三種植物的平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差。在括號里給出相對氨基酸比例。b與野生型相比，氨基酸含量在0.05概率水平上沒有顯著性變化。e沒有得到。觀察到了在營養(yǎng)階段的木質(zhì)部汁液的總氨基酸濃度的輕微下降，特別是在g/^-3，主要是由于天冬酰胺的下降，天冬酰胺是在木質(zhì)部汁液中最豐富的氨基酸。然而這種下降不顯著。有趣的是，與野生型相比，在突變型里谷氨酰胺的量(幾乎與天冬酰胺一樣豐富)沒有被顯著改變。實例5:GS1的過量表達植物轉(zhuǎn)化、再生與表征用存留一種超級雙元質(zhì)粒(super-binaryplasmid)的根瘤土壤桿菌菌株LBA4404進行了玉米的近交系A(chǔ)188的轉(zhuǎn)化，這基本上是按Ishida等人所描述的方法進行的(Nat.Biotechnol.,14:745-750,1996)。具體地，此后引用的所有介質(zhì)的組成在這篇參考文獻里做詳細說明。關(guān)于選擇性標(biāo)記，將實驗方案稍做修改，其中用了NPTII基因而不是bar基因。超級雙元質(zhì)粒pRec445用于轉(zhuǎn)化的該超級雙元質(zhì)粒是一種重組的結(jié)果，該重組是在土壤桿菌屬菌株LBA4404內(nèi)(pSBl)(Komarietal.,PlantJ.,10:165-74,1996)在pBIOS445質(zhì)粒與pSBl質(zhì)粒(存留從超毒力菌株A281分離出的virB與virG基因)之間的重組形成了質(zhì)粒pRec445。質(zhì)粒Pbios445是在T-DNA邊界之間存留的pSBll的一種衍生物(Komari等人，如上所述，1996)，T-DNA邊界是一種新霉素抗性盒(NPTII基因)(Bevanetal.，Biotechnol.，24:367-70,1992;BergandBerg,Biotechnol.,1:417-435,1983)，其側(cè)翼是一種肌動蛋白啟動子(McElroyetal.,PlantCell,2(2):163，1990)、以及3，Nos終止子(Depickeretal.,J.Mol.Appl.Genet"1:561-73，1982)，并且在木薯葉脈花葉病毒啟動子(pCsVMV)(Verdagueretal.,PlantMol.Biol"6:1129-39,1996)側(cè)翼的Glnl-3cDNA(Sakakibara等人，如上所述，1992)連接至一種肌動蛋白內(nèi)含子(McElroy等人，如上所述，19%)以及3'Nos終止子。所產(chǎn)生的用于轉(zhuǎn)化的土壤桿菌屬菌株是LB4404(pRec445)。在圖7中對pRec445進行了圖解-RB與LB代表該T-DNA的右側(cè)與左側(cè)邊界。-G^c)與(5'Ar)代表該Z)s轉(zhuǎn)座因子用于進一步消除賦予卡那霉素抗性的選擇性標(biāo)記。-^聲//是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，由肌動蛋白啟動子以及肌動蛋白內(nèi)含子與胭脂堿合成酶終止子(3'Wm)賦予卡那霉素抗性。-一個肌動蛋白內(nèi)含子被置于玉米的G/w/-JcDNA與CyKMF啟動子之間。LB與RB的外邊界、3'Mw、以及內(nèi)含子肌動蛋白被用作探針來確定在該轉(zhuǎn)基因玉米品系中的構(gòu)建體插入事件的模式。轉(zhuǎn)基因植物利用在授粉以后10天分離的未成熟的玉米胚進行植物轉(zhuǎn)化。未成熟的胚用根瘤土壤桿菌孵育5分鐘，并且在25。C的黑暗里，用沒有抗生素選擇的LSAs培養(yǎng)基培養(yǎng)3天。當(dāng)轉(zhuǎn)入該LSD5培養(yǎng)基時，根瘤土壤桿菌通過250mgL"頭孢噻肟的存在被反向選擇，并且該轉(zhuǎn)化的愈傷組織由存在的50mgpL—1卡那霉素選擇。培養(yǎng)2周以后，正在發(fā)育中的愈傷組織被轉(zhuǎn)到含有50mgnU1卡那霉素的LSD10培養(yǎng)基并且生長3周。將I型愈傷組織切離并且在卡那霉素上再培養(yǎng)3周。為了再生，發(fā)育良好的I型愈傷組織在在持續(xù)的選擇壓力以及卡那霉素條件下，在LSZ培養(yǎng)基上在22。C下進行培養(yǎng)。在2星期以后，帶苗的愈傷組織被轉(zhuǎn)到RMG2培養(yǎng)基中并且再培養(yǎng)2星期，以允許在將該小植株轉(zhuǎn)到土壤并且逐漸適應(yīng)環(huán)境濕度之前根的發(fā)育。然后將植物栽植在一種溫室里U8。C至24°C)并且自花受粉或與A188品系授粉以產(chǎn)生種子。選擇了多個轉(zhuǎn)基因品系并對pCsVMV-Glnl-3構(gòu)建體的插入模式進行試驗。隨后用Ncol消化基因組DNA，用Glnl-3cDNA、肌動蛋白內(nèi)含子以及3，Nos探針進行雜交以確定T-DNA的拷貝數(shù)。另外，在pRec445質(zhì)粒上設(shè)計了兩種探針，每個探針都重疊于RB與LB這兩種T-DNA邊界，以便于檢査在該T-DNA以外最終存在的質(zhì)粒序列(對于探針的位置參見圖7)。在兩種初級的轉(zhuǎn)化體中(品系1與品系9)，檢測到了一個單個插入事件而沒有附加的T-DNA序列存在，除了那些插入物側(cè)翼的序列之外，該插入物包含該pCsVMV-Glnl-3以及該pActin-NPTII嵌合構(gòu)建體(資料沒有顯示)。這兩種初級的轉(zhuǎn)化體同F(xiàn)V2品系雜交，F(xiàn)V2品系包含了對Glnl-3不利的等位基因(Hirel等人，如上所述，2001)。然后選擇Tl轉(zhuǎn)化體并且與FV2品系回交3次。在T4代中包含50%的轉(zhuǎn)基因、50%的無效分離型，對于品系1與品系9的無效分離型被用作未轉(zhuǎn)化的對照植物，并且分別命名為野生型l(WT1)與野生型9(WT9)。對進行編碼的cDNA通過將其與CsVMV啟動子融合而成為構(gòu)建性的。經(jīng)過選擇與再生之后，隨后是與FV2品系回交3次，選擇出過量表達G/"7-J的兩個T4轉(zhuǎn)基因植物(品系1與品系9)，以及對應(yīng)的無效的分離型(WT1和WT9)用于進一步分析。將這些玉米植物在一種包含IOmMN03—的營養(yǎng)液的氮最適度以下的環(huán)境里進行培養(yǎng)，并且在成熟期收獲。野生型未轉(zhuǎn)化的無效分離型(WT1和WT9)以及過量表達該G/W-3cDNA的T4轉(zhuǎn)基因品系(品系1與品系9)的穗如圖8所示。應(yīng)當(dāng)注意的是，與如圖6所示的未轉(zhuǎn)化的無效的分離型(野生型)的穗相比，該未轉(zhuǎn)化的野生型植物的穗較小，以便比較由于以下事實的突變型的表型，即歐洲品系FV2比起用來生產(chǎn)該轉(zhuǎn)基因玉米植物的北美品系B73生產(chǎn)更少的籽粒。轉(zhuǎn)基因植物的表征對于在最適度以下的氮供給條件下在溫室里生長直至成熟的植物測定了(^/"/-3的過量表達對植物表型以及籽粒產(chǎn)量的影響。利用識別GS1與GS2的煙草抗體，通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測了兩種未轉(zhuǎn)化的無效的分離型(WT1和WT9)以及兩種轉(zhuǎn)基因品系(品系1和品系9)在營養(yǎng)階段的葉的GS亞基的組成。結(jié)果如圖9所示。圖9的說明上面的帶(44kD的分子量)對應(yīng)于質(zhì)體GS(GS2)亞基，并且下面的帶(39kD的分子量)對應(yīng)于胞質(zhì)GS(GS1)亞基。在兩種轉(zhuǎn)化的植物的蛋白提取物中可清楚地看見GS1蛋白質(zhì)總量的提高，其中品系9的增高更顯著。當(dāng)分析在55DAS葉中的GS蛋白質(zhì)時，得到了GS1蛋白質(zhì)含量提高的一種相似的模式(數(shù)據(jù)未顯示)。與gy活絲賴關(guān)艦"J!谷教產(chǎn)著測定了兩種未轉(zhuǎn)化的無效的分離型(WT1和WT9)以及該兩種轉(zhuǎn)基因品系(品系1與品系9)的與GS活性相關(guān)的苗以及谷粒產(chǎn)量，結(jié)果如圖10所示。圖10的說明A=總的葉GS活性B=籽粒產(chǎn)量C=苗營養(yǎng)部分的總干重D=葉GS活性(橫坐標(biāo))與籽粒的產(chǎn)量(縱坐標(biāo))之間的散布圖與這兩種未轉(zhuǎn)化的無效的分離型相比，在品系1與品系9中分別觀察到葉的總GS活性的二倍和三倍的增大(圖10A)。觀察到了籽粒產(chǎn)量的顯著增加，當(dāng)與兩種相應(yīng)的野生型對照植物相比時，對于品系l與品系9這個增加均為大約30%(圖10B)，因此證實了如圖8所示的表型。籽粒數(shù)目是籽粒產(chǎn)量增大負主要責(zé)任的產(chǎn)量因素，如以下表6所示。表6谷粒產(chǎn)量(g)谷粒數(shù)目千粒重(g)谷粒氮含量(%干重)野生型(品系F2)26.05±3.5(100)102.5±17.4(100)259.9±8.2(100)2.16±0.02(100)dMF-G/""36.9±3.8(142)a127.9±13.6(125)a276.9土6.7(闊2.19±0.06(101)每個數(shù)值是從六種個體的植物得到的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。在括號里顯示的這些值表示為在該值野生型的百分比(這兩種轉(zhuǎn)基因品應(yīng)的無效的分離型的平均值)。系的平均值以及相對于在兩種未轉(zhuǎn)化的無效分離型以及兩種轉(zhuǎn)基因品系中葉的GS活性水平對谷粒產(chǎn)量計算了線性回歸以及相關(guān)系數(shù)。圖10D顯示在葉的GS活性水平與谷粒產(chǎn)量之間有一種強的相關(guān)性(r20.91)，因此提示產(chǎn)量的提高與酶活性的增大是成比例的。相比之下，在兩種野生型對照植物與兩種轉(zhuǎn)基因品系之間，苗的干物質(zhì)產(chǎn)量沒有看到顯著性差異(圖10C)。實例6:在葉的葉肉與維管束鞘細胞里GS1的過量表達。如實例5中所描述，來自該pCsVMV啟動子的GSl-3的表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物中GS活性顯著增加，并且改善了農(nóng)藝性狀。然而pCsVMV的表達主要局限在葉肉細胞，因此通過利用在葉肉以及維管束鞘細胞內(nèi)指導(dǎo)高水平表達的啟動子，在轉(zhuǎn)化玉米植物葉中GS1的表達可以被進一步優(yōu)化。如下所述，一種可替代的策略是用在pCsVMV啟動子控制下表達GSl-3的一種T-DNA與在一種維管束鞘細胞特異性的啟動子如玉米rbcS啟動子(Katayama等人，如上所述，2000)的控制之下的GSl-4—起來轉(zhuǎn)化玉米，以便獲得在葉肉里表達GSl-3并且在維管束鞘細胞里表達GSl-4的轉(zhuǎn)基因玉米植物。期望在所述的轉(zhuǎn)基因植物中、在氮受限以及不受限的情況下谷粒產(chǎn)量均得到改進。植物轉(zhuǎn)化、再生和表征用留存一種超級雙元質(zhì)粒的根瘤土壤桿菌菌株LBA4404對玉米近交系A(chǔ)188進行的轉(zhuǎn)化基本上按照Ishida等人描述進行的(如上所述，1996)。具體地，此后引用的所有介質(zhì)的組成在這個參考文獻里被詳細說明。僅有的修改涉及選擇性標(biāo)記物，即在本實例中它是NPTII基因，而不是Ishida等人所使用的bar基因。超級雙元質(zhì)粒pRec445+用于轉(zhuǎn)化的超級雙元質(zhì)粒是在土壤桿菌屬菌株LBA4404內(nèi)(pSBl)(Komari等人，如上所述，1996)pBIOS445質(zhì)粒與pSBl質(zhì)粒(留存從超毒力菌株A281分離出的virB與virG基因)之間的一種重組的結(jié)果，這形成了質(zhì)粒pRec445。(pBIOS445+與pBIOS445(實例5)相同，除了它還在T-DNA邊界之間包含一種玉米rbcS啟動子(Katayama等人，如上所述，2000)，該啟動子連接到Glnl-4cDNA以及一個nos終止子上。用于轉(zhuǎn)化的所生成的土壤桿菌屬菌株是LB4404(pRec445+)。權(quán)利要求1.一種提高玉米植物籽粒生產(chǎn)能力的方法，其中所述方法包括在所述植物中過量表達一種谷氨酰胺合成酶同工酶，該谷氨酰胺合成酶同工酶與多肽SEQIDNO2具有至少95％的同一性。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該籽粒的生產(chǎn)能力是通過增加籽粒的數(shù)目而提高的，并且所述谷氨酰胺合成酶是一種GS1-3同工酶，該GS1-3同工酶在41位有一個絲氨酸并且在278位有一個精氨酸。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述谷氨酰胺合成酶具有該序列SEQIDNO:2。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該籽粒的生產(chǎn)能力是通過增加籽粒的大小而提高的，并且所述谷氨酰胺合成酶是一種GS1-4同工酶，該GS1-4同工酶在41位有一個脯氨酸并且在278位有一個賴氨酸。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述谷氨酰胺合成酶具有該序列SEQIDNO:4。6.如權(quán)利要求1至5中任何一項所述的方法，其中該籽粒生產(chǎn)能力的提高是通過在同一種植物中對該GSl-3同工酶以及該GSl-4同工酶均進行過量表達，以使籽粒的大小與數(shù)目均增加。7.—種重組表達盒，包括一種多核苷酸，該多核苷酸在一種植物細胞中的一種異源性啟動子功能的控制下對權(quán)利要求1至5中任何一項所限定的一種谷氨酰胺合成酶同工酶進行編碼。8.如權(quán)利要求7所述的一種重組表達盒，包括對權(quán)利要求2或3中任何一項所限定的一種GS1-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸，以及對權(quán)利要求4或5中任何一項所限定的一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸。9.一種重組載體，該重組載體含有一種表達盒，該表達盒包括一種多核苷酸，該多核苷酸在一種啟動子的控制下對權(quán)利要求1至5中任何一項所限定的一種谷氨酰胺合成酶同工酶進行編碼。10.如權(quán)利要求9所述的一種重組載體，包括對權(quán)利要求2或3中任何一項所限定的一種GS1-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸，以及對權(quán)利要求4或5中任何一項所限定的一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸。11.一種宿主細胞，該宿主細胞含有如權(quán)利要求7或8中任何一項所述的一種重組表達盒，或者如權(quán)利要求9或10中任何一項所述的一種重組載體。12.如權(quán)利要求ll所述的一種宿主細胞，該宿主細胞是一種植物細胞，優(yōu)選是一種谷類細胞。13.如權(quán)利要求12所述的一種宿主細胞，該宿主細胞是一種玉米細胞。14.用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的一種方法，該轉(zhuǎn)基因植物具有一個提高的籽粒生產(chǎn)能力，其中所述方法包括-提供權(quán)利要求11所述的一種植物細胞；-從所述植物細胞再生一種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物過量表達如權(quán)利要求1至5中的任何一項所限定的一種谷氨酰胺合成酶同工酶。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的一種方法，其中該轉(zhuǎn)基因植物是一種轉(zhuǎn)基因谷類植物，優(yōu)選是一種轉(zhuǎn)基因小麥植物、一種轉(zhuǎn)基因稻植物、或一種轉(zhuǎn)基因玉米植物。16.—種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物可通過權(quán)利要求14所述的方法獲得。17.如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物對該GSl-3同工酶以及該GSl-4同工酶均進行過量表達。18.—種轉(zhuǎn)基因植物或它的一種分離的器官或組織，包括穩(wěn)定地整合入其基因組的一種重組表達盒，該重組表達盒包括對如權(quán)利要求2或3中任何一項所限定的一種GS1-3同工酶進行編碼的一種多核苷酸、和/或?qū)?quán)利要求4或5中任何一項所限定的一種GS1-4同工酶進行編碼的一種多核苷酸。19.如權(quán)利要求16至18中任何一項所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物是一種轉(zhuǎn)基因的玉米植物。20.包含如權(quán)利要求7或8中任何一項所述的一種重組表達盒的種子，這些種子是從權(quán)利要求16至19中任何一項所述的一種轉(zhuǎn)基因植物獲得。全文摘要本發(fā)明涉及一種提高玉米植物籽粒生產(chǎn)能力的方法，其中所述方法包括在所述植物中過量表達一種谷氨酰胺合成酶同工酶，以便增加籽粒的數(shù)目和/或大小。文檔編號C12N15/82GK101553570SQ200780036953公開日2009年10月7日申請日期2007年10月9日優(yōu)先權(quán)日2006年10月9日發(fā)明者帕斯夸爾·佩雷斯,貝特朗·伊雷爾申請人:法國植物基因組研究計劃-華萊