專利名稱：具有移動容器且以連續(xù)方式生產(chǎn)培養(yǎng)物的連續(xù)培養(yǎng)裝置的制作方法
具有移動容器且以連續(xù)方式生產(chǎn)培養(yǎng)物的連續(xù)培養(yǎng)裝置 發(fā)明領(lǐng)域
所述發(fā)明提供了允許在液體或半固體培養(yǎng)基中選擇具有高生殖率 和特殊代謝性質(zhì)的活細(xì)胞的方法和設(shè)備。對于選擇過程(適應(yīng)進化)，遺 傳變異生物(突變體)在群體中產(chǎn)生，并與相同起源的其它變體竟?fàn)帯＞?有最快生殖率的那些隨時間過去相對比例增加，導(dǎo)致產(chǎn)生具有增加的生 殖率的群體(和個別生物)。該過程可以提高用于工業(yè)過程或?qū)W術(shù)目的的 生物的性能。本發(fā)明利用連續(xù)培養(yǎng)裝置來實現(xiàn)活細(xì)胞(例如，原核生物、
古細(xì)菌(Archaea)、病毒、真核生物、真菌、藻類、酵母、植物細(xì)胞、動 物細(xì)胞或干細(xì)胞)的可行生產(chǎn)。本發(fā)明可以用于生產(chǎn)由活細(xì)胞生成的活性 成分或生物制品。所述活性成分或生物制品又可以用作診斷劑、預(yù)防劑 或治療劑。
背景技術(shù)：
對增加的生殖率(適合度)的選擇需要持續(xù)的生長，后者通過生長培 養(yǎng)物的定期稀釋來實現(xiàn)。在現(xiàn)有技術(shù)中，這已經(jīng)通過三條途徑來實現(xiàn) 固體培養(yǎng)，系列稀釋和連續(xù)培養(yǎng)，它們的主要差別在于稀釋程度。
固體培養(yǎng)包含將小體積的生長培養(yǎng)物或細(xì)胞從培養(yǎng)皿重復(fù)轉(zhuǎn)移至 裝有新鮮生長培養(yǎng)基的容器中。系列稀釋包含將小體積的生長培養(yǎng)物重 復(fù)轉(zhuǎn)移至裝有新鮮生長培養(yǎng)基的大的多的容器中。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)在 新容器中生長至々包和時，重復(fù)該過程。在文獻(Lenski & Travisano: Dynamics of adaptation and diversification: a lO，OOO-genemtion experiment with bacterial populations. 1994. Proc Natl Acad Sci U S A. 15: 6808-14) 中，該方法已經(jīng)用于實現(xiàn)持續(xù)培養(yǎng)的最長示范，在清楚地證實了生殖率 在數(shù)年時間段中一致提高的實驗中。該過程通常手工進行，相當(dāng)費勞動 力，且通過暴露于外部環(huán)境而被污染。如下段所述，系列培養(yǎng)也是低效 率的。
Genetical Theory of Natural Selection. 1930. Oxford University Press, London, UK)。此外，在類似于群體大小快速波動的系列轉(zhuǎn)移情況下，選擇與群體的調(diào)和平均數(shù)(&)成比例(Wright: Size of population and breeding structure in relation to evolution. 1938. Science 87: 430-431),且 因此可以通過循環(huán)過程中的最低群體估計出來。
通過連續(xù)培養(yǎng)可以維持群體大小，且因此使選擇更高效。不同于系 列稀釋的連續(xù)培養(yǎng)包含相對更小的體積，從而用等體積的新鮮生長培養(yǎng) 基定期替換小部分生長培養(yǎng)物。通過在循環(huán)稀釋過程中使它的最小大小 增加，該過程使有效的群體大小最大化。允許連續(xù)培養(yǎng)的設(shè)備稱作"恒 化器"(如果稀釋在指定的時間間隔發(fā)生)和"恒濁器"(如果當(dāng)培養(yǎng)物生 長至特定密度時自動發(fā)生稀釋)。
為了簡單，兩類設(shè)備在下文中將歸入術(shù)語"恒化器"組。恒化器由2 個組在二十世紀(jì)五十年代同時發(fā)明(Novick & Szilard: Description of the chemostat. 1950. Science 112: 715-716)和(Monod: La technique de la culture continue - Th6orie et applications. 1950. Ann. Inst. Pasteur 79: 390-410)。恒化器已經(jīng)用于證實生殖率的短時間段快速提高(Dykhuizen DE. Chemostats used for studying natural selection and adaptive evolution. 1993. Methods Enzymol. 224: 613-31)。
由于耐稀釋的(靜止的)變體的非計劃中的選擇，傳統(tǒng)的恒化器不能 維持長時間段選擇高生殖率。這些變體能通過貼壁到恒化器表面上來耐 受稀釋，且通過這樣做，竟?fàn)庍^(outcompete)較低粘性的個體，包括具 有更高生殖率的那些，從而消除了設(shè)備的預(yù)期目的(Chao&Ramsdell: The effects of wall populations on coexistence of bacteria in the liquid phase of chemostat cultures,. 1985. J. Gen. Microbiol. 131: 1229-36)。
已經(jīng)發(fā)明了一種方法和恒化設(shè)備(the Genetic Engine)來避免連續(xù) 培養(yǎng)物的稀釋抗性(PASTEUR INSTITUT [FR] & MUTZEL RUPERT [DE] 提交的專利US 6,686,194-B1)。該方法使用閥控制的流體轉(zhuǎn)移來在2個 恒化器之間定期移動生長培養(yǎng)物，從而允許每個在活性培養(yǎng)生長時間段 之間滅菌和沖洗。定期滅菌循環(huán)通過破壞耐稀釋變體來預(yù)防它們的選 擇。該方法和設(shè)備實現(xiàn)了該目的，但是需要在無菌(密封)環(huán)境中對幾種 流體進行獨立的復(fù)雜操作，包括一種(NaOH),它是極腐蝕性的和潛在極 反應(yīng)性的，迅速破壞閥，并產(chǎn)生污染和廢物處理問題。恒化設(shè)備也是有 限制的，因為沒有采取措施來提供細(xì)胞生長的支持物。諸如Genetic Engine的設(shè)備和其它已知的技術(shù)不允許連續(xù)培養(yǎng)非懸浮生長的和/或作為粘附細(xì)胞生長的細(xì)胞。
存在一些類型的難以大量培養(yǎng)的細(xì)胞，這是由于細(xì)胞存活和生長所
對于真核生物(例如，藻類、酵母、真菌、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞和干細(xì)胞) 情況是這樣。
例如，通常如下培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞分離干細(xì)胞群并將其轉(zhuǎn)移進裝 有稱作培養(yǎng)基的營養(yǎng)肉湯的實驗室用塑料培養(yǎng)皿。細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面分
的小鼠胚胎皮膚細(xì)胞。該細(xì)胞涂布層稱作飼養(yǎng)層。在培養(yǎng)皿底部具有飼 養(yǎng)層的原因是，給人胚胎干細(xì)胞提供它們可以附著的粘性表面。同樣， 詞養(yǎng)細(xì)胞向培養(yǎng)基中釋放營養(yǎng)物。最近，科學(xué)家已經(jīng)開始設(shè)計不使用小 鼠詞養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方式。這是重大的科學(xué)進步，因為它避 免了小鼠細(xì)胞中的病毒或其它大分子可能傳遞給人細(xì)胞的危險。
在幾天的過程中，內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞增殖，并開始擠滿培養(yǎng)皿。當(dāng)這 發(fā)生時，將它們輕輕取出，并鋪平板進幾個新鮮的培養(yǎng)皿中。重復(fù)重新 鋪平板(replate)細(xì)胞的過程多次和多個月，且這稱作傳代培養(yǎng)。傳代培 養(yǎng)細(xì)胞的每個周期稱作傳代。6個月或更久以后，細(xì)胞群的原始細(xì)胞產(chǎn) 生數(shù)百萬個胚胎干細(xì)胞。已經(jīng)未分化地在細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖6個月或更 多個月、是多潛能性的、且遺傳上表現(xiàn)正常的胚胎干細(xì)胞，稱作胚胎干 細(xì)胞系。
一旦確立了細(xì)胞系，或甚至在該階段之前，就可以將它們分批冷凍， 并運輸?shù)狡渌鼘嶒炇?，用于其它培養(yǎng)和試驗。但是，連續(xù)培養(yǎng)提供了抑 制最大量的對活細(xì)胞加壓和產(chǎn)生潛在污染源的操作的優(yōu)點。當(dāng)開始培養(yǎng) 時，連續(xù)培養(yǎng)條件允許技術(shù)人員利用細(xì)胞的連續(xù)生產(chǎn)。 一旦生成干細(xì)胞， 就可以不間斷地繼續(xù)生產(chǎn)干細(xì)胞，以生成比現(xiàn)在一般使用的方法多得多 的干細(xì)月包。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是，提供用于不受耐稀釋變體千擾地連續(xù)培養(yǎng) 細(xì)胞(包括原核生物、細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物和病毒)的改良的(且完 全獨立的)方法和設(shè)備。象其它恒化器一樣，該設(shè)備提供用新鮮生長培養(yǎng) 基定期稀釋生長培養(yǎng)物的工具，'用于在培養(yǎng)物和外部環(huán)境之間進行氣體交換、無菌和作為恒化器或恒濁器自動操作的工具。
另外，本發(fā)明的目的是，提供用于連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞的改良的且獨特的 方法和設(shè)備，所述細(xì)胞不懸浮生長和/或作為粘附細(xì)胞生長，例如真核生 物(例如，植物細(xì)胞、藻類、真菌、酵母、動物細(xì)胞或干細(xì)胞)和某些原 核生物(例如，鏈霉菌)和可能某些古細(xì)菌和病毒?？梢岳帽景l(fā)明培養(yǎng) 的干細(xì)胞包括、但不限于胚胎干細(xì)胞、月臺兒干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、月臺盤 衍生的干細(xì)胞和成年干細(xì)胞?？梢岳帽景l(fā)明培養(yǎng)的成年干細(xì)胞包括、 但不限于造血干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠
質(zhì)纟田月包G列嘖口， Hematopoietic Stem Cell Protocols by C. Klug和C. Jordan, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2002, I入本文作為參考)。
本發(fā)明被設(shè)計用于沒有任何流體轉(zhuǎn)移(包括滅菌和沖洗功能)地實 現(xiàn)這些目的。這在下述范圍內(nèi)代表著本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的具體優(yōu) 點它避免了與滅菌和沖洗有關(guān)的危害和困難，包括含有腐蝕性溶劑的 容器(containment)和復(fù)雜流體的轉(zhuǎn)移、污染和由于培養(yǎng)物從一個容器 向另一個容器轉(zhuǎn)移引起的生長紊亂。
在充滿了生長培養(yǎng)基的柔性無菌管內(nèi)實現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)基和室表 面彼此靜止，且通過使管道系統(tǒng)(tubing)蠕動穿過"門"或由防止培養(yǎng)的細(xì) 胞在管區(qū)域之間移動的夾子無菌地細(xì)分管的點，定期且同時替換二者。 為了進一步的安全，也可以(任選地)在培養(yǎng)容器的上游和下游添加紫 外線(UV)門。
本方法和設(shè)備也是在下述范圍內(nèi)優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的改進它們連續(xù) 地、而不是定期地選擇克服耐稀釋變體對恒化器表面的貼壁，因為替換 受影響的表面隨著稀釋過程串聯(lián)發(fā)生。同樣對于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞和作為 粘附細(xì)胞生長的細(xì)胞，管道系統(tǒng)提供生長的連續(xù)支持物，其優(yōu)點是不通 過將細(xì)胞從一個容器向另一個容器轉(zhuǎn)移而干擾細(xì)胞。
以瞬時方式細(xì)分管，從而使得存在含有飽和的(充分生長的)培養(yǎng)物 的區(qū)域、含有新鮮培養(yǎng)基的區(qū)域和這二者之間的區(qū)域，其中存在一個或 多個稱作生長室或培養(yǎng)室的室，以形成生長室區(qū)域，生長培養(yǎng)物與新鮮 培養(yǎng)基在其中混合，以實現(xiàn)稀釋。門定期從管上的一個點釋放，并在另 一個點替換，以便通過從生長室分離去除生長培養(yǎng)物以及它結(jié)合的生長 室表面和附著的靜止細(xì)胞，并用新鮮培養(yǎng)基和新鮮的室表面替換。附圖簡述
非窮盡地和非限制性地， 一個可能的普通構(gòu)型將包括下文所述的幾 個組分。在下文中，在優(yōu)選實施方案的基礎(chǔ)上示例性地解釋本發(fā)明，因
此參考附圖，其中


圖1顯示了設(shè)備的可能的構(gòu)型的全景，其中
(1) 代表含有設(shè)備的不同區(qū)域的柔性管道系統(tǒng)，所述區(qū)域是上游 新鮮培養(yǎng)基(7)、生長室(IO)、取樣室(11)和處置的生長培養(yǎng)區(qū)域(15)
(2) 代表允許根據(jù)用戶確定的條件調(diào)節(jié)溫度的恒溫可控箱，且在其 中可以放置
a. 所述生長室(IO),
b. 所述取樣室(ll),
c. 限定所述生長室(10)的開始的上游門(3),
d. 限定所述生長室(10)的結(jié)束和所述取樣室(11)的開始的下游門
(4),
e. 限定所述取樣室(11)的結(jié)束的第二個下游門(5),
f. 允許用戶或自動控制系統(tǒng)監(jiān)控生長培養(yǎng)物的光密度和操作反饋 控制系統(tǒng)(13)的濁度計(6)，從而在培養(yǎng)物密度(恒濁器功能)基礎(chǔ)上控制 管道系統(tǒng)(l)的運動，
g. —個或幾個攪拌器(9)。
應(yīng)當(dāng)指出，在a-g中列出的設(shè)備元件也可以位于恒溫可控箱的外 面，或沒有恒溫可控箱。
(7) 代表未使用的柔性管道系統(tǒng)中的新鮮培養(yǎng)基，
(8) 代表裝載有新鮮培養(yǎng)基填滿的管道系統(tǒng)的桶(barrel)，以在操 作過程中分配所述新鮮培養(yǎng)基和管道系統(tǒng)。
(12) 代表任選的紫外輻射門，
(13) 代表控制系統(tǒng)，它可以由與不同的監(jiān)控或操作界面通訊的工具 相聯(lián)的計算機組成，所述工具如光密度濁度計、溫度測量和調(diào)節(jié)設(shè)備、 攪拌器和傾斜馬達等，它們允許操作的自動化和控制，
(14) 代表任選的處置桶，它上面巻撓著裝有處置的生長培養(yǎng)物填滿 的管道系統(tǒng)的管道系統(tǒng)，
(15) 代表位于所述取樣室下游的處置的生長培養(yǎng)物。
圖2顯示了設(shè)備的兩種可能的位置，它們例示了下述事實，即所述恒溫可控箱(2)和與所述培養(yǎng)室有關(guān)的所述設(shè)備的其它部件可以傾斜至 不同的角度，這是為了攪拌目的、氣體循環(huán)和去除目的、和保證去除可 能通過沉降到底部而避免稀釋的顆?；?聚集的)細(xì)胞的目的。在細(xì)胞 的生長不需要攪拌的情況下，所述設(shè)備也可以位于相同位置(例如，平坦 位置或有一定角度)。圖3-9代表位于所述恒溫可控箱(2)中適當(dāng)位置且通過門(3) 、 (4) 和(5)傳入的所述柔性管(l),在所有過程步驟中所述管都通過這些門 停留，且所述管將根據(jù)它的蠕動運動通過這些門。圖3代表設(shè)備狀態(tài)T0，其中在注射預(yù)期用于連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞之前， 所述柔性管的所有區(qū)域都裝滿新鮮培養(yǎng)基。圖4代表在剛注射細(xì)胞林后所述柔性管的狀態(tài)Tl。圖5代表設(shè)備狀態(tài)T2，它是生長時間段，在這期間，培養(yǎng)物在定義 為所述門(3)和(4)卩艮定的生長室(10)的區(qū)域中生長。圖6代表在管和相關(guān)的培養(yǎng)基的第一次蠕動剛發(fā)生后的設(shè)備狀態(tài) T3,它決定了第二個生長周期的開始，通過門3的運動導(dǎo)入新鮮管和培 養(yǎng)基，同時通過門4的運動將等體積的管、培養(yǎng)基和生長培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移出 生長室區(qū)域(10)和進入取樣室區(qū)域(11)。關(guān)鍵是認(rèn)識到，管、在管內(nèi)的培 養(yǎng)基和已經(jīng)在所述培養(yǎng)基中生長的任意培養(yǎng)物都一起運動。流體轉(zhuǎn)移僅 通過生長室區(qū)域內(nèi)的攪拌在新鮮培養(yǎng)基和生長培養(yǎng)物混合物 一起的范 圍內(nèi)發(fā)生。圖7代表設(shè)備狀態(tài)T4，它是第二個生長周期；在這個周期過程中， 在管蠕動后保留在生長室中的細(xì)胞現(xiàn)在可以利用與在該步驟過程中的 剩余培養(yǎng)物相混合的新鮮培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)物生長。圖8代表在管和包含的培養(yǎng)基的第二次蠕動剛發(fā)生后的設(shè)備狀態(tài) T5,它決定了第三個生長周期的開始，通過門3的運動導(dǎo)入新鮮管和培 養(yǎng)基，同時通過門4的運動將等體積的管、培養(yǎng)基和生長培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移出 生長室區(qū)域(10)和進入取樣室區(qū)域(11)。圖9代表設(shè)備狀態(tài)T6，它是第三個生長周期；該步驟等價于狀態(tài) T4,并指示其它操作的重復(fù)性質(zhì)。使用注射器或其它可回收裝置，可以 在任意時間從取樣室區(qū)域(11 )取出選擇的細(xì)胞的樣品。圖10顯示了決定構(gòu)型中的門的牙的可能的概況，它由擠捏柔性管 的2個堆疊牙組成。門也可以由擠壓可移動帶的單個牙、可去除的夾子或阻止細(xì)胞穿過門的運動的其它機制決定，且其可以沿著管在可變的位 置交替放置和取下。發(fā)明詳述在圖3 -9中描述了設(shè)備的基本操作。在圖1中顯示了本設(shè)備的一種可能的構(gòu)型，正如其在已經(jīng)裝載無菌培養(yǎng)基的新鮮管后出現(xiàn)的(顯示為由所述門(3)、 (4)和(5)分成區(qū)域A-H)。 通過注射(圖4,區(qū)域B)將細(xì)胞導(dǎo)入生長室(圖3),可以給設(shè)備接種 選擇的細(xì)胞。然后允許培養(yǎng)物生長至需要的密度，并可開始連續(xù)培養(yǎng)(圖 5)。通過管的門控區(qū)域的重復(fù)運動，進行連續(xù)培養(yǎng)。這包含門、管、培 養(yǎng)基、和管內(nèi)的任意培養(yǎng)物的同時運動。管總是以相同方向運動；含有 新鮮培養(yǎng)基的未使用的管(且在下文中稱作在生長室(7)的"上游")將移動 進生長室，并與其中剩余的培養(yǎng)物相混合，從而為其中含有的細(xì)胞的進 一步生長提供基質(zhì)。在導(dǎo)入生長室區(qū)域之前，通過經(jīng)上游門(3)與生長室 分開，將該培養(yǎng)基和它有關(guān)的管維持在無菌條件下。含有生長培養(yǎng)物的 用過的管同時"向下游"運動，且經(jīng)下游門(4)與生長室分開。當(dāng)存在一個或多個生長室時，生長室可以用于相同或不同的目的。 例如，活細(xì)胞可以在具有相同或不同條件的第一個生長室和第二個生長 室中生長。在一個實施方案中，第一個生長室可以用于生長細(xì)胞，且第 二個生長室則可以用于在不同條件下處理活細(xì)胞。例如，可以處理細(xì)胞， 以誘導(dǎo)所需產(chǎn)物的表達。在培養(yǎng)開始之前或之后，可以加入培養(yǎng)基自身 的組分或添加劑。例如，所有組分或添加劑都可以在培養(yǎng)開始之前包含 在培養(yǎng)基中，或可以在已經(jīng)開始培養(yǎng)之后，將組分注射進一個或多個生 長室。門構(gòu)型不是本專利申請的特殊點。例如，在給定的構(gòu)型中，門可以 設(shè)計成穿過同時運動的多個牙的一條鏈，或在另一個構(gòu)型中，如圖l所 示在不同的同步鏈中分開。門可以由以如圖10所示的堆疊方式擠捏管 的2個牙制成的系統(tǒng)組成，從而通過牙之間的接觸面的精確，避免管的 G和H區(qū)域之間的污染。在另一個構(gòu)型中，可以如下得到無菌門將一 個牙壓靠到管的一側(cè)，且由此將管緊密壓靠到固定的底盤上，管在它的 蠕動過程中沿著該底盤滑動，如圖3至9標(biāo)記3、 4和5所示意的。在另一個構(gòu)型中，使用下述機制來移動管，其中夾子繞著關(guān)于該設(shè)備的固 定軸旋轉(zhuǎn)。通過已知的方式得到所述恒溫可控箱(2 ),例如與加熱和冷卻設(shè)備偶 聯(lián)的溫度計。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞的生長或?qū)嶒炘O(shè)計需要通氣(氣體交換)時，通過使用 透氣管來直接實現(xiàn)，且不使用機械輔助。例如且非限制性地，可以用硅 氧烷制成柔性透氣管。通氣可以通過與環(huán)境氣氛交換或通過與接觸生長 室或整個恒化器的人工確定的氣氛(液體或氣體)交換來實現(xiàn)。當(dāng)實驗要 求厭氧生活時，柔性管可以是不透氣的。例如且非限制性地，柔性不透 氣管可以由涂布的或處理過的硅氧烷制成。對于厭氧進化條件，也可以將管的區(qū)域限制在特定的且受控的氣氛區(qū)域內(nèi)，以控制氣體交換動力學(xué)。這可以如下實現(xiàn)通過使所述恒溫可 控箱不透氣，且然后向其中注射中性氣體，或通過將整個設(shè)備置于氣氛 可控的室內(nèi)。通過與生長培養(yǎng)基一起替換生長室表面，實現(xiàn)靜止變體的反選擇。 另外將設(shè)備設(shè)計成可以以關(guān)于重力的多個方向運行，也就是說，如 圖2所示傾斜，范圍最高達360。。如果聚集的細(xì)胞可以落入上游并從而避免從室去除，則耐稀釋變體 可以通過彼此粘連而不是粘到室壁上來避免稀釋。因此，希望管通常向 下傾斜，從而使得聚集的細(xì)胞將落向在管移動周期過程中將從生長室取 出的區(qū)域。該構(gòu)型包含使設(shè)備傾斜，從而使得下游門就重力而言低于上 游門。根據(jù)實驗人員選擇的條件，可以使生長室減壓或過壓?？梢允褂貌?同的調(diào)節(jié)壓力的方式，例如通過它的上游末端和穿過生長室給新鮮培養(yǎng) 基和管應(yīng)用真空或壓縮空氣；通過交替擠捏和鎖定在生長室上游或內(nèi)部 的管，可以實現(xiàn)另一種使管減壓或過壓的方式。當(dāng)在透氣管中含有培養(yǎng)基時，可以在培養(yǎng)基內(nèi)形成氣泡。它們將上 升到管密封區(qū)域的頂部，且在那里被捕獲，直到該區(qū)域(和限定它的門) 的運動將該區(qū)域釋放進生長室、取樣室或恒化器的終點(圖6，分別是區(qū) 域D-C、 B或A)。如果設(shè)備向下傾斜，這些氣泡將積聚在生長室或取樣 室中，并取代培養(yǎng)物。將設(shè)備設(shè)計成對于管運動周期定期向上傾斜，從 而允許積累的氣體從所述室去除。設(shè)備的傾斜運動和/或外部設(shè)備(9)對生長室的搖動，可以用于降低 生長室內(nèi)細(xì)胞的聚集。或者，可以在滅菌之前在裝滿新鮮培養(yǎng)基的管中 包含一個或幾個攪拌棒，且在培養(yǎng)操作過程中磁力攪拌。在細(xì)胞生長不 需要攪拌的情況下，機器可保持在相同位置。上游門限定的新鮮培養(yǎng)基區(qū)域與培養(yǎng)室長度的成比例的長度，將限 定在周期過程中達到的稀釋程度?？梢酝ㄟ^定時來確定稀釋的頻率(例如，恒化器功能)。例如，可以 在有限的時間范圍收獲干細(xì)胞，從而在細(xì)胞開始分化之前收集干細(xì)胞。 或者，可以用反饋調(diào)節(jié)來確定稀釋的頻率，由此通過濁度計(圖1-標(biāo)記6)測量生長室中培養(yǎng)物的密度，且當(dāng)濁度達到閾值時，發(fā)生稀釋循環(huán)(恒 濁器功能)。管可以是透明的或半透明的，以測量濁度。取樣室允許取出生長培養(yǎng)物，以分析實驗結(jié)果、收集具有提高的生 長速率的細(xì)胞用于進一步培養(yǎng)、保藏或功能執(zhí)行或其它目的，例如計數(shù) 群體、檢查培養(yǎng)基的化學(xué)組成、或測試生長培養(yǎng)物的pH、或大量生產(chǎn) 細(xì)月包(例如，真核生物例如干細(xì)力包、原核生物、古細(xì)菌和病毒)。為了實 現(xiàn)生長室內(nèi)pH的持久監(jiān)控，管可以通過構(gòu)建包含嵌入/結(jié)殼在管壁中的 pH指示線。任意形式的液體或半固體材料都可以用作本設(shè)備中的生長培養(yǎng)基。 利用半固體生長基質(zhì)的能力是勝過現(xiàn)有技術(shù)的顯著進步?？梢杂捎脩暨x 擇和限定生長培養(yǎng)基，后者將限定通過選擇過程提高的代謝過程。如果需要，該設(shè)備可以含有多個生長室，從而使得一個生長室的下 游門變成另一個的上游門。例如，這將允許一種細(xì)胞在第一室中單獨生 長，且然后用作第二室中第二種細(xì)胞(或病毒)的營養(yǎng)源。本發(fā)明可以用于生產(chǎn)制劑，例如用于藥物、疫苗或抗毒素的生物制 品，其從本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞或它們的產(chǎn)物合成。所述生物制品可以用作 診斷、預(yù)防或治療劑。例如，本發(fā)明可以用于生產(chǎn)治療性蛋白，例如胰 島素。在優(yōu)選的實施方案中，所述設(shè)備和/或方法可以以一定方式循環(huán)，以 連續(xù)收集處于它們的未分化狀態(tài)的干細(xì)胞。此外，可以修飾培養(yǎng)條件， 以抑制干細(xì)胞的分化。例如，可以向培養(yǎng)基中加入干細(xì)胞分化抑制劑(例如，醛脫氫酶的抑制劑、磷酸肌醇3-激酶的抑制劑、TGF受體激酶抑制 劑、TGF-B受體激酶抑制劑等)?；蛘撸梢陨呋蚪档瓦^程條件，例如遞送給培養(yǎng)基的氧的量，以提高某些干細(xì)胞的生長和/或減慢或提高干細(xì) 胞的分化。由于有些細(xì)胞的生長需要基質(zhì)，可以向容器培養(yǎng)室中加入物理支持 物或結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實施方案中，可以在管內(nèi)加入連續(xù)支持物，如由薄 連續(xù)纖維樣支持物結(jié)構(gòu)構(gòu)成的連續(xù)纖維床，可以加入容器培養(yǎng)室中，其 允許細(xì)胞三維地生長。例如，所述支持物可以是纖維床，其提供細(xì)胞生 長的支持物，所述細(xì)胞例如干細(xì)胞、植物細(xì)胞和其它類型的偏好這種支 持物結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，或不可以懸浮生長，或作為粘附細(xì)胞生長，且在有些 特定的條件或條件變化中，以進行靶突變的天然選擇。在優(yōu)選的實施方案中，在本文引入作為參考的Huang等人, Continuous Production of butanol by Clostridium acetobutylicum immobilized in a fibrous bed reactor, Appl Biochem Biotechnol. 2004 Spring; 113-116: 887-98中所述的纖維狀材料。也可以改變管的結(jié)構(gòu)和 大小，以無需將支持物結(jié)構(gòu)摻入可移動的容器培養(yǎng)室。在優(yōu)選的實施方 案中，使用具有更小直徑的管，從而細(xì)胞可以以更天然的方式貼壁，或 將管用作天然支持物，無需有些粘附細(xì)胞的貼壁。該設(shè)備和方法允許研究人員和產(chǎn)物開發(fā)人員通過持續(xù)生長(連續(xù)培 養(yǎng))進化出可懸浮培養(yǎng)的活細(xì)胞的任意林或在管壁上或在支持物上生長 的不可懸浮培養(yǎng)的活細(xì)胞的任意抹，所述支持物可以是管中的纖維床； 得到的改進的細(xì)胞可以構(gòu)成新林或物種。通過培養(yǎng)過程中獲得的突變， 可以鑒別這些新細(xì)胞，且這些突變可以允許新細(xì)胞與它們的祖先基因型 特征區(qū)分開。該設(shè)備和方法允許研究人員通過下述選擇任意活細(xì)胞的新 抹通過天然選擇過程，分離具有提高的生殖率的個體。本發(fā)明也提供 了改進的和完全不同的方法和設(shè)備，其用于連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，例如真核生 物，(例如，酵母、真菌、植物細(xì)胞、藻類、動物細(xì)胞或干細(xì)胞)、原核 生物、古細(xì)菌和病毒。在另一個實施方案中，可以用發(fā)射體持久地或暫時地使細(xì)胞遭受至 少一個輻射波、光波、x射線、聲波、電磁場、放射性場、放射性介質(zhì) 或它們的組合。下面的出版物引入作為參考Biofizika. 2005 Jul-Aug, 50(4): 689-92; Bioelect畫agnetics. 2005 Sep, 26(6): 431-9; Chem Commun (Camb). 2005 Jan 14, (2): 174-6; Biophvs J. 2005 Feb, 88(2): 1496-9; Bioelect譲agnetics. 1981, 2(3): 285-9; Sb Lek. 1998, 99(4):455-64; Antimicrob Agents Chemother. 2004 Dec, 48(12): 4662-4; J Food Prot. 2003 Sep, 66(9): 1712-5; Astrobiologv. 2006 Apr, 6(2): 332-47; Life Sci Space Res. 1970， 8: 33-8; Adv Space Res. 1995 Mar, 15(3): 211-4; Radiat Res. 2006 May, 165(5): 532-7; Mutagenesis. 2004 Sep, 19(5): 349-54; Cancer Sci. 2006 Jun, 97(6): 535-9; Appl Environ Microbiol. 2006 May, 72(5): 3608-14;和Pol J Microbiol. 2005, 54 S卿l: 7-11。在另 一 個實施方案中，可以使設(shè)備的生長室區(qū)域使細(xì)胞持久地或暫 時地處于不同重力。例如，可以在樣i重力環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞。下面的出版 物引入作為參考J Gravit Physiol. 2004 Mar; 11(1): 75-80; Immunol Rev. 2005 Dec; 208: 267-80;和J Gravit Physiol. 2004 Jul; 11(2): P181-3。本領(lǐng)域技術(shù)人員從本發(fā)明的前面的詳述，顯而易見與裝置和方法有 關(guān)的本發(fā)明的修飾和變化。這些修飾和變化意在落入所附權(quán)利要求書的 范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.用于以連續(xù)方式培養(yǎng)活細(xì)胞的設(shè)備，其包含裝有培養(yǎng)基的柔性管和表面，活細(xì)胞在其中可以懸浮生長或不懸浮生長，粘附或不粘附，其中所述管是透明的或半透明的，以測量濁度；和夾子系統(tǒng)，各自能處于打開和關(guān)閉位置，夾子這樣放置從而使得能將管分成i)裝有未使用的培養(yǎng)基的上游區(qū)域；ii)裝有用過的培養(yǎng)基的下游區(qū)域；和iii)置于所述上游和下游區(qū)域之間的用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的生長室區(qū)域；其中所述夾子系統(tǒng)被構(gòu)造和排列以打開和關(guān)閉，以便打開在管的上游和下游區(qū)域之間的管的生長室區(qū)域的夾子和限定在管的上游和下游區(qū)域之間的管的生長室區(qū)域，且周期性地重新限定管的生長室區(qū)域，從而使得以前限定的生長室區(qū)域的第一部分變成管下游區(qū)域的部分，且以前限定的管的上游區(qū)域的部分變成管的生長室區(qū)域的部分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的設(shè)備，其中所述夾子系統(tǒng)被構(gòu)造和排列，從而 當(dāng)所述夾子處于關(guān)閉位置時，每個夾子不相對于管運動。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的設(shè)備，其中所述表面是管的內(nèi)表面。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的設(shè)備，其中所述表面是插入管內(nèi)的連續(xù)支持物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的設(shè)備，其中所述表面是連續(xù)纖維。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5之一的設(shè)備，其中所迷管是透氣的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l-5之一的設(shè)備，其中所述管是不透氣的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l-7之一的設(shè)備，其中所迷管包含硅氧烷或任意柔 性材料。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l-8之一的設(shè)備，其中所述設(shè)備另外包含壓力調(diào)節(jié) 器，所述調(diào)節(jié)器被構(gòu)建以改變管的生長室部分相對應(yīng)環(huán)境壓力的壓力。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l-9之一的設(shè)備，其中所述管包含pH指示劑。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l-10之一的設(shè)備，另外包含溫度調(diào)節(jié)器，所述調(diào) 節(jié)器被構(gòu)建以允許控制管的生長室區(qū)域的溫度。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11之一的設(shè)備，其中所述設(shè)備另外包含攪拌器，所述攪拌器被構(gòu)建以允許攪拌管的生長室部分。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的設(shè)備，其中所述攪拌器包含至少一個攪拌棒。
14. 根據(jù)權(quán)利要求l-13之一的設(shè)備，另外包含發(fā)射體，所述發(fā)射體 被構(gòu)建以使生長培養(yǎng)室區(qū)域遭受下述的至少一個輻射波、光波、x射 線、聲波、電磁場和放射性場。
15. 根據(jù)權(quán)利要求l-14之一的設(shè)備，另外包含使生長室區(qū)域遭受不 同重力的工具。
16. 根據(jù)權(quán)利要求l-15之一的設(shè)備，其中所述生長室區(qū)域包含一個或多個裝有培養(yǎng)基的生長室。
17. 根據(jù)權(quán)利要求l-16之一的設(shè)備，另外包含用于測量管內(nèi)的濁度的濁度計。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17的設(shè)備，其中每個夾子可繞著關(guān)于所述設(shè)備 的固定軸旋轉(zhuǎn)移動，從而能移動管。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18之一的設(shè)備，另外包含在管組合物或襯里中 的pH指示劑，以允許測量培養(yǎng)基的pH。
20. 根據(jù)權(quán)利要求l-19之一的設(shè)備，另外包含傾斜裝置，以使生長 室管向下傾斜以去除聚集的細(xì)胞，或向上傾斜以去除空氣。
21. 根據(jù)權(quán)利要求l-20之一的設(shè)備，其中所述設(shè)備允許連續(xù)培養(yǎng)細(xì) 胞，其中所述細(xì)胞是真核生物、原核生物、古細(xì)菌和病毒，其中所述細(xì) 胞不在培養(yǎng)基中懸浮生長，或不在管中懸浮生長。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1-21之一的設(shè)備，其中所述設(shè)備允許連續(xù)培養(yǎng)細(xì) 胞，其中所述細(xì)胞是真核生物、原核生物、古細(xì)菌和病毒，且其中所述 細(xì)胞作為粘附細(xì)胞生長。
23. —種以連續(xù)方式培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包含a)提供柔性的、透明的或半透明的裝有培養(yǎng)基的管和表面，其中活 細(xì)胞可以在所述管中生長，和夾子系統(tǒng)，每個夾子能處于打開和關(guān)閉位 置，夾子這樣放置從而使得能將管分成i) 裝有未使用的培養(yǎng)基的上游區(qū)域；ii) 裝有用過的培養(yǎng)基的下游區(qū)域；和iii) 置于所述上游和下游區(qū)域之間的用于培養(yǎng)所述細(xì)胞的生長室區(qū)域；b)用濁度計或測量濁度的其它裝置測量管內(nèi)的濁度；C)關(guān)閉選擇的管上的夾子，以限定在管的上游和下游區(qū)域之間的管生長室區(qū)域，和將活細(xì)胞引入生長室區(qū)域；d) 監(jiān)控管內(nèi)的濁度，直到得到培養(yǎng)物的有關(guān)的需要的生長；e) 周期性地關(guān)閉和打開所選夾子，以重新限定管的生長室區(qū)域，從 而使得以前限定的生長室區(qū)域的第一部分變成管下游區(qū)域的部分，且以 前限定的管的上游區(qū)域的部分變成管的生長室區(qū)域的部分；和f) 重復(fù)步驟e),直到已經(jīng)培養(yǎng)足夠量的細(xì)胞。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其包含從下游區(qū)域的所述培養(yǎng)基取出 一些活細(xì)胞的額外步驟。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，另外包含從下游區(qū)域分離所述 活細(xì)月包。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23-25之一的方法，其中所述活細(xì)胞選自藻類、 真菌、酵母細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞和干細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述活細(xì)胞是干細(xì)胞。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述活細(xì)胞選自造血干細(xì)胞、 骨髓干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、 胎兒干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、胎盤衍生的干細(xì)胞和成年干細(xì)胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求23-28之一的方法，其中細(xì)胞生長的表面是管的 內(nèi)表面。
30. 根據(jù)權(quán)利要求23-29之一的方法，其中細(xì)胞生長的表面是連續(xù)纖維。
31. 根據(jù)權(quán)利要求23-30之一的方法，另外包含在生長室區(qū)域中存 在的一個或多個生長室中培養(yǎng)細(xì)胞。
32. 根據(jù)權(quán)利要求23-31之一的方法，另外包含在生長室區(qū)域培養(yǎng) 一個或多個類型的細(xì)胞。
33. 根據(jù)權(quán)利要求23-32之一的方法，其中所述管是透氣的。
34. 根據(jù)權(quán)利要求23-32之一的方法，其中所述管是不透氣的。
35. 根據(jù)權(quán)利要求23-34之一的方法，另外包含調(diào)節(jié)管的生長室部 分相對應(yīng)環(huán)境壓力的壓力。
36. 根據(jù)權(quán)利要求23-35之一的方法，另外包含測量生長室區(qū)域中 培養(yǎng)基的pH。
37. 根據(jù)權(quán)利要求23-36之一的方法，另外包含用溫度調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié) 生長室區(qū)域的溫度，所述溫度調(diào)節(jié)器被構(gòu)建以控制管的生長室區(qū)域的溫度。
38. 根據(jù)權(quán)利要求23-37之一的方法，另外包含用攪拌器攪拌生長 室區(qū)域中的培養(yǎng)基。
39. 根據(jù)權(quán)利要求23-38之一的方法，其中所述攪拌器包含至少一 個攪拌棒。
40. 根據(jù)權(quán)利要求23-39之一的方法，另外包含使生長培養(yǎng)室區(qū)域 遭受下述的至少一個輻射波、光波、x射線、聲波、電磁場和放射性 場。
41. 根據(jù)權(quán)利要求23-40之一的方法，另外包含使生長室區(qū)域遭受 不同重力。
42. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中步驟e)允許如下稀釋提供特定 量的來自上游區(qū)域的新鮮培養(yǎng)基進入生長室，同時通過所述生長室的另 一個末端，從生長室分離和取出等量的培養(yǎng)物到下游區(qū)域。
43. 根據(jù)權(quán)利要求23或42的方法，其中步驟e)另外包含在每個生 長周期之間移動管，從而使得生長室管與未使用的培養(yǎng)基的導(dǎo)入一起更 新，從而預(yù)防耐稀釋群體的可能的增殖，同時避免分離的生長室的可能 的污染。
44. 根據(jù)權(quán)利要求23-43之一的方法，其中所述細(xì)胞不懸浮生長。
45. 根據(jù)權(quán)利要求23-44之一的方法，其中所述細(xì)胞作為粘附細(xì)胞 生長。
全文摘要
用于以連續(xù)方式培養(yǎng)植物細(xì)胞、動物細(xì)胞或干細(xì)胞的方法和設(shè)置。
文檔編號C12M1/24GK101517063SQ200780036125
公開日2009年8月26日 申請日期2007年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者尤德斯·德克雷西 申請人:尤德斯·德克雷西