專利名稱：：通過實時聚合酶鏈反應(yīng)探測和同時進行多重量化病原體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：從其本質(zhì)上講，這項新的發(fā)明是一項用來對于病原體進行多量化實時檢測、鑒定的新技術(shù)。特別值得一提的是，本項發(fā)明提供的這種技術(shù)通過使用多聚酶鏈實時反應(yīng)，進行大規(guī)模擴展增殖，可以對所有病原體進行多量化實時檢測鑒定，比如李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌、大腸桿菌0157:H7，以及可以檢測出這四種病原體在樣品中組合出現(xiàn)的情況。
背景技術(shù)：
：實際上，針對這些容易通過飲食傳播的這些病原體，(比如說李斯特菌，金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌0157:H7)的檢測，是醫(yī)學(xué)界和公共衛(wèi)生學(xué)界長期以來的一項重大任務(wù)。不但如此，農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)的原材料以及初級產(chǎn)品的生產(chǎn)商、經(jīng)銷商對于這些病原體的檢測也非常關(guān)注，同樣顯示出濃厚的興趣?；谶@個原因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多對于這些病原體進行檢測和鑒定的技術(shù)。目前在使用的諸多檢測這些病原體的技術(shù)中，比較有效的一種方法是以分子技術(shù)為基礎(chǔ)的。這種技術(shù)使用多聚酶鏈反應(yīng)進行反應(yīng)，這項技術(shù)就是目前為人們所熟知的PCR技術(shù)。特別是在對于很多送檢驗樣品的檢測和鑒定中，這項技術(shù)是被認為是一種可以以最快的速度并且最靈敏的精度的檢測出病原體核酸的技術(shù)。我們可以在凱瑞-比-慕伊斯的在美國專利部門申請的一系列專利美國專利-4683195，美國專利-4683202，美國專利-4800159,美國專利-4889818,美國專利-4965188,美國專利-5008182,美國專利-5038852,美國專利-5079352,美國專利-5176995,美國專利-5310652,美國專利-5310893,美國專利-5322770,美國專利-5333675,美8國專利-5352600,美國專利-5374553,美國專利-5386022,美國專利-5405774,美國專利-5407800,美國專利-5418149,美國專利-5420029中找到對于這項技術(shù)的這些描述。為了利用PCR技術(shù)針對病原體進行檢測，就必須在在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核普酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶來進行酶促合成反應(yīng)。在這個反應(yīng)中，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3'-OH末端，并以此為起始點，沿模板5'—3'方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。這就是PCR技術(shù)的基本才支術(shù)流程。由于使用PCR技術(shù)可以迅速而敏銳地在樣品中才企測出病原體個體的存在，同時使用這種4支術(shù)也可以才全測出樣品中大量病原體的具體數(shù)量。但是毫無疑問，使用PCR技術(shù)來同時對于同一份樣品中存在的多種病原體進行檢測仍然有很大的疑惑和困難。因為利用PCR技術(shù)同時進行一份樣品中多種病原體的檢測的障礙在于，由于使用了多種核苷酸序列，除了出現(xiàn)檢測結(jié)果需要的反應(yīng)外，還會出現(xiàn)其他多個交叉的反應(yīng)，從而影響檢測的結(jié)果精度。利用PCR技術(shù)，對于樣品中存在的病原體進行檢測和鑒定的相關(guān)敘述可以在下列的文件中找到約|#-維-司4敎卡的WO-0314704號國際專利申請，以及林曉沃等在美國的一系列專利美國專利-5612473,美國專利-5738995,美國專利-5753444,美國專利-5756701和美國專利-5846783.根據(jù)已經(jīng)公布的WO-0314704號國際專利申請中所做的相關(guān)技術(shù)流程敘述，這份專利申請涉及到了一種比較獨特的技術(shù)方法。通過這種技術(shù)方法，可以在一份樣品同時檢測出不同的彎曲桿菌屬的多種細菌。包括空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌在內(nèi)都可以^皮檢測出來。送^r的這些樣品可以是食物的樣品，也可以是水樣品，或者是一系列從送檢樣品的表層再次提取的樣品。這種方法使用擴展的PCR技術(shù)，并對寡核核苷酸的氣勢序列部分進行適當(dāng)?shù)男揎?。大量不同種類的病原體可以在同一次反應(yīng)中被檢測出來。在其它的一系列美國專利中美國專利-5612473,美國專利-5738995,美國專利-5753444,美國專利-5756701，美國專利-5846783描述了另外一種技術(shù)。通過這種技術(shù)，可以在同一份樣品中通過一次反應(yīng)，迅速的檢測出多種易傳染的病原體。這些可以被檢測出的易傳染的病原體包括沙門氏菌，痢疾桿菌，彎曲桿菌，大腸埃希氏菌和耶爾森氏菌以及大腸桿菌0157:H7.上述的這些專利中所敘述的這種技術(shù)的缺陷和限制在于，在寡核核苷酸和其他的核酸序列的擴展增殖過程中，允許寡核核苷酸和探針發(fā)生最少的交叉反應(yīng)。在現(xiàn)在已經(jīng)得到使用的，所有的這些分子技術(shù)中，有的技術(shù)已經(jīng)在檢測食品樣品中的病原體方面得到了商業(yè)化的應(yīng)用。有的技術(shù)通過DNA(基因單向追蹤技術(shù))，也可以得到非常靈敏的結(jié)果，但是整個過程要耗費將近50個小時。有的通過核酸擴展技術(shù)(巴克斯，佛慕斯-杜邦，布諾波利亞，賽諾菲巴斯德診斷)需要24個小時。上述的任何一種技術(shù)都不能在送出食品樣品的同一天得出檢測結(jié)果，也不能得出實時的鑒定報告。在上述的所有技術(shù)中，針對一些特定的病原體進行檢測，需要增加上述技術(shù)的靈敏度，以便得出迅速和可靠的檢測結(jié)果。由于食品中存在的病原體會對消費者的身體健康構(gòu)成威脅，為了界定食品中病原體的數(shù)量和濃度，所以在有的檢測中需要對于樣品中的病原體進行多量化的檢測。根據(jù)以上的這些敘述可以看出，無論是從食品工業(yè)的角度出發(fā)，還是從人類食品健康安全的角度出發(fā)，擁有一種可以在五個小時以內(nèi)，并且快速的檢測出樣品中是否存在病原體的技術(shù)是非常重要的?？梢詸z測出的病原體，應(yīng)該包括最重要的四種容易通過飲食或是公共場所傳播的病原體，比如說李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H。這種實時的多量化檢測技術(shù)是通過對于多聚酶鏈反應(yīng)來進行大量擴展應(yīng)用來實現(xiàn)的。這種技術(shù)擁有檢測成本低，耗時短，由于食品工業(yè)對于食品生產(chǎn)時間段有著嚴格的要求，因此這項技術(shù)對于食品工業(yè)也有著極其關(guān)鍵的意義和價值。發(fā)明概述上面已經(jīng)提到了多項技術(shù)，但是都存在著不足之處，為了找到改善上述技術(shù)的不足的方法，本發(fā)明提供了一種可以在同一份樣品或是多份混合樣品中，通過多聚酶鏈的反應(yīng)多量化實時檢測病原體的技術(shù)?？梢詸z測出的這些病原體包括最重要的李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H。本技術(shù)的整個流程是這樣的1,提取出樣本和測試樣本中的出現(xiàn)的DNA。2,準備需要多量化檢測的多種病原體的特殊反應(yīng)，也包括為了提取和識別病原體的而進行量化檢測而對DNA擴展酶進行激活。3，DNA擴展，通過使用PCR技術(shù)進行大規(guī)模擴展從而獲得不同的病原體所獨有的不同特殊反應(yīng)。4，實時的檢測出送檢樣品中是否有病原體的存在。5，為了提耳又和識別病原體的量化檢測，利用DNA擴展酶進行進行混合反應(yīng)，來鑒定李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H在樣品中存在的任何組合形式。(而這一步驟又包括如下的部分a,需要準備將要鑒定的寡核核苷酸的起始部分，標記為序列編號1和序列編號2以及序列編號3的探針，這個纟笨針是第一個目標核酸比如說李斯特菌核酸的起始序列進行反應(yīng)的。b,需要準備將要鑒定的寡核核苷酸的第二部分部分，標記為序列編號4和序列編號5以及序列編號6的探針，這個探針是和第二個目標核酸金黃色葡萄球菌核酸進行反應(yīng)的。C,需要準備將要鑒定的寡核核苷酸的第三部分部分，標記為序列編號7和序列編號8以及序列編號9的探針，這個探針是和第三個目標核酸空腸彎曲菌核酸進行反應(yīng)的。d,需要準備將要鑒定的寡核核苷酸的第四部分部分，標記為序列編號IO和序列編號11以及序列編號12的探針，這個4果針是和第四個目標核酸大腸桿菌0157:H核酸進行反應(yīng)的。)6，李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H在送檢樣品中會有很多組合存在形式。通過每個擴展產(chǎn)物中的熒光或是放射性特殊標示，每一種上述四種病原體的組合存在形式在送檢樣品中是否存在，就可以一皮4企測出來。我們的這項技術(shù)的另外一個目的是，可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號1,序列編號2和序列編號3所形成的核苷酸序列，而這個核苷酸序列已經(jīng)被選定而且得到識別。li我們的技術(shù)的目的之一是可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號4,序列編號5和NO的序列編號6所形成的核苷酸序列，而這個核苷酸序列也已經(jīng)凈皮選定而且得到識別。我們的技術(shù)的目的之一是可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號7，序列編號8和NO的序列編號9所形成的核苷酸序列，而這個核苷酸序列也已經(jīng)被選定而且得到識別。我們的技術(shù)的目的之一是可以提供這樣一種寡核核苷酸，它包含由順序編號10，序列編號ll和NO的序列編號12所形成的核苷酸序列，而這個核苷酸序列也已經(jīng)被選定而且得到識別。同上述的目標聯(lián)系在一起，本技術(shù)也可以提供一個已經(jīng)被識別的探針，這個探針包括序列編號3的寡核核苷酸，這個探針至少可以被用作一個標記。本技術(shù)也可以提供另外一個已經(jīng)被識別的探針，這個探針包括序列編號6的寡核核苷酸，這個探針至少可以被用作一個標記。本技術(shù)也可以提供另外一個已經(jīng)被識別的探針，這個探針包括序列編號9的寡核核苷酸，這個探針至少可以被用作一個標記。本技術(shù)也可以提供另外一個已經(jīng)被識別的探針，這個探針包括序列編號12的寡核核苷酸，這個探針至少可以被用作一個標記。最后，我們的這項技術(shù)發(fā)明也可以被用作是對一個送檢樣品的檢測做出最終的檢測結(jié)果。這項技術(shù)是通過多聚酶鏈的反應(yīng)，多量化實時檢測出李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H,以及這四種病原體在一份或是多份送檢樣品中的每一種組合存在形式。檢測結(jié)果包括1，根據(jù)已經(jīng)被識別的由順序編號1，序列編號2和序列編號3所形成的核苷酸序列，由順序編號4,序列編號5和NO的序列編號6所形成的核苷酸序列，順序編號7,序列編號8和NO的序列編號9所形成的核苷酸序列，來檢測一種或多種寡核核香酸的存在。2,根據(jù)已被識別的序列編號3所形成的核苷酸序列，序列編號6所形成的核苷酸序列，序列編號9所形成的核普酸序列，序列編號12所形成的核苷酸序列，來檢測擁有以上序列的寡核核苷酸所形成的探針。3，為了進行;險測，所需的其他成分和試劑。關(guān)于本技術(shù)發(fā)明的一些詳細特征，將在下面的段落里進行詳細的闡述。而且還有一些圖像作為佐證一并呈現(xiàn)出來。拿出這些圖像的目的是為了給本項發(fā)明做出一個清晰地界定，但是這些圖像的作用并不局限于此。圖像一展示了一條根據(jù)本項技術(shù)得出的，擁有刻度并且可以用于測算李斯特菌的曲線。在這張圖像上，Al是一個高濃度條件下得出的可供參考的曲線，A4是在一個低濃度條件下得出的可供參考的曲線。而為了更好地了解UFC/ml,在對一個樣品的數(shù)據(jù)圖像閱讀的時候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。圖像二展示了一條根據(jù)本項技術(shù)得出的、擁有刻度并且可以用于測算金黃色葡萄球菌的曲線。在這張圖像上，Al是一個高濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果，A4是在一個低濃度條件得出的下可供參考的結(jié)果。而為了更好的了解UFC/ml，在對一個樣品的數(shù)據(jù)圖的閱讀的時候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。圖像三展示了一條根據(jù)本項技術(shù)得出的、擁有刻度并且可以用于測算空腸彎曲菌的曲線。在這張圖像上，Al是在一個高濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果，A2是在一個低濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果。而為了更好的了解UFC/ml，在對一個樣品的數(shù)據(jù)圖像閱讀的時候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。圖像四展示了一條根據(jù)本項技術(shù)得出的、擁有刻度并且可以用于測算大腸桿菌0157:H7的曲線。在這張圖像上，Al是在一個高濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果，A3是在一個低濃度條件下得出的可供參考的結(jié)果。而為了更好的了解UFC/ml，在對一個樣品的數(shù)據(jù)圖像閱讀的時候，插入了其它可供參考樣品的數(shù)據(jù)圖像。發(fā)明詳述DNA擴展酶應(yīng)用這個術(shù)語，正如在本文現(xiàn)在的描述中所使用的一樣，這個術(shù)語指的是通過利用多聚酶鏈的反應(yīng)(PCR),在很多混合的DNA的序列中，對某一個DNA中的特定序列進行擴增的技術(shù)。而這個DNA的特定序列就是我們所說的目標序列，被大規(guī)模的擴展放大。起始部分這個術(shù)語，僅僅是局限的指寡核核苦酸的起始序列部分。而寡核核苷酸的這部分起始序列正是和目標序列互補連接的。寡核核苷酸的起始序列里包括了一個上游序列，而這個上游序列里的核酸和目標序列里的上游序列形成互補連接。而寡核核苷酸的起始序列也包括了一個下游序列，這個下游序列里的核酸也和目標序列里的下游序列形成了互補連接。大量擴增反應(yīng)這個術(shù)語的的意思，正如在本文現(xiàn)在的描述中所使用的一樣，是一種基于PCR技術(shù)而進行的擴增過程。這個擴增過程是對于某個特定的送檢樣品中的許多目標DNA序列進行擴增。在本項新的技術(shù)發(fā)明中，通過利用PCR技術(shù)，利用多聚酶鏈的反應(yīng)，多量化可以實現(xiàn)實時才企測到四種病原體。同其他的技術(shù)相比，本項4支術(shù)不需要對于要檢測的病原體預(yù)先進行增殖培養(yǎng)，也不需要為每個要檢測的病原體準備許多具有它們各自特殊反應(yīng)的試管。需要特別強調(diào)的是，本項技術(shù)發(fā)明在實時檢測四種病原體方面實現(xiàn)了巨大的突破，遠遠的超越了其他技術(shù)，而且大大的節(jié)省了化驗分析的時間，最短只需2.5個小時，就可得出檢測結(jié)果。本技術(shù)只需要一份混合的特殊反應(yīng)試劑，而不像其他技術(shù)，需要很多份這樣的試劑。除了使用本技術(shù)檢測的靈敏度非常高以外，對于樣品的準備(已經(jīng)包括在2.5個小時以內(nèi))也有助于獲得更好地檢測結(jié)果，因為不存在那些可能對擴展過程產(chǎn)生不利影響的因素，這些因素已經(jīng)被消除。本項技術(shù)發(fā)明提供的這種方法，能夠?qū)τ谶@些容易通過飲食傳播和公共場所環(huán)境傳播的這些病原體(比如說李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7),在一份或是多份送檢的食物樣品，水樣品或是其他樣品中，通過利用多聚酶鏈的反應(yīng)進行大規(guī)模的擴展增殖，從而對送檢樣品進行多量化實時檢測和鑒定。送檢的樣品可以是任何類型的樣品，只要想知道這份樣品是否被上述四種病原體所污染，就可以進行檢測。在特定的情況下，我們所提到的樣品一般是指食物樣品，比如說，肉制品和乳制品，或是表層材料和收到污染的環(huán)境空氣材料。寡核核香酸序列的模本和信息庫本項技術(shù)發(fā)明里提到的寡核核香酸，它們被使用的目的是在鑒別一份送檢樣品中，檢測出李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7的特異性存在。免除可能出現(xiàn)的，在一份送檢樣品中還有其他的病原體，測驗結(jié)果被其他病原體的存在而被干擾的情況。首先需要掌握將要進行檢測的四種病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7),每一種病原體的寡核核苷酸起始序列。而這些寡核核香酸起始序列都擁有一個它們本身所形成的一個上游序列，而這個特意強調(diào)出來的上游序列是和目標核酸的5，頂端序列所形成互補鏈接的。而這些起始序列也擁有一個它們本身所有的下游序列，而這個特別需要強調(diào)的下游序列是和目標核酸的3，頂端序列形成互補鏈接的。這些核酸的序列應(yīng)該擁有所要檢測的這些病原體所各自擁有的寡核核香酸的起始序列部分。因此，對于每個要檢測的病原體，經(jīng)過這些過程，它們所擁有的這些寡核核苷酸都已經(jīng)在測驗中形成了一條新的合成鏈接。合成的這些寡核核苷酸詳細的見于圖表1:識別類型類型病原體種類核香酸序列序列編號1"上游"起始序列F#膽#CTTGACATCCTTTGACCACTCTG序列編號2"下游"起始序列RGACTTAACCCAACATCTCACGAC序列編號P試驗，麟謬AGCTGACGACAACCATGCACCACC序列編號4"上游"起始序列FAACAAAACAGACCATCTTTAAGCG序列編號6P試驗會#惑葡萄諒^"ACTCAACCGACGACACCGAACCCT序列編號"上游"起始序列FGCAGCAGTAGGGAATATTGCG15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>圖表l在本技術(shù)發(fā)明中所推薦使用的是序列編號3,序列編號6,序列編號:9，序列編號12的序列，它們是被用作檢測探針。它們的5'序列頂端被做了熒光處理，或是被一種可以放射能量的染料做處理。它們的3，序捕獲列頂端被去掉了熒光，或是#皮一種可以捕獲焚光放出的能量的染料處理。為了檢測和鑒定出李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌以及大腸桿菌0157:H7，這些具有熒光的和沒有熒光的序列是^t用作標記，他們之間是沒有交叉反應(yīng)的。而其他的組成部分，在表2里都清楚的顯示了出來<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>圖表2一份或多份送檢樣品中DNA材料的準備為了按照本項技術(shù)發(fā)明創(chuàng)造的方法進行檢測，需要按照如下的步驟對于送4企樣品進行進行準備首先取一段待檢測的樣品，食物樣品或是其它的樣品，隨后把待檢樣品浸入鹽水溶液中，讓樣品懸浮其中。隨后將對于樣品進行離心處理，從而獲得第一層的沉積物。不過為了后續(xù)的步驟，要除去這層沉積物里所帶的溶液里的水分。在得到送纟企樣品的沉積物之后，用溶菌酶對于這些沉積物中進行處理，從而破壞沉積物中的細胞的細胞壁，在隨后的步驟里，用蛋白酶K來對加過溶菌酶的沉積物進行處理，從而使蛋白質(zhì)成分完全水解成氨基酸，包括前一步使用的溶菌酶也會被蛋白酶水解掉。在除去蛋白質(zhì)成分和其他脂溶性化合物之后，應(yīng)該通過氯仿-酒精-苯酚處理的溶劑進行處理。在取出來經(jīng)過處理的樣品之后，就立即的噴灑乙醇溶液。然后加入乙醇溶液迅速攪拌，隨后需要的DNA就從溶液中析出，而這樣得出大量的DNA應(yīng)該做靜置處理。最后，把得到的大量DNA在大約65攝氏度的溫度條件下進行加熱處理，使在樣品中得到的這些DNA能夠迅速的溶解。在每一個實驗過程中的有關(guān)聯(lián)的因素，都被相關(guān)的試驗所反復(fù)證實。比如加入試劑的數(shù)量，自旋孵化的時間，反復(fù)洗滌，這次因素都被反復(fù)試驗，直到找到一個最好的條件。在準備樣品的整個過程中，應(yīng)該考慮到這樣的一個要求所有的試劑和樣品在整個過程中必須在冷卻的條件下存放。下面的部分將敘述準備一份或是多份樣品的示例步驟示例一在一份或是多份肉類制品或奶酪制品待檢樣品中提取所需DNA的全部過禾呈1.在一個容積是50ml的無菌的錐形管內(nèi)放置25g的待檢測食物樣品，同時加入40ml的無菌生理鹽水，鹽水的溫度保持在室溫條件下。2.把試管垂直放置10分鐘，以便使試管里的樣品充分沉淀3.處理樣品，用離心機以每分鐘3500轉(zhuǎn)速(min-1)離心處理樣品15分鐘，并且小心的取出上層清液，不要^s並到下面的沉積物。4.左右搖晃震蕩沉積物10秒鐘5.把全部的沉積物轉(zhuǎn)移到一個容積為2ml的無菌試管內(nèi)，用lml的無菌生理鹽水沖洗錐形試管，并把沖洗后的液體與沉積物合并在同一個無菌試管內(nèi)。6.以每分鐘14000轉(zhuǎn)(14000min")的速度，離心處理8分鐘。7.用自動吸量管吸取所有的上層清液。8.添加100pl，100mmol的Tris-HCl溶液，和30pg，pH=8的溶菌酶，震蕩混合10秒鐘。9.在37攝氏度的水溫中，水浴加熱30分鐘。10.添加100pl的TEIX溶液，和1%SDS溶液，以及3fd的K蛋白酶(20mg/ml)。11.混合均勻，并且在55攝氏度的水溫條件下，水浴加熱30分鐘。12.添加500^1苯酚-氯仿-酒精異戊溶液(配置比例為24:24:1)，再加入100TEIX，并且倒置震蕩5分鐘。13.以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度(min")離心處理8分鐘，并且從末層向另外的一個試管轉(zhuǎn)移250^。14.添加582.5(il的無水乙醇，并且在冰箱里冷藏j呆存10分鐘。15.以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度進行離心處理，時間是8分鐘。16.進行澄清和干燥處理。H.再次加入25^11的TE1X,確保底部的DNA也溶解掉。18.加熱15分鐘，溫度為65攝氏度。19.在室溫下靜置處理三十分鐘。示例二從空氣樣品和待檢物質(zhì)表層樣品中提取所需DNA的全部步驟。1.用一塊20cmx20cm無菌紗布在待檢測的樣品表面擦過，以便完成測-險的取樣過程。2.在無菌亞里積壓這塊紗布，-使里面的液體流出。4巴流出的液體倒入一個50ml的無菌錐形試管里，并且加入40ml的無菌生理鹽水。3.處理樣品，用離心機以每分鐘3500轉(zhuǎn)速(min")離心處理樣品15分鐘，并且小心的耳又出上層清液，不要石並到下面的沉積物。4.左右震蕩晃動沉積物IO秒鐘5.把全部的沉積物轉(zhuǎn)移到一個容積為2ml的無菌試管內(nèi)，用lml的無菌生理鹽水沖洗錐形試管，并4巴沖洗后的液體與沉積物合并在同一個無菌試管內(nèi)。6.以每分鐘14000轉(zhuǎn)(14000min-1)的速度，離心處理8分鐘。7.用1.5ml的無菌生理鹽水再清洗兩遍。8.用自動吸量管吸取所有的上層清液。9.添加100nl，100mmol的Tris隱HCl溶液，和30pg，pH=8的溶菌酶，震蕩混合]O秒鐘。10.在37:攝氏度的水溫條件下，水浴加熱30分鐘。11.添加100pl的TE1X溶液，和P/oSDS溶液，以及3pl的K蛋白酶(20mg/ml)。12.混合均勻，并且在55攝氏度的水溫條件下，水浴加熱30分鐘。13.添加50(^1苯酚-氯仿-酒精異戊溶液(配置比例為24:24:1)，再加入lOO^lTElX,并且倒置震蕩5分鐘。14以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度(min-1)離心處理8分鐘，并且從末層向另外的一個試管轉(zhuǎn)移250pl。15.添加582.5的無水乙醇，并且在冰箱里冷藏保存10分鐘。16.以13500轉(zhuǎn)每分鐘的速度進行離心處理，時間是8分鐘。1917.進行澄清和千燥處理。18.再次加入25pl的TEIX，確保底部的DNA也溶解掉。19.加熱15分鐘，溫度為65攝氏度。20.在室溫下靜置處理三十分鐘?；旌戏磻?yīng)的準備過程在取得一份或者多份DNA樣本之后，就開始準備混合反應(yīng)所需要的各種試劑，需要用到的試劑見于表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>圖表3隨后的步驟，開始準備一個有100種成分參與的混合反應(yīng)，反應(yīng)所需的試劑見于表格四4:混合反應(yīng)將會用到的試劑每種反應(yīng)需要添加的試劑的量(jil)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表格4應(yīng)該通過將試劑倒置震蕩的方法，使試劑混合均勻。并且利用多種方法配置19.75^的溶劑。其中有0.5ml的試劑應(yīng)該在避光的條件下冷藏保存。利用PCR大規(guī)模擴展增殖技術(shù)實時多量化檢測鑒定多種病原體本項技術(shù)發(fā)明提供的方法，即使用PCR實時大規(guī)模擴展增殖技術(shù)，和其它的只對一種目標進行檢測的常規(guī)PCR技術(shù)相比，擁有極其明顯的優(yōu)勢。利用PCR大規(guī)模擴展增殖技術(shù)進行反應(yīng)，需要對于寡核核苷酸的起始序列進行擴增反應(yīng)，而對于和要檢測的病原體的目標序列有特殊反應(yīng)的探針，也同樣要進行擴增反應(yīng)。通過這種方法，在40攝氏度到65攝氏度的這個溫度區(qū)間，寡核核苷酸的起始序列和探針是可以兼容存在的，也可以在相同的條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，最后允許出現(xiàn)雜交或是聯(lián)結(jié)。通過這種雜交，兩段互補的核酸序列聯(lián)結(jié)在了一起。于此同時，在整個擴展增殖過程中，寡核核苷酸的起始序列和探針卻不能夠和其他任何別的的核酸序列，發(fā)生任何類型的交叉反應(yīng)或是聯(lián)結(jié)反應(yīng)。綜上所述，接下來所有別的寡核核普酸的起始序列，都被用來和其它的，要檢測的目標病原體的核酸進行反應(yīng)。一對用來鑒定李斯特菌的寡核核苷酸序列，即所知的序列編號1和序列編號2，這組寡核核苦酸會被用來和李斯特菌的基因組中的序列進行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。一對用來鑒定金黃色葡萄球菌的寡核核苷酸序列，即所知的序列編號4和序列編號5，這組寡核核香酸會被用來和金黃色葡萄球菌的基因組中的序列進行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。一對用來鑒定空腸彎曲菌的寡核核普酸序列，即所知的序列編號7和序列編號8，這組寡核核香酸會被用來和空腸彎曲菌的基因組中的序列進行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。一對用來鑒定大腸桿菌0157:H7的寡核核苷酸序列，即所知的序列編號7和序列編號8,這組寡核核苷酸會被用來和大腸桿菌0157:H7的基因組中的序列進行雜交反應(yīng)和聯(lián)結(jié)反應(yīng)。在利用PCR技術(shù)大規(guī)模實時擴展增殖技術(shù)中所使用的鑒定探針，即序列編號3,序列編號6,序列編號9，序列編號12。這些核酸序列是被雙重標示的寡核核苷酸。這些寡核核苷酸和經(jīng)過大規(guī)模擴展后的核酸序列——互補對應(yīng)，形成新的鏈接。每個探針的在它的5'頂端被熒光，或是能夠放射能量的染料標示，而每個探針的3，頂端都被暗淡的，或是能夠吸收上述染料放出能量的另外一種染料所標示。對于這一點，納撒倫科在他的美國專利5866336號里有提及到。他在專利里寫到了能夠轉(zhuǎn)移能量的熒光物質(zhì)，以及在核酸大規(guī)3莫擴展技術(shù)里，這種物質(zhì)怎么樣在寡核核香酸里得到應(yīng)用的。在本技術(shù)發(fā)明提供的方法里，使用的熒光物質(zhì)是TET,TxR,Cy5,FAM，而在這個測驗過程中使用的吸收能量的物質(zhì)是BHQ-l,BHQ-2yBHQ-3.在檢測過程中被用作探針的寡核核苷酸序列(序列編號3，序列編號6,序列編號9，序列編號12)都根據(jù)上文所提到的表格二中的組合，在它們的3'和5'頂端做了標示。在本技術(shù)發(fā)明提供的方法里，用作大規(guī)模擴展的DNA樣本是在下列的條件下準備的乳制品樣品和空氣的送檢樣品:解凍小瓶溶液需用預(yù)先準備19.75^的混合溶液，并且添加0.25pi的嗜熱DNA聚合酶，4pl的水和1^待檢測分析的DNA。肉制品和奶酪制品的送檢樣品:解凍小瓶溶液需用預(yù)先準備19.75pl的混合溶液，0.25nl的嗜熱DNA聚合酶，和5pl待檢測分析的DNA。利用PCR大規(guī)才莫擴展增殖技術(shù)進行反應(yīng)的時候，需要有一種儀器來控制實時的大規(guī)模擴展增殖過程。羅塞爾-沃斯頓在他已經(jīng)公布的歐盟專利EP-640828里對于這種儀器有所有所描述。這個儀器的主要構(gòu)成是一個可以把大量進行待檢測病原體DNA擴增的試管放入其中的儀器架。儀器架上的專用光源，為儀器架上的多個試管提供光源，以及一個熒光探測器，可以實時纟全測釋^:的萸光。為了多量化檢測樣品里存在的微生物，需要制出每種待檢測病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H)在溶液中的存在數(shù)量的曲線。通過對試管的渾濁度調(diào)整0.5個McFarland單位，并且將溶液稀釋為10",10-2,l(T3，104,105,106,107y108的倍數(shù)，隨后用25g的待檢食物樣品加入到每份溶液中，每份溶液都加入同樣份額的樣品。接著進行DNA樣本的提取，并且記錄下每瓶不同溶液的反應(yīng)，確定不同的溶液里相對應(yīng)的病原體的數(shù)量。最后在圖像上加上單位cT和ug/g,最后就得到了一條溶液中病原體數(shù)量的曲線。李斯特菌的曲線見于圖像一，金黃色葡萄球菌的曲線見于圖像二，空腸彎曲菌的曲線見于圖像三，大腸桿菌0157:H的曲線見于圖像四。在本技術(shù)提供的方法里，使用到的儀器包括實時檢測焚光的焚光探測儀，可以實時檢測大規(guī)^莫擴展增殖過程的儀器。在這個流程中使用到的一種儀器是賽普伊德公司生產(chǎn)的"靈敏循環(huán)儀"。通過DNA多量化實時^r測鑒定樣品中的病原體這四種病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H)可能在樣品中出現(xiàn)的所有組合形式，存在與否都能夠^皮檢測出來。檢測的結(jié)果很直觀的由樣品里的DNA所具有的不同熒光或是放射性的焚光標志顯現(xiàn)出來。因此要確定不同熒光的波長，這樣就可以容易得辨別出哪種熒光是由哪種DNA所發(fā)射出的。檢測結(jié)果根據(jù)本技術(shù)提供的方法，圖表五顯示了結(jié)束整個大規(guī)模擴展步驟的條件，圖表六顯示了檢測可以達到的水平，圖表七顯示了讀取出的檢測結(jié)果里的四種病原體(李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H)的濃度，檢測結(jié)果分別來自冷肉，乳制品和從表層獲取的樣品，通過利用一種單一的混合試劑，在相同溫度下四種來自不同病原體的寡核核苷酸在擴增的過程中進行混合。當(dāng)然，圖像一二三四也顯示了多量化檢測結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>特定的四種病原體中的每一個病原體進行多量化實時檢測。根據(jù)不同情況量化實時檢測(僅僅使用寡核核苷酸起始序列部分和對應(yīng)的探針)。本技術(shù)所提供的方法所使用的相關(guān)的試劑，包括可以裝在盒子里的核酸序列，或是前面提到過的一些裝有寡核核苷酸起始部分序列或是探針的器皿。為了完成檢測，應(yīng)該擁有下列的條件一些裝有全部或是部分試劑的容器，以及純凈無菌水，NTPs(dATP,dCTP,dGTP,ydTTP),擴展酶法適當(dāng)?shù)难a充和儲備，一種嗜熱DNA聚合酶(比如說,DNA聚合酶Taq),—種鎂鹽(比如MgCl2)。上述的這些都應(yīng)該根據(jù)需要進行相關(guān)的配置和補充。此外根據(jù)本技術(shù)的提供的方法所使用的試劑，還包括盛有李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H的器皿，來作為陽性對照的比對。根據(jù)上文所述，為了進行上述的檢測，已經(jīng)敘述了很多檢測的步驟和程序。在這些檢測過程中，應(yīng)該對于所有需要的這些條件進行最大的改善，以期得到最好的檢測結(jié)果。包括上文所敘述的這些檢測的步驟和檢測的條件，這些都不是不會發(fā)生變化的。以上的這些敘述，都可能會有改正的余地，這些由我們負責(zé)，這一點需要格外的注意。權(quán)利要求1.對于檢測和同時進行的多重量化任何病原體(這些病原體是從由李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌O157H7組成的小組中選擇的)在一個或多個測試樣品中，通過復(fù)合擴增反應(yīng)實時作用于聚合酶鏈反應(yīng)的方法，包括以下幾個步驟a)現(xiàn)場提取上述樣品或試驗樣品的DNA；b)準備上述病原體的特有反應(yīng)混合物來檢測和量化，該反應(yīng)混合物包括對于提取的DNA的酶的擴增的必要試劑和對這些病原體的檢測和量化的鑒定；c)通過作用于聚合酶的復(fù)合擴增反應(yīng)，增強該混合物的反應(yīng)；d)同時確定這些病原體在上述樣品或檢驗樣品的存在與否和量化；其中i)該反應(yīng)混合物對于提取的DNA酶的擴增和任何李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和/或大腸桿菌O157H7的組合的檢測和量化包括第一對寡核苷酸序列確定為標識符編號1和編號2，探針確定為順序編號3，這些是越過或捆綁第一個目標的核酸序列的李斯特桿菌；第二對寡核苷酸序列確定為標識符編號4和編號5，探針確定為順序編號6，這些是越過或捆綁第二個目標的核酸序列的金黃色葡萄球菌；第三對寡核苷酸序列確定為標識符編號7和編號8，探針確定為順序編號9，這些是越過或捆綁第三個目標的核酸序列的空腸彎曲菌；第四對寡核苷酸序列確定為標識符編號10和編號11，探針確定為順序編號12，這些是越過或捆綁第四個目標的核酸序列的大腸桿菌O157H7；ii)這些病原體在上述樣品或檢驗樣品中的李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌O157H7的任一組合的存在與否和量化是由一種熒光信號或每個病原體特有熒光的發(fā)射決定的。2.如權(quán)利要求i所述的方法，其特征在于上述樣品或試驗樣品是一種加工食品的纟羊品或環(huán)境^羊品。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于現(xiàn)場從上述樣品或試驗樣品中提取DNA的過程包括這幾個步驟把試驗樣品放置于生理鹽水中；清除水溶性分子，并獲取濃縮物。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于反應(yīng)混合物包括至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號1;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號2;至少有50皮摩爾的寡核苷酸探測確定為序列編號3;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號4;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號5;至少有50皮摩爾的寡核苷酸探測確定為序列編號6;至少有300皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號7;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號8;至少有350皮摩爾的寡核苷酸探測確定為序列編號9;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號10;至少有200皮摩爾寡核苷酸發(fā)端確定為序列編號11;和\或至少有50皮摩爾的寡核苷酸探測確定為序列編號12。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于它列入了一次或多次探測來檢測產(chǎn)品或聚合酶鏈反應(yīng)增強的產(chǎn)品，其中每個探頭是和檢測李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和/或大腸桿菌0157:H7的任一組合的序列內(nèi)的序列相輔相成的。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第一個探針包括一個確定為序列編號3的寡核香酸，和至少一個才示j己。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于第一個探針在它的端點5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于上述熒光是四環(huán)素。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。10.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第二個探針包括一個確定為序列編號6的寡核香酸，和至少一個標記。11.如權(quán)利要求l0所述的方法，其特征在于第二個探針在它的端點5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。12.如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于上述熒光是TxR。13.如權(quán)利要求ll所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-2。14.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第三個探針包括一個確定為序列編號9的寡核香酸，和至少一個標記。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于第三個探針在它的端點5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該焚光振動發(fā)出的能量的染料標記。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于上述熒光是Cy5。17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-3。18.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于第四個探針包括一個確定為序列編號12的寡核苷酸，和至少一個標i己。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于第四個探針在它的端點5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于上述熒光是FAM。21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。22.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于上述這些探針都是在它的端點5'用熒光或能發(fā)射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于上述熒光是從由TET,TxR，Cy5和FAM組成的小組中選出的。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于上述阻尼器是從由BHQ-l,BHQ-2和BHQ-3組成的小組中選出的。25.—個寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核苷酸是^v那些確定為序列編號1，序列編號2和序列編號3的系列組成的小組中選出的。26.—個寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核香酸是乂人那些確定為序列編號4,序列編號5和序列編號6的系列組成的小組中選出的。27.—個寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核苷酸是>^人那些確定為序列編號7，序列編號8和序列編號9的系列組成的小組中選出的。28.—個寡核苷酸，其特征在于擁有一系列核苷酸，其中這系列核苦酸是^v那些確定為序列編號10,序列編號11和序列編號12的系列組成的小組中選出的。529.—次有標記的探測，其特征在于包括一個確定為序列編號3的寡核普酸和至少一個標記。30.如權(quán)利要求29所述的有標記的探測，其特征在于該探測在它的端點5'用熒光或能量射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。31.如權(quán)利要求30所述的有標記的探測，其特征在于上述熒光是TET。32.如權(quán)利要求30所述的有標記的探測，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。33.—次有標記的探測，其特征在于包括一個確定為序列編號6的寡核香酸和至少一個標^己。34.如權(quán)利要求33所述的有標記的探測，其特征在于該探測在它的端點5'用熒光或能量射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。35.如權(quán)利要求34所述的有標記的探測，其特征在于上述熒光是TxR。36.如權(quán)利要求34所述的有標記的探測，其特征在于上述阻尼器是BHQ曙2。37.—次有標記的探測，其特征在于包括一個確定為序列編號9的寡核苷酸和至少一個標記。38.如權(quán)利要求37所述的有標記的探測，其特征在于該探測在它的端點5'用熒光或能量射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。39.如權(quán)利要求38所述的有標記的探測，其特征在于上述熒光是Cy5。40.如權(quán)利要求38所述的有標記的探測，其特征在于上述阻尼器是BHQ-3。41.一次有標記的探測，其特征在于包括一個確定為序列編號12的寡核苷酸和至少一個標記。42.如權(quán)利要求4l所述的有標記的探測，其特征在于該探測在它的端點5'用熒光或能量射能量的染料標記，在它的端點3'用阻尼器或能捕獲該熒光振動發(fā)出的能量的染料標記。43.如權(quán)利要求42所述的有標記的探測，其特征在于上述熒光是FAM。44.如權(quán)利要求42所述的有標記的探測，其特征在于上述阻尼器是BHQ-1。45.用于檢測和同時進行的多重量化任何病原體(這些病原體是從由李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和大腸桿菌0157:H7組成的小組中選擇的)在一個或多個測試樣品中，通過復(fù)合擴增反應(yīng)實時作用于聚合酶鏈反應(yīng)的診斷試劑盒，其特征在于包含以下幾點根據(jù)權(quán)利要求25到權(quán)利要求28中的任何一個的情況而定的一個或多個核香酸；根據(jù)權(quán)利要求29到權(quán)利要求44中的任何一個的情況而定的一個或多個有標記的探測；用來完成試驗的其他試劑或所需成分。全文摘要李斯特菌，金黃色葡萄球菌，空腸彎曲菌和/或大腸桿菌O157∶H7的任一組合在一個或多個測試樣品中，通過復(fù)合擴增反應(yīng)實時作用于聚合酶鏈反應(yīng)的檢測和同時進行的多重量化的方法步驟是(a)從試驗樣品中現(xiàn)場提取DNA；(b)準備病原體的特有反應(yīng)混合物來檢測和量化，這樣，該反應(yīng)混合物包括對于提取的DNA的酶的擴增的必要試劑和對這些病原體的檢測和量化的鑒定；(c)通過作用于聚合酶的復(fù)合擴增反應(yīng)，發(fā)揮反應(yīng)混合物；(d)同時確定這些病原體在上述樣品或檢驗樣品的存在與否和量化，這個方法有其特殊性(i)對于DNA酶的擴增，此反應(yīng)混合物有幾對確定序列編號為1和2，序列編號4和5，序列編號7和8，序列編號10和11的寡核苷酸發(fā)端及確定序列編號為3，6，9，12的寡核苷酸序列探針；(ii)上述病原體在任何組合的存在與否和量化由一種熒光信號或每個病原體特有的熒光發(fā)射決定的。文檔編號C12Q1/68GK101432440SQ20078001476公開日2009年5月13日申請日期2007年4月19日優(yōu)先權(quán)日2006年4月24日發(fā)明者埃爾維拉·加爾薩·岡薩雷斯,弗朗西斯科·哈維爾·博格斯·帕迪拉,維克托·曼努埃爾·莫雷諾·卡帕娜申請人:西格馬食品可變資本有限公司