專利名稱：Mr-1作為腫瘤標(biāo)記物和靶分子在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腫瘤基因治療技術(shù)，具體而言，就是根據(jù)新發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)基因MR-1，通
過(guò)相應(yīng)手段，抑制其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)的影響，進(jìn)而闡明人類MR-1作為腫瘤診斷的新
標(biāo)記物和臨床治療的新靶點(diǎn)的可行性。
背景技術(shù)：
腫瘤的分子診斷與治療，是分子醫(yī)學(xué)的重要組成部分，已成為近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng) 域。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是人類基因組計(jì)劃的順利實(shí)施、人類基因組序列的剖析和 相關(guān)基因功能的識(shí)別，現(xiàn)在己經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的腫瘤分子標(biāo)記物以及^療靶點(diǎn)。
侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是患者死亡的主要原因?，F(xiàn)已對(duì)于這一復(fù)雜病理 過(guò)程有了深入的認(rèn)識(shí)。發(fā)現(xiàn)并證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的基因，成為當(dāng)前腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究 的熱點(diǎn)，因?yàn)檫@些基因及其蛋白，可能成為腫瘤診斷的標(biāo)記物和抗轉(zhuǎn)移治療的新靶點(diǎn)。
在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞自原發(fā)瘤體脫落后，降解基質(zhì)，穿越基底膜并進(jìn)入 血管內(nèi)，是完成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。而腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力，又是能否完成該過(guò)程的 重要因素，也是腫瘤侵襲周圍組織，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基本條件?，F(xiàn)在已知，腫瘤細(xì)胞在基質(zhì) 中的遷移由4個(gè)循環(huán)往復(fù)的步驟組成，即細(xì)胞頭部形成偽足，進(jìn)行延伸，之后與基質(zhì)之間建 立新的粘附位點(diǎn)，繼而胞體發(fā)生收縮，細(xì)胞尾部退縮，通過(guò)這種不斷重復(fù)的4個(gè)過(guò)程向前遷 移(Raftopoulou M, Dev Biol, 2004， 265: 23-32)。
首先，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞膜形成膜狀突起(例如板裝偽足和絲狀偽足)，即所謂 前緣突起。此為腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的起始步驟。接著，細(xì)胞持續(xù)的遷移，需依賴細(xì)胞偽足與 細(xì)胞夕l基質(zhì)(extracdlularmatrix, ECM)之間發(fā)生粘附，形成粘著斑，以作為細(xì)胞向前遷移的 支點(diǎn)。最后，細(xì)胞骨架發(fā)生重組，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞發(fā)生遷移時(shí)的持續(xù)運(yùn)動(dòng)，需要依靠張力纖維 收縮和肌動(dòng)蛋白絲的延長(zhǎng)提供動(dòng)力。張力纖維是真核細(xì)胞中一種穩(wěn)定的、平行排列的微絲結(jié) 構(gòu)，由肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等組成。肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白相對(duì)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的收縮 力，是細(xì)胞遷移動(dòng)力的主要來(lái)源。
對(duì)以上腫瘤遷移過(guò)程精確調(diào)節(jié)的分子機(jī)制十分復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)分子均參與其中。 如Rho GTP酶通過(guò)活化肌球蛋白參與對(duì)細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞與基質(zhì)粘附及細(xì)胞骨架重組的
調(diào)控(Wheeler AP, Exp Cell Res， 2004, 30:43-9), 由于其在許多惡性腫瘤中的高表達(dá)，Rho GTP酶可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床診斷指標(biāo)；粘著斑激酶FAK可通過(guò)自身磷酸化，在粘著斑 部位與paxillin (黏附有關(guān))以及Src (轉(zhuǎn)移/侵襲有關(guān))形成復(fù)合物(Nimwegen MJ, Bio Pharm. 2007, 73: 597-609),作為非受體蛋白酪氨酸激酶,FAK在多種腫瘤組織中表達(dá)都有顯著增加, 不失為一個(gè)有效的腫瘤治療新靶點(diǎn).；而肌球蛋白輕鏈2 (myosin light chain, MLC2)的磷酸化， 對(duì)于肌球蛋白的活化十分重要。MLC2磷酸化后，肌球蛋白即可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，促進(jìn)張力 纖維的聚合，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(Connell LE, J Cell Sci. 2006;119: 2269-81)。
上述這些信號(hào)分子之間存在復(fù)雜的聯(lián)系，例如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)需要細(xì)胞骨架蛋白的動(dòng)力學(xué)聚合 以及粘著斑的形成。另一方面，粘著斑以及張力纖維形成也有賴于肌球蛋白的激活。此外， 已知FAK925位酪氨酸發(fā)生磷酸化，F(xiàn)AK即可通過(guò)與Grb2結(jié)合，激活MAP激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路(Yamamoto D， Cell Signal, 2003; 15:575-83)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。
MR-1基因(肌纖基因調(diào)節(jié)因子)是本研究所發(fā)現(xiàn)的一種新的人類功能基因，由GenBank 收錄，收錄號(hào)為AF41700K MR-1 DNA位于人類染色體第二號(hào)染色體2q35位置上 (GeneBank收錄號(hào)為AC021016),跨越2887 bp片段長(zhǎng)度。MR-1基因存在三個(gè)不同剪切 方式的轉(zhuǎn)錄版本。本研究中的MR-1轉(zhuǎn)錄版本由3個(gè)外顯子組成，共7乂bp，編碼142個(gè)氨 基酸的蛋白。已有研究表明，MR-1在肌肉收縮單元中起著重要的調(diào)控作用。酵母雙雜交實(shí) 驗(yàn)以及蛋白體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，MR-1蛋白和參與肌肉收縮的蛋白如肌球蛋白重鏈組成蛋白 myomesinl、輕鏈蛋白MLC2以及p-烯醇化酶存在相互作用。
Myomesinl是紋狀肌M-band的組成部分，與p-肌球蛋白及其調(diào)節(jié)輕鏈均有相互作用； 輕鏈蛋白MLC2是肌原纖維粗纖維的組成蛋白，它的磷酸化在肌肉收縮中起著關(guān)鍵作用；p-烯醇化酶存在于紋狀肌M-band，與醛縮酶(aldolase)相互作用影響肌原纖維細(xì)纖維，從而 調(diào)節(jié)肌肉的收縮。所有這些結(jié)構(gòu)蛋白及其相互作用，對(duì)于肌肉細(xì)胞的構(gòu)成以及收縮功能的調(diào) 節(jié)都會(huì)產(chǎn)生重要影響。
由于腫瘤細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白間的相互作用產(chǎn)生的收縮力量可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的 運(yùn)動(dòng)，并且活化前述一系列包括FAK在內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此，MR-1有可能通過(guò)影響 MLC2的活化，在調(diào)節(jié)腫瘤遷移及增殖功能中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的某 些生物學(xué)行為存在密切關(guān)系?；虮磉_(dá)系列分析數(shù)據(jù)庫(kù)(SAGE)檢索結(jié)果也顯示，MR-1 基因在187個(gè)GSM文庫(kù)(含正常組織/細(xì)胞及癌組織/細(xì)胞)中均有表達(dá)，包括胚胎腎、腦、 卵巢、結(jié)腸、前列腺、胰腺、乳腺等多個(gè)組織及細(xì)胞系。其中MR-1在大部分卵巢癌、乳腺 癌、腦腫瘤以及前列腺癌組織/細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常組織/細(xì)脃，因此，MR-1有望成
為一個(gè)新的腫瘤診斷的標(biāo)記物和治療的靶分子。
本發(fā)明所述MR-1作為一個(gè)新的腫瘤診斷標(biāo)記物和治療靶分子的研究，迄今尚未見(jiàn)有相 關(guān)報(bào)道。
本發(fā)明目的在于，通過(guò)研究人類功能基因MR-1參與腫瘤細(xì)胞的遷移、生長(zhǎng)過(guò)程并在其
中發(fā)揮的重要調(diào)控功能，闡明人類MR-1與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，使MR-1成為腫瘤診斷
的新標(biāo)記物和治療的一個(gè)新耙點(diǎn)，進(jìn)而提供一種新的基因治療藥物用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先檢測(cè)了不同腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞中MR-1蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)了腫 瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中MR-1的轉(zhuǎn)錄水平，以證明和評(píng)價(jià)MR-1作為腫瘤診斷新標(biāo)記物和治療 靶點(diǎn)的可行性提供依據(jù)。為此，選擇了 MR-1表達(dá)水平較高的人肝癌HepG2細(xì)胞，根據(jù) GenBank中提供的MR-1序列(基因序列號(hào)為AF417001),選用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)，降低HepG2細(xì)胞中MR-1的表達(dá)，檢測(cè)MR-1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)、 黏附作用及運(yùn)動(dòng)功能的關(guān)系，證明以MR-1為腫瘤治療靶點(diǎn)，在基因水平或蛋白水平對(duì)其抑 制后，可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、黏附以及運(yùn)動(dòng)，因而有效抑制腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明為此提供了以下的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
1) 、 siRNA的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；
2) 、 Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞中MR-1的表達(dá)水平；
3) 、 RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中MR-1的轉(zhuǎn)錄水平；
4) 、生長(zhǎng)曲線法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖速率；
5) 、檢測(cè)MR-l對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分纖維粘連蛋白(Fibronectin， FN)的黏附能力 的影響；
6) 、檢測(cè)MR-1對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)趨化能力的影響;
7) 、體內(nèi)成瘤性比較實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果在于，證明了MR-l在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)高于正常細(xì)胞。降低 MR-1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、粘附及運(yùn)動(dòng)，并顯著抑制動(dòng) 物體內(nèi)的成瘤性，顯示MR-l有望成為腫瘤診斷和治療的新耙點(diǎn)，用于制備腫瘤診斷和治療 的新制劑。


圖l一不同腫瘤細(xì)胞中MR-1蛋白的表達(dá)水平；
圖2_ MR-1蛋白在人肝癌細(xì)胞以及不同人正常細(xì)胞中的表達(dá)水平；
圖3—人腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞中MR-1的轉(zhuǎn)錄水平；
圖4一瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA 300 nM對(duì)H印G2細(xì)胞中MR-1轉(zhuǎn)錄水平的影響 其中Control泳道一未轉(zhuǎn)染任何siRNA組； Mock泳道一轉(zhuǎn)染mock-siRNA組； MR-1-siRNA (1)泳道一轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA耙點(diǎn)1組； MR-1-siRNA (2)泳道—轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA耙點(diǎn)2組。
圖5—瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA 300 nM對(duì)H印G2細(xì)胞中MR-1蛋白水平的影響 其中Control泳道一未轉(zhuǎn)染任何siRNA組； Mock泳it一轉(zhuǎn)染mock-siRNA組； MR-l-siRNA (1)泳道一轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA耙點(diǎn)1組； MR-1-siRNA (2)泳道一轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA耙點(diǎn)2組。
圖6—低表達(dá)MR-1的H印G2/shMR-l穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建(Western blotting結(jié)果) 其中H印G2泳道一未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；
H印G2/shmock泳道一陰性對(duì)照細(xì)胞系； H印G2/shMR-1泳道一服-1穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系。
圖7— MR-1-siRNA和對(duì)人肝癌H印G2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 其中未轉(zhuǎn)染任何siRNA組； ~H~轉(zhuǎn)染mock-siRNA組；
▲ 轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA組。
圖8— H印G2/shMR-1細(xì)胞體外增殖速度的變化 其中H印G2—未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；
H印G2/shmock—陰性對(duì)照細(xì)胞系；
▲ H印G2/shMR-1—MR-l穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系。
圖9一 MR-l-siRNA對(duì)人肝癌H印G2細(xì)胞基質(zhì)粘附能力的影響
其中 未轉(zhuǎn)染任何siRNA組； —■I~轉(zhuǎn)染mock-siRNA組；
▲ 轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA組。
圖10—H印G2/shMR-1細(xì)胞的基質(zhì)黏附能力的變化 其中H印G2—未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；
HelpG2/shmock—陰性對(duì)照細(xì)胞系；
H印G2/shMR-1—MR-l穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系。
圖ll一MR-1-siRNA對(duì)人肝癌H印G2細(xì)胞體外趨化運(yùn)動(dòng)能力的影響
其中Control—未轉(zhuǎn)染任何siRNA組； Mock-siRNA—轉(zhuǎn)染mock-siRNA組； MR-l-siRNA—轉(zhuǎn)染MR-1-siRNA組。
圖12— H印G2/shMR-l細(xì)胞體外趨化運(yùn)動(dòng)能力的變化
其中H印G2—未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；
H印G2/shmock—陰性對(duì)照細(xì)胞系； H印G2/shMR-1—MR-1穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系。 圖13—H印G2/shMR-1細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)速度的變化 其中H印G2 —未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒；
H印G2/shmock—陰性對(duì)照細(xì)胞系； ▲ . H印G2/shMR-1—MR-1穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系。
具體實(shí)施方案
以下實(shí)施例僅為幫助所屬領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
<實(shí)施例1〉 MR-1在腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中的表達(dá)
1)、 Western blotting方法檢測(cè)細(xì)胞中MR-1的表達(dá)水平
在不同細(xì)胞系的細(xì)胞中，加入120ul新鮮配制的細(xì)胞裂解液(50mMTris-HC1， pH7. 5; l%NP-40; 150mMNaCl; 1 mg/ml aprotinin; 1 mg/ml le叩印tin; 1 mM Na3V04; ImMNaF), 立即用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞使其與裂解液充分混合，冰浴30分鐘至1小時(shí)。于4度13, OOOrpra 離心15分鐘，收集上清于新的EP管中，用標(biāo)準(zhǔn)Bradford法測(cè)定蛋白含量。取各樣品等量 總蛋白(20-50u g)，分別加入等體積的3倍上樣緩沖液，沸水煮沸變性5分鐘后，于10 % 的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移印跡蛋白到PVDF膜上。之后，將PVDF膜浸于含 5X(w/v)脫脂奶粉TBS溶液中后室溫振搖封閉過(guò)夜，TBS (10mMTris HC1 ， pH7. 5， 150mM NaCl)室溫潤(rùn)洗5次，每次5分鐘，裝入雜交袋，用含1%BSA的TBS溶液以1:1000稀釋兔 抗MR-l抗體[李天伯等，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2005, 27(1) :42-47]室溫孵育3小時(shí)，TBS 室溫潤(rùn)洗5次，每次5分鐘。裝入新的雜交袋內(nèi)，用二抗(服P-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 兔抗體)(Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品)溫育1小時(shí)，TBS室溫潤(rùn)洗5次，每次5 分鐘。膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(Santa Cruz Biotechnqlogy公司產(chǎn)品)，按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Chemilmager5500 (Alpha Innotech公司.)捕獲圖像。同 時(shí)檢測(cè)actin蛋白表達(dá)量，以保證各組樣品總蛋白上樣量的一致。&-&"^抗體以1:500 稀釋(Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品)。結(jié)果顯示，各個(gè)腫瘤細(xì)胞系中，MR-1均有不 同程度的表達(dá)，其中，H印G2細(xì)胞中的MR-l表達(dá)最高，HT1080細(xì)胞以及肺癌細(xì)胞系中表達(dá) 相對(duì)較低(圖1)。此外，正常人胚胎血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、正常人肝細(xì)胞(L02)、人胚 肺成纖維細(xì)胞(2BS)以及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)中的MR-1表達(dá)量，遠(yuǎn)低于三株肝癌 細(xì)胞系中MR-1的表達(dá)(圖2)。說(shuō)明MR-1呈腫瘤相關(guān)性表達(dá)特點(diǎn)。 2)、 RT-PCR方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中MR-1的轉(zhuǎn)錄水平
各個(gè)細(xì)胞系除去培養(yǎng)液加入Trizol，每平方厘米加lral Trizol試劑，提取總RNA,并 用紫外分光光度計(jì)(BECKMAN DU800)測(cè)定RNA的濃度。利用RT-PCR試劑盒(Invitrogen， Cat. No. 10928-34)進(jìn)行操作。每種總RNA在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)加入1 y g作為模板，GADffl或 P-actin對(duì)照引物各加0.5u 1， MR-l引物各加lul,反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)條件為 50'C X 30分鐘反轉(zhuǎn)錄，之后94。C X 2分鐘預(yù)變性，再后94'C X 30秒，55°C X 30秒，72°C X 1 分鐘，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后延伸反應(yīng)72'CX5分鐘。反應(yīng)后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳， 凝膠成像儀照相并進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，MR-l基因在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平，高于三種正 常細(xì)胞HUVEC、 L02以及2BS中的轉(zhuǎn)錄水平(圖3)。
<實(shí)施例2〉 MR-l-siRNA的設(shè)計(jì)與合成
目前最有效的siRNA雙鏈?zhǔn)怯?1個(gè)核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈的3'端均懸 掛突出兩個(gè)核苷酸，中間19個(gè)核苷酸配對(duì)。
本發(fā)明根據(jù)GenBank中提供的MR-1基因序列(序列號(hào)為AF417001),選擇設(shè)計(jì)了兩對(duì) siRNA序列。siRNA對(duì)應(yīng)的靶mRNA序列及siRNA核苷酸序列分別如下 raRNA耙序列1 (19 nt) : 5' -ACC GUG UGA AGC AGA UGA A -3' 寡核苷酸序列5' -UUC AUC UGC UUC ACA CGG UdTdT-3' 3， -dTdTA AGU AGA CGA AGU GUG CCA-5, mRNA耙序列2 (19 nt) : 5' -CCU AGG CUA UUG ACU GUU A-3' 寡核苷酸序列5' -UAA CAG UCA AUA GCC UAG GdTdT-3， 3' -dTdTA UUG UCA GUU AUC GGA UCC -5' 試驗(yàn)中采用的mock序列為對(duì)照
mRNA革巴序列(19 nt): 5' -AAU UCU CCG UUC GUG UCA CGU-3， 寡核苷酸序列5' -ACG UGA CAC GM CGG AGA AdTdT-3'
3' -dTdTU GCA CUG UGC UUG CCU CUU-5'
本發(fā)明所使用的MR-1-siRNA由廣州銳博生物技術(shù)公司合成，siRNA雙鏈純度>97%。用 水溶解RNA雙鏈后，可直接用于轉(zhuǎn)染。這種方式可保證雙鏈復(fù)合體以適當(dāng)形式存在并易于轉(zhuǎn) 染。 .
<實(shí)施例3>MR-1 shRNA靶序列及其DNA模板的設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建
ShRNA靶序列為MR-1-siRNA靶點(diǎn)2。按照現(xiàn)有規(guī)則合成shRNA的DNA模板，該模板包 括正義，反義兩條反的互補(bǔ)鏈，其組成的基本單位為Sa^^I酶切位點(diǎn)、靶序列正義鏈、9bp 的環(huán)序列、耙序列反義鏈、連續(xù)5個(gè)T、 ffi/ dl1酶切位點(diǎn)，總長(zhǎng)65bp。
MR-1 shRNA寡核苷酸序列如下
正義鏈
5' -GATCCCGCCTAGGCTATTGACTGTTATTCAAGAGATAACAGTCAATAGCCTAGG TTTTTTGGAAA-3'
反義鏈
3, -GGCGGATCCGATAACTGACMTAAGTTCTCTATTGTCAGTTATCGGATCCAAAAAACCTTTTCGA -5, mock shRNA寡核苷酸序列如下
5' -GATCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCMGAGMCGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGGAM-3 ，
3' -GGCMGAGGCTTGCACAGTGCAMGTTCTCTTGCACTGTGCMGCCTCTT磁MACCTTTTCGA -5'
以上引物中劃線部分為相應(yīng)靶mRNA序列的DNA序列及其互補(bǔ)序列，轉(zhuǎn)錄成RNA后，會(huì)
在此處形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的雙鏈部分。所形成的發(fā)夾RNA則可被RNA Dicer酶所識(shí)別切割成
雙鏈siRNA，從而發(fā)揮RNA干擾作用。
將合成引物退火后，形成的雙鏈DNA的5'端存在Bamhl酶切位點(diǎn)的粘末端，3'端存在
Hindll酶切位點(diǎn)的粘末端，可直接連接入經(jīng)萬(wàn)a礎(chǔ)和雙酶切的pCD-shRNA質(zhì)粒載體中，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤，將其命名為pCD-shMR-1和
pCD-shmock。
<實(shí)施例4〉 MR-1-siRNA的轉(zhuǎn)染及對(duì)MR-1表達(dá)的影響
本發(fā)明使用LipofectAMINE"2000脂質(zhì)體(Life Technologies,產(chǎn)品貨號(hào)11668-027)， 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24及36小時(shí)進(jìn)行沉默效應(yīng)測(cè)定。所有操作均按產(chǎn)品說(shuō)明書6孔板操作 規(guī)程進(jìn)行。將合成的MR-l-siRNA或mock-siRNA粉末用無(wú)RNA酶的水溶解，配成20幽的儲(chǔ) 備溶液。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞是在轉(zhuǎn)染前18-20小時(shí)，用2 ml含l(^胎牛血清的無(wú)抗生素MEM-EBSS 細(xì)胞培養(yǎng)液，以40萬(wàn)個(gè)/孔接種到六孔板中。將20PM的siKNA用無(wú)抗生素?zé)o血清的0pti-MEM
細(xì)胞培養(yǎng)液250ri稀釋至300 nM，取8ri脂質(zhì)體與250W無(wú)抗生素?zé)o血清的0pti-MEM培 養(yǎng)液混勻，5分鐘之內(nèi)，將MR-l-siRNA或mock-siRNA溶液與脂質(zhì)體稀釋液輕輕混勻。siRNA 與脂質(zhì)體復(fù)合物于室溫靜置20分鐘后，將500W MR-1-siRNA或mocK-siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物 加到細(xì)胞培養(yǎng)板(細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋率為80%-90%)中。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前用無(wú)抗生素?zé)o血清的 Opti-MEM培養(yǎng)液洗一遍后，再加入新的500W無(wú)抗生素?zé)o血清'Opti-MEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染5小 時(shí)后，每孔中補(bǔ)加1 ml含20%胎牛血清的無(wú)抗生素MEM-EBSS培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24以及36小時(shí) 后，分別采用RT-PCR以及Western blotting方法，對(duì)干擾效率進(jìn)行檢測(cè)或?qū)?xì)胞生長(zhǎng)、黏 附及運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行檢測(cè)。
采用實(shí)施例1中所述RT-PCR方法，檢測(cè)MR-1高表達(dá)H印G2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表 明，所設(shè)計(jì)的兩個(gè)MR-1-siRNA序列可不同程度的降低MR-l的mRNA水平，其中MR-l-siRNA(2) 序列抑制效率高于MR-1-siRNA(l)。而mock-siRNA則無(wú)明顯抑制作用(圖4)。
采用實(shí)施例l中所述Western blotting方法，對(duì)MR-1-siRNA抑制靶蛋白效果的檢測(cè)發(fā) 現(xiàn)，MR-1-siRNA耙點(diǎn)2序列可明顯降低MR-1的表達(dá)，而MR-1-siRNA耙點(diǎn)1和mock-siRNA, 則對(duì)細(xì)胞內(nèi)MR-1的蛋白水平未呈明顯影響(圖5)。 <實(shí)施例5>: MR-1穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞系H印G2/shMR-i的構(gòu)建與篩選
根據(jù)實(shí)施例3所得到的pCD-shMR-1構(gòu)建H印G2/shMR-1細(xì)胞系，采用同樣 LipofectAMINE 2000脂質(zhì)體(Life Technologies,產(chǎn)品貨號(hào)11668-027)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。所 有操作均按產(chǎn)品說(shuō)明書操作規(guī)程進(jìn)行。按質(zhì)粒:脂質(zhì)體(1 : 2. 5的比例，將2 pCD-shMR-1質(zhì)粒用無(wú)抗生素?zé)o血清的0pti-MEM培養(yǎng)液250 Hi進(jìn)行稀釋，其余轉(zhuǎn)染步驟同 siRNA的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將各組細(xì)胞分別改用含400 Pg/ml G418 (GIBCO公司產(chǎn)品) 選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)，待未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡后，將轉(zhuǎn)染組細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，用選擇性培養(yǎng)液 極度稀釋至5個(gè)細(xì)胞/ml，以每孔100W加入96孔板中，挑取只含一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔，進(jìn) 行單克隆培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，依次轉(zhuǎn)入24孔板、6孔板以及25cni2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。 Western blotting方法進(jìn)行鑒定。相應(yīng)地，建立轉(zhuǎn)染pCD-shmock質(zhì)粒的陰性對(duì)照細(xì)胞系 H印G2/shraock。本發(fā)明對(duì)所建立的低表達(dá)MR-1的H印G2/shMR-1穩(wěn)定系進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果表明， H印G2/shMR-1中MR-1的表達(dá)與正常H印G2及H印G2/shmock細(xì)胞相比明顯下調(diào)(圖6)。 <實(shí)施例6>生長(zhǎng)曲線法檢測(cè)MR-1-siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖速率的影響
H印G2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA36小時(shí)后，用1 ml含10%胎牛血清的MEM-EBSS細(xì)胞培養(yǎng)液， 以1000個(gè)/孔接種到24孔板中。此外，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2、H印G2/shmock、H印G2/shMR-l 細(xì)胞同樣用lml含10%胎牛血清的MEM-EBSS細(xì)胞培養(yǎng)液，以1000個(gè)/孔接種到24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)換液，每24小時(shí)將4個(gè)孔中細(xì)胞以EDTA-胰酶消化，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，共計(jì)6天。 結(jié)果表明，MR-l-siRNA可明顯降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速度(圖7)。 H印G2/shMR-1細(xì)胞的生長(zhǎng)速度 與正常H印G2細(xì)胞相比明顯減慢，而H印G2/shmock細(xì)胞的生長(zhǎng)速度未發(fā)生明顯改變。說(shuō)明 MR-1的表達(dá)水平，可以影響細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過(guò)程(圖8)。
<實(shí)施例7>檢測(cè)MR-l-siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分FN黏附能力的影響。
本發(fā)明進(jìn)行了細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)了 MR-1-siRNA對(duì)H:pG2細(xì)胞基質(zhì)黏附能力 的影響和MR-1低表達(dá)細(xì)胞系H印G2/shMR-1細(xì)胞對(duì)基質(zhì)粘附能力的變化情況。細(xì)胞消化后， 以含1%胎牛血清的MEM-EBSS洗滌2次后，接種于預(yù)先以10 u g/ml人纖維粘連蛋白FN 包被的96孔板中。.MTT法檢測(cè)細(xì)胞接種后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)FN的粘附率。結(jié)果顯示，MR-1-siRNA 處理后，細(xì)胞對(duì)FN的粘附能力明顯低于control和mock-siRNA組細(xì)胞(圖9);H印G2/shMR-l 細(xì)胞對(duì)FN的粘附能力與H印G2和H印G2/shmock細(xì)胞相比亦出現(xiàn)下降(圖10) <實(shí)施例8>檢測(cè)MR-1-siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)趨化能力的影響。
采用Transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)，掉測(cè)MR-1-siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)能力的影響以及 MR-1低表達(dá)細(xì)胞系H印G2/shMR-1細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)趨化能力變化情況。本發(fā)明將不同處理的H印G2 細(xì)胞及不同穩(wěn)定系細(xì)胞以含1%胎牛血清的MEM-EBSS培養(yǎng)液重懸，分別加入培養(yǎng)小室上室 腔中，下室腔加入含20%胎牛血清和10 ug/ml FN的MEM-EBSS,誘導(dǎo)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。3小時(shí) 后檢測(cè)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，MR-1-siRNA處理的細(xì)胞穿過(guò)膜的數(shù)量明顯少于正常 H印G2細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染mock-siRNA的細(xì)胞，MR-1-siRNA及mock-siRNA對(duì)細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)能力的 抑制率分別為63. 72 %和12. 73 % (圖11); H印G2/shMR-l細(xì)胞穿過(guò)膜的數(shù)量明顯少于正常 H印G2細(xì)胞及H印G2/shmock細(xì)胞。與正常H印G2細(xì)胞相比，H印G2/shMR-l細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng) 能力降低率為56. 55%, H印G2/shmock細(xì)胞系的降低率為8. 96% (圖12);
<實(shí)施例9>體內(nèi)成瘤性比較實(shí)驗(yàn)
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2、 H印G2/shmock及H印G2/shMR-1細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，以生理鹽水 重懸，皮下注射入5周齡雌性BALB/c 6w/"W裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，每只注射劑量為200 ul生理鹽水含5Xl(f細(xì)胞，每組6只。腫瘤接種時(shí)，開(kāi)始紀(jì)錄裸鼠體重，每周兩次。待瘤 塊形成后，通過(guò)測(cè)量可觸及的腫瘤長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，按照體積二ab2/2的公式計(jì)算腫瘤 體積。每4天一次，共測(cè)5次。結(jié)果顯示，H印G2/shMR-1細(xì)胞系的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢。 在第10天才出現(xiàn)可觸及的瘤塊。而H印G2及H印G2/shmock細(xì)胞系則在第4天即出現(xiàn)可觸及 的瘤塊，且生長(zhǎng)迅速。至接種后第20天，H印G2/shMR-1細(xì)胞組其腫瘤體積為103咖3 ，而 H印G2細(xì)胞已達(dá)1156咖3，下降率達(dá)91.01% (圖13)。
權(quán)利要求
1、MR-1作為腫瘤標(biāo)記物在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。
2、 MR-1作為腫瘤靶分子在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及MR-1基因作為腫瘤標(biāo)記物和靶分子在制備腫瘤診斷試劑和治療藥物中的應(yīng)用，具體而言，是對(duì)新基因MR-1在人正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)RNA干擾技術(shù)，對(duì)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的MR-1進(jìn)行抑制后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的遷移及生長(zhǎng)受到了抑制，說(shuō)明MR-1有望成為一個(gè)腫瘤診斷的新標(biāo)記物和臨床治療的新靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101200768SQ20071016634
公開(kāi)日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2007年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日
發(fā)明者任開(kāi)環(huán), 何紅偉, 王以光, 邊春景, 邵榮光, 金海霞 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所