專利名稱：一種提高重組人巨噬細(xì)胞抑制因子-1(mic-1)在畢赤酵母中表達(dá)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高重組人巨噬細(xì)胞抑制因子-1 (MIC-1)表達(dá)量的畢赤酵母工程菌 (i^/^/^Wo他)及其構(gòu)建方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。技術(shù)背景MIC-i是Bootcov等人1997年研究巨噬細(xì)胞相關(guān)活性因子時在U937細(xì)胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn) 的一個新基因，其編碼的蛋白屬于TCF-P超家族成員。隨著在其他組織和器官中的發(fā)現(xiàn)， MIC-1又被命名為PTGF-P、 PDF、 GDF-15、 PLAB、 NAG-1等。10年來的研究表明MIC-1 在胎兒的生長發(fā)育、巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程以及急性損傷等過程中 均發(fā)揮不同的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，MIC-1可能作為新的腫瘤標(biāo)志物和流產(chǎn)預(yù)警指標(biāo)，其在 診斷學(xué)中的應(yīng)用價值越來越受到重視。MIC-1作為TGF-p超家族成員，其體外表達(dá)需要真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術(shù)是在CHO細(xì) 胞和畢赤酵母真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)野生型重組MIC-1蛋白，但CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本 高，產(chǎn)量低；而在相對優(yōu)越的畢赤酵母中其表達(dá)量也僅為3~8mg/L，難以滿足大量生產(chǎn)的需 求。為克服現(xiàn)有技術(shù)存在之不足，設(shè)計尋找一種以畢赤酵母(/^Wa/w^or&)為宿主高效表 達(dá)人巨噬細(xì)胞抑制因子的新技術(shù)方法，具有一定的理論意義和十分重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高用畢赤酵母(i^W"p必/w^)工程菌分泌表達(dá)人巨噬細(xì)胞 抑制因子-1表達(dá)量的方法，以期利用該工程菌大規(guī)模地生產(chǎn)人巨噬細(xì)胞抑制因子-1。本發(fā)明是利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)MIC-1，其表達(dá)載體為pPIC9K質(zhì)粒，其表 達(dá)產(chǎn)物蛋白可形成二聚體成熟蛋白結(jié)構(gòu)并分泌到細(xì)胞外。本發(fā)明在MIC-1野生型基因的基礎(chǔ)上，將其5'端的7個畢赤酵母非偏好密碼子改造為其 同義優(yōu)越密碼子，從而大大提高MIC-1在畢赤酵母中的表達(dá)。MIC-1畢赤酵母菌株經(jīng)鑒定 MIC-1產(chǎn)量可達(dá)到50mg/L,遠(yuǎn)高于前述國外文獻(xiàn)報道的利用畢赤酵母生產(chǎn)MIC-1的表達(dá)量。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)1)獲得及優(yōu)化MIC-1基因片段根據(jù)人巨噬細(xì)胞抑制因子-1基因序列特點和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒多克隆位點 的序列特點，設(shè)計上游引物和下游引物，通過RT-PCR方法，2) 構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-MIC-l:將獲得的優(yōu)化密碼子的突變型MIC-1基因片段用o I和AW I雙酶切，直接插入到 pPIC9質(zhì)粒中，得到表達(dá)載體pPIC9-MIC-l;將表達(dá)載體pPIC9-MIC-l用^ww//1和WW I雙 酶切，pPIC9K質(zhì)粒用5側(cè)/ZI和油f I雙酶切后回收大片段，含MIC-1基因的片段和pPIC9K 質(zhì)粒酶切大片段通過T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而完成 畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-MIC-l的構(gòu)建。3) 構(gòu)建畢赤酵母MIC-1生產(chǎn)菌株重組質(zhì)粒pPIC9K-MIC-l用Sac I酶切使其線性化，PEG1000法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感 受態(tài)細(xì)胞，在MD平板上培養(yǎng)2~3天，挑取His+陽性轉(zhuǎn)化子，獲得畢赤酵母MIC-1生產(chǎn)菌株。4) 篩選畢赤酵母MIC-1高表達(dá)菌株用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，并通過PCR、 Western blot等方法對轉(zhuǎn)化子進 行檢測，確證MIC-1基因已整合到畢赤酵母基因組并正確表達(dá)。將各轉(zhuǎn)化子在不含甲醇的培 養(yǎng)基BMGY中28 3(TC培養(yǎng)至OD6oo=2~6，無菌條件離心后在含0.5%甲醇的BMMY誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，在誘導(dǎo)過程中，每24小時補充甲醇使其終濃度維持在3%附近，培養(yǎng)72小時后 離心收集各轉(zhuǎn)化子的上清培養(yǎng)基，用Tricine SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳、密度掃描法和BCA蛋 白定量法檢測轉(zhuǎn)化子MIC-1的分泌表達(dá)產(chǎn)量，篩選畢赤酵母MIC-1高表達(dá)菌株。 克隆MIC-1基因片段時所采用的上游引物和下游引物分別為 上游引物1: AGTCCTCGAGAAAAGAgcgcgcaacggggac 上游引物2: ggcccgggcgttgttgtcgtctgcacacggtcagagcttcgctggaagacctgggctgg 上游弓I物3: tatctcgagaaaagagctagaaacggggaccactgtccactcgggcccgggcgttgttg 下游引物TATAGCGGCCGCTTATCATATGCAGTGGCAGTCTTTGGC本發(fā)明的優(yōu)點和特點在于本發(fā)明對MIC-1基因序列的優(yōu)化，使生產(chǎn)產(chǎn)量大幅度提高；工藝簡單易行，MIC-1可分泌到胞外，易純化，從而降低生產(chǎn)成本。這對TGF-P超家族成員進 行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有決定性意義，同時對于指導(dǎo)其它以畢赤酵母表達(dá)體系分泌表達(dá)的外 源蛋白的表達(dá)量具有重要意義。


圖l.適合在畢赤酵母菌中高效表達(dá)的優(yōu)化密碼子的人巨噬細(xì)胞抑制因子-l基因序列 圖2.篩選高表達(dá)人巨噬細(xì)胞抑制因子-1的畢赤酵母工程菌株的技術(shù)路線具體實施方式
:實施例1:1)獲得及優(yōu)化MIC-1基因片段根據(jù)人巨噬細(xì)胞抑制因子-1基因序列特點和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒多克隆位點的序 列特點，設(shè)計3個上游引物和下游引物。首先選擇上游引物1和下游引物，通過RT-PCR方 法，從人胎盤組織中擴增MIC-1野生型基因片段；再依次通過上游引物2和上游引物3及下 游引物，進行2輪PCR擴增，最終獲得優(yōu)化密碼子的突變型MIC-1基因片段。 50nlPCR反應(yīng)體系10xBuffer5pldNTP(2.5mM)上游引物(50pM)1^1下游引物(50pM)模板PfuDNA聚合酶(5U/pl)1^1ddH20，總體積50nl反應(yīng)程序預(yù)變性94 。C5min變性94 。C40sec退火57 。C40sec延伸72 。C2min延伸72 °C7min4"C保溫卜30個循環(huán)2)構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-MIC-l:將獲得的優(yōu)化密碼子的突變型MIC-l基因片段用XhoI和NotI雙酶切，pPIC9質(zhì)粒用Xho1 和Not I雙酶切后回收大片段，將酶切后的MIC-1基因片段和pPIC9質(zhì)粒酶切大片段通過 T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到表達(dá)載體pPIC9-MIC-l;將表達(dá)載體 pPIC9-MIC-l用BamH I和Notl雙酶切，pPIC9K質(zhì)粒用BamH I禾Q Not I雙酶切后回收大片 段，將酶切后的MIC-1基因片段和pPIC9K質(zhì)粒酶切大片段通過T4DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5a，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，從而完成畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-MIC-l的構(gòu)建。3) 構(gòu)建畢赤酵母MIC-1生產(chǎn)菌株重組質(zhì)粒pPIC9K-MIC-l用Sac I酶切使其線性化，PEG1000法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài) 細(xì)胞，在MD平板上培養(yǎng)2 3天，挑取His+陽性轉(zhuǎn)化子，獲得畢赤酵母MIC-1生產(chǎn)菌株。4) 篩選畢赤酵母MIC-1高表達(dá)菌株用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，并通過PCR、 Western blot等方法對轉(zhuǎn)化子進行檢 測，確證MIC-1基因已整合到畢赤酵母基因組并正確表達(dá)。將各轉(zhuǎn)化子在不含甲醇的培養(yǎng)基 BMGY中28 30。C培養(yǎng)至OD600=2~6，無菌條件離心后在含0.5%甲醇的BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，在誘導(dǎo)過程中，每24小時補充甲醇使其終濃度維持在0.5~3%培養(yǎng)36~96小時后離 心收集各轉(zhuǎn)化子的上清培養(yǎng)基，用Tricine SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳、密度掃描法和BCA蛋白 定量法檢測各轉(zhuǎn)化子MIC-1的分泌表達(dá)產(chǎn)量及不同誘導(dǎo)條件對表達(dá)產(chǎn)量的影響，篩選出畢赤 酵母MIC-1高表達(dá)菌株和最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，即每24小時補充甲醇使其終濃度維持在3%培 養(yǎng)72小時。BMGY和BMMY培養(yǎng)基配方 1% yeast extract2% peptone lOOmM potassium phosphate pH6.0 1.34% YNB . 4x10-5% biotin1% glycerol for BMGY or 0.5% methanol for BMGY實施例2:1) 畢赤酵母MIC-1菌株的誘導(dǎo)表達(dá)將各轉(zhuǎn)化子在5ml BMGY培養(yǎng)基中28 3(TC 200~250rpm/min過液震蕩培養(yǎng)；第二天，取適 量菌液重新接種于100ml BMGY培養(yǎng)基中，28 30。C培養(yǎng)6 8h,至OD600=2~6;無菌條件離 心后棄上清，用100ml BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，28 30°C 200~250rpm/min震蕩培養(yǎng)開始誘 導(dǎo)；在誘導(dǎo)過程中，每24小時補充甲醇使其終濃度維持在3%培養(yǎng)72小時后離心收集各轉(zhuǎn)化 子的上清培養(yǎng)基，不加甲醇誘導(dǎo)為空白對照。2) 目的蛋白的電泳檢測及產(chǎn)量測定收集誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，用還原及非還原Tricine SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳來檢測目的蛋白的表達(dá)情況。通過密度掃描法對電泳條帶進行掃描分析，并用BCA蛋白定量法對各轉(zhuǎn)化子表達(dá)量進 行定量，篩選出畢赤酵母高表達(dá)MIC-1工程菌株，所得該工程菌MIC-1產(chǎn)量可達(dá)到50mg/L。
權(quán)利要求
1、一種提高重組人巨噬細(xì)胞抑制因子-1在畢赤酵母中的表達(dá)量的方法，其特征在于人巨噬細(xì)胞抑制因子-1基因序列如下GCT AGA AAC GGG GAC CAC TGT CCA CTC GGG CCC GGG CGT TGT TGT CGT CTG CAC ACG GTCAGA GCT TCG CTG GAA GAC CTG GGC TGG GCC GAT TGG GTG CTG TCG CCA CGG GAG GTGCAA GTG ACC ATG TGC ATC GGC GCG TGC CCG AGC CAG TTC CGG GCG GCA AAC ATG CACGCG CAG ATC AAG ACG AGC CTG CAC CGC CTG AAG CCC GAC ACG GTG CCA GCG CCC TGCTGC GTG CCC GCC AGC TAC AAT CCC ATG GTG CTC ATT CAA AAG ACC GAC ACC GGG GTG TCGCTC CAG ACC TAT GAT GAC TTG TTA GCC AAA GAC TGC CAC TGC ATA TGA克隆插入帶有甲醇調(diào)節(jié)型啟動子(AOX1)的載體pPIC9K中，獲得表達(dá)載體pPIC9K-MIC-1，采用PEG1000法轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌，用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，得到高表達(dá)畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-MIC-1。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備人巨噬細(xì)胞抑制因子-1方法，其特征在于表達(dá)載體pPIC9K-MIC-l含有權(quán) 利要求1所述的人巨噬細(xì)胞抑制因子-1基因序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備人巨噬細(xì)胞抑制因子-1方法，其特征在于含有權(quán)利耍求1所述的人巨噬細(xì) 胞抑制因子-1基因序列插入載體pPIC9K中，而獲得的表達(dá)載體pPIC9K-MIC-l 。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備人巨噬細(xì)胞抑制因子-1方法，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體 pPIC9K-MIC-l ， PEG1000法轉(zhuǎn)化的GS115畢赤酵母菌所獲得的高表達(dá)畢赤酵母工程菌GS115/ pPIC9K-MIC-l。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備人巨噬細(xì)胞抑制因子-1的方法，其特征在于A、 根據(jù)人巨噬細(xì)胞抑制因子-1基因序列特點和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒多克隆位點的序列特點， 設(shè)計3個上游引物和1個下游引物，采用RT-PCR方法，依次以上游引物1、 2及3和下游引物進行PCR 擴增出同權(quán)利要求1所述完全一樣的人巨噬細(xì)胞抑制因子-1基因序列。克隆MIC-1基因片段時所采用的上 游引物和下游引物分別為上游引物1 AGTCCTCGAGAAAAGAGCGCGCAACGGGGAC下游引物TATAGCGGCCGCTTATCATATGCAGTGGCAGTCTTTGGCB、 將上述人MIC-1基因序列克隆導(dǎo)入表達(dá)載體pPIC9K質(zhì)粒中獲得表達(dá)載體pPIC9K-MIC-l。線性化后 PEG1000法轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌，用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆得高表達(dá)畢赤酵母菌株 GS115/ pPIC9K-MIC-l。C、 上述所得高表達(dá)的畢赤酵母菌株在不含甲醇的培養(yǎng)基BMGY中28 3(TC培養(yǎng)至OD6QC)=2~6，再在含0.5%甲醇的BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每24小時補充甲醇使其終濃度維持在0.5~3%培養(yǎng)36~96小時后離心 收集各轉(zhuǎn)化子的上清培養(yǎng)基，用Tricine SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳、密度掃描法和BCA蛋白定量法檢測轉(zhuǎn)化 子的人MIC-1的分泌表達(dá)產(chǎn)量。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種提高重組人巨噬細(xì)胞抑制因子在畢赤酵母中表達(dá)量的方法。本發(fā)明其特征在于應(yīng)用分子生物學(xué)方法改造了人巨噬細(xì)胞抑制因子基因序列，使其更適合在畢赤酵母中表達(dá)，構(gòu)建了含有巨噬細(xì)胞抑制因子的外泌型表達(dá)載體，采用PEG1000法轉(zhuǎn)化GS115畢赤酵母菌，用G418抗性濃度遞增法篩選多拷貝克隆，得到高表達(dá)畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-MIC-1。巨噬細(xì)胞抑制因子畢赤酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外，離心所得的上清液中即含有重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物—巨噬細(xì)胞抑制因子。它具有提純工藝簡單、成本低、易于大規(guī)模表達(dá)的優(yōu)點，為以后的功能研究及抗體制備提供抗原等奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/67GK101225400SQ200710165228
公開日2008年7月23日 申請日期2007年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月1日
發(fā)明者偉 張, 茉 李, 李艷芬, 王小兵, 田海梅, 程東婉 申請人:偉 張