專利名稱：新型的g蛋白偶聯(lián)受體細胞水平篩選系統(tǒng)構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)細胞水平篩選系統(tǒng)及 其構(gòu)建方法，以及該在G蛋白偶耳關(guān)受體篩選系統(tǒng)在篩選GPCR或GPCR信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動劑或拮抗劑中的應(yīng)用。(二) 背景技術(shù)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是細胞表面最大的受體家族，也是一個最多樣 化的蛋白質(zhì)家族。GPCR享有一個共同的二級結(jié)構(gòu)的特征——7個a螺旋跨 膜結(jié)構(gòu)，N端在細胞膜外側(cè)，C端則位于細胞膜內(nèi)側(cè)，所以又叫7跨膜受 體.GPCR擔(dān)負著把細胞外信號傳遞到細胞內(nèi)從而改變細胞的功能活性的重 要作用，對生長發(fā)育、生殖、免疫細胞遷移、神經(jīng)傳導(dǎo)、代謝以及行為起到 調(diào)控作用，這些化學(xué)信號分子包括離子(作用于副曱狀腺和腎化學(xué)感測器 的鈣離子)，氨基酸(谷氨酸鹽和氨基酪酸)，單體胺(兒茶酚胺、乙酰膽 堿、復(fù)合胺等)，脂類信號(前列腺素、凝血噁烷、大麻素，(內(nèi)源的大麻 堿)，血小板激活因子等)，噪呤(腺香和ATP)，神經(jīng)肽(速激肽、神 經(jīng)肽Y、阿片樣物質(zhì)opioids、縮膽嚢肽、血管活性腸肽(VIP)等等)，肽類 激素(血管緊張素、緩激肽、胰高血糖素、降血鈣素、副曱狀腺激素等)， 化學(xué)趨化因子(白介素8, RANTES，MIP-lalpha等)，糖蛋白類激素(TSH、 LH/FSH、促性腺激素等)，以及蛋白酶(凝血酶)。G蛋白偶聯(lián)受體與人 類的疾病如心血管系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病，以及跟腫 瘤發(fā)生、炎癥、肥胖癥、糖尿病和骨質(zhì)疏松等密切相關(guān)，所以世界各大制藥 公司都把G蛋白偶聯(lián)受體為靶子研發(fā)新藥，近20年來，大約有40 50%的 處方藥是針對G蛋白偶聯(lián)受體。G蛋白偶聯(lián)受體作為藥靶的藥物篩選模型的建立主要基于受體活化后 的第二信使cAMP和Ca"以及受體內(nèi)吞。最早建立的藥物篩選模型有用焚 光圖像平板讀數(shù)器(FLIPR)測定細胞內(nèi)與敏感性熒光染料結(jié)合的Ca"濃度 變化，基于GTP-GDP交換的[35S]GTPyS結(jié)合測試法，和報告基因檢測法則 基于GPCR受體被活化后的第二信使cAMP和Ca^分別激活或抑制弱啟動子上游的增強子CRE或NFAT，從而促使弱啟動子的下游的報告基因-氯霉 素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),熒光素酶(Luc),堿性磷酸化酶(SEAP)，半乳糖 苷酶((3-Gal)和綠色熒光蛋白(GFP)得到轉(zhuǎn)錄。后來又陸續(xù)建立了用閃爍鄰近 測定法(SPA)測定GTP的類似物[35S]GTPyS與G蛋白a亞單位的結(jié)合， 用培養(yǎng)的非洲爪蟾黑素細胞系統(tǒng)檢測GPCRs被活化后，cAMP的濃度增加 可使黑素細胞內(nèi)的色素顆粒的變化情況(Melanophore)，放免法測定細胞 內(nèi)cAMP濃度的篩選模型。最近又建立了用4丐敏發(fā)光蛋白水母素測定細胞 內(nèi)Ca"濃度變化，用綠色熒光蛋白融合p-arrestin2檢測GPCR受體被活化后 內(nèi)吞過程和用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移檢測法(BRET)測定當(dāng)P-arrestin-GFP 融合蛋白與受體-renilla熒光素酶(rLuc)融合蛋白結(jié)合而使綠色熒光蛋白的 光譜發(fā)生的變化等的藥物篩選模型。內(nèi)含肽(intein)是來自細菌的蛋白翻譯產(chǎn)物(前體蛋白)閱讀框架內(nèi)的一 段氨基S1^列，它靠自我剪切的方式從前體蛋白中釋放出來，同時以肽鍵將 兩端肽鏈相連形成成熟蛋白的方式介導(dǎo)蛋白質(zhì)剪接(splicing)。 1998年報來自 藍藻S，ec/zoc，他sp. PCC6803的DnaE intein是一種內(nèi)含肽，其N端和C 端剪接結(jié)構(gòu)域的基因被750kb的基因組序列分開，蛋白翻譯產(chǎn)物仍可以通 過內(nèi)舍肽片段間的識別、重建完成外蛋白子(DnaE-N和DnaE-C)的剪接， 最終形成完整的DanE蛋白。DnaE內(nèi)含肽同樣存在于另外些藍藻中。DnaE intein的剪接特性應(yīng)用于蛋白環(huán)化、蛋白純化、蛋白片段同位素標記等，特 別是應(yīng)用于蛋白間的相互作用。將2個具有相互作用蛋白分別融合進DnaE intein的2個剪接片段，再直接與報告蛋白(如可發(fā)光檢測的熒光素酶、增 強型綠色熒光蛋白等)的C端和N端相連。兩個蛋白相互作用導(dǎo)致內(nèi)含肽 相互靠近進而折疊顯示出剪接活性，使兩個分別在不同載體表達的無活性報 告蛋白片段恢復(fù)完整的蛋白活性而發(fā)光，通過光檢測而定量定性蛋白間相互 作用。已報道用此方法來監(jiān)測線粒體釋放蛋白、核定位蛋白等。Arrestins通過終止G蛋白介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)在調(diào)控7TM受體應(yīng)答扮演著 重要角色。Arrestin是胞質(zhì)蛋白，激動劑刺激之后，當(dāng)激動劑結(jié)合到7TM受 體，Arrestin數(shù)秒分鐘內(nèi)易位到通常被磷酸化、有活性的受體上。Arrestin 家族分子結(jié)合到7TM受體，空間上阻礙G蛋白結(jié)合，導(dǎo)致整體信號失活。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明應(yīng)用細菌內(nèi)含肽DnaE和P-arrestin蛋白，提供了 一種可用于G 蛋白偶聯(lián)受體的功能檢測和藥物篩選的細胞水平篩選系統(tǒng)及其構(gòu)建與應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種G蛋白偶聯(lián)受體篩選系統(tǒng)，所述篩選系統(tǒng)由HEK293細胞或CHO 細胞構(gòu)建，含有來自以下序列中不同組間基因序列構(gòu)建的2種融合表達載 體第1組(l)DnaE基因的C端與報告基因的C端的拼接序列 DnaE-C-Report-C, U)DnaE基因的N端與報告基因的N端的拼接序列 Report-N-DnaE-N;第2組①GPCR基因，②P-arrestin基因；其中，所述 報告基因為用于檢測的有活性的酶基因或可發(fā)光的蛋白基因，包括各種發(fā)光 蛋白(例如GFP， YFP， CFP， BFP, RFP等)及其突變體，還包括水母發(fā) 光蛋白或克林霉素，以及各種熒光素酶、(3-半乳糖苷酶、酪氨酸酶和其它許 多種酶類等。將報告基因一分為二，即報告基因N端和報告基因C端，這 二部分均失去酶的活性或熒光，只有經(jīng)內(nèi)含肽(intern)將報告基因N端和 報告基因C端重新拼接成完整的蛋白，才恢復(fù)原有的酶活性或焚光。所述篩選系統(tǒng)由如下方法構(gòu)建得到(1) 將DnaE基因的C端與報告基因的C端拼接，所得拼接序列 DnaE-C-Report-C與GPCR基因或卩-arrestin基因融合表達，獲得 融合表達載體I -1或I -2;(2) 將DnaE基因的N端與報告基因的N端拼接，所得拼接序列 Report-N-DnaE-N與(3-arrestin基因或GPCR基因融合表達，獲得 融合表達載體II-1或II-2;(3 )將融合表達載體I -1和II,l 、或融合表達載體I -2和II -2共轉(zhuǎn)染 HEK293細胞或CHO細胞，得到所述篩選系統(tǒng)。本發(fā)明構(gòu)建的細胞水平高通量篩選系統(tǒng)主要基于具蛋白剪接功能的 DnaE和能與被激動劑活化后的受體相結(jié)合的p-arrestin兩個蛋白的應(yīng)用，其 原理參見圖1。由報告基因如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光素酶(Luc)、 堿性磷酸化酶(SEAP)、半乳糖苷酶(P-Gal)和綠色焚光蛋白(GFP)—分為二成 報告基因N端和報告基因C端，報告基因N端與受體的C端相接，并與具 有蛋白剪接功能的DnaE-N (DnaE基因N端)融合表達；報告基因C端則 與卩-arrestin的C端相接，并與具有蛋白剪接功能的DnaE-C (DnaE基因C 端)融合表達.將兩個表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞或CHO細胞，并構(gòu)建 成穩(wěn)定表達細胞抹。當(dāng)激動劑與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合并使之活化，(3-arrestin 由細胞質(zhì)向位于細胞膜上的受體移動并結(jié)合，促使DnaE-C靠近DnaE-N,而 由DnaE-N和DnaE-C共同作用把報告基因N端和報告基因C端連接成一個完整的報告基因，最后通過檢測報告基因活性便可知受體的活化程度。 具體的，所述篩選系統(tǒng)構(gòu)建方法如下(1)構(gòu)建含有GPCR基因的質(zhì)粒i : pCMV-flag-GPCR gene;將DnaE基 因的C端DnaE-C與報告基因的C端Report-C拼接，在DnaE-C 與Report-C之間加入CFNGT 5個氨基S吏序列，在DnaE-C的N端連 接一個氨基酸序列為GGGGSG的GC linker,得到DnaE-C-Report畫C, 將DnaE-C-Report-C插入到質(zhì)粒i中，獲得融合表達載體I : pCMV-flag-GPCR gene-DnaE-C-Report誦C;(2 )構(gòu)建含有(3-arrestin基因的質(zhì)粒ii: pCDNA-|3-arrestin gene;將DnaE 基因的N端DnaE-N與報告基因的N端Report-N拼接，在DnaE-N 與之間加入GS兩個氨基S臾序列，在Report-N的N端連接一個氨基酸 序列為GGGGSG的GC linker,得到Report-N- DnaE隱N,將 Report-N-DnaE-N插入到質(zhì)粒ii中，獲得融合表達載體II: pCDNA-卩-arrestin gene-Report誦N-DnaE-N;(3 )將融合表達載體I和融合表達載體II共轉(zhuǎn)染HEK293細胞或CHO細 胞，獲得所述篩選系統(tǒng)。 或者，所述方法如下(1) 構(gòu)建含有GPCR基因的質(zhì)粒i : pCMV-flag-GPCR gene;將DnaE基 因的N端DnaE-N與報告基因的N端Report-N拼接，在DnaE-N 與之間加入GS兩個氨基S吏序列，在Report-N的N端連接一個氨基酸 序列為GGGGSG的GC linker,得到Report畫N畫DnaE陽N,將 Report-N-DnaE-N插入到質(zhì)粒i中，獲得融合表達載體I : pCMV-flag-GPCR gene-Report畫N畫DnaE隱N;(2) 構(gòu)建含有P-arrestin基因的質(zhì)粒ii: pCDNA-p-arrestin gene;將DnaE 基因的C端DnaE-C與報告基因的C端Report-C拼接，在DnaE-C 與Report-C之間加入CFNGT 5個氨基酸序列，在DnaE-C的N端連 接一個氨基酸序列為GGGGSG的GC linker,得到DnaE-C-Report-C， 將DnaE-C-Report-C插入到質(zhì)粒ii中，獲得融合表達載體II: pCDN A-(3-arrestin gene-DnaE-C-Report-C;(3 )將融合表達載體I和融合表達載體II共轉(zhuǎn)染HEK293細胞或CHO細 胞，獲得所述篩選系統(tǒng)。 本發(fā)明構(gòu)建的篩選系統(tǒng)是利用G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞的原理，與偶聯(lián)的G蛋白(Gi,Gs和Gq)無關(guān)，故可以適用于所有的G蛋白偶聯(lián)受體。優(yōu)選的，所述報告基因為下列之一①綠色熒光蛋白基因(EGFP)、② 紅色熒光蛋白基因(DsRed)、③Renilla熒光素酶基因(i^"/〃a luciferase)、 Firefly熒光素酶基因(Firefly luciferase)、⑤堿性磷酸酶基因(SEAP)、 Bete-內(nèi)酰胺酶基因(Beta-lactamase)、⑦LacZ基因。所述DnaE基因來自藍球藻Anacystis nidulans R2 PCC7942或點狀念林 藻Nostoc punctiforme PCC73102。所述(3-arrestin基因為p-arrestinl或 卩-arrestin2,優(yōu)選為卩-arrestin2。 Arrestin家》矣至少有4類成員，本發(fā)明-使用 的卩-arrestinl和卩-arrestin2，幾乎分布在每一組織。卩-arrestin類氨基酸的同 源性在70%以上。Arrestins由3個結(jié)構(gòu)功能部分組成， 一個結(jié)合受體的氨基 末端結(jié)構(gòu)域， 一個結(jié)合受體內(nèi)吞相關(guān)蛋白(如籠形蛋白和AP-2 (接頭蛋白 2 ))的羧基末端結(jié)構(gòu)域和一個連接細胞膜組分如磷酸肌醇的中心區(qū)域。主要 作用于視紫紅質(zhì)受體的視覺arrestin與籠形蛋白連接作用很弱，且通常未介 導(dǎo)受體的內(nèi)吞過程。如上所述，激動劑刺激后數(shù)分鐘內(nèi)arrestin會易位結(jié)合 上被磷酸化有活性的受體，GPCR普遍通過此反應(yīng)活化。因此，酶互補法或 基于GPCR-arrestin相互作用的易位法對于大多數(shù)受體是有效的，同時對作 用于未知功能的GPCRs (如孤兒受體)的配體的發(fā)現(xiàn)也有意義。在該篩選系統(tǒng)中，DnaE-C與報告基因的C端通過overlap PCR拼接起 來并與GPCR基因融合表達，為了便于檢測該融合蛋白的表達，在該融合 蛋白之前加上一個flag標簽；在另一個表達載體中，DnaE-N與報告基因的 N端通過overlap PCR拼接起來并與(3-arrestin2基因融合表達。將兩種表達 載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，即可得到所述細胞系。為使細胞抹穩(wěn)定表達，可 用含800ug/ml G418, 10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)GPCR基因被其 配體活化后，在GRKs作用下，GPCR基因的C端祐:磷酸化，此時p-arrestin2 便與GPCR結(jié)合，從而使DnaE-N和DnaE-C發(fā)生相互作用，由于DnaE-N 和DnaE-C具有蛋白剪接功能，因此在DnaE-N和DnaE-C的共同作用下將 報告基因的N端和C端拼接到一起從而形成完整的報告基因，通過檢測報 告基因便可知GPCR基因被活化的程度。具體的，GPCR基因為人煙酸受體HM74a時，當(dāng)HM74a配體(煙酸) 與HM74a受體結(jié)合后，HM74a受體被活化，在GRKs作用下HM74a受體 的C末端被磷酸化，此時(3-arrestin2便與HM74a受體結(jié)合，從而使DnaE-N 和DnaE-C發(fā)生相互作用，由于DnaE-N和DnaE-C具有蛋白剪接功能，因此在DnaE-N和DnaE-C的共同作用下將rLuc-N和rLuc-C 4并接到一起從而 形成完整的熒光素酶rLuc基因，通過片企測rLuc基因活性便可知HM74a受 體被活化的程度。本發(fā)明旨在提供一個GPCR功能性檢測和藥物篩選方法，也為GPCRs 和GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑篩選提供了新的方法；此項發(fā)明可以以編碼受體的 基因或下游信號元件開始，快速構(gòu)建GPCRs篩選系統(tǒng)，其中一個目標是可 以對GPCR和GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進^f亍高通量篩選或高內(nèi)涵篩選；另外， 此發(fā)明還應(yīng)適用于多種檢測方式，包括熒光的、生物發(fā)光的、發(fā)磷光的或比 色的方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于對任何耙細胞型中任何GPCR或GPCR信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動劑、拮抗劑都可以篩選；另一優(yōu)點是在藥物發(fā)現(xiàn)過程中可以 進行GPCRs的去孤兒化；更大的優(yōu)點是可以構(gòu)建適合大范圍的檢測方式， 實驗室儀器操作或自動化操作。還有一優(yōu)點就是適合任何細胞類型，既可以 構(gòu)建活體外的檢測系統(tǒng)，也可以構(gòu)建活體內(nèi)的檢測系統(tǒng)。本發(fā)明構(gòu)建的篩選篩選系統(tǒng)是利用G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞的原理，與偶 聯(lián)的G蛋白(Gi,Gs和Gq)無關(guān)，故可以適用于所有的G蛋白偶聯(lián)受體?，F(xiàn)有技術(shù)中，利用G蛋白偶聯(lián)受體基因、響應(yīng)元件(CRE、 SRE和MRE )、 熒光素酶報告基因，建立一個適用于受體激動劑高通量篩選沖莫型，雖然響應(yīng) 元件能夠靈敏地監(jiān)控第二信使的變化，但是，由于影響第二信使變化的因素 很多，可能出現(xiàn)不通過G蛋白偶聯(lián)受體激活報告基因表達的現(xiàn)象，造成假 陽性。而本發(fā)明構(gòu)建的篩選系統(tǒng)只涉及G蛋白偶聯(lián)受體本身和p-arrestin, 當(dāng)配體與受體結(jié)合并激活后，P-arrestin就會靠近并與受體結(jié)合，導(dǎo)致具蛋白 剪接功能的DnaE的作用下將報告基因連接成一個完整的蛋白而恢復(fù)它的原 有的活性，因此影響的因素很少，而實驗中出現(xiàn)的假陽性就明顯少。另夕卜，如通過響應(yīng)元件(CRE、 SRE和MRE)構(gòu)建的報告基因篩選模 型，要通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，才能引起報告基因表達，所以需要孵育的時間 數(shù)小時，長的要8小時之久。而本發(fā)明要構(gòu)建的篩選模型是利用G蛋白偶 聯(lián)受體的內(nèi)吞的原理， 一般G蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)吞在配體與受體結(jié)合并激 活后的數(shù)分鐘內(nèi)就發(fā)生，15分鐘到半小時即可達到高峰，所以只需要孵育 的數(shù)分鐘到半小時就能檢測到報告基因的活性。再者，將綠色熒光蛋白(GFP)與p-arrestin或受體直接融合表達，可 以通過由于配體作用引起GPCR的活化而導(dǎo)致(3-arrestin在亞細胞結(jié)構(gòu)中的 重新分配進行成像檢測，來確定GPCR的活性。這種方法往往需要價格昂貴的檢測儀器，而本發(fā)明可運用諸如熒光素酶、p-內(nèi)酰胺酶和(3-半乳糖香酶等，只需化學(xué)發(fā)光^r測儀或普通的比色法就能測定。從根本上說，將具拼接功能的內(nèi)含肽使沒有活性的報告基因兩部分合而 為有活性的酶或發(fā)光蛋白是一個普遍而靈活的方法，可以研究蛋白-蛋白復(fù) 合物在活體細胞中的結(jié)合與解離，使之成為重要的藥物發(fā)現(xiàn)研究工具。這種 方法可以直接一企測分子間的相互作用，而不必通過次級反應(yīng)如轉(zhuǎn)錄活性或4丐 離子的釋放。不必要用大分子標記蛋白，如完整的熒光蛋白。更由于在細胞 或活體系統(tǒng)中進行拼接，當(dāng)且僅當(dāng)內(nèi)源蛋白存在的條件下，相關(guān)細胞表達的 蛋白經(jīng)正確的翻譯后加工顯示出天然構(gòu)象，直接或間接調(diào)控蛋白間的相互作 用。這種方法可使用多種報告蛋白，能為任何儀器平臺、自動操作系統(tǒng)、細 胞類型和需要的試驗方案特定設(shè)計。根據(jù)報告蛋白的選擇，可以構(gòu)建高內(nèi)涵 和高通量檢測系統(tǒng)，并且能依據(jù)特定的靶點和對激動劑或拮抗劑在細胞內(nèi)的 作用方式來靈活的設(shè)計檢測系統(tǒng)。在高內(nèi)涵系統(tǒng)中，無論在細胞膜，細胞質(zhì)， 細胞核還是在其它的亞細胞室中的蛋白-蛋白復(fù)合物的亞細胞定位都可以 被檢測到，而且蛋白-蛋白復(fù)合物在刺激物或阻遏物作用下發(fā)生的移動也可 進行可視化檢測。在高通量檢測系統(tǒng)中，可以通過標準熒光全自動定量繪圖 酶標儀定量檢測流式細胞，多孔板或微量滴定板。這種方法能夠定位信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑中的蛋白。也可以用來驗證新的靶點，主要通過4企測哺乳動物細胞框 架內(nèi)特定蛋白與其它蛋白的互作，然后決定蛋白-蛋白復(fù)合物是否可以對激 動劑、拮抗劑或抑制劑作出響應(yīng)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在應(yīng)用本發(fā)明篩選系統(tǒng)進行G蛋白偶聯(lián) 受體(GPCR)細胞水平篩選，靈敏度高、特異性強，操作簡單、快速，檢 測范圍廣，對任何靶細胞型中任何GPCR或GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動劑、 拮抗劑都可以篩選；在藥物發(fā)現(xiàn)過程中還可以進行孤兒GPCRs的去孤兒化； 適合任何細胞類型，既可以構(gòu)建活體外的檢測系統(tǒng)，也可以構(gòu)建活體內(nèi)的檢 測系統(tǒng)。(四)


圖1為本發(fā)明建模原理圖；圖2為不同濃度煙酸對HM74a作用結(jié)果；圖3為不同時間煙酸對HM74a作用結(jié)果(煙酸濃度300pM);圖4為激動劑WIN 55,212-2 (4|iM)對CB1受體內(nèi)吞的影響。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并 不僅限于此實施例中所涉及基因序列如下: HM74aNDA序列GCCCCTCTTATCTGGGCCCAACCTCTCCTTAA;固74a氨基酸序列 MNRHHLQDHFLEIDKKNCCVFRDDFIVKVLPPVLGLEFIFGLLGNGLAL WIFCFHLKSWKSSRIFLFNLAVADFLLIICLPFLMDNYVRRWDWKFGDIPC RLMLFMLAMNRQGSIIFLTVVAVDRYFRVVHPHHALNKISNRTAAIISCLLGnLFCSARIIWSLRQRQMDRHAKIKRAITFIMVVAIVFVICFLPSVVVRIRI FWLLHTSGTQNCEVYRSVDLAFFITLSFTYMNSMLDPVVYYFSSPSFPNFSPSYLGPTSP 。p-arrestin2 DNA序歹寸TGAAGGGGATGAAGGATGACGACTATGATGATCAACTCTGCTAGP-arrestin2氨基酸序列MGEKPGTRVFKKSSPNCKLTVYLGKRDFVDHLDKVDPVDGVVLVDSLHLEASLDKELYYHGEPLNVNVHVTNNSTKTVKKIKVSVRQYADICLFSHEDTNLASSTIVKEGANKEVLGILVSYRVKVKLVVSRGGDVSVELPFVLMHPKPHDHIPLPRPQSAAPETDVPVDTNLIEFDTNYATDDDIVFEDFARLRLKGMKDDDYDDQLC*RLuc的DNA序列ATGAACAATAARLuc的氨基酸序歹寸:FLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGACLAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEEYIKSFVERVLKNEQRLuc的N端(RLuc-N， l 229aa) DNA序列GTGGT;RLuc的N端(RLuc-N, l 229aa)氨基酸序列FLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEE FAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGG;RLuc的C端(RLuc-C, 230 311 aa) DNA序列CAATAA;RLuc的C端(RLuc-C, 230~311aa)氨基酸序列 KPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFV KVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ。RLuc的N端(RLuc-N, 1 110aa) DNA序列AAATATCTTACTGCATGGTTTGAACTTCTTAATTTACCARLuc的N端(RLuc-N， 1~110aa)氨基S吏序列 MTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVI FLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHY KYLTAWFELLNLRLuc的C端(RLuc-C， Ul 311aa) DNA序列TTCTCAAAAATGAACAATAARLuc的C端(RLuc-C, 111~31 laa)氨基酸序列EDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEQ來自藍球藻的DnaE的N端(Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-N, 37~152aa) DNA序列AGCGACGGCGTAA;Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-N (37~152aa)的氨基酸序列為:PLLAIAQPSPLATA;Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-C ( l 36aa)的DNA序列GTGGCCTCCAAC;Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-C ( l~36aa)的氨基酸序列為: MVKIVRRRSLGVQPVYDLGVATVHNFVLANGLVASN。來自點狀念抹藻Nostoc punctiforme PCC73102的DnaE N端(Nostoc punctiforme PCC73102 DnaE-N, 37 141 aa) DNA序列TGCGGGTTGATAATTTGCCGA ATTG A;Nostoc punctiforme PCC73102 DnaE國N ( 37~141 aa)的氨基酸序列NLPN;Nostoc punctiforme PCC73102 DnaE誦C ( l~36aa)的DNA序列AGCTTCTAAT;Nostoc punctiforme PCC73102 DnaE隱C ( l 36aa)的氨基酉臾序列為: MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN ; 人大麻石威受體CB1基因cDNA序列AGACACGTCTGCCGAGGCTCTGTGA 人大麻堿受體CB1蛋白氨基酉^f列為HFIGSLAVADLLGSVIFVYSFIDFHVFHRKDSRNVFLFKLGGVTASFTASVGSLFLTAIDRYISIHRPLAYKRIVTRPKAVVAFCLMWTIAIVIAVLPLLGWN CEKLQSVCSDIFPHIDETYLMFWIGVTSVLLLFIVYAYMYILWKAHSHAVPLLAIMVYDVFGKMNKLIKTVFAFCSMLCLLNSTVNPIIYALRSKDLRHAAKVTMSVSTDTSAEAL*實施例1:(1 )從人胎盤基因組DNA中克隆HM74a基因，從HEK293總脂A以 RT-PCR克隆卩-arrestin2基因，從藍球藻菌抹Anacystis nidulans R2(PCC7942)基因組DNA中克隆DnaE基因的N端(DnaE-N)和C 端(DnaE-C );構(gòu)建質(zhì)粒i : pCMV-flag-HM74a和質(zhì)粒ii : pCDNA-(3-arrestin2。(2 )將Anacystis nidulans R2 DnaE-C ( 1-36 aa)分別與兩種Renilla熒光素 酶基因C端(rLuc-C, 111 -311 aa )通過overlap PCR將DnaE-C與rLuc畫C 拼接起來，在DnaE-C與rLuc-C之間加入CFNGT 5個氨基酸序列， 并且在DnaE-C的N端連上一個GC linker (其氨基酸序列為 GGGGSG);將兩種Renilla熒光素酶基因N端(rLuc-N, l-110aa) 與Anacystis nidulans R2 DnaE隱N( 37-152aa )通過overlap PCR將rLuc-N 與DnaE-N拼接起來，在rLuc-N與DnaE-N之間加入GS兩個氨基酸 序列，在rLuc-N的N端同樣連上一個GC linker。(3 )將上述構(gòu)建的DnaE-C-rLuc-C及rLuc-N-DnaE-N分別插入到質(zhì)粒i和 質(zhì)粒ii中，便可獲得融合表達載體 I : pCMV-flag-HM74a-DnaE-C-rLuc-C 和融合表達載體II : pCDNA畫(3畫arrestin2陽rLuc-N畫DnaE-N;(4 ) HEK293細胞以3xl05密度傳代于6孔細胞培養(yǎng)板中，在含10 %胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C, 5%(302環(huán)境培養(yǎng)。第二天用 Lipofectamine 2000 ( invitrogen 公司)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCMV-flag-HM74a-DnaE-C畫rLuc-C 和 pCDNA畫P-arrestin2-rLuc-N畫DnaE-N, 24小時后傳至24孔細胞培養(yǎng)板 中繼續(xù)培養(yǎng)過夜。(5 )吸去上述培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，分別用含不同濃度(ImM, IO(VM， 10|iM, lpM, O.lpM和O.OljiM )煙酸的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)共轉(zhuǎn)染細胞60min;及用含300pM煙酸的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間，吸去培養(yǎng)基，用 PBS洗兩次，再用Renilla Luciferase Assay System ( Promega 7>司)裂 解液裂解細胞，加入反應(yīng)底物(按試劑盒要求進行)，用化學(xué)發(fā)光檢測 儀(Berthold公司)測定2S鐘內(nèi)熒光強度，結(jié)果見圖2、圖3。 細胞培養(yǎng)和穩(wěn)定表達細胞林構(gòu)建用于本發(fā)明的細胞林主要有HEK293 和CHO細胞。這2種細胞均用DMEM培養(yǎng)基加10%FBS。細胞轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn) 染受體表達載體和報告基因表達載體用Lipofectamine-2000.轉(zhuǎn)染24小時 后，加入G418, HEK293細胞為800(ig/ml,而CHO細胞為600pg/ml， 3 4 天換一次含G418新鮮培養(yǎng)基。二周后，可見明顯的細胞群落，挑20 30個 細胞群落擴增后，用流式細胞儀分析受體細胞表面表達，把高表達細胞抹擴 增后凍存，或用于藥物篩選和結(jié)合活性測試等實驗。螢光素酶活性的測定細胞水平篩選細胞系螢光素酶活性測定用 Promega試劑盒，按試劑盒要求，在反應(yīng)結(jié)束后，加入溶胞緩沖液，立即用 Topcounter或化學(xué)發(fā)光檢測儀(Berthold公司)測定2S鐘內(nèi)熒光強度，讀出 RLU (相對光強度單位)。實施例2:(1)從人胎盤基因組DNA中克隆HM74a基因，從HEK293總RNA以 RT-PCR克隆 P-arrestin2 基因，從點狀念抹藻 Nostoc punctiforme(PCC73102)基因組DNA中克隆DnaE基因的N端 (DnaE-N, 37-141aa)和C端(DnaE-C, 1 36aa);(2 )將Nostoc punctiforme DnaE-C ( l-36aa)分別與兩種i ew'〃a焚光素酶 基因C端(rLuc畫C, 229-3llaa)通過overlap PCR將DnaE-C與rLuc-C 拼接起來，在DnaE-C與rLuc-C之間加入CFNGT 5個氨基酸序列， 并且在DnaE-C的N端連上一個GC linker (其氨基酸序列為 GGGGSG);將兩種i em'〃a熒光素酶基因N端(rLuc-N, l-229aa) 與Nostoc punctiforme DnaE-N ( 37-141aa)通過overlap PCR將rLuc-N 與DnaE-N拼接起來，在rLuc-N與DnaE-N之間加入GS兩個氨基酸 序列，在rLuc-N的N端同樣連上一個GC linker。(3 )將上述構(gòu)建的DnaE-C-rLuc-C及rLuc-N-DnaE-N分別插入到質(zhì)粒i和 質(zhì)粒ii中，便可獲得融合表達載體 I : pCMV-flag-HM74a-DnaE-C-rLuc-C 和融合表達載體II :pCDNA-|3-arrestin2-rLuc-N-DnaE-N;(4) CHO細胞以3xl()S密度傳代于6孔細胞培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血 清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C, 5%(302環(huán)境培養(yǎng)。第二天用 Lipofectamine 2000 ( invitrogen 公司)共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCMV隱flag-畫74a-DnaE-C-rLuc-C 和 pCDNA-卩畫arrestin2-rLuc-N-DnaE-N。(5 )轉(zhuǎn)染24小時后，加入G418至濃度為600ng/ml， 3 4天換一次含G418 新鮮培養(yǎng)基。二周后，可見明顯的細胞群落，挑20 30個細胞群落擴 增后，用流式細胞儀分析受體細胞表面表達，把高表達細胞株擴增后 凍存，或用于藥物篩選和結(jié)合活性測試等實驗。實施例3:人大麻堿受體CB1內(nèi)吞活性的檢測按照實施例1方法，構(gòu)建質(zhì)粒載體pCMV-Flag-CBl-rLucN-DnaEN和 pcDNA-pArrestin2-DnaEC-rLucC , 再用Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染試劑將 pCMV-Flag-CBl-rLucN-DnaEN和pcDNA畫pArrestin2-DnaEC畫rLucC表達 載體共轉(zhuǎn)染到HEK293細胞，經(jīng)G418 ( 800pg/ml) 2 3周的選纟奪得到穩(wěn)定 表達細胞抹。穩(wěn)定表達細胞用胰酶-EDTA消化后，轉(zhuǎn)到24孔培養(yǎng)板，經(jīng)12~16 小時37。C在C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，加入含4pM激動劑WIN 55,212-2的無血清 DMEM培養(yǎng)基在37°C的C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 6小時，然后用化學(xué)發(fā)光4企測儀 檢測熒光素酶活性，結(jié)果見圖4。<110〉 <120〉 <160〉 <170〉 <210〉 <211> <212〉 <213> <400>序列表—ST25SEQUENCE LISTING浙江大學(xué)新型的G蛋白偶聯(lián)受體細胞水平篩選細胞系統(tǒng)構(gòu)建與應(yīng)用 24Patentln version 3.4 11092 腿Homo sapiens 1atgaatcggc accatctgca ttccgagatg acttcattgt gggcttctgg gcaatggcct tccagccgga ttttcctgttcccttcctga cggctgatgc gtggcggtag 犯tcggacag cacctcctga agcatctgcc ctgggcatca gaccggcatg gtcatctgct tcgggcacgc agcttcacct tttcccaact ccagataatatggacaacta tcttcatgtt acaggtattt cagccatcatataccttcca tcctgttctg ccaagatcaa tccttcccag3C3tgaacag tcttctccac accgcagcacgctccagagg cgttaatggc acctctcctt aaggatcacttt caaggtgttg tgccctgtgg caacctggca tgtgaggcgt ggctatgaac ccgggtggtc ctcttgcctt gccgatccag gtggcacgaa ctcagccaga gagagccatc cgtggUgtg agtgtaccgc catgctggac tttgatcaac gagcgtcgag caactccggtctggaaatag ccgccggtgt attttctgtt gtggctgacttggggctgga tccacctcaa ttctactgattgggactgga agtttgggga cgccagggca gcatcatcttcatcccca_cc ctgtggggca ■ggcggtg gccatgttcc attatctgga accttcatca cggatccgca tcggtggacc cccgtggtgt cgctgcctcc ctcacaggggacgccctgaa txactattgg caaatttgtg tcctggagtt gcctgcggca tggtggtggc tcttctggct tggcgttctt actacttctc3cccc犯ca^gagccatgga gcccctcttactgctgtgtg gtttatcttc gtcctggaaa catctgcctg catcccttgc cctcacggtg caagatctcc cctgacagtc cagcagcttc cttcctgccc gagacaaatg catcgtcttt cctgcacact tatcactctc cagcccatccg3C3ggtg3gaaccagaggc txtgggccca60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1092〈210〉 2<211> 363〈212〉 PRT〈213〉 Homo sapiens<400〉 2Met 1AsnArgHisHisLeuGinAsp丄 AsnCysCysValPheArgAspAsp20VaiLouC-lyLeuGluPheliePhe3540LeuTrpliePheCysPheHisLeu5055PheLeuPheAsnLeuAlaValAla6570ProPheLeuMetAspAsnTyrVal85AsplieProCysArgLeuMetLeu100GlySerlieliePheLeuThrVal115120ValValHisProHisHisAlaLeu130135AlalielieSerCysLeuLeuTrp145150HisLeuLeuLysLysLysMetPro165CysSerSerPheSerlieCysHis180PheLeuLeuGluPhePheLeuPro195200AlaArglielieTrpSerLeuArg210215tyslieLysArgAlalieThrPhe225230VallieCysPheLeuProSerVal245LeuLeuHisThrSerGlyThrGin260AspLeuAlaPhePhelieThrLeu275280LeuAspProValValTyrTyrPhe290295PheSerThrLeulieAsnArgCys305310ProAspAsnAsnArgSerThrSer325HisPheLeuGlulieAspLysLys1015PhelieValI>ysValLeuProPro2530GlyLeuLeuGlyAsnGlyLeuAla45LysSerTrpLysSerSerArglie60AspPheLeuLeulielieCysLeu7580ArgArgTrpAspTrp匕ysPheGly9095PheMetLeuAlaMetAsnArgGin105110ValAlaValAspArg丁yrPheArg125Asn匕yslieSerAsnArgThrAla140GlylieThrlieGlyLeuThrVal155160lieGinAsnGlyGlyAlaAsnLeu170175ThrPheGinTrpHisGluAlaMet185190LeuGlylielieLeuPheCysSer205GinArgGinMetAspArgHisAla220lieMetValValAlalieValPhe235240ValValArglieArgliePheTrp250255AsnCysGluValTyrArgSerVal265270SerPheThrTyrMetAsnSerMet285SerSerProSerPheProAsnPhe300LeuGinArgLysMetThrGlyGlu315320ValGluLeuThrGlyAspProAsn330335Lys Thr Arg Gly Ala Pro Glu Ala Leu Met Ala Asn Ser Gly Glu Pro340 345 350Trp Ser Pro Ser Tyr Leu Gly Pro Thr Ser Pro 355 360〈210〉 3 <211> 1233 <212> DNA<213〉 human embryonic kidney293 <400> 3accatggggg agaaacccgg gaccagggtc accgtgtact tgggcaagcg ggacttcgta ggcgtggtgc ttgtggaccc tgactacctg tgcgccttcc gctatggccg tgaagacctg ctgttcatcg ccacctacca ggccttcccc cgcctgcagg accggctgct gaggaagctg ataccccaga atcttccatg ctccgtcaca gcctgcggcg tagactttga gattcgagcc cacaaaagga actctgtgcg gctggtgatc ggcccccagc cttcagccga aaccacacgc ctcgaggctt ccctggacaa ggagctgtac cacgtcacca acaactccac caagaccgtc gccgacatct gcctcttcag caccgcccag gatgaccagg tatctcccag ctccacattc agcgacaacc gggagaagcg gggtctcgcc aacctggctt ccagcaccat cgtgaaggag gtgtcctaca gggtcaaggt gaagctggtg ctgccttttg ttcttatgca ccccaagccc tcagccgctc cggagacaga tgtxcctgtg tatgccacag atgatgacat tgtgtttgag aaggatgacg actatgatga tcaactctgcttc^gaagtcgagccctaactgcaagctc60gatcacctggacaaagtggaccctgtagat120aaggaccgcagaccctcacc180gatgtgctgggcttgtccttccgcaaagac240ccggtgccca3CCC3CCCCggccccccacc300ggCC3gC3tgcccaccccttcttcttcacc360ctgcagccaggccc卿ggatacagga^g420ttctgtgctaa_a_tca_ctagaagagaaaagc480cgaaaggtgcagttcgccccggagaaaccc540cacttcctcatgtctgaccggtccctgcac600ta_ccatggggagcccctcaatgtaaatgtc660犯gaagatcaaagtctctgtgagacagtac720tacaagtgtcctgtggctcaactcgaacaa780tgtaaggtgtacaccataaccccactgctc840ctggatgggaaactcaagcacgaggacacc900ggtgccaacaaggaggtgctgggaatcctg960gtgtctcgaggcggggatgtctctgtggag1020C3Cg3CC3C3tccccctccccagaccccag1080gacacc^cctcattgaatttgatacc肌c1140gactttgcccggcUcggctga鄉(xiāng)ggatg1200tag1233<210> 4〈211〉 409〈212〉 PRT<213> human embryonic kidney293〈400〉 4MetGlyGlu匕ysProGlyThrArgValPheLysLysSerSer ProAsn151015CysL'/sLeuValTyrLeuGlyLysArgAspPheValAsp HisLeu;2530AspLysValAspProValAspGlyValValLeuValAspPro AspTyr354045LeuLysAspArgLysValPheValThrLeuThrCysAlaPhe ArgTyr505560GlyArgGluAspLeuAspValLeuGlyLeuSerPheArgLys AspLeu65707580PhelieAlaThrTyrGinAlaPheProProValProAsnPro ProArg859095ProProThrArgLeuGinAspArgLeuLeuArgLysLeuGly GinHis100105110AlaHisProPhePhePheThrlieProGinAsnLeuProCys SerVal115120125ThrLeuGinProGlyProGluAspThrGly匕ysAlaCysGly ValAsp130135140PheGlulieArgAlaPheCysAlaLysSerLeuGluGluLys SerHis145150155160LysArgAsnSerValArgLeuVallieArg匕ysValGinPhe AlaPro165170175GluLysProGlyProGinProSerAlaGluThrThrArgHis PheLeu180185190MetSerAsp/VrgSerLeuHisLeuGluAlaSerLeuAspLys GluLeu195200205TyrTyrHisGlyGluProLeuAsnValAsnValHisValThr AsnAsn210215220SerThrLysThrValLysLyslieLysValSerValArgGin TyrAla225230235240AsplieCysLeuPheSerThrAlaGinTyrLysCysProVal AlaGin245250255LeuGluGinAspAspGinValSerProSerSerThrPheCys LysVal260265270TyrThrlieThrProLeuLeuSerAspAsnArgGluLysArg GlyLeu275280285AlaLeuAspGlyLysLeuLysHisGluAspThrAsnLeuAla SerSer290295300ThrlieValLysGluGlyAlaAsnLysGluValLeuGlylie LeuVal305310315320SerTyrArgVal LysValLysLeuValValSerArgGlyGlyAspVal325330335SerValGluLeu ProPheValLeuMetHisProLysProHisAspHis340345350lieProLeuPro ArgProGinSerAlaAlaProGluThrAspValPro355360365ValAspThrAsn LeulieGluPheAspThrAsn丁yrAlaThrAspAsp370375380AsplieValPhe GluAspPheAlaArgLeuArgLeu匕ysGlyMetLys385390395400AspAspAspTyr AspAspGinLeuCys405〈210〉 5<211〉 936〈212〉 DNA〈213> Renilla reniformis〈400〉 5atgacttcga肌gtt"tatgatccagaacaaaggaaacggatgataactggtccgcagtgg60tgggccagatgtaaacaaatgaatgttcttgattcatttattaattattatgattcagaa120aaacatgcagaaaatgctgttatttttttacatggtaacgcggcctcttcttatttatgg180cgacatgttgtgccacatattgagccagtagcgcggtgtattataccagatcttattggt240atgggcaaatcaggcaaatctggtaatggttcttataggttacttgatca300cttactgcatggtttgaact"tcttaatttacc犯ag犯gatcatttttgtcggccatgat360tggggtgcttgtttggcatttcattatagctatgagcatc犯g3taagat420gttcacgctg犯agtgtagtagatgtga/ttg犯tcatgggatgaatggcctgatattgaa480gaagatattgcgttgatcaastctg犯gaaggagaaaaaatggttttggag幼"taacttc540ttcgtgga肌ccatgttgcc3tcaaa犯tcatgags犯gttag肌ccagaagaatttgca600gcatatcttgaaccattcaagaagttcgtcgtccaacattatcatggcct660cgtgaaatcccgttagtaaaaggtggtaaacctgacgttgtacaaattgttaggaattat720aatgcttatxtacgtgcaagtgatgatttaccaaaaatgtttattgaatcggatccagga780ttct"tttccaatgctattgttgaaggcgcca￡Lg￡L￡LgtttCatttgtcaaa柳gt犯aaggtcttcat"ttttcgcaaga鄧3tgcacctgatg3aatggga^3atatatcaaa900tcgttcgttgagcgagttxt936<210> 6<211> 311<212〉 PRT<213> Renilla reniformisMetThrSerLysValTyrAspProGluGinArgLysArgMetlieThr151015GlyProGinTrpTrpAlaArgCysLysGinMetAsnValLeuAspSer202530PhelieAsnTyrTyrAspSerGluLysHisAlaGluAsnAlaVallie354045PheLeuHisGlyAsnAlaAlaSerSerTyrLeuTrpArgHisValVal505560ProHislieGluProValAlaArgCyslielieProAspLeulieGly65707580MetGlyLysSerGlyLysSerGlyAsnGlySer丁yrArgLeuLeuAsp859095HisTyrLysTyrLeuThrAlaTrpPheGluLeuLeuAsnLeuProLys100105110LyslieliePheValGlyHisAspTrpGlyAlaCysLeuAlaPheHis115120125TyrSerTyrGluHisGinAspLyslieLysAlalieValHisAlaGlu130135140SerValValAspVallieGluSerTrpAspGluTrpProAsplieGlu145150155160GluAsplieAlaLeulieLysSerGluGluGlyGluLysMetValLeu165170175GluAsnAsnPhePheValGluThrMetLeuProSerLyslieMetArg180185190LysLeuGluProGluGluPheAlaAlaTyrLeuGluProPheLysGlu195200205LysGlyGluValArgArgProThrLeuSerTrpProArgGluliePro210215220LeuValLysGlyGlyLysProAspValValGinlieValArgAsnTyr225230235240AsnAlaTyrLeuArgAlaSerAspAspLeuProLysMetPhelieGlu245250255SerAspProGlyPhePheSerAsnAlalieValGluGlyAla匕ysLys260265270PheProAsnThrGluPheVal匕ysValLysGlyLeuHisPheSerGin275280285GluAspAlaProAspGluMetGlyLysTyrlieLysSerPheValGlu290 295 Arg Val Leu Lys Asn Glu Gin 305 310300<210〉 7〈211〉 687<212> DNA<213> Renilla reniformis<400> 7atgacttcga tgggccagat aaacatgcag cgacatgttg atgggcaaat cttactgcat tggggtgcU gttcacgctg g^gatattg ttcgtgga^a gcatatcttg cgtgaaatccaagtttatga gtaaacaaat aaaatgctgt tgccacatat caggcaaatc ggtttgaact gtttggcatt aaagtgtagt cgttgatcaa ccatg"ttgcc aaccattcaa cgttagta犯tccag^c肌tattttttta tgagccagta tggtaatggt tcttaattta tcattatagc agatgtgatt atctgaagaa 3tc犯a^"tcaggtggtgattcattta catggtaacg gcgcggtgta tcttataggt ccaaag肪ga tatgagcatc g犯tcatggg ggag333aaa atgag犯3gt gaagttxgtctgat朋ctggtccgcagtgg60ttaa_tt3tta_tgattcagaa120cggcctcttcttatttatgg180ttataccagatcttattggt240tacttgatcattacaaatat300tcatttttgtcggccatgat360犯gat^gat420atgaatggcctgatattgaa480tggttttggaga3t^cttc540tagaaccagaagaatttgca600gtccaacattatcatggcct660687〈210〉 8<211> 229<212> PRT<213> Renilla reniformis〈400〉 8MetThrSerLysValTyrAspProGluGinArgArgMetlieThr151015GlyProGinTrpTrpAlaArgCysLysGinMetAsnVall>euAspSer202530PhelieAsnTyrTyrAspSerGluLysHisAlaGluAsnAlaVallie354045PheLeuHisGlyAsnAlaAlaSerSerTyrLeuTrpArgHisValVal505560ProHislieGluProValAlaArgCyslielieProAspLeulieGly65707580MetGly匕ysSerGlylysSerGlyAsnGlySerTyrArgLeuLeuAsp859095TyrL'/s"TyrLeuThrAlaTrpPheGluLeuLeuAsnLeuProLys100105110LyslieliePheValGlyHisAspTrpGlyAlaCysLeuAlaPheHis115120125TyrSerTyrGluHisGinAsp丄yslieLysAlalieValHisAlaGlu130135140SerValValAspVallieGluSerTrpAspGluTrpProAsplieGlu145150155160GluAsplieAlaLeulieLysSerGluGluGlyGlu匕ysMetValLeu165170175GluAsnAsnPhePheValGluThrMetLeuProSerLyslieMetArg180185190LysLeuGluProGluGluPheAlaAlaTyrLeuGluProPheLysGlu195200205LysGlyGluValArgArgProThrLeuSerTrpProArgGluliePro210215220LeuValLysGlyGly225<210> 9 〈211〉 249 <212> DNA<213〉 Renilla reniformis <400〉 9ttgtacaaat tgttaggaat tataatgctt atctacgtgc aagtgatgat tgtttattga atcggatcca ggattctttt ccaatgctat tgttgaaggc ttcctaEitac tgaatttgtc 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12<211> 110〈212〉 PRT<213〉 Renilla reniformis<400〉 12Met ThrSerLysValTyrAspPro GluGinArgLysArgMetlieThr51015Gly ProGinTrp 20TrpAlaArgCys Lys 25GinMetAsnValLeu 30AspSerPhe lieAsn 35TyrTyrAspSerGlu Lys 40HisAlaGluAsn 45AlaValliePhe LeuHisGlyAsnAlaAlaSer Ser丁yrLeuTrpArgHisValVal505560Pro HislieGluProValAlaArg CyslielieProAspLeulieGly65707580Met GlyLysSerGly 85LysSerGly AsnGly 90SerTyrArgLeuLeu 95AspHis Tyr匕ysTyr 100LeuThrAlaTrp Phe 105GluLeuLeuAsnLeu 110〈210> 13 <211> 603 <212〉 腿〈213〉 Renilla reniformis 〈400〉 13aagaagatca tttttgtcgg ccatgattgg ggtgcttgtt tggcatttca ttatagctat 60gagcatcaag ataagatcaa agcaatagtt cacgctgaaa gtgtagtaga tgtgattgaa 120tcatgggatg aatggcctga tattgaagaa gatattgcgt tgatcaaatc tgaagaagga 180gaaaaaatgg ttttggagaa taacttcttc gtggaaacca tgttgccatc aaaaatcatg 240agaaagttag aaccagaaga atttgcagca tatcttgaac cattcaaaga gaaaggtgaa 300gttcgtcgtc caacattatc atggcctcgt gaaatcccgt tagtaaaagg tggtaaacct 360gacgttgtac aaattgttag gaattataat gcttatctac gtgcaagtga tgat"ttacca 420aaaatgttta ttgaatcgga tccaggattc ttttccaatg ctattgttga aggcgccaag 480aag"t"ttccta atactgaatt tgtcaaagta aaaggtcttc atttttcgca agaagatgca 540cctgatgaaa tgggaaaata tatcaaatcg ttcgttgagc gagttctcaei aaatgaacaa 600taa 603<210> 14<211> 201<212> PRT<213> Renilla reniformis〈400〉 14ProLysLyslieliePheValGlyHisAspTrpGlyAlaCysLeuAla151015PheHisTyrSerTyrGluHisGinAspLyslieLysAlalieValHis202530AlaGliiSerValValAspVallieGluSerTrpAspGluTrpProAsp354045lieGluGluAsplieAlaLeulieLysSerGluGluGlyGluLysMet505560ValLeuGluAsnAsnPhePheValGluThrMetLeuProSerLyslie65707580MetArgLysLeuGluProGluGluPheAlaAlaTyrLeuGluProPhe859095LysGluLysGlyGluValArgArgProThrLeuSerTrpProArgGlu100105110lie ProLeu 115ValLysGlyGlyLys 120ProAspValValGin 125lieValArgAsn TyrAsnAlaTyrLeuArgAlaSerAspAspLeuProLysMetPhe130135140lie GluSerAspProGlyPhePheSerAsnAlalieValGluGlyAla145150155160Lys LysPheProAsn 165ThrGluPheValLys 170ValLysGlyLeuHis 175PheSer GinGluAsp 180AlaProAspGluMet 185GlyLysTyrlieLys 190SerPheVal GluArg 195ValLeuLysAsnGlu 200Gin〈210〉 15 <211> 351 〈212〉 DNA<213〉 Anacystis nidulans <400> 15gccgaatatt gtttggcggc agatacagaa attggcaaac tagtcgaaga aaatattcgt tatatctaca gtcagccgat tggtxaatgg tacgaactca gtgatggtcg catcattcga gagggtgaa3 tgctgtcgct ggstgaaatc ccgacaccat tgttagcgat cgctcagcca<210> 16<211〉 116<212> PRT<213〉 Anacystis nidulans<400〉 16AlaGlu丁yrCysLeuAlaAla AspThrGluValLeuThrValGlu丁yr151015GlyProlieAlalieGlyLys LeuValGluGluAsnlieArgCysGin202530ValTyrCysCysAsnProAsp GlyTyrlieTyrSerGinProlieGly354045GinTrpHisGinArgGlyGlu GinGluVallieGluTyrGluLeuSer505560AspGlyArglielieArgAla ThrAlaAspHisArgPheMetThrGlu707580GlyGluMetLeuSerLeu AspGluliePheGluArgSerLeuGlu859095LeuLysGinlieProThrPro LeuLeuAlalieAlaGinProSerPro100 105 110Leu Ala Thr Ala 115gttctgaccg ttgaatatgg cccgatcgcg 60tgccaagttt attgctgtaa cccagatggc 120catcaacgag gtgaacagga agtgattgaa 180gcaactgctg accatcgctt tatgactgaa 240t"ttgagcga"t cgctagaact gaagcagatt 300tccccgttag cgacggcgta a 351<210〉 17 <211〉 108 <212〉 DNA<213> Anacystis nidulans 〈400〉 17atggtcaaaa ttgttcggcg gcgttccttg ggtgtgcaac ccgtctacga ccttggcgtg 60 gcaaccgtac ataactttgt gctggccaat ggccttgtgg cctccaac 108<210> 18 <211> 36 <212> PRT〈213〉 Anacystis nidulans 〈400〉 18Met Val Lys lie Val Arg Arg Arg Ser Leu Gly Val Gin Pro Val Tyr15 10 15Asp Leu Gly Val Ala Thr Val His Asn Phe Val Uu Ala Asn Gly Leu20 25 30Val Ala Ser Asn 35〈210〉 19 〈211〉 318 〈212〉 DNA〈213〉 Nostoc sp. PCC73102 <400〉 19gctgaatatt gtttaagcta tgaaacggaa atattgacag tagaatatgg attattaccg 60 attggtaaaa ttgtagaaaa gcgcatcgaa tgtactgttt atagcgttga taataatgga 120 aatatttata cacaacctgt agcacaatgg cacgatcgcg gagaacaaga ggtgtttgag 180 tattgtttgg aagatggttc attgattcgg gcaacaaaag accataag"tt tatgactgtt 240 gatggtcaaa tgttgccaat tgatgaaata tttgaacgtg aattggattt gatgcgggtt 300gataatttgc cgaattga318<210> 20<211> 105<212> PRT<213> Nostoc sp. PCC73102<400〉 20Ala GluTyrCysLeuSerTyrGlu ThrGlu lieUu Thr Val GluTyr151015Gly LeuLeuProlieGly匕yslie ValGlu LysArg lie Glu CysThr202530Vsl TyrSerValAspAsnAsnGly Asnlie TyrThr Gin Pro ValAla354045Gin TrpHisAspArgGlyGluGin GluVal PheGlu Tyr Cys L>euGlu505560Asp GlySerleulieArgAlaThr LysAsp HisLys Phe Met ThrVal65707580Asp GlyGinMetLeuProlieAsp Glulie PheGlu Arg Glu LeuAsp859095Leu MetArgValAspAsnLeuPro Asn100105〈210〉 21 <211〉 108 <212〉 DNA<213〉 Nostoc sp. PCC73102 <400〉 21atgatcaaaa tagccacacg taaatattta ggcaaacaaa gagcgcgacc ataattttgc actcaaaaat ggcttcatag<210> 22 〈211> 36 <212> PRT<213> Nostoc sp. PCC73102 <400> 22Met lie Lys lie Ala Thr Arg Lys Tyr Leu Gly1 5 '10Asp lie Gly Val Glu Arg Asp His Asn Phe Ala20 25 lie Ala Ser Asn 35atgtctatga cattggagtt cttctaatLys Gin Asn Val Tyr 15Leu Lys Asn Gly Phe 3060 108〈210〉 23 〈211〉 1419 〈2L2〉 DNA 〈213> Homo sapiens <400> 23 a"tg犯gtcga ctgtacgtggaag3tgactg ttttacaaca aacttcatgg gtcctgtccc atcctccact gtggcagacc caccgcaaag actgcctccg cccctggcct tggaccatag caatctgttt ggggtcacca gctcacagcc acgtctgagg ttagccaaga gcaatcatgg ttctgcagta agtaaggacc cctctggata agtgttcaca 3tgtctgtgttcctagatgg gctc肌atga tcccacagaa cgggagacaa ag"tctctxt;c acatagagtg tcacgctggg cccgcagcct txctggggag atagccgcaa tgggcagcctccattgtgat gctcagacat gcgtactgct acgccgtccg atggg犯ggt ccctggtcct tgtatgatgt tgctctgcct tgcgacacgc3C3gC3tggggggccgcaga ccacagacacccttgcagat cattcagtsc attcccttta cccccagcta gtccttcaag tttcatggtc caccttcacg ccgctgcaggcgtgtttctg gttcctcaca ig"tcaccagg cgccgtgctg tt"tcccacac tctgttcatc catgattcag acaggtgacc gatcctggtg ctttgggaag gctgaactcc tttccggagc ggactcggac aagctgcatc gtctgccgagaccaccttcc gaagacatca acttcctt"ta gtcccagcag g柳atgsgg ctgaacccca gtcctggaga ccttcctacc gtctacagct ttcaaactgg gccatcgaca cccaaggccg cctctcctgg attgatgaaa gtgtatgcgt cgtggcaccc cggccagacc gtgttgatca atgaacsagc accgtgaacc atgtttccct tgcctgcacagctctgtgagcaccatcac aaggtgacat ggggaagtcc accaggtgaa 3gaacstcca gccagcagct acctcctggt acttcatcgggtggggtcac ggtacatatc tggtggcgtt gctggaactg cctacctgat scatgtatat犯gcccgcat tctgctgggg tcattaagac ccatcatcta cttgtgaagg aacacgcssa tcaagattgccactgacctc ggcatccaaa cttccaagag cattacagaa gtgtggggag ggccattgca gctgtgcgtc cagcctggcg ccacg"tgttc ggcctccttc cattcacagg ttgcctgatg cgagaaactg gttctggatc tctctggaag catcatccac ggacattagg ccctxtgctt ggtgtttgca tgctctgagg cactgcgcag caatgcagcc caaggtaacc60 120 180 240 300 360 420 ■ 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1419<210〉 24<211〉 472<212〉 PRT<213〉 Homo sapiens<400〉 24Met 1LysSerlieLeuAspGlyLeuThrThrAspLeu0 I>euTyrValGly20lieLysGlyAspMetAlaSerLys3540ProLeuThrSerPheArgGlySer5055GlyAspAsnProGinLeuValPro6570Phe丁yrAsnLysSerLeuSerSer85GinCysGlyGluAsnPheMetAsp100ProSerGinGinLeuAlalieAla115120PheThrValLeuGluAsnLeuLeu130135ArgSerLeuArgCysArgProSer145150ValAlaAspLeuLeuGlySerVal165PheHisValPheHisArg匕ysAsp180LeuGlyGlyValThrAlaSerPhe195200LeuThrAlalieAspArgTyrlie210215LysArglieValThrArgProLys225230TrpThrlieAlalieVallieAla245CysGluLysLeuGinSerValCys260GluThrTyrLeuMetPheTrplie275280PhelieValTyrAlaTyrMetTyr290295AlaValArgMetlieGinArgGly305310;SerGluAspGlyl>ysValGin325MetAsplieArgLeuAlaLysThr340lielieCysTrpGlyProLeuLeu355360GlyLysMetAsnLysLeulieLys370375LeuCysLeuLeuAsnSerThrVal385390SerLysAspLeuArgHisAlaPhe405GlyThrAlaGinProLeuAspAsn420HisLysHisAlaAsnAsnAlaAla435440CyslieLysSerThrValLyslie450455ThrAspThrSerAlaGluAlaLeu465 470AlaAspThrThrPheArgThrlie1015SerAsnAsplieGinTyrGluAsp2530LeuGlyTyrPheProGinLysPhe45ProPheGinGluLysMetThrAla60AlaAspGinValAsnlieThrGlu7580PheLysGluAsnGluGluAsnlie9095lieGluCysPheMetValLeuAsn105110ValLeuSerLeuThrLeuGlyThr125ValLeuCysVallieLeuHisSer140TyrHisPhelieGlySerLeuAla155160liePheValTyrSerPhelieAsp170175SerArgAsnValPheLeuPheLys185190ThrAlaSerValGlySerLeuPhe205SerlieHisArgProLeuAlaTyr220AlaValValAlaPheCysLeuMet235240ValLeuProLeuLeuGlyTrpAsn250255SerAspliePheProHislieAsp265270GlyValThrSerValLeuLeuLeu285lieLeuTrpLysAlaHisSerHis300ThrGinLysSerlielielieHis315320ValThrArgProAspGinAlaArg330335LeuValLeulieLeuValValLeu345350AlalieMetValTyrAspValPhe365ThrValPheAlaPheCysSerMet380AsnProlielieTyrAlaLeuArg395400ArgSerMetPheProSerCysGlu410415SerMetGlyAspSerAspCysLeu425430SerValHisArgAlaAlaGluSer445AlaLysValThrMetSerValSer柳
權(quán)利要求
1.一種新型的G蛋白偶聯(lián)受體細胞水平篩選系統(tǒng)，所述篩選系統(tǒng)由HEK293細胞或CHO細胞構(gòu)建，含有來自以下序列中不同組間基因序列構(gòu)建的2種融合表達載體第1組(1)DnaE基因的C端與報告基因的C端的拼接序列DnaE-C-Report-C，(2)DnaE基因的N端與報告基因的N端的拼接序列Report-N-DnaE-N；第2組①GPCR基因，②β-arrestin基因；其中，所述報告基因為用于檢測的有活性的酶基因或可發(fā)光的蛋白基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于所述篩選系統(tǒng)由如下方法 構(gòu)建得到(1) 將DnaE基因的C端與報告基因的C端拼接，所得拼接序列 DnaE-C-Report-C與GPCR基因或卩-arrestin基因融合表達，獲得 融合表達載體I -1或I -2;(2) 將DnaE基因的N端與報告基因的N端拼接，所得拼接序列 Report-N-DnaE-N與P-arrestin基因或GPCR基因融合表達，獲得 融合表達載體II-1或II-2;(3 )將融合表達載體I -1和II -1 、或融合表達載體I -2和II -2共轉(zhuǎn)染 HEK293細胞或CHO細胞，得到所述篩選系統(tǒng)。
3. —種構(gòu)建如權(quán)利要求1所述篩選系統(tǒng)的方法，其特征在于，所述方法 如下(1)將DnaE基因的C端與報告基因的C端拼接，所得拼接序列 DnaE-C-Report-C與GPCR基因或卩-arrestin基因融合表達，獲得融合表達載體I -1或I -2; (2)將DnaE基因的N端與報告基因的N端拼接，所得拼接序列Report-N-DnaE-N與|3-arrestin基因或GPCR基因融合表達，獲得融合表達載體II-1或II-2; (3 )將融合表達載體I -1和II -1 、或融合表達載體I -2和II -2共轉(zhuǎn)染HEK293細胞或CHO細胞，得到所述篩選系統(tǒng)。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )構(gòu)建含有GPCR基因的質(zhì)粒i : pCMV-flag-GPCRgene;將DnaE 基因的C端DnaE-C與報告基因的C端Report-C拼接，在 DnaE-C與Report-C之間加入CFNGT 5個氨基酸序列，在DnaE-C 的N端連接一個氨基S吏序列為GGGGSG的GC linker,得到 DnaE-C-Report-C，將DnaE-C-Report-C插入到質(zhì)粒i中，獲得融 合表達載體I : pCMV-flag畫GPCRgene-DnaE國C畫Report-C;(2) 構(gòu)建含有卩-arrestin基因的質(zhì)粒ii: pCDNA-卩-arrestin gene;將 DnaE基因的N端DnaE-N與報告基因的N端Report-N拼接， 在DnaE-N與之間加入GS兩個氨基酸序列，在Report-N的N端 連接一個氨基S臾序列為GGGGSG的GC linker,得到Report-N-DnaE-N, 將Report-N-DnaE-N插入到質(zhì)粒ii中，獲得融合表達載 體II: pCDNA隱卩-arrestin gene-Report-N-DnaE-N;(3) 將融合表達載體I和融合表達載體II共轉(zhuǎn)染HEK293細胞或 CHO細胞，獲得所述篩選系統(tǒng)。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)構(gòu)建含有GPCR基因的質(zhì)粒i : pCMV-flag-GPCRgene;將DnaE基因的N端DnaE-N與報告基因的N端Report-N拼接，在 DnaE-N與之間加入GS兩個氨基l拼列，在Report-N的N端連 接一個氨基酸序列為GGGGSG的GC linker,得到Report-N-DnaE-N，將Report-N-DnaE-N插入到質(zhì)粒i中，獲得融合表達載 體I : pCMV-flag-GPCR gene-Report漏N-DnaE-N;(2) 構(gòu)建含有p-arrestin基因的質(zhì)粒ii: pCDNA-p-arrestin gene;將 DnaE基因的C端DnaE-C與報告基因的C端Report-C拼接， 在DnaE-C與Report-C之間加入CFNGT 5個氨基酸序列，在 DnaE-C的N端連接一個氨基S吏序列為GGGGSG的GC linker, 得到DnaE-C-Report-C,將DnaE-C-Report-C插入到質(zhì)粒ii中， 獲得融合表達載體II: pCDNA-(3-arrestin gene-DnaE-C-Report-C;(3) 將融合表達載體I和融合表達載體II共轉(zhuǎn)染HEK293細胞或 CHO細胞，獲得所述篩選系統(tǒng)。
6. 如權(quán)利要求3 5之一所述的方法，其特征在于所述報告基因為下列之 一①綠色熒光蛋白基因、②紅色熒光蛋白基因、③Renilla熒光素酶 基因、④Firefly熒光素酶基因、⑤石咸性磷酸酶基因、 Bete-內(nèi)酰胺酶 基因、⑦LacZ基因。
7. 如權(quán)利要求3 5之一所述的方法，其特征在于所述DnaE基因來自藍球 藻Anacystis nidulans R2 PCC7942或點訝犬念斗朱藻Nostoc punctiforme PCC73102。
8. 如權(quán)利要求3 5之一所述的方法，(3-arrestin基因為(3-arrestin-l或 (3-arrestin-2。
9. 如權(quán)利要求1所述的篩選系統(tǒng)在篩選GPCR或GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動劑或拮抗劑中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1所述的篩選系統(tǒng)在^企測GPCR配體與GPCR結(jié)合活性中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)細胞水平篩選系統(tǒng)及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。所述篩選系統(tǒng)由HEK293細胞或CHO細胞構(gòu)建，含有來自以下序列中不同組間基因序列構(gòu)建的2種融合表達載體第1組(1)DnaE基因的C端與報告基因的C端的拼接序列DnaE-C-Report-C，(2)DnaE基因的N端與報告基因的N端的拼接序列Report-N-DnaE-N；第2組①GPCR基因，②β-arrestin基因。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在應(yīng)用本發(fā)明篩選系統(tǒng)進行G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)細胞水平篩選，靈敏度高、特異性強，操作簡單、快速，檢測范圍廣，對任何靶細胞型中任何GPCR或GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激動劑、拮抗劑都可以篩選。
文檔編號C12Q1/02GK101333555SQ20071016461
公開日2008年12月31日 申請日期2007年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日
發(fā)明者周耐明 申請人:浙江大學(xué)