專利名稱：腎細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于篩選、診斷和預(yù)測(cè)腎細(xì)胞癌(RCC)以及用于鑒定RCC亞類的腫瘤標(biāo)記。本發(fā)明還涉及腫瘤標(biāo)記作為免疫原激發(fā)免疫反應(yīng)的用途和在制備針對(duì)腫瘤標(biāo)記的抗體和抗體融合蛋白中的用途。
背景技術(shù)：
與MHC I類相關(guān)的肽主要源于胞質(zhì)蛋白的蛋白水解降解。在初始遍在蛋白化之后，這些蛋白由大的多催化蛋白酶復(fù)合體切割。不但有干擾素(IFN)-y-誘導(dǎo)亞基、低分子量蛋白(LMP)亞基LMP2，MECL1(LMP10)和LMP7，還有一些組成β-亞基，即Y、Z和X，也可以分別地形成蛋白酶復(fù)合體的蛋白水解活性位點(diǎn)。產(chǎn)生的肽被與抗原加工相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)(由TAP1和TAP2亞基組成的異二聚體膜蛋白)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。然后，在ER內(nèi)肽加載到MHC I類分子上，這包含多步裝配加工過程。新合成的MHC I類的重鏈(HCs)與ER定位的伴侶蛋白鈣聯(lián)接蛋白相連，然后結(jié)合β2-微球蛋白(β2-m)，隨后整入由伴侶蛋白鈣聯(lián)接蛋白、巰基氧化還原酶ERp57、TAP異二聚體和跨膜蛋白tapasin組成的大的MHC I類肽加載復(fù)合體中。另外，不但ER內(nèi)而且胞質(zhì)內(nèi)的熱休克蛋白也與肽結(jié)合并在其穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中扮演重要角色。然后穩(wěn)定相連的MHC I類/肽復(fù)合體通過高爾基體外側(cè)apparatus運(yùn)輸至細(xì)胞表面以呈遞給CD8+T細(xì)胞。
在一些疾病例如，癌癥、自身免疫疾病或者心血管失調(diào)中，正?；虿徽５募?xì)胞蛋白的肽存在于細(xì)胞表面，這在健康個(gè)體的細(xì)胞表面沒有發(fā)現(xiàn)。因此，這些肽或蛋白可以用作鑒別這些異常細(xì)胞的標(biāo)記。而且，針對(duì)這些血清或其他體液內(nèi)的肽或蛋白的抗體檢測(cè)也可以用作危險(xiǎn)指標(biāo)或預(yù)測(cè)指標(biāo)。
腎細(xì)胞癌(RCC)導(dǎo)致的死亡占所有癌癥死亡的約5％。在出現(xiàn)時(shí)，超過50％的患者已經(jīng)發(fā)展為局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病，并且具有5年存活期的則小于20％。盡管RCC對(duì)傳統(tǒng)的治療方案有相對(duì)的抵抗性，但是對(duì)基于T細(xì)胞的免疫療法對(duì)部分起作用。
在分化階段或生理/病理生理過程中，蛋白質(zhì)組可以用作研究在給定的條件培養(yǎng)的細(xì)胞中蛋白表達(dá)以及修飾模式的改變的重要工具(Pandey等，Nature 2000，405，837；Appella等，Exs.2000，88，1；Gevaert等.Electrophoresis 2000，21，1145)。
近來，蛋白質(zhì)組學(xué)已用于搜尋不同來源腫瘤中診斷、預(yù)測(cè)和前兆參數(shù)(Alaiya等，Electrophoresis 2000，第21卷，第1210頁；Unwin等，Electrophoresis 1999，第20卷，第3629頁；Jungblut等，Electrophoresis 1999，第20卷，第2100頁)。這些腫瘤標(biāo)記(即與腫瘤相關(guān)的分子)可慣例地用于監(jiān)測(cè)患者的疾病并可能在選擇腫瘤患者對(duì)其使用特殊設(shè)計(jì)的免疫治療策略時(shí)有進(jìn)一步的幫助。
幾個(gè)策略用于闡明這個(gè)治療模式的潛在目標(biāo)結(jié)構(gòu)，包括2D-PAGE分離(Sarto等，Electrophoresis 1997，第18卷，第599頁；Sarto等，Electrophoresis 1999，第20卷，第3458頁)、SEREX分析(Scanlan等，Int.J.Cancer 1999，第83卷，第456頁)、cDNA克隆表達(dá)(Boon等.Immunol.Today1997，第18卷，第267頁)和扣除雜交步驟(Pitzer等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.1999，第125卷，第487頁)。
在WO99/00671中，對(duì)來自患者的血清進(jìn)行雙向凝膠電泳之后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，鑒定出幾個(gè)特異的β-微管蛋白同種型用作成神經(jīng)細(xì)胞瘤的腫瘤標(biāo)記。
在WO00/20586中，通過用來自癌癥患者的抗血清對(duì)腎癌細(xì)胞中表達(dá)的核酸文庫進(jìn)行自身抗體篩選，鑒定出與腎癌相關(guān)的新抗原，可用作腫瘤標(biāo)記。
可是，還需要另外的腫瘤標(biāo)記用于開發(fā)適合于RCC癌癥患者或其他癌癥患者的療法和診斷，以及用于鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新腫瘤標(biāo)記。
更具體地，本發(fā)明涉及至少一個(gè)選自下列的蛋白作為腫瘤標(biāo)記的用途β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白、α-微管蛋白、細(xì)胞角蛋白、細(xì)胞角蛋白8(CK8)、細(xì)胞骨架原肌球蛋白、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白、hsp27、hsp60、hsp70、hsp90、grp78(BIP)、gp96、谷光甘肽(gluthathione)-S-轉(zhuǎn)移酶、谷光甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巰基酯酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、醛糖還原酶、烯酰-CoA水合酶、α-烯醇化酶、膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、B23/核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)和波形蛋白。
特別地，本發(fā)明涉及至少一個(gè)選自下列的蛋白作為腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)記的用途β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白、α-微管蛋白、細(xì)胞角蛋白、細(xì)胞角蛋白8(CK8)、細(xì)胞骨架原肌球蛋白、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白、hsp27、hsp60、hsp70、hsp90、grp78(BIP)、gp96、谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷光甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巰基酯酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、醛糖還原酶、烯酰-CoA水合酶、α-烯醇化酶、膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、B23/核仁磷酸蛋白和波形蛋白。
另一個(gè)目的是提供在免疫測(cè)定中這些腫瘤標(biāo)記的使用，免疫測(cè)定用于檢測(cè)與個(gè)體血清中鑒定出的腫瘤標(biāo)記特異結(jié)合的抗體的存在。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供免疫測(cè)定方法，該方法用于檢測(cè)針對(duì)個(gè)體血清中腫瘤標(biāo)記特異的抗體的存在。這些免疫測(cè)定可用于篩選、診斷、預(yù)測(cè)疾病。依照本發(fā)明，對(duì)個(gè)體樣品中抗體水平的測(cè)定可用作RCC或其他腫瘤的早期診斷。而且，血清抗體水平的監(jiān)測(cè)可用于預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是腫瘤標(biāo)記作為免疫原的用途，用來刺激個(gè)體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或殺傷腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有這些腫瘤標(biāo)記的藥物，用來刺激對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺傷腫瘤細(xì)胞。
此外，本發(fā)明的另一方面是腫瘤標(biāo)記在制備抗體或抗體融合蛋白中的用途。這些抗體或抗體融合蛋白可用作殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤生長(zhǎng)的藥物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用免疫組織化學(xué)方法鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類的方法和試劑盒。
基于以下的詳述，對(duì)技術(shù)人員來說本發(fā)明的其他目的是顯而易見的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1在高分子量篩選窗口檢測(cè)到的目標(biāo)(7％T/2.5％C凝膠)圖中所示是膠態(tài)考馬斯染色2D凝膠(7％T/2.5％C)的一部分，代表來自約5×106未處理MZ1257RC細(xì)胞的全部裂解物的斑點(diǎn)模式。在第一維電泳中，蛋白聚集在非線性Immobiline DryStrip上(pH 3-10，NL；Amersham Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。對(duì)患者血清中用陽性免疫染色印跡所檢測(cè)到的相關(guān)目標(biāo)斑點(diǎn)用箭頭示出。在相應(yīng)的凝膠上通過肽質(zhì)量指紋和/或部分測(cè)序分析鑒定這些目標(biāo)斑點(diǎn)。
圖2在低分子量篩選窗口檢測(cè)到的目標(biāo)(16％T/2.5％C凝膠)圖中所示是膠態(tài)考馬斯染色2D凝膠(16％T/2.5％C)，代表來自約2.5×106未處理MZ1257RC細(xì)胞的全部裂解物的斑點(diǎn)模式。在第一維電泳中，蛋白聚集在非線性Immobiline DryStrip上(pH 3-10，NL；AmershamPharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。對(duì)患者血清中用陽性免疫染色印跡所檢測(cè)到的相關(guān)目標(biāo)斑點(diǎn)用箭頭示出。在相應(yīng)的凝膠上通過肽質(zhì)量指紋和/或部分測(cè)序分析鑒定這些目標(biāo)斑點(diǎn)。
圖3IFN-γ刺激細(xì)胞系MZ1257RC后，在低分子量篩選窗口檢測(cè)到的目標(biāo)(16％T/2.5％C凝膠)圖中所示是膠態(tài)考馬斯染色2D凝膠(7％T/2.5％C)，代表來自約2.5×106IFN-γ刺激(48小時(shí))MZ1257RC細(xì)胞的全部裂解物的斑點(diǎn)模式。在第一維電泳中，蛋白聚集在非線性Immobiline DryStrip上(pH 3-10，NL；Amersham Pharmacia Biotech，F(xiàn)reiburg，德國(guó))。對(duì)患者血清用陽性免疫染色印跡所檢測(cè)到的相關(guān)目標(biāo)斑點(diǎn)用箭頭示出。在相應(yīng)的凝膠上通過肽質(zhì)量指紋和/或部分測(cè)序分析鑒定這些目標(biāo)斑點(diǎn)。
圖4對(duì)CK8、stathmin和波形蛋白的正常腎組織和RCC免疫組織化學(xué)分析用如實(shí)施例5所述的抗-CK8、抗-stathmin和抗-波形蛋白特異抗體進(jìn)行正常腎組織、RCC透明細(xì)胞亞類(G2)和RCC嫌色亞類(G2)的免疫組織化學(xué)染色(400x，自左到右)。圖中顯示不但在RCC細(xì)胞透明亞類和嫌色亞類中而且在遠(yuǎn)端小管和集合管系統(tǒng)的上皮細(xì)胞中均存在CK8強(qiáng)陽性染色。圖中顯示遠(yuǎn)端小管系統(tǒng)中上皮細(xì)胞的stathmin中等到強(qiáng)烈陽性胞質(zhì)染色；分散浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞和RCC細(xì)胞透明細(xì)胞亞類的陽性胞質(zhì)染色；以及RCC細(xì)胞嫌色亞類的陰性反應(yīng)。正常腎組織和RCC細(xì)胞透明細(xì)胞亞類的間質(zhì)細(xì)胞對(duì)抗-波形蛋白染色是強(qiáng)烈的陽性胞質(zhì)染色，而正常小管上皮細(xì)胞對(duì)其為陰性。發(fā)現(xiàn)了RCC細(xì)胞嫌色亞類中的波形蛋白弱表達(dá)。
發(fā)明詳述本發(fā)明目的的取得是基于以下意外發(fā)現(xiàn)β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白、細(xì)胞角蛋白、CK8、細(xì)胞骨架原肌球蛋白、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白、hsp27、hsp60、hsp70、hsp90、grp78(BIP)、gp96、谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷光甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巰基酯酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、醛糖還原酶、烯酰-CoA水合酶、α-烯醇化酶、膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、B23/核仁磷酸蛋白和波形蛋白，優(yōu)選膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、波形蛋白和B23/核仁磷酸蛋白在RCC患者體內(nèi)是大多催化蛋白酶復(fù)合體蛋白水解降解的底物，因此，這些蛋白的肽是這些個(gè)體內(nèi)與腎癌相關(guān)的抗原。因此，這些蛋白或其片段可用作腫瘤標(biāo)記。
已經(jīng)通過雙向凝膠電泳(見圖1到3)鑒定出本發(fā)明的蛋白，并隨后通過患者血清免疫印跡檢測(cè)到。從復(fù)制膠上切下免疫染色的蛋白斑點(diǎn)，進(jìn)行凝膠消化，并用質(zhì)譜分析。通過對(duì)來自患者的血清與對(duì)健康志愿者的血清的示差分析，以上提到的蛋白鑒定為RCC患者的腫瘤標(biāo)記。
如本文所用，術(shù)語“腫瘤標(biāo)記”根據(jù)本發(fā)明指蛋白β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白、細(xì)胞角蛋白、CK8、細(xì)胞骨架原肌球蛋白、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白、hsp27、hsp60、hsp70、hsp90、grp78(BIP)、gp96、谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷光甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巰基酯酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、醛糖還原酶、烯酰-CoA水合酶、α-烯醇化酶、膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、B23/核仁磷酸蛋白和波形蛋白，及它們的免疫原片段。
這些蛋白在RCC患者體內(nèi)是免疫原性的發(fā)現(xiàn)，不但是研發(fā)監(jiān)測(cè)此疾病不同藥物治療預(yù)測(cè)的方法的基礎(chǔ)，還是研發(fā)RCC和其他癌癥的診斷方法的基礎(chǔ)。另外，這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了使用這些蛋白作為免疫原的方法，以刺激對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
因此，本發(fā)明提供β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白、α-微管蛋白、細(xì)胞角蛋白、細(xì)胞角蛋白8、細(xì)胞骨架原肌球蛋白、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白、hsp27、hsp60、hsp70、hsp90、grp78(BIP)、gp96、谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷光甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巰基酯酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、醛糖還原酶、烯酰-CoA水合酶、α-烯醇化酶、膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、B23/核仁磷酸蛋白和波形蛋白作為腫瘤標(biāo)記的用途。
特別地，本發(fā)明提供β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白、α-微管蛋白、β-微管蛋白、細(xì)胞角蛋白、CK8、細(xì)胞骨架原肌球蛋白、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白、hsp27、hsp60、hsp70、hsp90、grp78(BIP)、gp96、谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷光甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巰基酯酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、醛糖還原酶、烯酰-CoA水合酶、α-烯醇化酶、膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、B23/核仁磷酸蛋白和波形蛋白作為腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)記的用途。
可以用標(biāo)準(zhǔn)方法，包括層析(例如，離子交換、親合和分子排阻柱層析)、離心、不同溶解度、電泳，或者用蛋白純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來分離和純化這些蛋白。純化的蛋白可用在設(shè)計(jì)用于檢測(cè)個(gè)體樣品中抗體存在的免疫測(cè)定中，或者可選擇地，這些蛋白制劑可以用于如本文所述的免疫測(cè)定中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供對(duì)于本發(fā)明腫瘤標(biāo)記的抗體檢測(cè)和/或定量測(cè)量的方法，此抗體在生物樣品中，象在患有RCC或其他疾病患者的血清或其他體液中；患者所患疾病是通過以細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)記片段的特異呈遞為特征的。這些方法可以由許多方法中的任一個(gè)完成。這些方法包括免疫測(cè)定，它包括但不限于競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定系統(tǒng)，使用的技術(shù)例如蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測(cè)定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、“夾心”免疫測(cè)定、免疫沉淀測(cè)定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、凝集測(cè)定、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、免疫放射分析、熒光免疫測(cè)定、蛋白質(zhì)A免疫測(cè)定，僅依此為例。
為了進(jìn)行測(cè)定，將腫瘤標(biāo)記固定在膜或底物上，或者用在液相中。合適的膜或底物例如能結(jié)合蛋白的表面例如聚苯乙烯微量滴定板的小孔或硝化纖維素膜。其他合適的體外測(cè)定對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
例如，診斷和預(yù)測(cè)個(gè)體癌癥的體外方法，包括通過免疫測(cè)定檢測(cè)來自所述個(gè)體血清樣品并且針對(duì)腫瘤標(biāo)記蛋白的抗體的存在，可以用包括以下步驟的方法來實(shí)施(a)在膜或底物上固定至少一個(gè)腫瘤標(biāo)記；(b)使膜或底物與個(gè)體血清接觸，和；(c)檢測(cè)個(gè)體血清樣品中腫瘤標(biāo)記特異抗體的存在。
為了檢測(cè)血清樣品中腫瘤標(biāo)記的特異抗體，通常使用標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗體?？蓹z測(cè)的標(biāo)記可以是通過放射自顯影檢測(cè)的放射性同位素。就本發(fā)明目的而言，特別有用的同位素是3H、125I、131I、35S和14C。
第二抗體可以用熒光化合物標(biāo)記。通過把免疫綴合物暴露于適當(dāng)波長(zhǎng)的光下，并檢測(cè)因此產(chǎn)生的熒光來測(cè)定熒光標(biāo)記抗體的存在。熒光標(biāo)記化合物包括熒光素、異硫氰酸、羅丹明、藻紅素、藻籃素、別藻籃素、鄰苯二醛和熒光胺。
可選擇地，用第二抗體與化學(xué)發(fā)光化合物偶聯(lián)來對(duì)其進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。通過檢測(cè)在化學(xué)反應(yīng)過程中出現(xiàn)的光的來檢測(cè)帶有化學(xué)熒光標(biāo)記的免疫綴合物的存在?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子包括魯米諾、異魯米諾、芳族吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓、草酸酯。
相似地，生物發(fā)光化合物可用于標(biāo)記第二抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光的一種，其中有催化活性的蛋白增加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過檢測(cè)發(fā)光的存在測(cè)定生物發(fā)光蛋白的存在。用于標(biāo)記的生物發(fā)光化合物包括熒光素、熒光素酶和acquorin。
可選擇地，用第二抗體與酶相連來對(duì)第二抗體進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。在合適底物存在下，抗體-酶綴合物溫育時(shí)，酶部分與底物反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的化學(xué)部分，例如，通過分光光度法、熒光測(cè)定法或目視法。用于可檢測(cè)多特異免疫綴合物的酶的例子包括β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、過氧化物酶和堿性磷酸酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道能用于依據(jù)本發(fā)明的其他合適的標(biāo)記。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以完成標(biāo)記部分與抗體的結(jié)合。
關(guān)于這方面的典型的方法學(xué)在Kennedy等，Clin.Chim.Acta 1976，第70卷，第1頁；Schurs等，Clin.Chim.Acta 1977，第81卷，第1頁；Shih等，Intl.J.Cancer 1990，第46卷，第1101頁；Stein等，Cancer Res.1990，第50卷，第1330頁中描述。
針對(duì)在血清或其他體液中本發(fā)明的腫瘤標(biāo)記的抗體的檢測(cè)和/或定量測(cè)量，可用在篩選RCC或其他疾病患病危險(xiǎn)的個(gè)體中，患病危險(xiǎn)個(gè)體是通過本發(fā)明腫瘤標(biāo)記的免疫原性特性鑒定的。另外，抗體的測(cè)量可用于預(yù)測(cè)疾病的進(jìn)展。
本發(fā)明也提供用于實(shí)施這些檢測(cè)方法的試劑盒。這樣的試劑盒可以包括用于實(shí)施上述診斷測(cè)定的所有必須成分。試劑盒將含有至少一個(gè)包括腫瘤標(biāo)記的容器。試劑盒也含有包括抗體或其片段的第二容器，此抗體或其片段有對(duì)患者血清抗體的合適識(shí)別位點(diǎn)(例如抗人IgG抗體)和可檢測(cè)標(biāo)記，如上所述。
與RCC相關(guān)的腫瘤標(biāo)記的鑒定為疾病的免疫治療提供了基礎(chǔ)?？梢詫?duì)患者免疫接種腫瘤標(biāo)記以誘發(fā)能有利于殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的免疫反應(yīng)?？梢杂蒙鲜鲇脕砑兓鞍椎姆椒▉碇苽淠[瘤標(biāo)記。
可選擇地，可以對(duì)患者使用腫瘤標(biāo)記的抗體，優(yōu)選人源化抗體或抗體片段，以誘發(fā)有利于殺死腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
術(shù)語“抗體片段”在本發(fā)明中的意思是指抗體的一部分例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等。不管結(jié)構(gòu)如何，抗體片段結(jié)合被完整抗體識(shí)別的相同抗原。該術(shù)語也包括結(jié)合特異抗原的合成的或基因工程多肽，例如由輕鏈可變區(qū)組成的多肽、由重鏈和輕鏈的可變區(qū)組成的“Fv”片段、重組單鏈多肽分子其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽接頭連接(“scFv蛋白”)、以及由模擬超變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小識(shí)別單位。
術(shù)語“人源化抗體”指含有位于輕鏈和重鏈氨基酸可變區(qū)和恒定區(qū)的FR的抗體，可變區(qū)和恒定區(qū)來自人源，而超變區(qū)來自非人源?！癋R”指抗體的框架區(qū)，并在可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)。在這些區(qū)發(fā)生氨基酸的某些變更。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以制備本發(fā)明腫瘤標(biāo)記的多克隆抗體(Green等，″Production of Polyclonal Antisera″ImmunochemicalProtocols(Manson，ed.)，pages 1-5(Humana Press 1992)；Williams等，″Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors andpurification of specific polyclonal antibodies″DNA Cloning 2ExpressionSystems，第二版，Glover等(eds.)，第15頁(Oxford University Press1995))。
通過使用佐劑，例如明礬(氫氧化鋁)或弗氏完全或不完全佐劑，可以增強(qiáng)腫瘤標(biāo)記的免疫原性。用于免疫接種的多肽也包括融合多肽，例如腫瘤標(biāo)記或其部分與免疫球蛋白多肽或者與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合多肽。多肽免疫原可以是全長(zhǎng)分子或其一部分。如果多肽部分是“類半抗原”，那么這部分可以有益地與大分子載體(例如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)或破傷風(fēng)類毒素)連接用來免疫接種。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以得到腫瘤標(biāo)記的單克隆抗體(參看，例如，Kohler等，Nature 1975，第256卷第495頁；Coligan等.(eds.)，CurrentProtocols in Immunology，第1卷，第2.5.1-2.6.7頁(John Wiley & Sons1991)；Picksley等，″Production of monoclonal antibodies against proteinsexpressed in E coli″in DNA Cloning 2Expression Systems，第二版，Glover等.(eds.)，第93頁(Oxford University Press 1995))。
簡(jiǎn)要地，單克隆抗體可以通過以下步驟獲得對(duì)小鼠注射含有一個(gè)或多個(gè)腫瘤標(biāo)記的組合物，移取血清樣品以證實(shí)抗體產(chǎn)物的存在，摘除脾臟以獲得B-淋巴細(xì)胞，B-淋巴細(xì)胞與骨髓瘤融合產(chǎn)生雜交瘤，克隆雜交瘤，篩選產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體的陽性克隆，培養(yǎng)產(chǎn)生針對(duì)抗原的抗體的克隆，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體。
另外，本發(fā)明的抗-腫瘤標(biāo)記的抗體可以來自人單克隆抗體。從已構(gòu)建用以產(chǎn)生應(yīng)答抗原挑戰(zhàn)的特異人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠可以獲得人單克隆抗體。在這個(gè)技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件引如入小鼠品系，此小鼠品系來自含有定向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座的胚胎干細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成對(duì)人體原特異的人抗體，并且此小鼠可用以產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。
從轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得人抗體的方法由，例如，Green等，Nature Genet.1994 7，13；Lonberg等，Nature 1994，368，856；和Taylor等，Int.Immun.1994，6，579，描述。
通過各種已經(jīng)建立好的技術(shù)可以從雜交瘤培養(yǎng)物中分離并純化出單克隆抗體。這些分離技術(shù)包括用蛋白質(zhì)-A Sepharose的親合層析、分子排阻層析和離子交換層析(參見，例如Coligan 2.7.1-2.7.12頁和2.9.1-2.9.3頁；Baines等，″Purification of Immunoglobulin G(IgG)″in Methods inMolecular Biology，第10卷，第79-104頁(The Humana Press，Inc.1992)。
為了特殊用途，可能需要制備抗-腫瘤標(biāo)記抗體的片段。可以通過，例如，抗體的蛋白質(zhì)水解來獲得這些抗體片段。用傳統(tǒng)方法對(duì)整個(gè)抗體用胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化可以獲得抗體片段。作為說明，抗體的胃蛋白酶酶切可以產(chǎn)生抗體片段從而提供5S片段，F(xiàn)(ab′)2?？梢杂脦€基還原劑進(jìn)一步切割這個(gè)片段以產(chǎn)生3.5S Fab′單價(jià)片段?？蛇x擇地，使用巰基基團(tuán)的封閉基團(tuán)完成切割反應(yīng)，所述巰基基團(tuán)由二硫鍵切割產(chǎn)生。作為選擇，用胃蛋白酶酶切直接產(chǎn)生兩個(gè)單價(jià)Fab片段和一個(gè)Fc片段。這些方法由，例如，Goldenberg，美國(guó)專利號(hào)4,331,647，Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.1960，89，230；Porter，Biochem.J.1959，73，119；Edelman等，inMethods in Enzymology第1卷，422頁(Academic Press 1967)，和Coligan2.8.1-2.8.10頁和2.10.-2.10.4頁，描述。
只要所得片段可以結(jié)合被完整抗體識(shí)別的抗原，那么則可以用切割抗體的其他方法，例如重鏈分離以形成單價(jià)輕-重鏈片段，片段的進(jìn)一步切割或其他酶學(xué)、化學(xué)或基因技術(shù)。例如，F(xiàn)v片段含有VH和VL鏈的結(jié)合。這個(gè)結(jié)合可以是非共價(jià)的，如Inbar等.Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)1972，69，2659所述。可選擇地，可變鏈可以通過分子間二硫鍵連接或者用化學(xué)試劑例如戊二醛交聯(lián)(參見，例如Sandhu，Crit.Rev.Biotech.1992，12，437)。
Fv片段可以含有由肽接頭連接起來的VH和VL鏈。通過構(gòu)建含有編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列(由寡核苷酸連接)的結(jié)構(gòu)基因來制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(scFv)。結(jié)構(gòu)基因插入到隨后轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞(例如大腸桿菌)的表達(dá)載體中。重組宿主細(xì)胞合成有接頭肽連接兩個(gè)V結(jié)構(gòu)域的單多肽鏈。生產(chǎn)scFv的方法由，例如，Whitlow等.MethodsA Companionto Methods in Enzymology 1991 2，97(也參見，Bird等，Science1988，242，423，Ladner等，美國(guó)專利號(hào)4,946,778)，描述。
作為示例，通過將淋巴細(xì)胞體外暴露于腫瘤標(biāo)記，并篩選噬菌體或相似載體內(nèi)的抗體展示文庫(例如，通過使用固定化的或標(biāo)記的腫瘤標(biāo)記)。抗體片段的另一個(gè)形式是編碼單個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的多肽。通過構(gòu)建編碼目的抗體CDR的基因可以獲得CDR多肽(“最小識(shí)別單位”)。這些基因可以制備，例如，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA來合成可變區(qū)(參見，例如Larrick等，MethodsA Companion to Methodsin Enzymology 1991，2，106；Courtenay-Luck，″Genetic Manipulation ofMonoclonal Antibodies″in Monoclonal AntibodiesProduction，Engineering and Clinical Application，Ritter等(eds.)，166頁(CambridgeUniversity Press 1995)，and Ward等，″Genetic Manipulation andExpression of Antibodies″in Monoclonal AntibodiesPrinciples andApplications，Birch等，(eds.)，137頁(Wiley-Liss，Inc.1995))。
可選擇地，抗腫瘤標(biāo)記的抗體可以來自“人源化”單克隆抗體。通過把來自鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的鼠互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)入人可變區(qū)，可以生產(chǎn)人源化單克隆抗體。然后，人抗體的典型殘基在鼠相應(yīng)部位的框架區(qū)內(nèi)被替換。來自人源化單克隆抗體的抗體組分的使用排除了與鼠恒定區(qū)免疫原性有關(guān)的潛在問題。克隆鼠免疫球蛋白可變區(qū)的通用技術(shù)由，例如，Orlandi等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 1989，86，3833描述。生產(chǎn)人源化單克隆抗體的技術(shù)由，例如，Jones等，Nature 1986，321，522；Carter等；Proc.Natl.Acad.Sci.美國(guó)1992，89，4285；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.1992，12，437；Singer等，J.Immun.1993，150，2844；Sudhir(ed.)，AntibodyEngineering Protocols(Humana Press，Inc.1995)；Kelley，″EngineeringTherapeutic Antibodies″in Protein EngineeringPrinciples and Practice，Cleland等(eds.)，399-434頁(John Wiley & Sons，Inc.1996)；和Queen等，美國(guó)專利號(hào)5,693,762(1997)，描述。
可選擇地，可以對(duì)患者使用針對(duì)腫瘤標(biāo)記蛋白的抗體融合蛋白進(jìn)行治療以誘發(fā)有助于殺傷腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的反應(yīng)。
如本文所用，術(shù)語“抗體融合蛋白”指基本上由本發(fā)明腫瘤標(biāo)記的抗體或其片段和與免疫球蛋白或其片段直接或者通過接頭或間隔物融合的治療劑組成的融合分子。適合于這些融合蛋白的治療劑的例子包括免疫調(diào)制劑和毒素，例如(但不限于)細(xì)胞因子例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-13、IFNs、IFNα或CSFs。
通過制備融合蛋白的每個(gè)組分并把它們化學(xué)綴合，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以制備融合蛋白?？蛇x擇地，用已知的技術(shù)可以產(chǎn)生在適當(dāng)讀框內(nèi)編碼融合蛋白的兩個(gè)組分的多核苷酸，并用如在EP 0659439中描述的方法表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用含有純化的腫瘤標(biāo)記(癌癥患者對(duì)該標(biāo)記已出現(xiàn)了抗體)的一個(gè)或混合物的免疫原來誘發(fā)免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以采用針對(duì)本發(fā)明腫瘤標(biāo)記的抗體或抗體片段，以誘發(fā)有利于殺傷腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的反應(yīng)。
本發(fā)明的腫瘤標(biāo)記、其混合物或者抗體、抗體片段或抗體融合蛋白可以對(duì)患有RCC或其他疾病的患者直接使用或者用在含有所述化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥物組合中，這些患者的特征在于腫瘤標(biāo)記片段在細(xì)胞表面上的特異呈遞。
如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指惰性、無毒的固體或液體填充劑、稀釋劑或包裹材料，它們沒有對(duì)活性化合物或患者產(chǎn)生不利反應(yīng)。合適的、優(yōu)選的液體載體是本領(lǐng)域已知的，例如無菌水、鹽水、葡萄糖溶液、糖溶液、乙醇、二元醇和油，該油包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油和礦物油。
根據(jù)本發(fā)明的制劑可以以單位劑量用藥，所述制劑含有傳統(tǒng)無毒藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、添加劑和介質(zhì)，只要它們是腸胃外用藥慣用的即可。
可以用許多方法使用以上的制劑；包括(但不限于)經(jīng)口、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈和皮下。
術(shù)語“腸胃外”在本文中包括皮下、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和氣管內(nèi)注射及輸注技術(shù)。其他用藥方法例如口服或局部用藥是合適的。腸胃外組合物最優(yōu)選靜脈內(nèi)用藥，可以根據(jù)已知方法大劑量注射或連續(xù)輸注。
當(dāng)將本發(fā)明的化合物配制為片劑、膠囊或粉末形式時(shí)，可以使用通常的載體和賦形劑例如碳酸鎂、碳酸鈣、碳酸氫鈉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉、乳糖、微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉淀粉和無水二氧化硅，潤(rùn)滑劑例如水合蓖麻油、硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、糖、果膠、糊精、西黃蓍膠、低熔點(diǎn)蠟、可可油、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、季銨化合物等，還可以使用粘合劑例如淀粉、葡萄糖、阿拉伯膠和甘露醇。用本領(lǐng)域已知的方法可以對(duì)片劑或膠囊進(jìn)行包衣。
口服液體制劑可以是水或油混懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的形式，也可以制成干燥產(chǎn)物，在使用前用水或其他合適載體復(fù)制。這些液體制劑可含有傳統(tǒng)的添加劑像懸浮劑、乳化劑、非水載體和防腐劑。
局部用藥可以是水或油混懸液、溶液、乳劑、膠凝劑或優(yōu)選乳劑軟膏的形式。
在含有腫瘤標(biāo)記的組合物和組合中，優(yōu)選腫瘤標(biāo)記與合適助劑一起制成的制劑，由此可以增強(qiáng)對(duì)蛋白抗原的免疫反應(yīng)。合適的助劑包括(但不限于)礦物膠，如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳劑，和可能有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和(短棒狀桿菌)。
根據(jù)本發(fā)明的單位劑量可包括每日所需根據(jù)本發(fā)明化合物的量，或其多個(gè)亞劑量以組成所需的劑量。對(duì)于給定患者(哺乳動(dòng)物，包括人)的最佳治療可接受劑量或劑量比取決于技術(shù)人員所知的各種因素，例如所使用的具體活性化合物的活性、年齡、體重、基本健康狀況、性別、飲食、用藥的時(shí)間和途徑、清除率、治療目的，即是用于治療還是用于預(yù)防以及疾病的性質(zhì)。
因此，在被治療患者(體內(nèi))，組合物和組合中的本發(fā)明活性化合物的藥物有效日劑量在約0.01到100mg/kg體重之間，優(yōu)選0.1到10mg/kg體重之間。根據(jù)使用形式，單劑量可含有0.01到10mg活性化合物。
本發(fā)明的腫瘤標(biāo)記、抗體和抗體融合蛋白也可以與其他化學(xué)治療劑結(jié)合一起使用。根據(jù)本發(fā)明，可以用于與本發(fā)明的化合物結(jié)合的化學(xué)治療劑包括有抗瘤作用的試劑，例如，阻止瘤細(xì)胞發(fā)育、成熟或擴(kuò)散，直接作用在腫瘤細(xì)胞上，例如抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，非間接通過例如生物反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制起作用。根據(jù)本發(fā)明的化學(xué)治療試劑優(yōu)選天然或合成的化學(xué)化合物，但不排除生物分子，例如蛋白、抗體、趨化因子、細(xì)胞因子、多肽等。大量在商業(yè)使用、臨床評(píng)估、臨床前研發(fā)中可以得到的化學(xué)治療劑也包括在本發(fā)明中。
化學(xué)治療劑的例子包括烷化劑，例如，氮芥、乙烯亞胺化合物、烷基磺酸酯和其他有烷化作用的化合物例如亞硝基脲、順鉑、達(dá)卡巴嗪；抗代謝物，例如，葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗物；有絲分裂抑制劑，例如，長(zhǎng)春花生物堿和鬼臼毒素的衍生物；有細(xì)胞毒性的抗生素和喜樹堿衍生物。優(yōu)選的化學(xué)治療試劑或化學(xué)療法包括氨磷汀(羥乙基)、順鉑、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、放線菌素D、氮芥(氮芥子氣)、鏈佐星、環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體、吉西他濱(健擇)、道諾霉素、道諾霉素脂質(zhì)體(枸櫞酸道諾霉素脂質(zhì)體)、丙卡巴肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、博來霉素、紫杉醇、多西他賽(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉑、克拉屈濱、喜樹堿、CPT-11、10-羥基-7-乙基喜樹堿(SN38)、達(dá)卡巴嗪、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、伊達(dá)比星、美鈉、α-干擾素、β-干擾素、伊立替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙立德、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、普卡霉素、米托坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、鏈佐星、他莫西芬、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、噻替派、尿嘧啶芥子氣、長(zhǎng)春瑞濱、苯丁酸氮芥及它們的組合。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了基于下述發(fā)現(xiàn)用免疫組織化學(xué)方法鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類的方法和試劑盒。
根據(jù)組織學(xué)特征，RCC分為不同的亞類，最常見的為透明細(xì)胞、嫌色細(xì)胞、嗜色細(xì)胞和癌細(xì)胞亞類。鑒定RCC不同亞類的方法在Thoenes等(Path.Res.Pract.1986，181，125)和Srkel及van der Berg(World J.Urol.1995，13，153)中已描述。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在正常腎和不同RCC亞類中三個(gè)選擇免疫原性蛋白的表達(dá)模式不同。在一系列外科摘除不同亞類RCC病灶和自體正常腎上皮中用免疫組織化學(xué)分析了CK8、stathmin和波形蛋白的表達(dá)模式。如圖4所示，收集管系統(tǒng)的上皮細(xì)胞以及近端和遠(yuǎn)端小管系統(tǒng)上皮細(xì)胞顯示CK8的細(xì)胞膜強(qiáng)烈陽性染色，而所有的正常腎組織上皮細(xì)胞顯示波形蛋白的陰性染色。與之相反，在36％和72％外科摘除病灶中不同RCC亞類分別顯示對(duì)CK8和波形蛋白中等強(qiáng)烈陽性染色(圖4、表1)。
表1在不同RCC亞類中CK8和波形蛋白的表達(dá)
在全部不同RCC亞類的64個(gè)RCC病灶(透明細(xì)胞類51；嫌色13)中，用抗-CK8和抗波形蛋白單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行(根據(jù)Srkel和van der Berg(World J.Urol.1995，13，153)的組織病理學(xué)分類)。結(jié)果由實(shí)施例中打分系統(tǒng)概括(+++＝強(qiáng)烈，++＝中等，+＝弱，-＝非常弱或無陽性染色)在16％和18％的RCC病灶中檢測(cè)到細(xì)胞膜的強(qiáng)烈或中等陽性CK8染色，在45％所分析的腫瘤中顯示CK8的弱表達(dá)(圖4)。在RCC透明和嫌色細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CK8和波形蛋白表達(dá)的不同頻率(表1)。78％和10％RCC透明細(xì)胞分別顯示強(qiáng)烈或中等陽性胞質(zhì)波形蛋白染色。在4％這個(gè)RCC亞類中發(fā)現(xiàn)波形蛋白的弱表達(dá)。與之相反，在31％和15％所分析的病灶中RCC嫌色亞類顯示CK8的強(qiáng)烈或中等陽性染色，而在38％這個(gè)RCC亞類中檢測(cè)到CK8的弱表達(dá)。僅有8％和23％的嫌色RCC分別顯示中等或弱波形蛋白胞質(zhì)染色(圖4；表1)。觀察到的CK8和波形蛋白共表達(dá)好像經(jīng)常發(fā)生在RCC中，尤其是其透明細(xì)胞亞類。因此，兩個(gè)蛋白的組合表達(dá)可用作RCC透明細(xì)胞檢測(cè)的診斷標(biāo)記。
RCC病灶和正常腎組織的染色顯示不同stathmin表達(dá)模式(表2)。雖然抗-stathmin抗體染色少于10％的近端和遠(yuǎn)端小管系統(tǒng)的上皮細(xì)胞，但扁平peritumoral tubules的內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞顯示強(qiáng)烈陽性胞質(zhì)染色。與之相反，RCC透明細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞在10％和33％中分別顯示僅有中等或弱陽性stathmin染色，而57％的這個(gè)RCC亞類完全缺乏stathmin表達(dá)(圖4；表2)。在60％的所分析病灶中RCC嫌色亞類顯示stathmin弱陽性染色，而其余40％是陰性stathmin染色(圖4；表2)。
表2RCC亞類中stathmin表達(dá)
在全部31RCC中，用抗-atathmin單克隆抗體通過免疫組織化學(xué)法分析不同亞類病灶和等級(jí)。根據(jù)實(shí)施例中描述的打分系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。(+++＝強(qiáng)烈，++＝中等，+＝弱，-＝非常弱或無陽性染色)。
這些結(jié)果顯示CK8、波形蛋白和/或stathmin的共表達(dá)可用作RCC亞類的診斷標(biāo)記。
因此本發(fā)明提供用抗-CK 8、抗-波形蛋白和/或抗stathmin抗體對(duì)腎上皮細(xì)胞組織樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色來鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類的方法。
原則上，所述方法包括以下步驟a)把來自懷疑患有RCC個(gè)體的腎上皮組織樣品與選自由CK8、抗-波形蛋白和抗-stathmin(第一抗體)組成的組中的至少一個(gè)抗體在保證所述抗體與組織樣品結(jié)合的情況下溫育；b)將第一抗體與含有如上述第一抗體結(jié)合親合識(shí)別位點(diǎn)和可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗體在保證抗體與第一抗體結(jié)合的情況下接觸；c)檢測(cè)第二抗體與第一抗體的結(jié)合d)將步驟C)檢測(cè)的組織樣品與根據(jù)步驟a)到c)處理的參考樣品對(duì)比，此參考樣品來自患有RCC個(gè)體的透明細(xì)胞、嫌色、嗜色或癌細(xì)胞亞類?？梢允褂脜⒖紭悠返腞CC亞類鑒定由，例如，Thoenes等，(Path.Res.Pract.1986，181，125)和Srkel and van der Berg(World J.Urol.1995，13，153)所述。
本發(fā)明還提供含有免疫組織化學(xué)方法鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類的組分的試劑盒。
這些組分至少是A)抗-CK8、抗-波形蛋白和/或抗-stathmin抗體；B)直接針對(duì)第一抗體的、帶有可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗體。
實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)與IFN-γ處理MZ1257RC和MZ1940RC代表充分定義的、鑒定為腎細(xì)胞癌(RCC)透明細(xì)胞類型的人源細(xì)胞系(Seliger，B.等，Cancer Res.1996，第56卷，第1756-60頁)，而其相應(yīng)的正常腎組織MZ2733RC和MZ2733NN近來建立自有初級(jí)RCC透明細(xì)胞類型的患者。所有的RCC細(xì)胞系維持在添加有10％胎小牛血清、2mM谷氨酰胺和100U/ml青霉素/100μg/ml鏈霉素的DMEM中。
在300U/ml重組IFN-γ(Imukin，Boehringer Ingelheim，Ingelheim，德國(guó))存在下，對(duì)MZ1257RC細(xì)胞用IFN-γ進(jìn)行處理48小時(shí)。
血清樣品所有血清樣品分離自人靜脈血樣品，經(jīng)每個(gè)個(gè)體同意后收集自診斷為腎細(xì)胞癌的患者或來自正常志愿捐獻(xiàn)者。
實(shí)施例2雙向凝膠電泳樣品制備細(xì)胞系擴(kuò)增到每批細(xì)胞數(shù)為5×107到1×108，然后用胰酶消化(trypsination)收獲。細(xì)胞沉淀在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗3～4次，之后貯存在無菌低溫管中，將干燥細(xì)胞沉淀以5×106或1×107細(xì)胞/管的諸份儲(chǔ)存在液氮中待用。在裂解緩沖液(7M尿素、2M硫脲，0.2M丙磺酸二甲基苯甲銨(NDSB)、1％二硫蘇糖醇(DTT)、4％3-[(3-cholamidopropyl)二甲基-ammino]-1-丙-磺酸鹽(CHAPS)、0.5％pharmalytes和微量染料溴酚藍(lán))中重懸細(xì)胞沉淀。裂解物用超聲處理(超聲波浴中3×4分)，然后用在微量離心機(jī)中離心澄清(90分鐘，15℃，13,000rpm)。
蛋白定量根據(jù)Ramagli和Rodriguez描述的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行蛋白定量，該流程允許即使在大量尿素存在下也能使用原始Bradford方法。簡(jiǎn)略地，澄清的裂解物的2.5μl～10μl等分試樣調(diào)整到終體積為10μl，一式兩份，然后每個(gè)樣品與10μl 0.1M HCl混合。隨后每個(gè)樣品中加入80μl ddH2O，樣品再次混合。每個(gè)復(fù)份樣品(100μl)中加入3.5ml 1∶3的稀染料試劑混合液(Bio-Rad蛋白分析染料試劑濃縮液)，用輕輕的渦旋來混合混合物。5分鐘后，用試劑空白(10μl裂解緩沖液，如上述處理)在塑料樣品杯中測(cè)595nm的光吸收作為對(duì)照。
上樣/等電聚焦和帶(strip)平衡用新裂解緩沖液調(diào)整每個(gè)裂解液的終體積為350μl，其中340μl轉(zhuǎn)入IPGphor strip固定器(Amersham Pharmacia Biotech)。ImmobilineDryStrip(pH 3-10，NL，18cm，Amersham Pharmacia Biotech)再水合與樣品上樣是在一個(gè)步驟中進(jìn)行的。把DryStrips加到裂解物90分鐘后，用400μl Immobiline DryStrip覆蓋液體覆蓋吸收樣品的帶。于20℃在IPGphor單元(Amersham Pharmacia Biotech)上進(jìn)行等電聚集，用以下參數(shù)，于0V再水合2小時(shí)，30V 10小時(shí)，500V 1小時(shí)，1000V 1小時(shí)，5000V 1小時(shí)，8000V 4～5小時(shí)，如果目標(biāo)蛋白(低分子量組分)是在16％T/2.5％C SDS-PAGE凝膠(最后一步是8000v4小時(shí))的第二向分離則加至36.000～38.000伏小時(shí)或者如果樣品裂解物在7％T/2.5％CSDS-PAGE凝膠上分離高分子量組分(最后一步是8000V 5小時(shí))則加至44.000～46.000伏小時(shí)。所有步驟按步并在一固定模式下進(jìn)行。聚焦的帶貯存在-80℃或者直接進(jìn)行帶平衡步驟，它的實(shí)施是通過在添加有1.5％DTT的10ml平衡緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.8，6M尿素，30％甘油，2％SDS)中溫育15分鐘，之后在添加有4.8％jodacetamide的10ml平衡緩沖液中溫育15分鐘。
第二向SDS-PAGE用Hoefer ISO-DALT系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行SDS-PAGE分離，并在聚丙烯酰胺/哌嗪二丙烯酰胺(PDA)PAGE凝膠上電泳。凝膠混合物含有375mM Tris//HCl pH8.8，5mMNa2S2O4和4％甘油但不含十二烷基磺酸鈉(SDS)。新平衡好的Immobiline DryStrip轉(zhuǎn)到完全漂洗PAGE凝膠表面。通過把帶包埋在含有微量標(biāo)記染料(7％T/2.5％C凝膠用溴酚藍(lán)，16％T/2.5％C凝膠用溴酚藍(lán)加二甲苯青FF)的1％軟熔化瓊脂糖中使帶固定。在SDS-PAGE電泳緩沖液(2.5mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS)中嚴(yán)格溫度控制(＜20℃)下電泳凝膠直到染料前端到達(dá)凝膠的末端(16％T/2.5％C凝膠是直到二甲苯青FF染料前端跑出凝膠)。在低壓(恒壓50V 1小時(shí))下進(jìn)行從等電聚焦(IEF)帶到凝膠的樣品初始轉(zhuǎn)移，而分離則是在恒定高壓下(100～140V)進(jìn)行。
凝膠染色用膠態(tài)考馬斯藍(lán)對(duì)凝膠染色。所有凝膠在傳統(tǒng)掃描儀(HewlettPackard ScanJet 6100C)上分辨率為600dpi下掃描，并存為TIFF圖片。用作蛋白質(zhì)印跡分析的凝膠或者含有對(duì)其用質(zhì)譜分析的蛋白斑點(diǎn)的凝膠，只用膠態(tài)考馬斯藍(lán)染色溶液(10％硫酸銨、2％磷酸、0.1％考馬斯亮藍(lán)G-250、20％甲醇)染色，因此跳過了初始固定步驟及其后的在H2O(dd)中漂洗使之脫色。
實(shí)施例3免疫印跡為了免疫印跡分析，膠態(tài)考馬斯藍(lán)預(yù)染的2-D PAGE凝膠用ISO-DALT槽印跡系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)印在ImmobilonP膜上，用添加20％甲醇的SDS-PAGE電泳緩沖液作為轉(zhuǎn)移緩沖液，并且每次轉(zhuǎn)移用500伏小時(shí)。隨后印跡膜在封閉溶液(140mM NaCl，10mMTris/HCl pH7.4，0.4％Tween20，5％低脂奶粉和10％馬血清)中溫育1小時(shí)，在Tris緩沖鹽(TBS140mM NaCl、10mM Tris/HCl pH7.4)中漂洗兩次，然后與在抗體溫育緩沖液(TBS，0.1％Tween20，2％低脂奶粉)中1∶20稀釋的對(duì)照或患者血清4℃溫育過夜。然后在TBS、0.4％Tween20中洗膜3次(每次10分鐘)，在室溫下與辣根過氧化物酶(HRP)-綴合第二單克隆抗體溶液(20ml/膜，兔抗人IgG，在抗體溫育緩沖液中以1∶1000稀釋)溫育0.5～1小時(shí)。用TBS、0.4％Tween20洗3次之后，根據(jù)制造商的說明用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Lumi-Light蛋白質(zhì)印跡底物，RocheMolecular Biochemicals，Mannheim)進(jìn)行斑點(diǎn)顯色，并記錄在科學(xué)圖象膠片(Kodak X-Omat Blue XB-1)上。把圖象膠片與相應(yīng)的凝膠印重疊預(yù)形成與點(diǎn)匹配的信號(hào)。
實(shí)施例4質(zhì)譜為了質(zhì)譜分析，從膠態(tài)考馬斯藍(lán)染色的復(fù)份膠上切下免疫染色蛋白斑點(diǎn)。每個(gè)樣品轉(zhuǎn)入無菌微量反應(yīng)管中，30℃在50mM NH4CO3/乙腈(60％/40％)中溫育凝膠切片30分鐘，隨后取出并丟棄產(chǎn)生的上清液。然后凝膠切片真空干燥，在-80℃貯存直至進(jìn)一步使用。為了凝膠消化，每個(gè)樣品在25～40μl含有0.1μg/ml修飾的胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，美國(guó))的50mM NH4HCO3中浸泡1小時(shí)。收集上清，加入25μl新NH4HCO3，然后樣品37℃溫育過夜。通過在抽提緩沖液(H2O/三氟乙酸(TFA)；50％/50％，v/v)中溫育20分鐘兩次，然后在含有乙腈/TFA；50％/50％，v/v的緩沖液中溫育20分鐘兩次，完成肽抽提。濃縮來自每個(gè)樣品的上清至終體積約25～50μl/樣品，然后根據(jù)制造商的操作流程用ZipTips(Millipore)脫鹽。產(chǎn)生的洗脫物1μl等分試樣加在MALDI基質(zhì)上，用Perseptive Biosystems Voyager RP-DE儀器(Perseptive Biosystems，F(xiàn)ramington，MA)直接進(jìn)行肽指紋分析。
實(shí)施例5用作免疫組織化學(xué)的患者和組織樣品為了免疫組織化學(xué)分析，RCC和相應(yīng)正常腎上皮的外科切除組織樣品是隨機(jī)來自經(jīng)歷根部(radical)腎切除的患者的。根據(jù)Thoenes和其同事(Thoenes等，Path.Res.Pract.1986，181，125；Strkel和van der Berg，World J.Urol.1995，13，153)提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行每個(gè)腫瘤的組織病理學(xué)分類。這些數(shù)據(jù)包括性別、疾病的階段、腫瘤入侵和根據(jù)TNM(腫瘤結(jié)轉(zhuǎn)移)系統(tǒng)的淋巴結(jié)介入。總共，在切除時(shí)不但收集64個(gè)自體腎樣品而且收集包括51個(gè)透明細(xì)胞癌和13個(gè)嫌色癌的64個(gè)初級(jí)腎腫瘤。組織樣品用福爾馬林固定并用石蠟包埋。
免疫組織化學(xué)用單克隆抗體抗-人細(xì)胞角蛋白8(clone βH11，DAKO，Hamburg，德國(guó)，1∶25稀釋)，抗波形蛋白單克隆抗體(clone V9，DAKO，1∶40稀釋)和抗stathmin(B37545，Calbiochem，美國(guó)，1∶500稀釋)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。為了抗原提取，在微波爐中將連續(xù)切片在檸檬酸緩沖液中分別溫育8和6分鐘，之后有一個(gè)Tris緩沖鹽洗滌步驟，并再與正常豬血清(1∶10稀釋)溫育10分鐘。室溫下玻片與初級(jí)抗體溫育1小時(shí)。如所述(DAKODiagnostika GmbH，Hamburg，德國(guó))用LASB(標(biāo)記鏈酶抗生物素生物素)-過氧化酶試劑盒和AEC(氨基-9-乙基咔唑)進(jìn)行檢測(cè)。省略初級(jí)抗體作陰性對(duì)照。
根據(jù)以下得分進(jìn)行每個(gè)腫瘤定量分析
權(quán)利要求
1.至少一種選自下列的蛋白作為腫瘤標(biāo)記的用途β-肌動(dòng)蛋白、γ-肌動(dòng)蛋白、α-微管蛋白、細(xì)胞角蛋白、細(xì)胞角蛋白8、細(xì)胞骨架原肌球蛋白、F-肌動(dòng)蛋白加帽蛋白、hsp27、hsp60、hsp70、hsp90、grp78(BIP)、gp96、谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷光甘肽合成酶、超氧化物歧化酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、PA28α、遍在蛋白巰基酯酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、醛糖還原酶、烯酰--CoA水合酶、α-烯醇化酶、膜聯(lián)蛋白II、IV和V、stathmin、煙酰胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶、B23/核仁磷酸蛋白和波形蛋白。
2.權(quán)利要求1中限定的蛋白和/或β-微管蛋白作為腎細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)記的用途。
3.用來診斷和預(yù)測(cè)個(gè)體內(nèi)癌癥的體外方法，該方法包括用免疫測(cè)定的方法檢測(cè)抗體的存在，此抗體來自所述個(gè)體的血清樣品并且是如權(quán)利要求1或2中限定的、在血清中存在的腫瘤標(biāo)記蛋白的抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中免疫測(cè)定包括以下步驟(a)在膜或底物上固定根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白；(b)使所述膜或底物與個(gè)體的血清樣品接觸，和；(c)檢測(cè)個(gè)體血清樣品中腫瘤標(biāo)記特異抗體的存在。
5.權(quán)利要求4的方法，其中用對(duì)所述血清抗體的外源標(biāo)記的抗體來檢測(cè)血清樣品中的腫瘤標(biāo)記特異抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3到5中任一項(xiàng)的方法，其中所述個(gè)體患有腎細(xì)胞癌。
7.適合于實(shí)施權(quán)利要求3到6中任一項(xiàng)的方法的診斷試劑盒，該試劑盒含有至少一種或多種如權(quán)利要求1或2中限定的腫瘤標(biāo)記。
8.至少一種如權(quán)利要求1或2中限定的腫瘤標(biāo)記在制備刺激個(gè)體的免疫反應(yīng)的藥物中的用途。
9.至少一種與至少一種如權(quán)利要求1或2限定的腫瘤標(biāo)記發(fā)生免疫特異結(jié)合的抗體或其片段在制備有利于殺傷腫瘤細(xì)胞和/或抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的反應(yīng)的藥物中的用途。
10.權(quán)利要求9的用法，其中所述抗體或其片段是抗體融合蛋白。
11.藥物組合物，該組合物含有至少一種如權(quán)利要求1或2中限定的腫瘤標(biāo)記和任選的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
12.藥物組合物，該組合物含有至少一種與至少一種如權(quán)利要求1或2中限定的腫瘤標(biāo)記免疫特異結(jié)合的抗體或其片段和任選的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述抗體或其片段是抗體融合蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項(xiàng)的藥物組合物，該組合物還含有化療劑。
15.藥物包裝，該包裝在第一容器中含有根據(jù)權(quán)利要求11到13中任一項(xiàng)的藥物組合物以及在第二容器中含有包括化療劑的藥物組合物，這兩種組合物同時(shí)給藥或交替給藥。
16.至少一種選自下列的抗體在用免疫組織化學(xué)方法鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類中的用途抗--細(xì)胞角蛋白8、抗-波形蛋白和抗-stathmin抗體。
17.鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類的方法，該方法包括以下步驟a)把來自懷疑患有RCC個(gè)體的腎上皮組織樣品與選自抗--細(xì)胞角蛋白8、抗-波形蛋白和抗-stathmin(第一抗體)的至少一種抗體在保證所述抗體與組織樣品結(jié)合的情況下溫育；b)將第一抗體與含有對(duì)上述第一抗體具有結(jié)合親合性識(shí)別位點(diǎn)并具有可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗體在保證第二抗體與第一抗體結(jié)合的情況下接觸；c)檢測(cè)第二抗體與第一抗體的結(jié)合；和d)將步驟c)檢測(cè)的組織樣品與來自患有RCC的個(gè)體的透明細(xì)胞、嫌色細(xì)胞、嗜色細(xì)胞或癌細(xì)胞亞類的參考樣品對(duì)比。
18.鑒定RCC和區(qū)別RCC亞類的試劑盒，該試劑盒包括a)至少一種根據(jù)權(quán)利要求16的抗體(第一抗體)，和b)至少一種對(duì)抗第一抗體的載有可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤標(biāo)記，該標(biāo)記可用于篩選、診斷、預(yù)測(cè)和鑒定腎細(xì)胞癌亞類。本發(fā)明也涉及所鑒定的抗原蛋白在免疫測(cè)定中的用途以及腫瘤標(biāo)記用作免疫原以刺激免疫反應(yīng)的用途。本發(fā)明還涉及所述腫瘤標(biāo)記在制備針對(duì)腫瘤標(biāo)記的抗體和抗體融合蛋白中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1630819SQ02806866
公開日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月3日
發(fā)明者R·克爾納, S·馬茨庫, B·塞利格, R·利希騰費(fèi)爾斯 申請(qǐng)人:默克專利有限公司