專利名稱：：實時定量pcr檢測細(xì)胞周期蛋白b2基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)肺瘤學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的檢測血液尤其是血清中細(xì)胞周期蛋白B2基因表達(dá)的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：惡性肺瘤是威脅人類健康的重要疾病，目前全球每年至少有700萬人死于惡性胂瘤，其中我國約130萬，惡性胂瘤已成為繼心腦血管病之后人類因疾病死亡的第二位原因。惡性胂瘤中90%以上屬于上皮來源的實體胂瘤(俗稱癌癥，如肺癌、肝癌、胃癌等)，這些惡性實體腫瘤(以下簡稱肺瘤)致死的主要原因是轉(zhuǎn)移，尤其是全身轉(zhuǎn)移。臨床觀察到，對病理檢查無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期肺瘤患者，根治性手術(shù)后仍有相當(dāng)一部分因全身轉(zhuǎn)移而最終死亡，提示在手術(shù)時體內(nèi)已經(jīng)存在少量癌細(xì)胞全身播散但應(yīng)用現(xiàn)有的診斷手段(如影像學(xué)和核醫(yī)學(xué)等)尚無法發(fā)現(xiàn)，這類隱匿性的轉(zhuǎn)移(OccultMetastasis,或稱微轉(zhuǎn)移，Micrometastasis)是患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個重要根源(1)。動物實驗揭示，當(dāng)瘤重達(dá)到l克(直徑1cm)時，每天約有106癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落進(jìn)入血液，這些癌細(xì)胞在血液中很少死亡，它們通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運到各器官后很快穿越血管內(nèi)皮屏障進(jìn)入組織，其中98%的癌細(xì)胞在組織內(nèi)凋亡并被機體清除，但仍有2%的癌細(xì)胞存活下來并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移病灶(2)。德國學(xué)者曾對骨髓中的微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，證明此類癌細(xì)胞能夠在體外生長，并且癌細(xì)胞活躍生長者生存期短。因此，血液中出現(xiàn)癌細(xì)胞是肺瘤轉(zhuǎn)移的一項早期預(yù)警指標(biāo)，預(yù)示轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增高。建立腫瘤轉(zhuǎn)移的早期預(yù)警系統(tǒng)在臨床上具有廣泛的應(yīng)用價值，因為該系統(tǒng)不僅有助于對患者進(jìn)行預(yù)后評估，而且更重要的是可以對術(shù)后轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期診斷和及時治療，以期鞏固療效和改善預(yù)后。此外，檢測血液中癌細(xì)胞還可以作為評估晚期腫瘤化療療效的一項分子標(biāo)志。文獻(xiàn)報道，化療后血液中癌細(xì)胞消失者預(yù)后好、生存期長(2'3)。幾乎所有腫瘤都有一個根本的共同特征細(xì)胞周期調(diào)控機制的破壞導(dǎo)致細(xì)胞的失控性生長。細(xì)胞周期素是細(xì)胞周期調(diào)控的作用蛋白，它可大致分成兩大類Gl周期素(Glcyclins或STARTcyclins)及分裂期周期素(mitoticcyclins)。在哺乳類動物中，Gl周期素有周期素D及E二種，而分裂期周期素包括周期素A和B1、B2，它們在整個間期中相當(dāng)穩(wěn)定，但在有絲分裂時卻被迅速而特異地降解。在啟動有絲分裂中周期素A和B起重要的協(xié)同作用，一旦進(jìn)入有絲分裂期，周期素B將成為最重要的。它在有絲分裂的中期-后期過渡處降解；是完成有絲分裂所必需的。細(xì)胞周期素B2是細(xì)胞周期依賴合成的。它與細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶1(cdc2)相連接形成一個復(fù)合物，這一復(fù)合物對于細(xì)胞有絲分裂有正向調(diào)節(jié)的作用，對于細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂是關(guān)鍵的(4，5)。三氧化二砷(八3203)是一種致癌劑可以促進(jìn)細(xì)胞增殖誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，但在體外實驗上存在劑量效應(yīng)外推的不確定性。細(xì)胞周期素B2在G2期有最大的表達(dá)，且受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)(6),在肺癌、乳腺癌等腫瘤中表達(dá)增高，可被認(rèn)為是一種較好的血清診斷標(biāo)志物。因此近十年來從血液中4全測胂瘤標(biāo)記物受到了國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注(8)。隨著現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前己經(jīng)能夠?qū)ρ褐械奈⒘磕[瘤標(biāo)記物的mRNA進(jìn)行檢測，表1列舉了近年來對6種常見腫瘤患者血液的胂瘤標(biāo)記物檢測的若干結(jié)果，報道中有6篇附有2年以上的隨訪結(jié)果，證明血液中檢出癌細(xì)胞與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。根據(jù)北京市肺瘤研究所的最新統(tǒng)計資料，這些腫瘤的發(fā)病率居北京市區(qū)惡性胂瘤的前10位，占惡性胂瘤總發(fā)病率的70%以上。表1惡性實體肺瘤患者血液中腫瘤標(biāo)記物;險測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注CEA:癌胚抗原；CK:細(xì)胞角蛋白；S5A:肺癌特異性單抗識別的抗原；MAGE:黑色素瘤抗原；EPCAM:上皮細(xì)胞粘附分子；RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；FCM:流式細(xì)胞儀^r測；IHC:免疫組化。目前從血液中片全測腫瘤標(biāo)記物的技術(shù)還不完善，存在許多問題，一是檢測方法不統(tǒng)一，包括各家采用的檢測技術(shù)和腫瘤標(biāo)志不一致，研究結(jié)果很難相互比較二是敏感性較低，可能會有一部分患者漏診；三是大部分腫瘤標(biāo)志基因在正常白細(xì)胞中有"非法表達(dá)"(IllegitimateExpression)現(xiàn)象，如采用RT-PCR檢測CK-19mRNA在一部分健康人外周血中可能出現(xiàn)"假陽性"(10)。因此，本領(lǐng)域中迫切需要建立一種敏感性高、特異性好、適用面廣的^^測方法。
發(fā)明內(nèi)容為達(dá)到上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種體外檢測樣品中細(xì)胞周期素B2的方法，所述方法包括以下步驟在細(xì)胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸區(qū)間制備標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)細(xì)胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸區(qū)間設(shè)計引物及Taqman探針；用Taqman技術(shù)對細(xì)胞周期蛋白B2基因mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析。本發(fā)明第二方面還提供了一種體外實時定量檢測血液樣品中細(xì)胞周期素B2基因表達(dá)的方法，它包括以下步驟用分離膠從血液樣品中分離血清；從血清中抽才是RNA并獲得cDNA;在細(xì)胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸區(qū)間制備標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)細(xì)胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸區(qū)間設(shè)計引物及Taqman探針；用Taqman技術(shù)對細(xì)胞周期蛋白B2基因mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)4亍相對定量的分析。本發(fā)明第三方面提供了一種用于定量檢測血清樣品中細(xì)胞周期蛋白B2基因表達(dá)的試劑盒，所述試劑盒包含引物、DNA標(biāo)準(zhǔn)品和Taqman探針，其中所述引物及探針是根據(jù)細(xì)胞周期蛋白B2基因第1]44-1243位核苷酸區(qū)間設(shè)計得到，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)細(xì)胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核普酸區(qū)間制得。本發(fā)明的方法通過分離月交從血液中分離血清后，采用實時定量PCR檢測血清樣本中細(xì)胞周期蛋白B2的mRNA表達(dá)，從而對血清中的細(xì)胞周期蛋白B2的含量做出判斷。本發(fā)明的優(yōu)點是一，可用于幾乎所有惡性腫瘤的檢測，適用面廣；二，具有較高的特異性和敏感性。具體實施例方式對本領(lǐng)域中所存在的上述問題，本發(fā)明提出了一套新的解決方案。首先，本發(fā)明選擇細(xì)胞周期蛋白B2作為區(qū)分腫瘤患者和正常人的血清分子標(biāo)志，從而提供了能夠適用于所有腫瘤的檢測技術(shù)。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白B2在部分肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食道癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌和腎細(xì)胞癌等實體肺瘤患者的血清中均呈高表達(dá)。而在340例正常人中沒有表達(dá)。肺瘤細(xì)胞的一個基本特征是無限制增殖，該特征與細(xì)胞周期素B2的mRNA異常表達(dá)有關(guān)。惡性肺瘤細(xì)胞通過啟動細(xì)胞周期素B2基因的表達(dá)促進(jìn)惡性增殖。由于成年人體內(nèi)絕大部分細(xì)胞，除了原始的干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和活化的淋巴細(xì)胞外，均不表達(dá)細(xì)胞周期蛋白B2,而在部分腫瘤中均可以檢測到細(xì)胞周期素B2的mRNA,這一特性使得細(xì)胞周期素B2成為腫瘤細(xì)胞的一種理想標(biāo)志。因此，細(xì)胞周期素B2可以鑒別正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，正常細(xì)胞的表型為細(xì)胞周期素B2"-，，，而癌細(xì)胞為細(xì)月包周期素B2"+"。第二，在血液中正常白細(xì)胞與癌細(xì)胞的鑒別也是一個十分棘手的問題。由于血液中癌細(xì)胞含量甚少，采用病理形態(tài)觀察無法找到癌細(xì)胞。目前普遍采用RT-PCR等高度敏感的分子檢測技術(shù)進(jìn)行分析，但由于正常白細(xì)胞存在肺瘤標(biāo)志基因的非法表達(dá)現(xiàn)象，假陽性問題很難排除，通過分離血清可以排除檢測過程中正常白細(xì)胞的干擾、消除假陽性和提高診斷率。實時定量PCR是根據(jù)Taqman技術(shù)發(fā)展起來的一項新穎的基因檢測方法，其原理是將靶基因特異性的一組引物和熒光標(biāo)記探針與模板cDNA進(jìn)行雜交，然后在聚合酶鏈反應(yīng)過程中利用Taq酶的3，-核酸外切酶活性水解探針3，-端的熒光淬滅基團(tuán)，獲得焚光激發(fā)信號，后者與模板量呈正相關(guān)。應(yīng)用這一技術(shù)可以/人l-10pgRNA中4企測到靶基因mRNA的表達(dá)，由于1個細(xì)胞中至少含有10pgRNA,因而實時定量PCR的檢測極限可以達(dá)到1-10個細(xì)胞。本發(fā)明4是供了一種相對實時定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)技術(shù)，用于檢測細(xì)胞周期素B2基因表達(dá)。該方法主要采用目前國際上通用的2—"€1法進(jìn)行相對定量分析(16)，通過分析靶基因與內(nèi)參基因((3-肌動蛋白基因)的比值與標(biāo)準(zhǔn)品中靶基因與內(nèi)參基因(3-肌動蛋白基因)的比值，得到相對于標(biāo)準(zhǔn)品而言，靶基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)狀況，由此來達(dá)到定量分析。本發(fā)明另一方面還提供了幾套PCR引物及探針，能夠特異性地擴增細(xì)胞周期素B2和內(nèi)參照基因(p-肌動蛋白基因)的mRNA。具體而言，發(fā)明人根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的細(xì)胞周期素B2(NM一004701.2)和作為內(nèi)參基因的(3-肌動蛋白(NM一001101.2)基因序列，采用internet上公開的引物設(shè)計軟件(例如ABI公司的引物設(shè)計軟件primerexpress2.0),根據(jù)細(xì)胞周期素B2基因第1144-1243位核苦酸區(qū)間和第1078-1316位核苦酸區(qū)間分別設(shè)計了引物和探針，建立了細(xì)胞周期素B2和作為內(nèi)參基因的e-肌動蛋白基因的實時定量PCR檢測方法。本發(fā)明另一方面還提供了利用標(biāo)準(zhǔn)品來定量檢測細(xì)胞周期素B2基因在生物樣本中的相對表達(dá)量的方法。本發(fā)明中所涉及到的標(biāo)準(zhǔn)品包括但不限于從人的血清、全血、或人細(xì)胞系中提取的RNA樣本。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠理解，本文列舉的引物和探針僅僅是為了描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本說明書后，能夠采用常規(guī)的手段在細(xì)胞周期素B2基因第1078-1316位核苷酸區(qū)間內(nèi)通過適當(dāng)選I奪其他引物來合成DNA標(biāo)準(zhǔn)品，也能夠在細(xì)胞周期素B2基因第1144-1243位核苷酸區(qū)間內(nèi)選擇其它合適的引物和探針，通過相對定量的2—"0法，來達(dá)到本發(fā)明的目的。實時定量PCR通常分為相對定量和絕對定量二類。相對定量分析以靶基因陽性表達(dá)的細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，通過分析輩巴基因與內(nèi)參照基因(如P-肌動蛋白等)的比值，獲得待測樣本中靶基因表達(dá)的相對值。這種方法的優(yōu)點是容易開發(fā)，但所得的數(shù)值受陽性標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞的影響，不同的實驗室若采用不同的陽性細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果難以相互比較。單細(xì)胞實時定量PCR(SingleCellQuantitativeReal-timePCR)。將該方法與常規(guī)PCR進(jìn)行了比較，證明單細(xì)胞實時定量PCR檢測的敏感性可以提高100倍。此外，發(fā)明人應(yīng)用相對定量的方法對10例正常肺組織和55例肺癌組織中細(xì)胞周期素B2mRNA含量進(jìn)行了分析，確定了正常肺組織中細(xì)胞周期素B2基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)值。按此標(biāo)準(zhǔn)，肺癌組織中細(xì)胞周期素B2陽性表達(dá)率為69.1%。表2:各種腫瘤患者血清中細(xì)胞周期蛋白B2的相對表達(dá)量<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>0.41*:是相對定量，正常人的基準(zhǔn)值是IOO。以下借助非限制性實施例詳細(xì)描述本發(fā)明。實施例1:實時定量PCR檢測技術(shù)1.1材料與方法正常血清樣本來自北京軍區(qū)總醫(yī)院新兵體檢，各種胂瘤患者血清主要取自承德北方醫(yī)院與保定恒興中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院。TrizolRNA抽提試劑盒購自InVitrogen上海申能博采生物科技有限公司。RevertAidT'第一鏈cDNA合成試劑盒購自Promege公司。PCR引物探針由大連寶生物生物工程公司合成。熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程公司。定量PCR儀為FB-2000(上海才風(fēng)嶺生物科技公司)根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的細(xì)胞周期素B2(NM00470L2)和(3-月幾動蛋白(NM—0011.01.2)基因序列，采用Internet公開的ABI公司出產(chǎn)的引物設(shè)計軟件primerexpress2.0,分別設(shè)計了幾組引物和探針，見表3。表3:引物和Taqman探針<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>反應(yīng)體積為10jal。(1)檢測樣本總RNA的制備用帶有分離膠的管子采血，4，400rpm離心IO分鐘，取250血5青分裝到1.5mleppendorf管中，力口入750jalTrizoli式劑，馬上居1執(zhí)〉'昆勻，短暫離心，開蓋加入200(il氯仿，混勻，靜置10分鐘，12000rpm離心IO分鐘，取上清(大約500^1)到另一個l.5ml的eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，混勻沉淀l小時，12000rpm離心10分鐘，收集沉淀，用lml的70%乙醇洗滌一次，晾干沉淀，用10(al的DEPC-H20溶解。取3(il用紫外分光光度計進(jìn)行濃度純度測定。(2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取2)Lig總RNA配成5.5^1反應(yīng)體積，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。選取針對細(xì)胞周期素B2、(3-肌動蛋白特異反轉(zhuǎn)錄引物SEQIDNO:16,SEQIDNO:19,用MMLV分別對各個樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。(3)定量PCR反應(yīng)取反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物，稀釋10倍，取5^1為模板，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5|^1,表4.定量PCR反應(yīng)反應(yīng)體系計算,<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例2熒光定量PCR法纟全測血清18SrRNA和細(xì)胞周期素B2轉(zhuǎn)錄本在癌癥檢測中的應(yīng)用，測定各個反應(yīng)管的Ct值，應(yīng)用deltaCt法進(jìn)行樣本中細(xì)胞周期素B2相對量的計算分析(圖l所顯示的是表2中列出的的10種不同類型癌癥檢測所得到的相對表達(dá)量的平均值)。用表3中所列的引物和探針分別對表2中的各種樣品進(jìn)行檢測。不同實驗間誤差共5%。在檢測的來自IO種類型癌癥(見表2)的所有血清樣品中，發(fā)現(xiàn)與正常樣品相比，細(xì)胞周期素B2明顯過量表達(dá)。實施例3熒光定量PCR法4全測血清18SrRNA和細(xì)力包周期素B2轉(zhuǎn)錄本在治療處理后的患者中的應(yīng)用為了檢查細(xì)胞周期素B2的血清表達(dá)水平的實時PCR檢測是否能用于監(jiān)測癌癥治療處理(例如手術(shù)、化療、放療等)，以及監(jiān)測治療后癌癥復(fù)發(fā)的效力。在癌癥治療處理之前和之后，如上所述比較血清細(xì)胞周期素B2的表達(dá)水平(圖2)。發(fā)現(xiàn)在治療(例如手術(shù))之后，上述IO種癌癥的患者中血清細(xì)胞周期素B2水平都顯著降低(圖2所顯示的是平均值士標(biāo)準(zhǔn)方差)。實施例4熒光定量PCR法檢測人細(xì)胞系中18SrRNA和細(xì)胞周期素B2轉(zhuǎn)錄本作為標(biāo)準(zhǔn)品為了選擇穩(wěn)定性和一致性高的標(biāo)準(zhǔn)品作為計算細(xì)胞周期素B2的血清相對表達(dá)水平，從而更準(zhǔn)確有效地反映癌癥治療處理(例如手術(shù)、化療、放療等)，以及監(jiān)測治療后癌癥復(fù)發(fā)的情況，我們對人細(xì)胞系293T的細(xì)胞懸濁液(圖3A)和從人細(xì)胞系293T中提取的總RNA(圖3B)進(jìn)行了梯度稀釋并按照實施例1中的方法進(jìn)行了細(xì)胞周期素B2的熒光定量PCR法檢測(圖3所顯示的是平均值)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期素B2在293T細(xì)胞中的相對表達(dá)水平和細(xì)胞個數(shù)(圖3A),以及RNA濃度(圖3B)成很好的相關(guān)性。另外，我們在6個月內(nèi)對上述實驗進(jìn)行了多次重復(fù)(每周一次)(樣本均保存在-80。C)并發(fā)現(xiàn)所有實驗中細(xì)胞周期素B2的相對表達(dá)水平具有很好的一致性和穩(wěn)定性(標(biāo)準(zhǔn)方差<10%)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明利用熒光定量PCR法檢測人細(xì)胞系中18SrRNA和細(xì)胞周期素B2轉(zhuǎn)錄本可以作為標(biāo)準(zhǔn)品。雖然上面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行了具體描述，但是熟悉本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員均了解，在不違背本發(fā)明的原則和精神的情況下，根據(jù)本說明書及所附權(quán)利要求書中公開的內(nèi)容，可對本發(fā)明做出各種變動和改進(jìn)。因此，所有這些變動和改進(jìn)均應(yīng)包括在所附權(quán)利要求書中所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。參考文獻(xiàn)1.曾益新，腫瘤學(xué)[M],第2版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2003,151-152。2.HofmannH.S.，HansenG.，BurdachS.等，通過兩個耙基因從正常肺部中區(qū)分出人肺胂瘤，Am.J.Respir.Crit.CareMed.2004;170:516-519.3.LiC.，ShridharK.，LiuJ.,表達(dá)溫度敏感型p53突變體的MCF-7細(xì)胞的制癌蛋白M誘導(dǎo)的生長抑制的分子表征，BreastCancerRes.Treat.2003;80:23-37。4.YoshitomeS.,FumnoN.,HashimotoE.等，細(xì)刀包周期蛋白B2刀包質(zhì)滯留信號區(qū)的C末端七個氨基酸是爪蟾卯母細(xì)胞和胚胎的正常雙極紡錘體形成必需的，Mol.CancerRes.，2003,1:589-597。5.ZhaoS.,TsuchidaT.,KawakamiK.等，As203對p53狀態(tài)不同的兩種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞周期蛋白D1和B1表達(dá)的影響，Int.J.Oncol.，2002,21:49-55。6.WasnerM.，HaugwitzU.,ReinhardW.等，三種CCAAT2盒和單一細(xì)胞周期基因同系物區(qū)(CHR)是由人類細(xì)胞周期蛋白B2啟動子轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控位點，Gene,2003,17(312):225。7.YamazakiK.,AbeS.,TakekawaH.等，人肺腺癌中的肺瘤血管生成，Cancer,1994,74(8):2245。8.KurusuY.，YamashitaJ.,OgawaW.，通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對非小細(xì)胞肺癌患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，Surgery,1999,126(5):820陽826。9.董強剛，沙慧芳，外周血循環(huán)中肺癌細(xì)胞的流式細(xì)胞儀定量分析，《腫瘤》，2000/20/01P31-34。10.YehK.H.，ChenY.C.,YehS.H.等，通過細(xì)胞角蛋白19(K19)巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測循環(huán)癌細(xì)胞-對晚期胃癌的潛在臨床意義，AnticancerRes.，1998,18(2B):1283-1286。11.WeigeltB.,BosmaA丄，HartA.A.M.等，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記基因預(yù)告轉(zhuǎn)移乳癌患者的存活率，BrJCancer,2003,88(7):1091-1094。12.GullerU.，ZajacP.，SchniderA.等，用實時定量PCR檢測到的散播的單一腫瘤細(xì)胞是直腸結(jié)腸癌手術(shù)患者的診斷因子，Ann.Surg.,2002，236(6):768-776。13.ItoS.，NakanishiH.,KodemY.等，胃癌患者的腹腔沖洗液的定量CEAmRNA檢測的預(yù)期驗證，Br.J.Cancer,2005，93(9):986-992。14.MouD.C.，CaiS丄.，PengJ.R.等，作為檢測肝癌細(xì)胞的血液散播的腫瘤特異性標(biāo)記物的MAGE-l和MAGE-3的評估，Br.J.Cancer2002，86(l):110-6。15.JudsonP丄.，GellerM.A.，BlissR丄.，BoenteM.P.,DownsL.S.，ArgentaP.A.，CarsonL.F，外周循環(huán)癌細(xì)胞的術(shù)前檢測及其對卵巢癌的診斷意義，GynecologicOncology,Volume91，Number2,November2003，pp.389-394(6)。圖1顯示的是對10種不同類型癌癥檢測所得到的細(xì)胞周期素B2的相對表達(dá)量的平均值；圖2顯示的是在癌癥治療處理之前和之后，血清細(xì)胞周期素B2表達(dá)水平的比較；圖3顯示的是對人細(xì)胞系293T的細(xì)胞懸濁液(圖3A)和從人細(xì)胞系293T中提取的總RNA(圖3B)進(jìn)行的細(xì)胞周期素B2的熒光定量PCR法檢測的結(jié)果。序列表<110〉北京雅康博生物科技有限公司<120>實時定量PCR檢測細(xì)胞周期蛋白B2基因表達(dá)的方法<160〉32<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1CACAGGATACACAGAGAATG20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2CTTGATGGCGATGAATTTAG20<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針<400>3ATTGGAAGTCATGCAGCACATGGC24<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400〉4GGACATTGATAACGAAGATTG21<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5GCTGCCTGAGATACTGAT18<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針<400>6AGAACCCTCAGCTCTGCAGTGAC23<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>7GGCACTCTTGCCTTC15<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述引物<400>8GTTCGCCTAATAGTCACA18<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述探針<400>9CTCATGGCGCTGCTCCGACG20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>10TTGCAGTCCATAAACCCACA20<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物<400>11GAAGCCAAGAGCAGAGCA18<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>12TCAACCCACCAAAACAACAA20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>13AGGGTTCTCCCAATCTTCGT20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400〉14AGCTGCTTCCTGCTTGTCTC20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400〉15GGTCTTTGACGGCTTTTGAG20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>16CCTACTGCTTCTGTCAAACC20<210>17<211〉20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<■>17TGTGGGTTTATGGACTGCAA20<210>18<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>18AGCTGCTTCCTGCTTGTCTC20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>19GCACAATGAAGCACACATCC20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>20CCAGTTCCCAAATCCGAGAA20<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><220><223>人工序列的描述探針<400>24CCCATCGAGCACGGCATCGT20<210>25<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>25ACATCCAAGGAAGGCAGCAG<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>26TTCGTCACTACCTCCCCGG<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探針<400>27CGCGCAAATTACCCACTCCCGA<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>28CGCATGCGTCCATTTATA<210>29<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述引物<400>29GTAGGTTTCAGTTGTTTG<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>30GCAAGGTCTTTGACGGCTTT<210>31<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>31GGTCATCTTCTCGCGGTT<210>32<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>32GGACTCATTCCAATTACAG權(quán)利要求1.一種體外檢測樣品中細(xì)胞周期蛋白B2基因表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟在細(xì)胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核苷酸區(qū)間制備DNA標(biāo)準(zhǔn)品；根據(jù)細(xì)胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸區(qū)間設(shè)計引物及Taqman探針；用Taqman技術(shù)對樣本中細(xì)胞周期蛋白B2基因mRNA進(jìn)行相對定量分析。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述引物選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10-23、25、26和28-32。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述Taqman探針選自SEQIDNO:3、6、9、24和27。4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其特征在于，它還包括以下步驟用分離膠從血液樣品中分離血清；從血清中抽提RNA并獲得cDNA。5.用于定量檢測血清樣本中細(xì)胞周期蛋白B2基因表達(dá)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含引物，DNA標(biāo)準(zhǔn)品和Taqman探針，其中所述引物及探針是根據(jù)細(xì)胞周期蛋白B2基因第1144-1243位核苷酸區(qū)間設(shè)計得到，所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)細(xì)胞周期蛋白B2基因第1078-1316位核香酸區(qū)間制得。6.權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述引物選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、10-23、25、26和28-32。7，權(quán)利要求5的試劑盒，其中所述Taqman探針選自SEQIDNO:3、6、9、24和27。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述引物具有SEQIDNO:1或2所示的序列。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述探針具有SEQIDNO:3所示的序列，且其5'端與熒光報告基團(tuán)相連，3'端與熒光淬滅基團(tuán)相連。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述DNA標(biāo)準(zhǔn)品用具有SEQIDNO:4和5所示序列的引物擴增獲得。全文摘要本發(fā)明提供了一種體外定量檢測血液樣品中尤其是血清樣本中細(xì)胞周期蛋白B2基因表達(dá)的方法。本發(fā)明還提供了在體外檢測樣品中細(xì)胞周期蛋白B2基因表達(dá)的方法以及用于定量檢測血液樣品中細(xì)胞周期蛋白B2基因的試劑盒。該試劑盒可以用于腫瘤的臨床輔助診斷以及療效監(jiān)測。文檔編號C12Q1/68GK101429540SQ20071016628公開日2009年5月13日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日發(fā)明者董曉明申請人:北京雅康博生物科技有限公司