專利名稱：人心肌保護(hù)基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人心肌保護(hù)基因，具體地說，涉及人心 肌保護(hù)塞因熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF1)及其篩選方法和用途。
背景技術(shù)：
心力衰竭是一組復(fù)雜的臨床癥候群，是多數(shù)器質(zhì)性心臟病人的嚴(yán)重階段，5 年存活率與惡性腫瘤相仿。心臟病人一旦出現(xiàn)心力衰竭，其1年死亡率為43%， 5年死亡率達(dá)75%，嚴(yán)重危害人類健康。流行病學(xué)資料顯示目前全球心衰患病人 數(shù)高達(dá)2250萬,并且每年新增病例200萬。人口快速老齡化及各種危險(xiǎn)因素的 增加使缺血性心臟病成為引起心衰最常見的病因，在發(fā)達(dá)國家心肌梗死生存率提 高是心力衰竭增加的主要原因，在發(fā)展中國家流行病學(xué)從感染、結(jié)核到心臟病的 轉(zhuǎn)變也是一個(gè)重要問題。與全球流行趨勢一致，缺血性心臟病是我國引起心衰最 常見的病因，尤其是我國有約1.3億高血壓人口，并且仍然處于低知曉率、低治 療率、低達(dá)標(biāo)率的現(xiàn)狀，在我國缺血性心臟病現(xiàn)在及今后相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)都將是 導(dǎo)致心力衰竭的主要原因，且呈上升趨勢，是我國公共衛(wèi)生面臨的重大問題，給 國民經(jīng)濟(jì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。
隨著對心衰發(fā)病機(jī)制的逐步闡明及大規(guī)模循證醫(yī)學(xué)的研究，心衰的治療模式 也在不斷更新和演變。從20世紀(jì)50至80年代以糾正血流動(dòng)力學(xué)異常、改善癥狀到 90年代以后的長期修復(fù)性策略、改善預(yù)后。然而目前心衰的治療方式均是針對已 經(jīng)受損或壞死心肌的姑息治療，恢復(fù)程度有限。心肌細(xì)胞一般認(rèn)為是終末期細(xì)胞， 功能心肌細(xì)胞的喪失是引起心肌收縮力低下、導(dǎo)致心衰的直接原因。而缺氧是多 種致病囟素導(dǎo)致細(xì)胞損傷、死亡的共同環(huán)節(jié)，細(xì)胞在損傷刺激作用下存活與死亡 結(jié)局取決于其內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制與死亡信號之間的動(dòng)態(tài)平衡，如何在細(xì)胞損傷極早 期調(diào)節(jié)其保護(hù)因子與死亡信號的平衡，激發(fā)保護(hù)性機(jī)制是保護(hù)功能性心肌組織、 預(yù)防心衰的關(guān)鍵問題。
隨著遺傳學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，通過基因修飾改變基因功能曾經(jīng)一度成為
治療心衰的希望，然而目前關(guān)于基因的研究主要側(cè)重于單個(gè)基因的功能，而器官組織的功能是多種基因相互協(xié)調(diào)共同調(diào)節(jié)的結(jié)果，并且心衰是多種因素共同參與 導(dǎo)致的一種臨床綜合征，以單個(gè)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的治療方式并不能取得理想的效果。 現(xiàn)有技術(shù)用基因芯片的方法找出差異表達(dá)基因，再對這些基因(往往成百上千個(gè)) 進(jìn)行功能學(xué)的鑒定，往往有大海撈針的感覺。雖然能得到大量的有關(guān)基因的序列 信息，但其中對闡明功能起關(guān)鍵作用的并不多。VitoP于1996年報(bào)道了從誘導(dǎo) 死亡的培養(yǎng)細(xì)胞中篩選保護(hù)性基因的方法，稱死亡陷阱(Death Trap)的方法。 尚未見有將死亡陷阱基因篩選的方法應(yīng)用于心臟疾病的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人心肌保護(hù)基因，具體涉及細(xì)胞損傷極早期具有保 護(hù)心肌抵抗缺氧損傷的基因。更具體地說涉及人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子 (HSF1)。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述基因的篩選方法及其用途。 本發(fā)明采用死亡陷阱"(Death Trap)的方法，進(jìn)行功能基因篩選，從人心
臟基因庫中篩選出具有抵抗心肌細(xì)胞死亡的基因，從中，克隆出具有序列l(wèi)結(jié)構(gòu)
的熱休克轉(zhuǎn)錄因子l (HSF1 )。
本發(fā)明所述的HSF1經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抗細(xì)胞死亡的作用；經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
證明具有抵抗缺血保護(hù)心肌細(xì)胞和防治心力衰竭發(fā)生發(fā)展的作用。 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，
1. 采用death trap功能基因篩選法篩選保護(hù)心肌抵抗缺氧損傷的基因并克隆其 c薩；
2. 通過細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證克隆的cDNA中具有心肌保護(hù)作用的基因；
3. 在基本闡明篩選基因相互聯(lián)系和作用的基礎(chǔ)上，尋求最優(yōu)化的相互作用模式，
并通過細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證能否達(dá)到最佳的心肌保護(hù)效果；
4. 根—據(jù)篩選的具有心肌保護(hù)功能的基因序列預(yù)測產(chǎn)物形式，將能產(chǎn)生分泌蛋白
的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進(jìn)行細(xì)胞因子活性篩選、鑒定；
5. 比較患者心肌缺血后血清及心臟相關(guān)保護(hù)基因的表達(dá)變化，篩選具有判斷預(yù)
后價(jià)值的早期預(yù)測指標(biāo)，并進(jìn)行臨床驗(yàn)證。 本發(fā)明進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將上述HSF1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示60%以上轉(zhuǎn)染 了所述基因的細(xì)胞能夠抵抗缺氧引起的死亡，確認(rèn)所述的HSF1具有抗細(xì)胞死亡 的作用。
本發(fā)明進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，首先，用心臟HSF1基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠制作了 心臟缺血/再灌注損傷模型，結(jié)果顯示，心臟缺血/再灌注損傷后，HSF1轉(zhuǎn)基因 小鼠心肌壞死的面積比非轉(zhuǎn)基因小鼠減少了 30%以上，心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量則減 少了 40%以上。同時(shí)，本發(fā)明證實(shí)了 HSF1是通過熱休克蛋白HSP27、HSP70和HSP90 而不是HSP110來對心臟進(jìn)行保護(hù)。這些保護(hù)作用也同時(shí)體現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠的心 電圖上一一缺血/再灌注損傷后ST-T改變的更快恢復(fù)；另外，本發(fā)明用心臟HSF1 基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠和心臟HSF1基因敲除的小鼠制作了壓力超負(fù)荷心力衰 竭模型。結(jié)果顯示，前者同對照組比，延緩了心力衰竭的發(fā)生發(fā)展，并且同時(shí)顯 示可以促進(jìn)心臟新生微血管的形成，后者反之。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了HSF1基 因在活體的心臟內(nèi)也具有抵抗缺血保護(hù)心肌細(xì)胞和防治心力衰竭發(fā)生發(fā)展的作 用。
本發(fā)明將死亡陷阱這一直接功能基因篩選的方法應(yīng)用于心臟，更具有目的性 和精確性?？梢詫Y選到的基因有針對性地進(jìn)行再組合，更加有利于尋找到最佳 的基因治療方法。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中使用COS7細(xì)胞株(購自美國ATCC公司)進(jìn)行基因篩選； 人類心臟基因庫購自美國Life Technologies公司；采用HSF1轉(zhuǎn)基因鼠(日本 山口大學(xué)應(yīng)用醫(yī)學(xué)工程科)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
本發(fā)明將人的心臟基因庫轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞并使用過氧化氫進(jìn)行死亡誘導(dǎo)，從存 活的細(xì)胞株中提取的基因中克隆了熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF1)。進(jìn)一步研究表明HSF1
不僅能抗細(xì)胞死亡，在活體的心臟內(nèi)也具有保護(hù)作用，而且還發(fā)現(xiàn)HSF1通過激活 具有細(xì)胞保護(hù)作用的蛋白激酶Aktl的同時(shí)，抑制了能夠引起細(xì)胞凋亡的激酶JNK 和蛋白質(zhì)caspase3的活性，從而減少了心肌細(xì)胞的凋亡，起到了心肌保護(hù)的作用。 本發(fā)明從處于不同死亡階段的細(xì)胞或不同心力衰竭程度的心臟組織中篩選 出相關(guān)基因，并人工制作出這些基因的cDNA，將這些cDNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物 心臟內(nèi)，觀察它們的相互聯(lián)系和作用。能為進(jìn)一步的功能研究和基因工程藥物開 發(fā)提供新的靶基因。通過"死亡陷阱"功能基因篩選的方法，篩選出在心肌損傷
極早期具有逆轉(zhuǎn)心肌死亡、保護(hù)心肌的新基因，并闡明其相互作用模式，對心衰 的早期預(yù)防、治療及進(jìn)一步研發(fā)有關(guān)藥物及手段均有重要意義。
本發(fā)明對尋找治療缺血性心臟病和預(yù)防心功能不全的藥物和手段具有重要 的意義。


圖l是本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
圖2是壓力超負(fù)荷模型左室射血分?jǐn)?shù)測量數(shù)值圖。
圖3、 4是壓力超負(fù)荷模型新生血管數(shù)測量數(shù)值圖。 圖—5是ASK1與HSF1之間存在的聯(lián)系。
圖6是HSF1對細(xì)胞的保護(hù)作用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
一、 用death trap方法篩選保護(hù)心肌抵抗缺氧損傷的基因 以大鼠心臟成纖維細(xì)胞為研究對象，通過電穿孔法轉(zhuǎn)染人心臟基因庫(pCMV
SPORT heart cell expression cDNA library) 。 48小時(shí)后對轉(zhuǎn)染細(xì)胞給予致死 性缺氧刺激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，存活的細(xì)胞克隆可能包含有保護(hù)心肌抵抗缺氧損傷的 基因。從存活的細(xì)胞克隆中提取亞基因庫后再轉(zhuǎn)染心臟成纖維細(xì)胞，重復(fù)實(shí)驗(yàn)程 序4次?！獜淖詈蟠婊畹募?xì)胞克隆中篩選改變最明顯的幾種基因，克隆出其cDNA。
二、 驗(yàn)證篩選的cDNA是否具有心肌保護(hù)作用并優(yōu)化其相互作用模式 1.細(xì)胞學(xué)水平
將克隆的cDNA分別轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，給予致死性缺氧刺激后，觀察細(xì)胞存活與 死亡情況，明確death trap方法篩選的哪幾種基因具有保護(hù)心肌細(xì)胞抵抗缺氧刺 激的作用。
本發(fā)明將具有保護(hù)細(xì)胞抵抗缺氧損傷的幾種基因以不同組合方式共轉(zhuǎn)染心肌 細(xì)胞，給予致死性缺氧刺激后，比較不同轉(zhuǎn)染方式對細(xì)胞存活與死亡的影響，在 細(xì)胞水平優(yōu)化不同基因的相互組合模式。
ASK1的967位ser在生理狀態(tài)下自身磷酸化,試驗(yàn)結(jié)果顯示溫度升高時(shí)， p967發(fā)生脫磷酸化，此時(shí)ASK1激活(易致細(xì)胞凋亡)。結(jié)果顯示，將培養(yǎng)乳鼠
心肌細(xì)胞置于42'C 2小時(shí)，此時(shí)HSF1的活性最高，高于37。C時(shí)，故42"CASK1 表達(dá)下降較37t:時(shí)更明顯，而總ASK1的表達(dá)沒有明顯的變化。以上結(jié)果說明，
HSF1激活可抑制ASK1表達(dá)，進(jìn)而可能使細(xì)胞凋亡減少，保護(hù)心肌。
培養(yǎng)新生鼠心肌細(xì)胞，0. 1M過氧化氫誘導(dǎo)凋亡，選用R0S作為指標(biāo)，DCFH-DA 標(biāo)記R0S，流式檢測R0S，細(xì)胞轉(zhuǎn)染HSF1，結(jié)果顯示，加入H202后心肌細(xì)胞凋 亡明顯增加，轉(zhuǎn)染HSF1后的細(xì)胞對于H202誘導(dǎo)的凋亡與不轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，ROS 水平可以降低20%以上，對于未加過氧化氫誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染HSF1并不一 定降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。
上述細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示HSF1可抑制ASK1表達(dá)，抑制ROS水平，保護(hù)心肌。 2.動(dòng)物水平
復(fù)制大鼠急性心肌梗死模型，于冠脈結(jié)扎即亥l」、急性缺血后30min， 3h, 6h， 12h 分別于局部缺血心肌單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染克隆的cDNA，分別于術(shù)后l個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè) 月行心臟超聲檢査評價(jià)心功能，取心肌組織行病理學(xué)檢查觀察形態(tài)學(xué)改變，在動(dòng) 物水平評價(jià)哪一種基因或幾種基因的組合具有保護(hù)心肌抵抗急性缺氧剌激的作 用。
復(fù)制冠狀動(dòng)脈縮窄慢性心肌缺血模型，于局部單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染克隆的cDNA，分 別于術(shù)后l個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月行心臟超聲檢查評價(jià)心功能，取心肌組織行病理 學(xué)檢查觀察形態(tài)學(xué)改變，在動(dòng)物水平評價(jià)所述基因或幾種基因的組合具有保護(hù)心 肌抵抗慢性缺氧刺激的作用。
復(fù)制小鼠機(jī)械壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭模型，于局部單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染克隆的 cDNA，分別于術(shù)后l周、2周和4周行心臟超聲檢查評價(jià)心功能，取心肌組織行病 理學(xué)檢査觀察形態(tài)學(xué)改變，在動(dòng)物水平評價(jià)所述基因或幾種基因的組合具有防治 心力衰竭發(fā)生發(fā)展的作用。
結(jié)果顯示
1.壓力超負(fù)荷模型建立成功后，野生小鼠(NO)組左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)在第 3周開始下降，第4周下降明顯，出現(xiàn)心力衰竭；同NO組比較，基因敲除小鼠 (K0) LVEF從第一周就開始下降直到第4周都降低，出現(xiàn)心力衰竭，而基因轉(zhuǎn) 染小,(TG)組直到第4周LVEF也未下降，未出現(xiàn)心力衰竭。其具體的測量數(shù) 值見圖2。2.壓力超負(fù)荷模型建立成功后，在第4周末用免疫組化檢測新生血管數(shù)目，可 觀察到，野生小鼠(N0)組，基因敲除的小鼠(K0)組，數(shù)目下降，但基因轉(zhuǎn)染 的小鼠(TG)組增多。其具體的測量數(shù)值及圖表見圖表3、 4。 上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步顯示HSF1可促進(jìn)新生血管生成，改善心臟功能。
三、 根據(jù)篩選的具有心肌保護(hù)功能的基因序列預(yù)測產(chǎn)物形式，將其中產(chǎn)生分 泌蛋白的基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進(jìn)行細(xì)胞因子活性篩選、鑒定，為進(jìn)一步開發(fā)生 長因子和蛋白質(zhì)類藥物提供源頭創(chuàng)新的靶基因。
四、 比較患者心肌缺血后血清及心臟相關(guān)保護(hù)基因的表達(dá)變化，篩選具有判 斷預(yù)后價(jià)值的早期預(yù)測指標(biāo)
1. 收集健康志愿者及急性心肌梗死患者梗死后6h， 12h， 24h的血清標(biāo)本，提 取基因組cDNA。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)篩選的保護(hù)基因序列分別設(shè)計(jì)并合成探針，與血清 標(biāo)本cDNA雜交，觀察健康志愿者及急性缺氧后不同時(shí)間段篩選基因在血清的表達(dá) 變化。
2. 收集意外死亡及因缺血性心臟病終末期心力衰竭行心臟移植患者的心肌 標(biāo)本，提取基因組cDNA。將合成探針與心肌組織cDNA雜交，觀察篩選基因在慢 性缺氧心肌組織的表達(dá)變化。通過比較分析血清及心肌組織標(biāo)本相關(guān)保護(hù)基因的 表達(dá)變化，篩選可能作為判斷缺血性心臟病預(yù)后的極早期指標(biāo)，并進(jìn)一步進(jìn)行臨 床隨訪驗(yàn)證。SEQUENCE LISTING
<110〉復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
〈120> -人心肌保護(hù)基因及其用途
〈130〉 11
〈160> 1
〈170> Patentln version 3.1
〈210〉 1
〈211〉 2156
<212> 腿
〈213>人類
〈400> 1
cgggcccgtt gcaagatggc ggcggccatg ctgggccccg gggctgtgtg tgcgcagcgg 60
gcggcggcgc ggcccggaag gctggcgcgg cgacggcgtt agcccggccc tcggcccctc 120
tttgcggccg ctccctccgc ctattccctc cttgctcgag atggatctgc ccgtgggccc 180
cggcgc'ggcg gggcccagca acgtcccggc cttcctgacc aagctgtgga ccctcgtgag 240
cgacccggac accgacgcgc tcatctgctg gagcccgagc gggaacagct tccacgtgtt 300
cgaccagggc cagtttgcca aggaggtgct gcccaagtac ttcaagcaca acaacatggc 360
cagcttcgtg cggcagctca acatgtatgg cttccggaaa gtggtccaca tcgagc鄉(xiāng)g 420
cggcctggtc aagccagaga gagacgacac ggagttccag cacccatgct tcctgcgtgg ■
ccaggagcag ctccttgaga acatcaagag gaaagtgacc agtgtgtcca ccctgaagag 540
tga卿cata aagatccgcc aggacagcgt caccaagctg ctgacggacg tgcagctgat 600
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aaagateccc ctgatgctga acgacagtgg ctcagcacat tccatgccca agtatagccg 840
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cagcagctcc agcctctacg cccctgatgc tgtggccagc tctggaccca tcatctccga 960
catcaccgag 1020
gcccqj:^tcc 1080
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ccgtcacagc
CCCCgCCC3C
tcagtgacca
gCC3CggCtt
tgcccgacat
ctccccagga
agctggtgca
1560
ctacacagcg cagccgctgt tcctgctgga ccccggctcc gtggacaccg ggagcaacga 1620
cctgccggtg ctgtttgagc tggg卿ggg ctcctacttc tccgaagggg acggcttcgc 1680
cgaggacccc accatctccc tgctgacagg ctcggagcct cccaaagcca 鄉(xiāng)accccac 1740
tgtctcctag aggccccgga ggagctgggc cagccgccca cccccacccc cagtgcaggg 1800
ctggt—c—ttgg ggaggcaggg cagcctcgcg gtcttgggca ctggtgggtc ggccgccata 1860
gccccagtag gacaaacggg ctcgggtctg ggcagcacct ctggtc鄉(xiāng)a gggtcaccct 1920
ggcctgccag tctgccttcc cccaaccccg tgtcctgtgg tttggttggg gcttcacagc 1980
cacaop力gga ctgaccctgc 鄉(xiāng)ttgttca tagtcagaat tgtattttgg atttttacac 2040
aactgtcccg ttccccgctc cacagagata cacagatata tacacacagt ggatggacgg 2100
3C3卿c鄉(xiāng) ceig3g3tct3 taaac卿ca ggctctaaaa 犯aaaaaa88 ^aa犯 2156 。
權(quán)利要求
1、人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子，其特征是具有序列1的結(jié)構(gòu)。
2、 權(quán)利要求l所述的人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子制備方法，其特征是采用"死亡陷阱"的方法，進(jìn)行功能基因篩選，從人心臟基因庫中篩選具有抵抗 心肌細(xì)胞死亡的基因，從所獲得的具有抵抗心肌細(xì)胞死亡的基因中，克隆具 有序列l(wèi)結(jié)構(gòu)的熱休克轉(zhuǎn)錄因子l。
3、 權(quán)利要求1的人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子在制備治療心力衰竭藥物中的 用途。
4、 權(quán)利要求1的人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子在制備預(yù)防心力衰竭藥物中的 腿
5、 權(quán)利要求1的人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子在制備保護(hù)心肌抵抗缺氧損傷 藥物中的用途。
6、 權(quán)利要求1的人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子在制備保護(hù)心肌細(xì)胞抵抗缺血 藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子(HSF1)及其篩選方法和用途。本發(fā)明采用“死亡陷阱”的方法，從人心臟基因庫中篩選具有抵抗心肌細(xì)胞死亡的基因，從所獲得的基因中，克隆人心肌保護(hù)基因熱休克轉(zhuǎn)錄因子1。經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示所獲得的人心肌保護(hù)基因具有抗細(xì)胞死亡的作用，在活體的心臟內(nèi)也具有抵抗缺血保護(hù)心肌細(xì)胞和防治心力衰竭發(fā)生發(fā)展的作用。本發(fā)明可制備治療缺血性心臟病和預(yù)防心功能不全的藥物，為進(jìn)一步的功能研究和基因工程藥物開發(fā)提供新的靶基因，對心衰的早期預(yù)防、治療及研發(fā)有關(guān)藥物及手段有重要意義。
文檔編號C12N15/12GK101200721SQ20071015450
公開日2008年6月18日 申請日期2007年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日
發(fā)明者紅 姜, 磊 張, 李紀(jì)明, 鄒云增 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院